DE102010031354B3

DE102010031354B3 - Mittel und Verfahren zur Diagnostik, Prognose und Therapiekontrolle von Tumorerkrankungen

Info

Publication number: DE102010031354B3
Application number: DE201010031354
Authority: DE
Inventors: Dr. Menschikowski Mario; Dr. Hagelgans Albert; Margot Vogel; Prof. Dr. Siegert Gabriele
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2010-07-14
Filing date: 2010-07-14
Publication date: 2012-02-02
Anticipated expiration: 2030-07-15
Also published as: WO2012007462A1

Abstract

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin, speziell die Diagnostik, Prognose und Therapiekontrolle von Tumorerkrankungen. Die Erfindung beruht auf der durch die Erfinder zufällig entdeckten und bisher unbekannten epigenetischen Stilllegung des für den Phospholipase A2 Rezeptor-1 codierenden Gens in Leukämiezellen () und bei Patienten mit Leukämien und soliden Tumoren. Basierend auf dieser Erkenntnis gibt die Erfindung Verfahren und ein Kit an, mit welchem der Methylierungsgrad des Phospholipase A2 Rezeptor-1-Gens in einer isolierten Patientenprobe bestimmt wird.

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin, speziell die Diagnostik, Prognose und Therapiekontrolle von Tumorerkrankungen.
Gegenwärtige Verfahren zum Nachweis von Tumoren wie klinisch-chemische Untersuchungen in Körperflüssigkeiten und Gewebeproben oder bildgebende Verfahren führen trotz aller Fortschritte in den letzten Jahren zu einem zu späten Nachweis von malignen Veränderungen. So ist die Hauptursache der hohen Mortalitätsrate von Tumorpatienten nicht das Auftreten von Primärtumoren, sondern von Metastasen. Um das Auftreten von Metastasen zu verhindern, ist ein so früh wie möglicher Nachweis von malignen Veränderungen erforderlich. Ferner bedarf es neben sensitiver auch hochspezifischer Verfahren, um maligne Zellen von normalen Zellen richtig unterscheiden zu können. Sowohl falsch-positive als auch falsch-negative Befunde haben fatale Konsequenzen für die Betroffenen. Ebenso sind Methoden erforderlich, die eine richtige Prognose von Tumorpatienten gestatten und eine entsprechend auf den Patienten individuell abgestimmte Therapie erlauben.
Bisher werden in Körperflüssigkeiten wie Blutproben, Urin, Sputum oder Gewebeproben sogenannte Tumormarker bestimmt. Hierbei handelt es sich um Bestandteile von Tumorzellen, die verstärkt oder vermindert gebildet werden und deren Veränderungen in Körperflüssigkeiten wie Blut nachgewiesen werden können. Bis auf wenige Ausnahmen erlauben diese Tumormarker jedoch kein generelles Screening auf Tumorerkrankungen, da ihre diagnostischen Spezifitäten und Sensitivitäten zu gering sind. Wenngleich diese Tumormarker gegenüber bildgebenden Verfahren oft frühzeitiger maligne Veränderungen anzeigen können, gestatten sie bisher keinen Nachweis von malignen Veränderungen zu einem Zeitpunkt, bei dem das Auftreten von Metastasen in jeden Fall auszuschließen ist.
Die Nachteile bisheriger Verfahren zum Nachweis von Tumorerkrankungen beruhen in ihren niedrigen diagnostischen Sensitivitäten und Spezifitäten und ihr zu spätes Anzeigen von malignen zellulären Veränderungen.
Es ist bekannt, dass Gene durch DNA-Methylierung epigentisch reguliert werden können. In Tumoren ist die DNA generell hypomethyliert. Einzelne Gene sind jedoch hypermethyliert [60, 61, 62]. Methoden zum Nachweis der DNA-Methylierung in Tumoren sind ebenfalls bekannt [60]. Auch DE 100 56 802 A1 beschreibt eine solche Methode zur toxologischen Diagnostik.
Vor mehr als 20 Jahren wurde erstmals eine Phospholipase A2 (PLA₂) aus Thrombozyten der Ratte und aus Synovialflüssigkeiten von Patienten mit rheumatoider Arthritis isoliert, die sich strukturell von der bis dahin bekannten PLA₂ aus dem Pankreas unterschied [1-3]. Aus diesem Grund wurden in der Folgezeit beide Enzyme als pankreatische bzw. nicht-pankreatische oder synoviale PLA₂ bezeichnet und den Gruppen I und II zugeordnet [1, 2]. Eine weitere Differenzierung der sPLA₂s wurde erforderlich, als die Struktur der im Bienengift vorkommenden PLA₂ aufgeklärt war. Im Gegensatz zu den Gruppen I und II besitzen Bienen- und Wespen-sPLA₂s nur 10 Cysteinreste, weshalb diese Enzyme der Gruppe III zugeordnet werden [4].
Nicht zuletzt durch die Untersuchungen des menschlichen Genoms wurden in den letzten Jahren zahlreiche neue PLA₂s entdeckt, die ebenfalls einen katalytischen Histidinrest besitzen. Da sich diese Enzyme strukturell deutlich von denen der Gruppen I-III unterscheiden, werden diese Enzyme den Gruppen V, X und XII zugeordnet [5]. Weitere PLA₂s wurden identifiziert, die bis auf die Anordnung der 7. Disulfidgruppe und einer C-terminalen Aminosäure-sequenzverlängerung den bisher bekannten PLA₂ der Gruppe II ähnlich sind. Dementsprechend wurde eine Klassifizierung dieser Enzyme vorgeschlagen, die weitere Untergruppen vorsieht wie sPLA₂-IIA, sPLA₂-IID, sPLA₂-IIE und sPLA₂-IIF [6, 7]. Die nicht-pankreatische bzw. synoviale PLA₂ entspricht nunmehr der sPLA₂-IIA, der sekretorischen PLA₂ vom Typ IIA.
In einer Publikation aus dem Kreise der Erfinder wird eine epigenetische Regulierung von sezernierten Phospholipasen A2 vom Typ IIA (sPLA₂-IIA) und vom Typ V (sPLA₂-V) durch DNA-Hypermethylierung in Jurkatzellen diskutiert [61].
Die sPLA₂-IIA ist neben der pankreatischen sPLA₂-IB und der cPLA₂-IVA das am häufigsten untersuchte Enzym der PLA₂-Superfamilie [1, 2, 6-8]. Bei Säugern einschließlich des Menschen wird die sPLA₂-IIA in einer Reihe unterschiedlicher Zelltypen konstitutiv exprimiert und in sekretorischen Granula gespeichert. Dazu zählen Thrombozyten [9], Neutrophilen, Makrophagen und Mastzellen [10-12]. In Organen und Geweben wie Prostata [13], Plazenta [14], Milz, Leber, Darmmukosa, Tonsillen, Speichel- und Tränendrüsen, Knorpel und Knochenmark finden sich ebenfalls sPLA₂-IIA-Enzymaktivitäten [13, 15]. Das Enzym lässt sich auch in Körperflüssigkeiten wie Seminalplasma [16, 17] und Tränenflüssigkeiten [18] nachweisen. In der Prostata sind besonders die glandulären Epithelzellen reich an sPLA₂-IIA. Die Funktion der sPLA₂-IIA im Seminalplasma und der Prostata wird mit einer aktiven Prostaglandinbiosynthese in Verbindung gebracht [19]. Außerdem sind fusogene Eigenschaften von Lysophospholipiden beschrieben, die bei der sPLA₂-IIA-katalysierten Reaktion freigesetzt werden. Dadurch wird möglicherweise die Penetration der Spermien durch die Eiplasmamembran erleichtert [20]. Auch anti-bakterielle Eigenschaften der sPLA₂-IIA können von Bedeutung sein. Weiterhin wurde eine sPLA₂–IIA in den Paneth-Zellen des Verdauungstraktes nachgewiesen. Neben der Körperabwehr soll die sPLA₂-IIA der Paneth-Zellen auch eine Rolle bei der Verdauung von Nahrungsphospholipiden spielen [21]. Schließlich lassen sich auch hohe sPLA₂-IIA-Konzentrationen in der Plazenta feststellen [22]. Die Funktion des Enzyms in diesem Gewebe ist jedoch noch weitgehend ungeklärt. Es wird eine Beteiligung des Enzyms an der Eicosanoidbiosynthese durch Freisetzung von Arachidonsäure diskutiert [23].
Neben Effekten, die mit der Freisetzung von Arachidonsäure assoziiert sind, kann eine Hochregulation der sPLA₂-IIA auch zu Effekten führen, die unabhängig von der Enzymaktivität sind. So behielten inaktive sPLA₂-IIA-Mutauen, die unfähig waren, Arachidonsäure von Zytokin-stimulierten Bindegewebsmastzellen freizusetzen, ihre Fähigkeit, die COX-2-Expression in diesen Zellen zu erhöhen. Das lässt darauf schließen, dass COX-2-induzierende Aktivitäten der sPLA₂-IIA unabhängig von ihrer Enzymaktivität vermittelt werden [24]. In mesangialen Zellen und glatten vaskulären Muskelzellen war die autokrine und parakrine transkriptionelle Regulation des PLA2G2A-Gens ebenfalls unabhängig von der Aktivität des Enzyms [25, 26]. Außerdem führt die sPLA₂-IIA zu einer Aktivierung von Signaltransduktionswegen wie den Proteinkinase C-, MEK/ERK1/2-, p38 MAPK- und PI3-K/Akt-abhängigen Kaskaden [27-31] wie auch zur Aktivierung der Synthese und Freisetzung von Zytokinen aus humanen Monozyten, Lungenmakrophagen und eosinophilen Zellen, wofür auch hier die Enzymaktivität, zumindest teilweise, nicht erforderlich war [32-35]. Schließlich konnte gezeigt werden, dass in Mastzellen sogenannte survival signals durch die pankreatische sPLA₂-IB und Bienengift sPLA₂-III induziert werden. Dabei scheint weniger die Bildung von sPLA₂-katalysierten Mediatoren als vielmehr ein sPLA₂-vermittelte Mechanismus von Bedeutung zu sein [36].
Aus diesen Gründen werden Rezeptoren bzw. Bindungsstellen diskutiert, die für die durch sPLA₂-R1 hervorgerufenen und von ihren Enzymaktivitäten unabhängigen Effekte verantwortlich sind. Ein entsprechender sPLA₂-Rezeptor wurde in einer Reihe von Zellen wie glatte Muskelzellen, Fibroblasten, polymorphkernige neutrophile Zellen (PMN), Swiss 3T3-Zellen und Astrozyten nachgewiesen (31, 37-42). Die mögliche Bedeutung dieses Rezeptors für die Zellphysiologie und -pathophysiologie zeigt sich z. B darin, dass entsprechende Einflüsse auf die Migration und Proliferation glatter vaskulärer Muskelzellen, auf die Adhäsion von PMN und auf die Aktivität von p38 MAPK beschrieben wurden. Dadurch wurden wiederum die Elastasefreisetzung, Hemmung von Acetylcholinfreisetzungen, die Proliferation von Swiss 3T3-Zellen und vor allem die Tumorinvasion verändert (31, 43-47).
In einer von Augert et al. [48] publizerten Arbeit wurde mittels eines Loss-of-function-Screening einer shRNA-Bibliothek des Netherlands Cancer Institutes [49] der sPLA₂-Rezeptor (sPLA₂-R1) als eine von vier Komponenten beschrieben, die im Prozess der Seneszenz, der Zellalterung, eine zentrale Rolle spielt [48]. Der sPLA₂-R1 stellt einen transmembranen Glykoproteinrezeptor vom Typ I dar und ist auch als multifunktionaler M-Typ-Rezeptor bekannt. Er hat ein Molekulargewicht von 180 kDa, wurde erstmals bei Kaninchen in Skelettmuskelzellen entdeckt und bindet spezifisch sekretorische sPLA₂s [50, 51]. Er ist dem Mannose-Rezeptor, DEC-205 Rezeptor und dem Endo-1890-Rezeptor strukturell ähnlich und besteht aus einer transmembranen Domäne, einem kurzen cytoplasmatischen Teil und einer großen extrazelluläten Region. Letztere wird durch eine N-terminale Cystein-reichen Domäne, einer Fibronektinähnlichen Typ II-Domäne und einem Tandemrepeat bestehend aus acht Lektin-ähnlichen Kohlenhydraterkennungsdomänen zusammengesetzt [52-54].
Die biologische Funktion des sPLA₂-R1 ist noch ungeklärt. Bekannt ist, dass sPLA₂-R1-defiziente Mäuse teilweise rersistant gegenüber einer LPS-induzierten Letalität sind und dass diese Mäusen nach LPS-Gabe verminderte TNF-α- und IL-β-Serumspiegel aufweisen. Daraus wurde eine pro-inflammatorische Bedeutung des Rezeptors abgeleitet [55]. Ferner wird der Rezeptor ähnlich dem LDL-Rezeptor endozytiert und führt zur lysosomalen Degradation von gebundenen sPLA₂s, so dass der Rezeptor möglicherweise auch bei der Regulation von sPLA₂-Aktivitäten bei Entzündungen eine Rolle spielt [56, 57].
Im Vergleich mit sPLA₂-R1-exprimierenden humanen Fibroblasten, die nach 2-wöchiger Kultivierung im Zellwachstum blockiert und verstärkt seneszent wurden, wiesen mit shorthairpin RNA(shRNA)-transfizierte Zellen, deren Translation des PLA2R1-Gens blockiert war, ein ungehindertes Wachstum auf. Dies zeigte sich auch anhand einer erhöhten β-Galaktosidase-Aktivität als Zeichen der Seneszenz [58], die in sPLA₂-R1-exprimierenden Zellen nachweisbar war, nicht aber in Zellen ohne sPLA₂-R1-Expression. Schließlich konnte nachgewiesen werden, dass die sPLA₂-R1-abhängigen Effekte über p53-abhängige Stoffwechselwege vermittelt werden und die Generation von reaktiven Sauerstoffspecies dabei von Bedeutung ist [48].
Mit Hilfe der Erfindung sollen die oben genannten Nachteile bisheriger Verfahren beseitigt werden. Neben einer verbesserten diagnostischen Sensitivität und Spezifität soll durch die Erfindung ein Nachweis von malignen Veränderungen bereits frühzeitig, d. h. auf Zellebene, ermöglicht werden. Ferner sollen mit Hilfe der Erfindung Verfahren entwickelt werden, die eine unmittelbare Effizienzkontrolle von Therapien ermöglichen und die Suche nach neuen Wirkstoffen für die Therapie von Tumorerkrankungen erleichtern.
Aufgabe der Erfindung ist es insbesondere, neue Mittel und Methoden zur Diagnostik, Prognose und Therapiekontrolle von Tumorerkrankungen anzugeben.
Die Erfindung beruht auf der durch die Erfinder zufällig entdeckten und bisher unbekannten epigenetischen Stilllegung des für den Phospholipase A2 Rezeptor-1 codierenden Gens (nachfolgend PLA2R1-Gen) in Leukämiezellen ( ) und bei Patienten mit Leukämien und soliden Tumoren.
Diese epigenetische Stilllegung des PLA2R1-Gens ist mit einer DNA-Methylierung in GC-reichen Abschnitten (CpG-Inseln) innerhalb der für PLA2R1-codierenden Exons (insbesondere Exon 1) und/oder regulatorischer Bereiche, insbesondere vor (in 5'-Richtung stromaufwärts) des Exons 1 assoziert. Die codierenden Exons und die regulatorischer Bereiche werden nachfolgend als PLA2R1-Gen (oder PLA2R1-DNA) bezeichnet. Als Referenz wird dazu die PLA2R1-Sequenz gemäß SEQ ID No. 1 herangezogen, welche die Nukleotide –2000 (Position 1 in SEQ ID No. 1) bis +2199 (Position 4199 in SEQ ID No. 1) gerechnet vom Start des Exons 1 (Position 2001 in SEQ ID No. 1) umfasst, wobei der Begriff PLA2R1-Gen jedoch vorzugsweise auch homologe Sequenzen umfasst, die eine Sequenzidentität von 90%, bevorzugt 95%, besonders bevorzugt 98% zu SEQ ID No. 1 aufweisen.
Die einzelnen GC Paare, die im PLA2R1-Gen methyliert werden können, werden nachfolgend CpG-Stellen genannt.
Der Grad der nachgewiesenen PLA2R1-Gen-Methylierung korreliert mit der Bösartigkeit des Tumors. Umso höher die nachgewiesene PLA2R1-Gen-Methylierung, umso niedriger ist die Lebenserwartung des Patienten.
Die Bestimmung der PLA2R1-Gen-Methylierung als Biomarker lässt sich somit nicht nur zur Diagnostik, sondern auch zur Prognose des Verlaufs von Tumorerkrankungen einsetzen.
Folgende CpG-Inseln im PLA2R1-Gen sind in den Tumoren insbesondere methyliert: Der Bereich –662 bp bis +783 bp (1339 bis 2783 in SEQ ID No. 1) vom Beginn des Exons 1 des PLA2R1-Gen enthält insgesamt 91 CpG-Stellen. Bevorzugt wird in der Erfindung der Methylierungsgrad einzelner oder mehrerer dieser insgesamt 91 CpG-Stellen in der im Bereich –662 bp bis +783 bp des Exons 1 und distalen Promotorbereiches des PLA2R1-Gen (1339 bis 2783 in SEQ ID No. 1) bestimmt.
Das Exon 1 des PLA2R1-Gens ist 315 bp lang (Postionen 2001 bis 2315 in SEQ ID No. 1). Der Translationstart ist an Position 207 (2207 in SEQ ID No. 1). In 5'-Richtung stromaufwärts des Exon 1 enthält das PLA2R1-Gen eine CpG-Insel (hier als Insel 1 bezeichnet): –356 bp bis –241 bp (1645 bis 1760 in SEQ ID No. 1) vom Beginn des Exons 1 und drei weitere 5'-CpG-Inseln in den Nukleotidbereichen +37 bp bis +458 bp (Insel 2: 2038 bis 2458 in SEQ ID No. 1), +511 bp bis +667 bp (Insel 3: 2511 bis 2667 in SEQ ID No. 1) und +836 bp bis +990 bp (Insel 4: 2836 bis 2990 in SEQ ID No. 1).

CpG-Stellen, welche in Tumoren methyliert sind, sind in durch Fettdruck hervorgehoben und mit 1 bis 108 (tiefgestellt) nummeriert. Der Abschnitt des Exon 1 (Beginn und Ende) ist mit einem Stern (*) markiert und die CpG-Inseln sind unterstrichen. Die CpG-Stellen 1 bis 108 entsprechen folgenden Sequenzpositionen in SEQ ID No. 1: Tabelle 1:

Nr.	Position in SEQ ID No. 1	Nr.	Position in SEQ ID No. 1	Nr.	Position in SEQ ID No. 1	Nr.	Position in SEQ ID No. 1
1	1418-1419	2	1469-1470	3	1480-1481	4	1529-1530
5	1554-1555	6	1587-1588	7	1590-1591	8	1651-1652
9	1657-1658	10	1660-1661	11	1662-1663	12	1691-1692
13	1702-1703	14	1704-1705	15	1738-1739	16	1759-1760
17	1774-1775	18	1795-1796	19	1840-1841	20	1854-1855
21	1929-1930	22	1946-1947	23	1960-1961	24	1972-1973
25	1974-1975	26	1983-1984	27	2003-2004	28	2010-2011
29	2029-2030	30	2035-2036	31	2073-2074	32	2087-2088
33	2089-2090	34	2101-2102	35	2107-2108	36	2113-2114
37	2115-2116	38	2117-2118	39	2120-2121	40	2126-2127
41	2139-2140	42	2141-2142	43	2155-2156	44	2171-2172
45	2186-2187	46	2205-2206	47	2217-2218	48	2220-2221
49	2223-2224	50	2250-2251	51	2253-2254	52	2255-2256
53	2263-2264	54	2267-2268	55	2277-2278	56	2280-2281
57	2283-2284	58	2293-2294	59	2297-2298	60	2332-2333
61	2344-2345	62	2349-2350	63	2365-2366	64	2374-2375
65	2394-2395	66	2415-2416	67	2425-2426	68	2429-2430
69	2431-2432	70	2445-2446	71	2476-2477	72	2522-2523
73	2524-2525	74	2529-2530	75	2549-2550	76	2556-2557
77	2560-2561	78	2563-2564	79	2569-2570	80	2585-2586
81	2601-2602	82	2610-2611	83	2614-2615	84	2625-2626
85	2639-2640	86	2655-2656	87	2886-2887	88	2718-2719
89	2737-2738	90	2750-2751	91	2753-2754	92	2856-2857
93	2878-2879	94	2886-2887	95	2903-2904	96	2910-2911
97	2920-2921	98	2942-2943	99	2966-2967	100	2970-2971
101	2974-2975	102	3007-3008	103	3061-3062	104	3070-3071
105	3108-3109	106	3115-3116	107	3171-3172	108	3215-3216

Untersuchungen der Erfinder haben gezeigt, dass die CpG-Stellen in vier CpG-Inseln (CpG-Insel 1: –356 bp bis –241 bp, 1645 bis 1760 in SEQ ID No. 1 vom Beginn des Exons 1; CpG-Insel 2: +37 bp bis +458 bp, 2038 bis 2458 in SEQ ID No. 1; CpG-Insel 3: +511 bp bis +667 bp, 2511 bis 2667 in SEQ ID No. 1 und CpG-Insel 4: +836 bp bis +990 bp, 2836 bis 2990 in SEQ ID No. 1) in Lymphoma-(U937)- und Leukämiezelllinien (Jurkat) vollständig methyliert vorliegen. Im Gegensatz dazu sind in DNA-Proben, die von Normalprobanden isoliert wurden, die CpG-Stellen in drei CpG-Inseln (CpG-Insel 1: –356 bp bis –241 bp (1645 bis 1760 in SEQ ID No. 1) vom Beginn des Exons 1, CpG-Insel 2: +37 bp bis +458 bp (2038 bis 2458 in SEQ ID No. 1) und CpG-Insel 3: +511 bp bis +667 bp (2511 bis 2667 in SEQ ID No. 1) im PLA2R1-Gen nahezu vollständig unmethyliert. Die CpG-Stellen in CpG-Insel 4: +836 bp bis +990 bp (2836 bis 2990 in SEQ ID No. 1) hingegen waren auch in Proben gesunder Probanden vollständig methyliert.
In DNA-Proben aus Tumorproben (insbesondere weißen Blutzellen von Hoch-Risiko-Patienten mit MDS und Patienten mit akuten Leukämien) sind die bei Normalprobanden unmethyliert vorliegenden CpG-Stellen im PLA2R1-Gen verstärkt methyliert (insbesondere in der CpG-Insel 1: –356 bp bis –241 bp (1645 bis 1760 in SEQ ID No. 1). Aber auch in der CpG-Insel 2: +37 bp bis +458 bp (2038 bis 2458 in SEQ ID No. 1) und CpG-Insel 3: +511 bp bis +667 bp (2511 bis 2667 in SEQ ID No. 1) sind CpG-Stellen methyliert und unterscheiden sich deutlich von den Proben gesunder Probanden.
Bevorzugte CpG-Stellen, welche in Tumoren, nicht aber in Proben gesunder Probanden methyliert sind, umfassen CpG-Stellen in Positionen 1 und 4-87 (Positionen in SEQ ID No. 1 sind in Tab. 1 dargestellt). Die CpG-Stellen in Positionen 2, 3, 88-108 sind sowohl in Tumoren als auch in Proben gesunder Probanden methyliert. Die Anzahl und Positionen der CpG-Stellen, die in den einzelnen Tumoren methyliert vorliegen, sind unterschiedlich. Häufig sind besonders die Positionen 6-11 (Position in SEQ ID No. 1: 1587-1588, 1590-1591, 1651-1652, 1651-1652, 1660-1661 und 1662-1663) und die Positionen 31-36 (Positionen in SEQ ID No. 1: 2073-2074, 2087-2088, 2089-2090, 2101-2102, 2107-2108 und 2113-2114) in Tumoren, nicht aber in Proben gesunder Probanden methyliert.
Eine stromabwärts in 3'-Richtung liegende CpG-Insel (CpG-Insel 4: +836 bp bis +990 bp (2836 bis 2990 in SEQ ID No. 1) im PLA2R1-Gen war in Proben von Hoch-Risiko-Patienten mit MDS und Patienten mit akuten Leukämien und U937-Leukämiezellen, aber auch in DNA-Proben von Normalprobanden vollständig methyliert.
Die Erfindung betrifft somit die Verwendung methylierter und unmethylierter Sequenzen des PLA2R1-Gens, insbesondere die oben genannten CpG-Inseln und CpG-Stellen (Positionen 1 und 4-87), als Biomarker zur Diagnostik, Prognose und zur Kontrolle des Therapieverlaufs von Tumorerkrankungen.
Zur Detektion der DNA-Methylierung eignen sich unterscheidliche Verfahren:
In einer Variante werden dazu Unterschiede hinsichtlich der Methylierung im PLA2R1-Gen nach CpG-spezifischer Modifikation, bevorzugt durch Bisulfit-Modifizierung genomischer DNA, die aus Körperflüssigkeiten wie z. B. Blut, Urin, Sputum oder aus Gewebeproben isoliert wurde, durch unterschiedliche Verfahren, wie z. B. Sequenzierung, Verwendung methylierungsspezifischer Oligonukleotide, methylierungsspezifischer Restriktasen oder durch Bestimmung von DNA-Schmelzkurven, qualitativ und/oder quantitativ bestimmt. Durch die Bisulfit-Behandlung tritt eine Sequenzänderung aller nicht-methylierter Cytosinbasen ein (Cytosin wird in Uracil umgewandelt), während 5-Methyl-Cytosin-Basen unverändert bleiben. Diese Sequenzänderung ist nur bei nicht methylierter DNA möglich, da die methylierte DNA geschützt ist. Aufgrund dieser chemischen Veränderung entstehen Sequenzen, die sich von der ursprünglichen Sequenz im Bereich der unmethylierten CpG-Stellen unterscheiden. Die modifizierte DNA wird dann bevorzugt mittels PCR amplifiziert. Die bei der PCR verwendeten Primer-Sets sind so kreiert, dass sie methylierte DNA von nicht-methlyierter DNA unterscheiden und nur an modifizierte nicht-methylierte DNA (Uracil statt Cytosin) bzw. nur an nicht-modifizierte methylierte DNA binden. Weiters binden sie an verschiedenen Stellen in der kritischen Region, was zur Entstehung ungleich langer PCR-Produkte führt, die getrennt voneinander detektierbar sind.
Diese Verfahren können die direkte Sequenzierung (z. B. Pyrosequenzierung mit Massenspektronomie) genomischer DNA nach Bisulfit-Modifizierung, aber auch MethyLight (z. B. nach Eads et al 2000 Nucleic Acids Res. 28(8): e32), MS-SnuPE (methylation-sensitive signle nucleotide Primer extension), MSP (methylation-specific PCR), MCA (methylated CpG island amplification), COBRA (combined bisulfite restriction analysis), Real-Time-PCR mit HMR (high melting resolution) und deren Kombinationen einschließen.
Alternativ erfolgt die Detektion der PLA2R1-DNA-Methylierung auch ohne vorherige Bisulfit-Modifizierung mit Hilfe methylierungssensitiver Restriktasen qualitativ und/oder quantitativ z. B. durch quantitative Real-Time-PCR.
Die Detektion der PLA2R1-DNA-Methylierung erfolgt bevorzugt in biologischen Körperflüssigkeiten wie Vollblut (Blutzellen), Serum, Plasma, Urin, Liquor, Sputum oder Gewebeproben insbesondere Tumorbiopsien und/oder histologischen Präparaten. Aus diesen Gewebeproben wird genomische DNA mit bekannten Methoden isoliert.
In einer bevorzugten Variante erfolgt die Detektion der PLA2R1-DNA-Methylierung in einer Probe von Zellen, die kein oder nur wenig PLA₂-R1 exprimieren (nachfolgend PLA₂-R1-negative Zellen). Diese Variante eignet sich insbesondere zum Nachweis von Minimalresterkrankung („minimal residual disease (MRD)”). Die Anreicherung der PLA₂-R1-negativen Zellen erfolgt bevorzugt durch Separation von sPLA₂-R1-positiven und -negativen Zellen durch Bindung an Antikörpern gegen PLA₂-R1. Diese Antikörper sind vorzugsweise an Matrixmaterialien (z. B. magnetische Beads oder Trägermaterialien für Säulenchromatografie u. a.) immobilisiert. Alternativ erfolgt die Separation von sPLA₂-R1-positiven und -negativen Zellen durch Durchflusszytometrie oder Immunpräzipitation mittels Antikörpern gegen sPLA₂-R1.
Zusätzlich zu der qualitativen oder quantitativen Bestimmung der PLA2R1-DNA-Methylierung erfolgt bevorzugt eine Detektion der sPLA2-R1-Expression auf Protein-Ebene (z. B. durch Antikörper gegen sPLA₂-R1) und/oder mRNA-Ebene. Die Detektion der PLA₂-R1-Expression erfolgt beispielsweise durch Durchflusszytometrie, Western-Blotting oder andere immunchemische Verfahren. Bevorzugt werden diese Verfahren zur Bestimmung von sPLA₂-R1-negativen Zellen verwendet, insbesondere zum Nachweis der Minimalresterkrankung („minimal residual disease” (MRD).
Gegenstand der Erfindung sind auch die Verwendung eines entsprechenden Laborkits zur Diagnostik, Prognose und Therapie von Tumorerkrankungen durch Nachweis der PLA2R1-DNA-Methylierung.
Zur Detektion der PLA2R1-DNA-Methylierung enthält das Laborkit mindestens: Bisulfit als Reduktionsmittel, welches Cytosin in Uracil reduziert, und/oder methylierungssensitive DNA-Restriktasen,
sowie einen oder mehrere der folgenden Bestandteile:

– PCR-Primer, Desoxyribonukleosidtriphosphat-Mix, PCR-Puffer und DNA-Polymerase,
– unmethylierte PLA2R1-DNA (Negativkontrolle) und vollständig methylierte PLA2R1-DNA (Positivkontrolle) als Kontroll-DNA, DNA-Leiter,
– Antikörper gegen sPLA₂-R1 (ggf. an Matrixmaterialien immobilisiert),
– Puffer,
– Gebrauchsanleitung und Software zur Auswertung.

Die Primer zur PLA2R1-DNA-Detektierung der Methylierung sind bevorzugt ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID No. 6 bis 26.
Die Erfindung gestattet vorteilhaft den sensitiven und spezifischen Nachweis von malignen Veränderungen bereits auf Zellebene, wozu einzelne wenige veränderte Zellen erforderlich sind. Dadurch wird eine frühzeitige Diagnostik von Tumorerkrankungen möglich. Durch die Erfindung wird somit eine verbesserte Diagnostik und Therapie von Tumorerkrankungen ermöglicht mit dem Ziel, die Mortalitäts- und Morbititätsraten von tumorerkrankten Patienten deutlich zu verringern.
Vorteilhaft können anhand der PLA2R1-DNA-Methylierungen DNA-Proben von Patienten mit Tumorerkrankungen, insbesondere Leukämiepatienten, Hochrisikopatienten mit MDS und Patienten mit AML sowie Patienten mit Prostatatumoren, eindeutig von DNA-Proben unterschieden werden, die von Normalprobanden ohne Erkrankungen stammen.
Darauf aufbauend ermöglicht die Erfindung die Kontrolle der Antitumortherapie, insbesondere wenn Methyltransferase-Hemmstoffe oder andere Subsatnzen, welche die Methylierung des PLA2R1 reduzieren, eingesetzt werden.
Die Erfindung ist dabei nicht auf die Differenzierung von Blutkrebszellen und normalen Blutzellen beschränkt, sondern kann auch bei der Differenzierung von malignen Zellen solider Tumoren, wie z. B. bei Prostatakarzinomen, eingesetzt werden, da auch in soliden Tumoren, insbesondere Prostatatumorzellen im Vergleich zu normalen epithelialen Zellen eine verstärkte Methylierung des PLA2R1-Gen beobachtet wurde.
Die Erfindung wird bevorzugt, insbesondere zur Diagnose, Prognose und Therpaiekontrolle, auf Tumorerkrankungen ausgewählt aus Lymphomen, Leukämien, Neoplasien, Myelomen und Prostatatumoren angewandt, insbesondere akute lymphatische Leukämie (ALL), akute myeloische Leukämie (AML), Hodgkin-Lymphome, myelodysplastische Syndrome (MDS), myeloproliferative Neoplasien, chronische myeloische Leukämien (CML), Multiple Myelome (MM, Plasmozytome), B- und T-Zell-Lymphome (NHL), Chronische Lymphozyten-Leukämien, Polycythaemia vera, primäre Myelofibrosen, Aggressive B- und T-Zell-Lymphome, Indolente (reife) B- und T-Zell-Lymphome, B-CLL, Prolymphozytenleukämie (B-PLL, T-PLL), T-Zell ”Large Granular Lymphocyte”-Leukämien (T-LGL), adulte T-Zell-Leukämien (ATL), Lymphome der Haut, kutane T-Zell-Lymphome, Mycosis fungoides, Sézary-Syndrome, Lymphome des ZNS, Lymphome des GI-Traktes, Magenlymphome, intestinale Lymphome und Prostatatumorerkrankungen, aber auch auf Pankreas-, Hoden-, Mundhöhlen- und Rachentumoren, Speiseröhren-, Kehlkopf, Schilddrüsen-, Magen-, Darm-, Lungen-, Nieren- und ableitende Harnwegs- und Harnblasentumoren, Mamma-, Eierstock-, Gebärmutterhals- und Gebährmutterkörpertumoren, malignes Melanom, Gallenblasentumoren, Astrozytome, Glioblastome und Neuroblastome.
Die Erfindung eignet sich weiter zum Einsatz bei der Entwicklung und Suche von Wirkstoffen zur Prävention und Therapie von Tumorerkrankungen.
Dazu werden in einem Screeningverfahren bevorzugt Tumorzellen oder Tumorzelllinien, in denen PLA2R1-DNA methyliert vorliegt, mit zu testenden Substanzen inkubiert.
Anschließend (z. B. nach 2-6 Tagen) wird die PLA2R1-DNA-Methylierung in den Tumorzellen oder Tumorzelllinien, wie oben beschrieben detektiert, und die PLA2R1-DNA-Methylierung mit und ohne Einwirkung der zu testenden Substanzen verglichen. Der Vergleich erfolgt entweder basierend auf einer mitgeführten Kontrolle (Tumorzellen oder Tumorzelllinien ohne Testsubstanz) oder Vergleichsdaten aus vorherigen Messungen.
Substanzen, welche die PLA2R1-DNA-Methylierung vermindern, eignen sich vorraussichtlich zur Prävention und Therapie von Tumorerkrankungen. Die so ermittelteten Substanzen können vorteilhaft weiter in einem Tiermodell auf ihre Antitumorwirkung und Verträglichkeit getestet werden.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Abbildungen und Ausführungsbeispiele näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein:
: Bestimmung von PLA₂-R1-mRNA-Transkripten mittels RT-PCR in U937-Leukämiezellen. L: Größenstandard; 1, 6: Leerwert; 2, 7: IFN-γ; 3: IL-1β; 5: IL-6; 5: TNF-α; 6: Leerwert; 7: IFN-γ; 8: IL-1β; 9: IL-6; 10: TNF-α.
: Untersuchung des PLA2R1-Promotors und Exon 1 (Nukleotidbereich –2000 bp bis zum Beginn des Exons 1 und +2200 bp nach Beginn des Exons 1) hinsichtlich des Vorkommens von CpG-Stellen mittels MethPrimer-Software; CpG-Inseln in den Nukleotidbereichen –356 bp bis –241 bp, +37 bp bis +458 bp, +511 bp bis +667 bp und +836 bp bis +990 bp.
: Sequenzausschnitt des PLA2R1-Gens (Nukleotidbereich –2000 bp vom Beginn des Exons 1 und +2199 bp nach Beginn des Exons 1. CpG-Stellen in den Nukleotidbereichen –356 bp bis –241 bp, +37 bp bis +458 bp, +511 bp bis +667 bp und +836 bp bis +990 bp) sind durch Fettdruck und Unterstreichung hervorghoben.
Quellen: GenBanks Genome Reference Consortium Human Build 37 (GRCh37), NC_000002.11 und NT_005403.17; Alternate assembly (Celera), AC_000045.1 und NW_921585.1 bzw. Alternate assembly (HuRef), AC_000134.1 und NW_001838860.1. Chromosom: 2; Lokalisation: 2q23-q24; GeneID: 22925; primäre Quelle: HGNC: 9042. Sequenz unter:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=gene&term=%28pla2r1[gene]%29%20AND%20%28Homo%20sapiens[orgn]%29%20AND%20alive[prop]%20NOT%20newentry[gene]&log$= genesensor5&logdbfrom=pubmed&sort=weight und SEQ ID No. 1.
: Verwendung methylierungsspezifischer Restriktasen HinfI und HgaI zum Methylierungsnachweis von CpG-Stellen in den Positionen 9 und 20 des Framentes 1 im PLA2R1-Gen bei Jurkat- und U937-Leukämiezellen und Leukozyten eines Normalprobanden [NP-1] in (A) bzw. eines Patienten [Pat. 21] mit AML und Normalprobanden [NP2 und NP3] in (B).
: Verwendung methylierungsspezifischer Restriktasen AciI, BstUI, BsrBI und BceAI zum Methylierungsnachweis von CpG-Stellen im Fragment 1 des PLA2R1-Gens von Leukozyten eines Normalprobanden (A), U937-Leukämiezellen (B) und eines Patienten mit AML (C).
: Restriktion genomischer DNA mittels methylierungssensitiver Restriktase HgaI und anschließender Amplifikation zur Bestimmung des Methylierungsgrades einer CpG-Stelle im Fragment 1 (Position 9) des PLA2R1-Gens ohne Natriumbisulfit-Modifizierung in U937-Leukämiezellen (Bahnen 2 und 3), Blutleukozyten eines Patienten mit AML, M1 (Patient 21, Bahnen 4 und 5) und eines Normalprobanden (NP1, Bahnen 6 und 7). Bahnen 1 und 8: 100 bp-Ladder, Bahnen 2, 4 und 6 wurden mit HgaI und Bahnen 3, 5, und 7 mit Puffer versetzt. Bahn 9: Leerwert ohne Template.
: Restriktion genomischer DNA mittels methylierungssensitiver Restriktase HgaI und anschließender Amplifikation zur Bestimmung des Methylierungsgrades einer CpG-Stelle im Fragment 1 (Position 9) des PLA2R1-Gens ohne Natriumbisulfit-Modifizierung. (A) Normalprobanden 1-4 (Bahnen 2-9), Patient 1 mit MDS (Bahnen 10, 11). (B) Patient 2 mit MDS (Bahnen 2, 3), Patient 5 mit MDS (Bahnen 4 und 5), Patient 7 mit MDS (Bahnen 6 und 7), Patient 8 mit MDS (Bahnen 8 und 9) und U937-Leukämiezellen (Bahnen 10 und 11). Bahnen 2, 4, 6, 8 und 10 wurden mit HgaI und Bahnen 3, 5, 7, 9 und 11 mit Puffer versetzt. Bahn 1: 100 bp-Ladder, Bahn 12: ohne Template.
: Übersicht über die Methylierungen der CpG-Stellen 1 bis 21 im untersuchten Fragment 1 des PLA2R1-Gens bei U937- und Jurkat-Leukämiezellen, 6 Normalprobanden (NP 1-4, NP 29 und 30) und Patienten mit MDS (Pat. 7 und 8) und AML (Pat. 19, 21-24, 53 und 54).
: Übersicht über die Methylierungen der CpG-Stellen 22 bis 61 in dem untersuchten Fragment 2A des PLA2R1-Gens bei U937-Leukämiezellen, Normalprobanden 1-4 (NP 1-4) und Patienten 21, 22, 53 und 54 mit AML (Pat. 21, Pat. 22, Pat. 53 und Pat. 54).
: Übersicht über die Methylierungen der CpG-Stellen 62 bis 91 in dem untersuchten Fragment 2B des PLA2R1-Gens bei U937-Leukämiezellen, Normalprobanden 1-4 (NP 1-4) und Patienten 21, 22, 53 und 54 mit AML (Pat. 21, Pat. 22, Pat. 53 und Pat. 54).
: Übersicht über die Methylierungen der CpG-Stellen 92 bis 108 in dem untersuchten Fragment 3 des PLA2R1-Gens bei U937-Leukämiezellen, Normalprobanden 1-4 (NP 1-4) und Patienten 21, 22, 53 und 54 mit AML (Pat. 21, Pat. 22, Pat. 53 und Pat. 54).
: Übersicht über die Methylierung von CpG-Stellen 1 bis 21 in der Insel 1 (Fragment 1) des PLA2R1-Gens bei normalen epithelialen Prostatazellen (PrEC), und drei Prostatatumorzelllinien (PC-3, DU-145 und LNCaP).
: Prinzip der Differenzierung zwischen Blut, Urin oder anderen Probenarten von Patienten mit Tumorerkrankungen und von gesunden Probanden.
In den bis steht ein weißes Kästchen jeweils für einen Methylierungsgrad von 0% bis 25%, ein gestricheltes Kästchen für einen Methylierungsgrad von 30% bis 70% und ein schwarzes Kästchen für einen Methylierungsgrad von 75% bis 100%.
Untersuchungen zur Expression von sPLA₂-R1 durch RT-PCR
Nach Isolierung zellulärer RNA aus humanen manozytären Leukämiezellen (U937-Zellen, ATCC CRL-1593.2) mittels TRIAZOL (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany) und reverser Transkription mit Hilfe von GeneAmp RNA-PCR Kits (PerkinElmer LAS GmbH, Jügesheim, Germany) wurden die cDNA von sPLA₂-R1 unter Verwendung entsprechender Primer (Tab. 1) amplifiziert und semi-quantitativ bestimmt. Als Kontrolle diente die Bestimmung der Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase(GAPDH)-spezifischen mRNA. Die Oligonukleotide wurden in einer Endkonzentration von 0.8 μM eingesetzt. Die PCR-Amplifikation wurde wie folgt durchgeführt: 40 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 68°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute. Die eingesetzten Puffer und Reagenzien stammten vom GeneAmp Kit (PerkinElmer LAS GmbH). Die amplifizierten Produkte wurden in der Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Dabei waren 1) die basale Expression, 2) die Expressionen in Abhängigkeit von der Inkubation mit proinflammatorischen Cytokinen (IL-1β, IL-6, TNF-α und IFN-γ) und 3) die Expressionen nach gleichzeitiger Hemmung der DNA-Methylierung mit 5-Aza-2'-desoxycytidin (5-Aza-dC) von Interesse ( ). Tabelle 1: Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide zum Nachweis von sPLA2-R1-mRNA
Nachweis von 5'-CpG-Stellen im PLA2R1-Gen
Mit Hilfe von MethPrimer-Software konnten im PLA2R1-Gen im Nukleotidbereich –2000 bp vom Exon 1 und +2199 bp nach Beginn des Exons 1 vier 5'-CpG-Inseln identifiziert werden ( ; Chromosom 2, Lokalisation: 2q23-q24; GeneID: 22925; primäre Quelle: HGNC: 9042; Sequenz ENSG00000153246 ENSEMBL-Datenbank (http://www.ensembl.org/). Das Exon 1 selbst ist 315 bp lang. In 5'-Richtung stromaufwärts enthält das PLA2R1-Gen eine 5'-CpG-Insel: –356 bp bis –241 bp vom Beginn des Exons 1 und drei weitere 5'-CpG-Inseln in den Nukleotidbereichen +37 bp bis +458 bp, +511 bp bis +667 bp und +836 bp bis +990 bp.
Untersuchungen zur DNA-Methylierung von 5'-CpG-Stellen im PLA2R1-Gen durch Sequenzierung
Nach Isolierung genomischer DNA aus U937- und humanen lymphozytären Jurkat-Leukämie-Zelllinien, normalen epithelialen Prostatazellen und Prostatatumorzelllinien (PC-3, DU-145 und LNCaP) sowie aus Leukozyten von Normalprobanden und Patienten mit Myelodysplastischem Syndrom (MDS) und akuter myeloischer Leukämie (AML) mit Hilfe des QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, DE) wurde die DNA nach Frommer et al. [59] mittels EpiTect Bisulfit Kit (Qiagen) modifiziert und anschließend gereinigt.
Um die 5'-aufwärts gelegene Promotorregion des PLA2R1-Gens im Nukleotidbereich –662 bp bis zum Exon 1 und stromabwärts bis +1275 bp das PLA2R1-Gen zu sequenzieren, wurden 4 Fragmente in einer nested PCR amplifiziert. Dazu kamen folgende Oligonukleotid-Primerpaare zum Einsatz: Fragment 1 (–662 bp bis –86 bp): extrinsische Primer:
und intrinsische Primer:
Fragment 2 (–105 bp bis +783 bp): extrinsische Primer:
intrinsische Primer:
Anstelle des gesamten Fragmentes 2 wurden z. T. auch Teilfragmente amplifizert, wozu folgende Primer-Paare verwendet wurden: extrinsische Primer:
Fragment 2A: intrinsische Primer:
Fragment 2B: intrinsische Primer:
Fragment 3 (+824 bp bis +1275 bp): semi-nested-PCR: extrinsische Primer:
iritrinsische Primer:
Die Oligonukleotide wurden in einer Endkonzentration von 0,8 μM eingesetzt. Die Bedingungen für die PCR waren folgende: 20 Zyklen bei 95°C für 45 Sekunden, 44°C für 60 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden unter Verwendung der extrinsischen Primer und 35 Zyklen bei 95°C für 30 Sekunden, 45°C für 45 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden unter Verwendung der intrinsischen Primer. Die Puffer und Reagentien stammten vom GeneAmp Kit (PerkinElmer LAS GmbH). Die PCR-Produkte wurden schließlich mittels QIAquick PCR-Reinigungskit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) gereinigt.
Nach Markierung der PCR-Produkte mittels BigDye Terminator Sequencing Standard Version 3.1 (Qiagen) wurden die DNA-Sequenzen der PCR-Produkte am ABT 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) analysiert.
Untersuchungen zur DNA-Methylierung von 5'-CpG-Stellen im PLA2R1-Gen durch methylierungsspezifische Restriktasen
Alternativ zur direkten Sequenzierung wurden PCR-Produkte nach Modifizierung genomischer DNA durch Natriumbisulfit-Behandlung mit Restriktasen inkubiert.
Als Beispiel wurde das Fragment 1, das die 5'-CpG-Insel 1 des PLA2R1-Gens umfasst, mit methylierungssensitiven Restriktasen wie HinfI und HgaI inkubiert und anschließend in der Agarosegelelektrophorese analysiert. Mit Hilfe dieser Methode konnten die Methylierungen der 5'-CpG-Stellen in Positionen 9 und 20 im Fragment 1 bestimmt werden ( ). Ferner wurden die methylierungssensitiven Restriktasen AciI, BstUI, BsrBI und BceAI zur Bestimmung der Methylierung weiterer 5'-CpG-Stellen im PLA2R1-Gen bestimmt ( ). Durch diese Untersuchungen konnten die Ergebnisse, die durch Sequenzierung erhalten wurden, bestätigt werden.
Untersuchungen zur DNA-Methylierung von 5'-CpG-Stellen im PLA2R1-Gen ohne Natriumbisulfit-Behandlung genomischer DNA
Um eine Natriumbisulfit-Modifizierung genomischer DNA zu umgehen, wurden DNA-Proben direkt mit methylierungssensitiven Restriktasen behandelt und anschließend durch PCR-Amplifikation und Analyse im Agarosegel untersucht.
Als Beispiel wurden genomische DNA von U937-Leukämiezellen und Leukozyten von Normalprobanden bzw. Patienten mit MDS bzw. AML mit der methylierungssensitiven Restriktase HgaI inkubiert und anschließend durch nested PCR amplifiiert. Folgende Oligonukleotide wurden dafür eingesetzt: extrinsische Primer:
intrinsische Primer:
Mittels dieser Untersuchungen konnte die Methylierung der 5'-CpG-Stelle Nr. 9 im Fragment 1 bestimmt ( und ) und die Daten, die durch Sequenzierung erhalten wurden, bestätigt werden.
Die Ergbnisse werden wie folgt zusammengefasst:

(1) Überraschend wurde in U937-Zellen eine epigenetische Stilllegung (epigenetic silencing) des PLA2R1-Gens festgestellt ( ).
(2) Anschließende Untersuchungen zeigten, dass vier 5'-CpG-Inseln in unmittelbarer Nähe des Exons 1 im PLA2R1-Gen existieren ( ). Diese vier 5'-CpG-Inseln liegen in U937-Leukämiezellen vollständig methyliert vor ( - ).
(3) Im Gegensatz dazu waren in DNA-Proben, die aus weißen Blutzellen von Normalprobanden isoliert wurden, drei 5'-CpG-Inseln im PLA2R1-Gen nahezu vollständig unmethyliert ( - ).
(4) Untersuchungen von DNA-Proben aus weißen Blutzellen von Hoch-Risiko-Patienten mit MDS und Patienten mit akuten Leukämien zeigten, dass die bei Normalprobanden unmethyliert vorliegenden 5'-CpG-Inseln im PLA2R1-Gen verstärkt methyliert waren und sich deutlich von den Proben gesunder Probanden unterschieden ( - ).
(5) Eine stromabwärts in 3'-Richtung liegende 5'-CpG-Insel im PLA2R1-Gen war in Proben von Hoch-Risiko-Patienten mit MDS und Patienten mit akuten Leukämien und U937-Leukämiezellen, aber auch in DNA-Proben von Normalprobanden vollständig methyliert ( ).
(6) Beispiele für diese Verfahren basierend auf der Verwendung methylierungsspezifischer Restriktasen nach Natriumbisulfit-Modifizierung genomischer DNA-Proben zur Bestimmung des Methylierungsgrades von 5'-CpG-Stellen im PLA2R1-Gen sind in und dargestellt.
(7) Ein Beispiel für diese Verfahren zur Bestimmung der Methylierung von 5'-CpG-Stellen im PLA2R1-Gen, die keine Natriumbisulfit-Modifizierung genomischer DNA erfordern und damit besonders für die Untersuchung geringer DNA-Probemengen, z. B. aus Paraffinschnitten, geeignet sind und den Einsatz methylierungssensitiver Restriktasen vorsehen, ist in und dargestellt.
(8) Auch in Prostatatumorzelllinien (PC-3-, DU-145- und LNCaP-Zellen) wurde im Vergleich zu normalen epithelialen Prostatazellen (PrEC) eine deutliche erhöhte PLA2R1-DNA-Methylierung festgestellt ( ). Die Erfindung ist damit auch auf solide Tumore anwendbar.

In der Patentbeschreibung wird folgende Nichtpatentliteratur zitiert:
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SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Diagnose, Prognose und Therapiekontrolle von Tumorerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, dass der Methylierungsgrad des Phospholipase A2 Rezeptor-1-Gens in einer isolierten Patientenprobe bestimmt wird, der bestimmte Methylierungsgrad mit dem Referenz-Methylierungsgrad des Phospholipase A2 Rezeptor-1-Gens in einer Referenzprobe eines gesunden Probanden oder mit entsprechenden Referenzdaten verglichen wird, wobei ein gegenüber dem Referenz-Methylierungsgrad erhöhter Methylierungsgrad mit dem Vorliegen einer Tumorerkrankung korreliert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Tumorerkrankung ausgewählt ist aus Lymphomen, Leukämien oder soliden Tumoren.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des Methylierungsgrades des Phospholipase A2 Rezeptor-1-Gens in einer Probe erfolgt, in der zuvor Zellen angereichert wurden, die kein oder nur wenig Phospholipase A2 Rezeptor-1 exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 3 zum Nachweis einer Minimalresterkrankung.
Verwendung von methylierten Nukleinsäuren mit Sequenzen des Phospholipase A2 Rezeptor-1-Gens als Tumormarker für die Diagnostik, Prognose und Therapiekontrolle von Tumorerkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 5 zum Nachweis einer Minimalresterkrankung.
Verwendung eines Kit enthaltend: – Bisulfit und/oder methylierungssensitive Restriktasen, sowie einen oder mehrere der folgenden Bestandteile: – PCR-Primer, Desoxyribonukleosidtriphosphat-Mix, PCR-Puffer und DNA-Polymerase, – unmethylierte Phospholipase A2 Rezeptor-1-DNA und methylierte Phospholipase A2 Rezeptor-1-DNA als Kontroll-DNA, – Antikörper gegen den Phospholipase A2 Rezeptor-1, – Puffer, – Gebrauchsanleitung und Software zur Auswertung. für die Diagnostik, Prognose und Therapiekontrolle von Tumorerkrankungen durch Nachweis der Phospholipase A2 Rezeptor-1-DNA-Methylierung.
Screeningverfahren zur Ermittlung von Wirkstoffen zur Prävention und Therapie von Tumorerkrankungen, mit den Schritten: a.) Inkubation von Tumorzellen oder Tumorzelllinien, in denen Phospholipase A2 Rezeptor-1-DNA methyliert vorliegt, mit einer Testsubstanz, und anschließende b.) Detektion der Phospholipase A2 Rezeptor-1-DNA-Methylierung in den Tumorzellen oder Tumorzelllinien, wobei Substanzen, welche die Phospholipase A2 Rezeptor-1-DNA-Methylierung vermindern, sich vorraussichtlich zur Prävention und Therapie von Tumorerkrankungen eignen.