DE102009022895A1

DE102009022895A1 - Substituierte Piperidine

Info

Publication number: DE102009022895A1
Application number: DE102009022895A
Authority: DE
Inventors: Dirk Dr. Heimbach; Susanne Dr. Röhrig; Yolanda Dr. Cancho Grande; Ulrich Dr. Rester; Eckhard Dr. Bender; Katja Dr. Zimmermann; Dmitry Dr. Zubov; Anja Dr. Buchmüller; Georges Dr. Degenfeld; Christoph Dr. Gerdes; Mark Jean Dr. Gnoth; Kersten Matthias Dr. Gericke; Mario Dr. Jeske
Original assignee: Bayer Schering Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2009-05-27
Filing date: 2009-05-27
Publication date: 2010-12-02
Also published as: WO2010136137A1; EP2435405A1; US20120142690A1; CA2763381A1

Abstract

Die Erfindung betrifft neue substituierte Piperidine, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und von Tumorerkrankungen.

Description

Die Erfindung betrifft neue substituierte Piperidine, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und von Tumorerkrankungen.
Thrombozyten (Blutplättchen) sind ein wesentlicher Faktor sowohl in der physiologischen Blutstillung (Hämostase) als auch bei thromboembolischen Erkrankungen. Insbesondere im arteriellen System kommt Thrombozyten eine zentrale Bedeutung in der komplexen Interaktion zwischen Blutkomponenten und Gefäßwand zu. Unerwünschte Thrombozytenaktivierung kann durch Bildung plättchenreicher Thromben zu thromboembolischen Erkrankungen und thrombotischen Komplikationen mit lebensbedrohlichen Zuständen führen.
Einer der potentesten Plättchenaktivatoren ist die Blutgerinnungsprotease Thrombin, die an verletzten Blutgefäßwänden gebildet wird und neben der Fibrinbildung zur Aktivierung von Thrombozyten, Endothelzellen und mesenchymalen Zellen führt (Vu TKH, Hung DT, Wheaton VI, Coughlin SR, Cell 1991, 64, 1057–1068). An Thrombozyten in vitro und in Tiermodellen hemmen Thrombin-Inhibitoren die Plättchenaggregation bzw. die Bildung plättchenreicher Thromben. Beim Menschen können arterielle Thrombosen erfolgreich mit Inhibitoren der Thrombozytenfunktion sowie Thrombin-Inhibitoren verhindert oder behandelt werden (Bhatt DL, Topol EJ, Nat. Rev. Drug Discov. 2003, 2, 15–28). Deshalb besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass Antagonisten der Thrombinwirkung auf Blutplättchen die Bildung von Thromben und das Auftreten von klinischen Folgen wie Herzinfarkt und Schlaganfall vermindern. Weitere zelluläre Thrombinwirkungen, z. B. auf Gefäßendothel- und -glattmuskelzellen, Leukozyten und Fibroblasten, sind möglicherweise für entzündliche und proliferative Erkrankungen verantwortlich.
Die zellulären Effekte von Thrombin werden zumindest teilweise über eine Familie G-Proteingekoppelter Rezeptoren (Protease Activated Receptors, PARs) vermittelt, deren Prototyp der PAR-1-Rezeptor darstellt. PAR-1 wird durch Bindung von Thrombin und proteolytische Spaltung seines extrazellulär liegenden N-Terminus aktiviert. Durch die Proteolyse wird ein neuer N-Terminus mit der Aminosäurensequenz SFLLRN... freigelegt, der als Agonist („Tethered Ligand”) zur intramolekularen Rezeptoraktivierung und Übertragung intrazellulärer Signale führt. Von der Tethered-Ligand Sequenz abgeleitete Peptide können als Agonisten des Rezeptors eingesetzt werden und führen auf Thrombozyten zur Aktivierung und Aggregation. Andere Proteasen sind ebenfalls in der Lage, PAR-1 zu aktivieren, hierunter z. B. Plasmin, Faktor VIIa, Faktor Xa, Trypsin, aktiviertes Protein C (aPC), Tryptase, Cathepsin G, Proteinase 3, Granzyme A, Elastase und Matrixmetalloprotease 1 (MMP-1).
Im Gegensatz zur Inhibition der Proteaseaktivität von Thrombin mit direkten Thrombin-Inhibitoren sollte eine Blockade des PAR-1 zur Hemmung der Thrombozytenaktivierung ohne Verminderung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes (Antikoagulation) führen.
Antikörper und andere selektive PAR-1-Antagonisten hemmen die Thrombin-induzierte Aggregation von Thrombozyten in vitro bei niedrigen bis mittleren Thrombinkonzentrationen (Kahn ML, Nakanishi-Matsui M, Shapiro MJ, Ishihara H, Coughlin SR, J. Clin. Innest. 1999, 103, 879–887). Ein weiterer Thrombinrezeptor mit möglicher Bedeutung für die Pathophysiologie thrombotischer Prozesse, PAR-4, wurde auf humanen und tierischen Thrombozyten identifiziert. In experimentellen Thrombosen an Tieren mit einem dem Menschen vergleichbaren PAR-Expressionsmuster reduzieren PAR-1-Antagonisten die Bildung plättchenreicher Thromben (Derian CK, Damiano BP, Addo MF, Darrow AL, D'Andrea MR, Nedelman M, Zhang H-C, Maryanoff BE, Andrade-Gordon P. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 304, 855–861).
In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Substanzen auf ihre plättchenfunktionshemmende Wirkung geprüft, in der Praxis haben sich aber nur wenige Plättchenfunktionshemmer bewährt. Es besteht daher ein Bedarf an Pharmazeutika, die spezifisch eine gesteigerte Plättchenreaktion hemmen ohne das Blutungsrisiko erheblich zu erhöhen und damit das Risiko von thromboembolischen Komplikationen vermindern.
Effekte von Thrombin, die über den Rezeptor PAR-1 vermittelt werden, haben Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf während und nach operativer koronarer Bypassanlage (CABG) sowie anderer Operationen und insbesondere Operationen mit extrakorporalem Kreislauf (z. B. Herz-Lungenmaschine). Im Verlauf der Operation kann es aufgrund der prä- oder intraoperativen Medikation mit gerinnungshemmenden und/oder plättchenhemmenden Substanzen zu Blutungskomplikationen kommen. Aus diesem Grunde muss beispielsweise eine Medikation mit Clopidogrel mehrere Tage vor einer CABG pausiert werden. Außerdem kann es wie erwähnt (z. B. aufgrund des ausgedehnten Kontaktes zwischen Blut und künstlichen Oberflächen bei Einsatz einer extrakorporalen Zirkulation oder bei Bluttransfusionen) zur Ausbildung einer disseminierten intravaskulären Gerinnung oder Verbrauchskoagulopathie (DIC) kommen, die sekundär zu Blutungskomplikationen führen kann. Im weiteren Verlauf kommt es häufig zur Restenose der angelegten venösen oder arteriellen Bypässe (bis hin zum Verschluß) aufgrund von Thrombose, Intimafibrose, Arteriosklerose, Angina pectoris, Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz, Arrhythmien, transitorische ischämische Attacke (TIA) und/oder Schlaganfall.
Der Rezeptor PAR-1 wird im Menschen auch auf anderen Zellen exprimiert, hierunter z. B. Endothelzellen, glatte Gefäßmuskelzellen und Tumorzellen. Bösartige Tumorerkrankungen (Krebs) haben eine hohe Inzidenz und sind im Allgemeinen mit einer hohen Sterblichkeit verbunden. Gegenwärtige Therapien erreichen nur in einem Bruchteil der Patienten eine Vollremission und sind typischerweise mit schweren Nebenwirkungen verbunden. Daher besteht ein hoher Bedarf an effektiveren und sichereren Therapien. Der PAR-1-Rezeptor trägt zur Entstehung, dem Wachstum, der Invasivität und der Metastasierung von Krebs bei. Außerdem vermittelt auf Endothelzellen exprimiertes PAR-1 Signale, die in Gefäßwachstum münden („Angiogenese”), ein Vorgang, der zur Ermöglichung von Tumorwachstum über ca. 1 mm³ hinaus unerläßlich ist. Angiogenese trägt auch zur Enstehung oder Verschlimmerung anderer Erkrankungen bei, hierunter z. B. hämatopoetische Krebserkrankungen, die zur Erblindung führende Makuladegeneration und diabetische Retinopathie, entzündliche Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis und Colitis.
Sepsis (oder Septikämie) ist eine häufige Erkrankung mit hoher Letalität. Anfängliche Symptome der Sepsis sind typischerweise unspezifisch (z. B. Fieber, reduziertes Allgemeinbefinden), im weiteren Verlauf kann es jedoch zur generalisierten Aktivierung des Gerinnungssystems kommen (”Disseminated Intravascular coagulation^„ oder ”Verbrauchskoagulopathie” (DIC)) mit Mikrothrombosierung in verschiedenen Organen und sekundärer Blutungskomplikationen. DIC kann auch unabhängig von einer Sepsis auftreten, z. B. im Rahmen von Operationen oder bei Tumorerkrankungen.
Die Therapie der Sepsis besteht einerseits in der konsequenten Beseitigung der infektiösen Ursache, z. B. durch operative Herdsanierung und Antibinse. Andererseits besteht sie in der temporären intensivmedizinischen Unterstützung der beeinträchtigten Organsysteme. Therapien der verschiedenen Stadien dieser Erkrankung sind z. B. in folgender Publikation beschrieben (Dellinger et al., Crit. Care Med. 2004, 32, 858–873). Für die DIC existieren keine erwiesenermaßen effektive Therapien.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue PAR-1-Antagonisten zur Behandlung von Erkrankungen, wie z. B. Herz-Kreislauf-Erkrankungen und thromboembolischen Erkrankungen, sowie Tumorerkrankungen bei Menschen und Tieren zur Verfügung zu stellen.
WO 2006/012226 , WO 2007/130898 und WO 2007/101270 beschreiben strukturell ähnliche Piperidine als 11-β HSD1 Inhibitoren zur Behandlung von unter anderem Diabetes, thromboembolischen Erkrankungen und Schlaganfall.
Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel
in welcher
R¹ für Phenyl steht,
wobei Phenyl substituiert sein kann mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Monofluormethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl, Monofluormethoxy, Difluormethoxy, Trifluormethoxy, Monofluormethylsulfanyl, Difluormethylsulfanyl, Trifluormethylsulfanyl, Methylsulfonyl, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy und C₁-C₄-Alkoxycarbonyl,
R² für Phenyl, Naphtyl oder 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl steht,
wobei Phenyl, Naphtyl und Heteroaryl substituiert sein können mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Hydroxy, Amino, Monofluormethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl, Monofluormethoxy, Difluormethoxy, Trifluormethoxy, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, C₁-C₆-Alkylamino, Phenyl und 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl,
worin Phenyl und Heteroaryl substituiert sein können mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Hydroxy, Amino, Monofluormethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl, Monofluormethoxy, Difluormethoxy, Trifluormethoxy, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy und C₁-C₆-Alkylamino,
R³ für C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Alkoxy, C₁-C₆-Alkylamino, C₃-C₇-Cycloalkyl, 4- bis 7-gliedriges Heterocyclyl, Phenyl, 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, C₃-C₇-Cycloalkyloxy, C₃-C₇-Cycloalkylamino, 4- bis 7-gliedriges Heterocyclylamino, Phenylamino oder 5- oder 6-gliedriges Heteroarylamino steht,
wobei Alkyl, C₂-C₆-Alkoxy und Alkylamino substituiert sein können mit einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, C₁-C₄-Alkoxy, C₁-C₄-Alkoxycarbonyl, C₃-C₇-Cycloalkyl, 4- bis 6-gliedriges Heterocyclyl, Phenyl und 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl,
und
wobei Cycloalkyl, Heterocyclyl, Phenyl, Heteroaryl, Cycloalkyloxy, Cycloalkylamino, Heterocyclylamino, Phenylamino und Heteroarylamino substituiert sein können mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Oxo, Hydroxy, Amino, Monofluormethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl, Monofluormethoxy, Difluormethoxy, Trifluormethoxy, Monofluormethylsulfanyl, Difluormethylsulfanyl, Trifluormethylsulfanyl, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, C₁-C₆-Alkylamino, C₁-C₄-Alkoxycarbonyl, C₁-C₄-Alkylaminocarbonyl und Cyclopropyl,
worin Alkyl substituiert sein kann mit einem Substituenten Hydroxy,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze; die von Formel (I) umfassten Verbindungen der nachfolgend genannten Formeln und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze sowie die von Formel (I) umfassten, nachfolgend als Ausführungsbeispiele genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate der Salze handelt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung umfasst deshalb die Enantiomeren oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren.
Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegenden Erfindung sämtliche tautomere Formen.
Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind aber auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind aber beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z. B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethan sulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z. B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z. B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin, N-Methylpiperidin und Cholin.
Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen. Der Begriff ”Prodrugs” umfasst Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper zu erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden (beispielsweise metabolisch oder hydrolytisch).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:

Alkyl per se und ”Alk” und ”Alkyl” in Alkoxy, Alkylamino, Alkoxycarbonyl und Alkylaminocarbonyl stehen für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl.
Alkoxy steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, iso-Propoxy, n-Butoxy, tert-Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy.
Alkylamino steht für einen Alkylaminorest mit einem oder zwei (unabhängig voneinander gewählten) Alkylsubstituenten, beispielhaft und vorzugsweise für Methylamino, Ethylamino, n-Propylamino, iso-Propylamino, tert-Butylamino, N,N-Dimethylamino, N,N-Diethylamino, N-Ethyl-N-methylamino, N-Methyl-N-n-propylamino, N-iso-Propyl-N-n-propylamino und N-tert-Butyl-N-methylamino. C₁-C₄-Alkylamino steht beispielsweise für einen Monoalkylaminorest mit 1 bis 4 Koh lenstoffatomen oder für einen Dialkylaminorest mit jeweils 1 bis 4 Kohlenstoffatomen pro Alkylsubstituent.
Alkoxycarbonyl steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, n-Propoxycarbonyl, iso-Propoxycarbonyl, n-Butoxycarbonyl und tert-Butoxycarbonyl.
Alkylaminocarbonyl steht für einen Alkylaminocarbonylrest mit einem oder zwei (unabhängig voneinander gewählten) Alkylsubstituenten, beispielhaft und vorzugsweise für Methylaminocarbonyl, Ethylaminocarbonyl, n-Propylaminocarbonyl, iso-Propylaminocarbonyl, tert-Butylaminocarbonyl, N,N-Dimethylaminocarbonyl, N,N-Diethylaminocarbonyl, N-Ethyl-N-methylaminocarbonyl, N-Methyl-N-n-propylaminocarbonyl, N-iso-Propyl-N-n-propylaminocarbonyl und N-tert-Butyl-N-methylaminocarbonyl. C₁-C₄-Alkylaminocarbonyl steht beispielsweise für einen Monoalkylaminocarbonylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder für einen Dialkylaminocarbonylrest mit jeweils 1 bis 4 Kohlenstoffatomen pro Alkylsubstituent.
Cycloalkyl steht für eine monocyclische Cycloalkylgruppe mit in der Regel 3 bis 7, bevorzugt 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Cycloalkyl seien genannt Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cycloheptyl.
Cycloalkyloxy steht für eine monocyclische Cycloalkyloxygruppe mit in der Regel 3 bis 7, bevorzugt 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Cycloalkyloxy seien genannt Cyclopropyloxy, Cyclobutyloxy, Cyclopentyloxy und Cyclohexyloxy.
Cycloalkylamino steht für eine monocyclische Cycloalkylaminogruppe mit in der Regel 3 bis 7, bevorzugt 3 oder 4 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Cycloalkylamino seien genannt Cyclopropylamino, Cyclobutylamino, Cyclopentylamino und Cyclohexylamino.
Heterocyclyl steht für einen monocyclischen oder bicyclischen, heterocyclischen Rest mit 4 bis 7 Ringatomen und bis zu 3, vorzugsweise bis zu 2 Heteroatomen und/oder Heterogruppen aus der Reihe N, O, S, SO, SO₂, wobei ein Stickstoffatom auch ein N-Oxid bilden kann. Die Heterocyclyl-Reste können gesättigt oder teilweise ungesättigt sein. Bevorzugt sind 5- oder 6-gliedrige, monocyclische gesättigte Heterocyclylreste mit bis zu zwei Heteroatomen aus der Reihe O, N und S, beispielhaft und vorzugsweise für Oxetanyl, Azetidinyl, Pyrrolidin-2-yl, Pyrrolidin-3-yl, Pyrrolinyl, Tetrahydrofuranyl, Tetrahydrothienyl, Pyranyl, Piperidin-1-yl, Piperidin-2-yl, Piperidin-3-yl, Piperidin-4-yl, 1,2,5,6-Tetrahydropyridin-3-yl, 1,2,5,6-Tetrahydropyridin-4-yl, Thiopyranyl, Morpholin-1-yl, Morpholin-2-yl, Morpholin-3-yl, Piperazin-1-yl, Piperazin-2-yl.
Heterocyclylamino steht für einen monocyclischen oder bicyclischen, heterocyclischen Heterocyclylamino-Rest mit 4 bis 7 Ringatomen und bis zu 3, vorzugsweise bis zu 2 Heteroatomen und/oder Heterogruppen aus der Reihe N, O, S, SO, SO₂, wobei ein Stickstoffatom auch ein N-Oxid bilden kann. Die Heterocyclyl-Reste können gesättigt oder teilweise ungesättigt sein. Bevorzugt sind 5- oder 6-gliedrige, monocyclische gesättigte Heterocyclylreste mit bis zu zwei Heteroatomen aus der Reihe O, N und S, beispielhaft und vorzugsweise für Oxetanylamino, Azetidinylamino, Pyrrolidin-2-yl-amino, Pyrrolidin-3-yl-amino, Tetrahydrofuranylamino, Tetrahydrothienylamino, Pyranylamino, Piperidin-2-yl-amino, Piperidin-3-yl-amino, Piperidin-4-yl-amino, 1,2,5,6-Tetrahydropyridin-3-yl-amino, 1,2,5,6-Tetrahydropyridin-4-yl-amino, Thiopyranylamino, Morpholin-2-yl-amino, Morpholin-3-yl-amino, Piperazin-2-yl-amino.
Heteroaryl steht für einen aromatischen, mono- oder bicyclischen Rest mit 5 bis 10 Ringatomen und bis zu 5 Heteroatomen aus der Reihe S, O und N, wobei ein Stickstoffatom auch ein N-Oxid bilden kann. Bevorzugt sind Heteroaryle mit 5 oder 6 Ringatomen und bis zu 4 Heteroatomen, beispielhaft und vorzugsweise seinen genannt Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Oxadiazolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Triazolyl, Pyridyl, Pyrimidyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl, Indolyl, Indazolyl, Benzofuranyl, Benzothiophenyl, Chinolinyl, Isochinolinyl.
Heteroarylamino steht für einen aromatischen, monocyclischen Heteroarylamino-Rest mit in der Regel 5 oder 6 Ringatomen und bis zu 4 Heteroatomen aus der Reihe S, O und N, wobei ein Stickstoffatom auch ein N-Oxid bilden kann, beispielhaft und vorzugsweise für Thienylamino, Furylamino, Pyrrolylamino, Thiazolylamino, Oxazolylamino, Isoxazolylamino, Oxadiazolylamino, Pyrazolylamino, Imidazolylamino, Pyridylamino, Pyrimidylamino, Pyridazinylamino, Pyrazinylamino.
Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom und Jod, vorzugsweise für Fluor und Chlor.

In den Verbindungen der Formel (I) bedeutet die geschlängelte Linie zu R², dass R² sowohl in cis- als auch in trans-Position zum Piperidinring an die Doppelbindung gebunden sein kann.
Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), in welcher
R¹ für Phenyl steht,
wobei Phenyl substituiert ist mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trifluormethyl, Trifluormethoxy, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy und C₁-C₄-Alkoxycarbonyl,
R² für Phenyl, Pyridyl oder Chinolinyl steht,
wobei Phenyl, Pyridyl und Chinolinyl substituiert sein können mit 1 bis 2 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, Phenyl und Pyridyl,
worin Phenyl und Pyridyl substituiert sein können mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, C₁-C₄-Alkyl und C₁-C₄-Alkoxy,
R³ für C₃-C₇-Cycloalkyl, 4- bis 7-gliedriges Heterocyclyl, Phenyl, 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, C₃-C₇-Cycloalkyloxy, C₃-C₇-Cycloalkylamino, 4- bis 7-gliedriges Heterocyclylamino, Phenylamino oder 5- oder 6-gliedriges Heteroarylamino steht,
wobei Cycloalkyl, Heterocyclyl, Phenyl, Heteroaryl, Cycloalkyloxy, Cycloalkylamino, Heterocyclylamino, Phenylamino und Heteroarylamino substituiert sein können mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Oxo, Hydroxy, Amino, Trifluormethyl, Difluormethoxy, Trifluormethoxy, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy, Dimethylamino, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Dimethylaminocarbonyl und Cyclopropyl,
worin Methyl und Ethyl substituiert sein können mit einem Substituenten Hydroxy,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
R¹ für Phenyl steht,
wobei Phenyl substituiert ist mit 1 bis 2 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Methyl, Ethyl und Methoxy,
R² für Phenyl, Pyridyl oder Chinolinyl steht,
wobei Phenyl, Pyridyl und Chinolinyl substituiert sein können mit einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy, Phenyl und Pyridyl,
worin Phenyl und Pyridyl substituiert sein können mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Methyl, Ethyl, Methoxy und Ethoxy,
R³ für Morpholin-4-yl, 1,1-Dioxidothiomorpholin-4-yl, 3-Hydroxyazetidiny-1-yl, 3-Hydroxypyrrolidin-1-yl, 4-Cyanopiperidin-1-yl oder 4-Hydroxypiperidin-1-yl steht,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
R¹ für Phenyl steht,
wobei Phenyl substituiert ist mit einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trifluormethyl und Ethyl,
R² für Phenyl, Pyridyl oder Chinolinyl steht,
wobei Phenyl und Pyridyl substituiert sein können mit einem Substituenten Phenyl,
worin Phenyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Trifluormethyl und Methoxy,
und
wobei Chinolinyl substituiert ist mit einem Substituenten Methoxy,
R³ für Morpholin-4-yl steht,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher die Substituenten -R¹ und -CH=CH-R² in cis-Position zueinander stehen.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher der Piperidinring und der Substituent -R² an der Doppelbindung in trans-Position zueinander stehen.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R¹ für Phenyl steht, wobei Phenyl substituiert ist mit einem Substituenten in para-Position zur Verknüpfungsstelle an den Piperidinring, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trifluormethyl, Trifluormethoxy und Ethyl.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R¹ für Phenyl steht, wobei Phenyl substituiert ist mit einem Substituenten in para-Position zur Verknüpfungsstelle an den Piperidinring, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trifluormethyl und Ethyl.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
R² für Phenyl, Pyridyl oder Chinolinyl steht,
wobei Phenyl und Pyridyl substituiert sein können mit einem Substituenten Phenyl,
worin Phenyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Trifluormethyl und Methoxy,
und
wobei Chinolinyl substituiert ist mit einem Substituenten Methoxy.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R² für 5-[3-(Trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl steht.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R³ für Morpholin-4-yl, 1,1-Dioxidothiomorpholin-4-yl, 3-Hydroxyazetidiny-1-yl, 3-Hydroxypyrrolidin-1-yl, 4-Cyanopiperidin-1-yl oder 4-Hydroxypiperidin-1-yl steht.
Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R³ für Morpholin-4-yl steht.
Die in den jeweiligen Kombinationen bzw. bevorzugten Kombinationen von Resten im einzelnen angegebenen Reste-Definitionen werden unabhängig von den jeweiligen angegebenen Kombinationen der Reste beliebig auch durch Reste-Definitionen anderer Kombinationen ersetzt.
Ganz besonders bevorzugt sind Kombinationen von zwei oder mehreren der oben genannten Vorzugsbereiche.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I), oder ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze, wobei Verbindungen der Formel
in welcher
R¹ und R³ die oben angegebene Bedeutung aufweisen,
mit Verbindungen der Formel
in welcher
R² die oben angegebene Bedeutung aufweist, und
Y für -P(=O)(OCH₂CH₃)₂ oder -P⁺(Phenyl)₃X^– steht,
wobei
X^– für eine Halogenid, bevorzugt Bromid oder Chlorid, steht,
umgesetzt werden.
Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von –10°C bis 40°C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Diethylether, Dioxan, Tetrahydrofuran oder 1,2-Dimethoxyethan, bevorzugt ist Tetrahydrofuran.
Basen sind beispielsweise metallorganische Verbindungen wie n-Butyllithium, Phenyllithium, oder Natrium- oder Kaliummethanolat oder Kalium-tert.-butylat, bevorzugt ist n-Butyllithium oder Kalium-tert.-butylat.
Die Verbindungen der Formel (III) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen synthetisieren.
Die Verbindungen der Formel (II) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R¹ und R³ die oben angegebene Bedeutung aufweisen,
mit einem Oxidationsmittel umgesetzt werden.
Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von –40°C bis 40°C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Trichlormethan oder 1,2-Dichlorethan, bevorzugt ist Methylenchlorid.
Oxidationsmittel sind beispielsweise Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex und DMSO, Oxalylchlorid und DMSO, Dess-Martin Periodinan, Tetrapropylammoniumperruthenat/N-Methylmorpholin N-Oxid und Molsieb, bevorzugt ist Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex und DMSO oder Dess-Martin Periodinan.
Basen sind beispielsweise Triethylamin, Diisopropylethylamin oder N-Methylmorpholin, bevorzugt ist Diisopropylethylamin.
Die Verbindungen der Formel (IV) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R¹ und R³ die oben angegebene Bedeutung aufweisen,
mit einem Reduktionsmittel umgesetzt werden.
Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von –30°C bis 80°C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Diethylether, Tetrahydrofuran, Dioxan oder 1,2-Dimethoxyethan, bevorzugt ist Tetrahydrofuran.
Reduktionsmittel sind beispielsweise Lithiumaluminiumhydrid, Natriumborhydrid in Verbindung mit Bortrifluorid-Diethyletherat, Lithiumborhydrid, Boran-THF-Komplex, Boran-Dimethylsulfid-Komplex, bevorzugt ist Natriumborhydrid in Verbindung mit Bortrifluorid-Diethyletherat.
Die Verbindungen der Formel (V) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R¹ und R³ die oben angegebene Bedeutung aufweisen, und
R⁶ für Methyl oder Ethyl steht,
mit einer Base umgesetzt werden.
Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis zum Rückfluss der Lösungsmittel bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Trichlormethan, Tetrachlormethan oder 1,2-Dichlorethan, Ether wie Diethylether, Methyl-tert-butylether, 1,2-Dimethoxyethan, Dioxan oder Tetrahydrofuran, oder andere Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Acetonitril oder Pyridin, oder Gemische von Lösungsmitteln, oder Gemische von Lösungsmittel mit Wasser, bevorzugt ist ein Gemisch aus Tetrahydrofuran und Wasser.
Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium-, Lithium- oder Kaliumhydroxid, oder Alkalicarbonate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, bevorzugt ist Lithiumhydroxid.
Die Verbindungen der Formel (VI) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R¹ und R⁶ die oben angegebene Bedeutung aufweisen,
mit Verbindungen der Formel
in welcher
R³ die oben angegebene Bedeutung aufweist, und
X¹ für Halogen, bevorzugt Brom oder Chlor, oder Hydroxy steht,
umgesetzt werden.
Die Umsetzung erfolgt, wenn X¹ für Halogen steht, im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von –30°C bis 50°C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Tetrahydrofuran, Methylenchlorid, Pyridin, Dioxan oder Dimethylformamid, bevorzugt ist Tetrahydrofuran.
Basen sind beispielsweise Triethylamin, Diisopropylethylamin oder N-Methylmorpholin, bevorzugt ist Triethylamin oder Diisopropylethylamin.
Die Umsetzung erfolgt, wenn X¹ für Hydroxy steht, im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Dehydratisierungsreagenzes, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von –30°C bis 50°C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol, Nitromethan, Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt ist Dichlormethan oder Dimethylformamid.
Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z. B. N,N'-Diethyl-, N,N,'-Dipropyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylaminoisopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDC), N-Cyclohexylcarbodiimid N'-propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-1,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert-Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-1-ethoxy-carbonyl-1,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat, oder O-(Benzotrtazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetra-methyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo-1-(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat (TPTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyl-uroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), oder Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat (BOP), oder N-Hydroxysuccinimid, oder Mischungen aus diesen, mit Basen.
Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z. B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hydrogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine z. B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropylethylamin.
Vorzugsweise wird die Kondensation mit HATU oder mit EDC in Gegenwart von HOBt durchgeführt.
Die Verbindungen der Formel (VIII) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen synthetisieren.
Die Verbindungen der Formel (VII) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R¹ und R⁶ die oben angegebene Bedeutung aufweisen,
hydriert werden.
Die Hydrierung erfolgt im Allgemeinen mit einem Reduktionsmittel in inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls unter Zusatz von Säure wie Mineralsäuren und Carbonsäuren, bevorzugt Essigsäure, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis zum Rückfluss der Lösungsmittel und in einem Druckbereich von Normaldruck bis 100 bar, bevorzugt bei 50–80 bar.
Reduktionsmittel sind beispielsweise Wasserstoff mit Palladium auf Aktivkohle, mit Rhodium auf Aktivkohle, mit Ruthenium auf Aktivkohle oder daraus gemischte Katalysatorn, oder Wasserstoff mit Palladium auf Aluminiumoxid oder mit Rhodium auf Aluminiumoxid, bevorzugt ist Wasserstoff mit Palladium auf Aktivkohle oder mit Rhodium auf Aktivkohle.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, iso-Propanol, n-Butanol oder tert-Butanol, bevorzugt ist Methanol oder Ethanol.
Die Verbindungen der Formel (IX) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R⁶ die oben angegebene Bedeutung aufweist,
mit Verbindungen der Formel
in welcher
R¹ die oben angegebene Bedeutung aufweist,
umgesetzt werden.
Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Katalysators, gegebenenfalls in Gegenwart eines Zusatzreagenzes, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis zum Rückfluss des Lösungsmittels bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran oder 1,2-Dimethoxyethan, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Xylol oder Toluol, oder andere Lösungsmittel wie Nitrobenzol, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid oder N-Methylpyrrolidon, gegebenenfalls wird diesen Lösungsmitteln etwas Wasser zugesetzt. Bevorzugt ist Toluol mit Wasser oder eine Mischung aus 1,2-Dimethoxyethan, Dimethylformamid und Wasser.
Katalysatoren sind beispielsweise für Suzuki-Reaktionsbedingungen übliche Palladium-Katalysatoren, bevorzugt sind Katalysatoren wie z. B. Dichlorbis(triphenylphosphin)-palladium, Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0), Palladium(II)acetat oder Bis-(diphenylphosphanferrocenyl)-palladium-(II)-chlorid.
Zusatzreagenzien sind beispielsweise Kaliumacetat, Cäsium-, Kalium- oder Natriumcarbonat, Bariumhydroxid, Kalium-tert-butylat, Cäsiumfluorid, Kaliumfluorid oder Kaliumphosphat, bevorzugt sind Kaliumfluorid oder Natriumcarbonat.
Die Verbindungen der Formeln (X) und (XI) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen synthetisieren.
In den Verbindungen der oben genannten Verfahren sind freie Aminogruppen gegebenenfalls während der Umsetzung durch dem Fachmann bekannte Schutzgruppen geschützt, bevorzugt ist eine tert-Butoxycarbonyl-Schutzgruppe. Diese Schutzgruppen werden nach der Umsetzung durch dem Fachmann bekannte Reaktionen abgespalten, bevorzugt ist die Umsetzung mit Trifluoressigsäure oder konzentierter Salzsäure.
Die Herstellung der Verbindungen der Formel (I) kann durch folgendes Syntheseschema verdeutlicht werden.
Schema:
Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen ein nicht vorhersehbares, wertvolles pharmakologisches und pharmakokinetisches Wirkspektrum. Es handelt sich dabei um selektive Antagonisten des PAR-1-Rezeptors, die insbesondere als Thrombozytenaggregationshemmer, als Hemmer der Endothelproliferation und als Hemmer des Tumorwachstums wirken.
Sie eigenen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten bei Menschen und Tieren.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, vorzugsweise von thromboembolischen Erkrankungen und/oder thromboembolischen Komplikationen.
Zu den „thromboembolischen Erkrankungen” im Sinne der vorliegenden Erfindung zählen insbesondere Erkrankungen wie Herzinfarkt mit ST-Segment-Erhöhung (STEMI) und ohne ST-Segment-Erhöhung (non-STEMI), stabile Angina Pectoris, instabile Angina Pectoris, Reokklusio nen und Restenosen nach Koronarinterventionen wie Angioplastie, Stentimplantation oder aortokoronarem Bypass, periphere arterielle Verschlusskrankheiten, Lungenembolien, tiefe venöse Thrombosen und Nierenvenenthrombosen, transitorische ischämische Attacken sowie thrombotischer und thromboembolischer Hirnschlag.
Die Substanzen eignen sich daher auch zur Prävention und Behandlung von kardiogenen Thromboembolien, wie beispielsweise Hirn-Ischämien, Schlaganfall (Stroke) und systemischen Thromboembolien und Ischämien, bei Patienten mit akuten, intermittierenden oder persistierenden Herzarrhythmien, wie beispielsweise Vorhofflimmern, und solchen, die sich einer Kardioversion unterziehen, ferner bei Patienten mit Herzklappen-Erkrankungen oder mit intravasalen Körpern, wie z. B. künstlichen Herzklappen, Kathetern, intraaortale Ballongegenpulsation und Schrittmachersonden.
Thromboembolische Komplikationen treten ferner auf bei mikroangiopathischen hämolytischen Anämien, extrakorporalen Blutkreisläufen, wie z. B. Hämodialyse, Hämofiltration, ventricular assist devices und Kunstherz, sowie Herzklappenprothesen.
Außerdem kommen die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zur Beeinflussung der Wundheilung, für die Prophylaxe und/oder Behandlung von atherosklerotischen Gefäßerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen wie rheumatische Erkrankungen des Bewegungsapparats, koronaren Herzkrankheiten, von Herzinsuffizienz, von Bluthochdruck, von entzündlichen Erkrankungen, wie z. B. Asthma, COPD, entzündlichen Lungenerkrankungen, Glomerulonephritis und entzündlichen Darmerkrankungen in Betracht, darüber hinaus ebenso für die Prophylaxe und/oder Behandlung der Alzheimer'schen Erkrankung, Autoimmunerkrankungen, Morbus Crohn und Kolitis Ulzerosa.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Inhibition des Tumorwachstums und der Metastasenbildung, bei Mikroangiopathien, altersbedingter Makuladegeneration, diabetischer Retinopathie, diabetischer Nephropathie und anderen mikrovaskulären Erkrankungen sowie zur Prävention und Behandlung thromboembolischer Komplikationen, wie beispielsweise venöser Thromboembolien, bei Tumorpatienten, insbesondere solchen, die sich größeren chirurgischen Eingriffen oder einer Chemo- oder Radiotherapie unterziehen, eingesetzt werden.
Weiterhin eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Krebs. Krebserkrankungen schließen unter anderem ein: Karzinome (hierunter Brustkrebs, hepatozelluläre karzinome, Lunkenkrebs, kolorektaler Krebs, Kolonkrebs und Melanome), Lympohome (z. B. Non-Hodgkin-Lymphome und Mykosis fungoides), Leukämien, Sarkome, Mesotheliome, Hirnkrebs (z. B. Gliome), Germinome (z. B. Hodenkrebs und Ovarialkrebs), Choriokarzinome, Nierenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Kopf- und Halskrebs, Endometrieum-Krebs, Zervix-Krebs, Blasenkrebs, Magenkrebs und multiples Myelom.
Außerdem vermittelt auf Endothelzellen exprimiertes PAR-1 Signale, die in Gefäßwachstum münden („Angiogenese”), ein Vorgang, der zur Ermöglichung von Tumorwachstum über ca. 1 mm³ hinaus unerläßlich ist. Induktion der Angiogenese ist auch bei anderen Erkrankungen relevant, hierunter Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises (z. B. rheumatoide Arthritis), bei Lungenerkrankungen (z. B. Lungenfibrose, pulmonale Hypertonie, insbesondere pulmonalarterielle Hypertonie, Erkrankungen, die durch Lungengefäßverschlüsse charakterisiert sind), Arteriosklerose, Plaqueruptur, diabetische Retinopathie und feuchte Makuladegeneration.
Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Sepsis geeignet. Sepsis (oder Septikämie) ist eine häufige Erkrankung mit hoher Letalität. Anfängliche Symptome der Sepsis sind typischerweise unspezifisch (z. B. Fieber, reduziertes Allgemeinbefinden), im weiteren Verlauf kann es jedoch zur generalisierten Aktivierung des Gerinnungssystems kommen (”Disseminated Intravascular coagulation”, oder ”Verbrauchskoagulopathie”, nachfolgend als ”DIC” bezeichnet) mit Mikrothrombosierung in verschiedenen Organen und sekundärer Blutungskomplikationen. Außerdem kann es zur endothelialen Schädigung mit Erhöhung der Gefäßpermeabilität und Austritt von Flüssigkeit und Proteinen in den Extravasalraum kommen. Im weiteren Verlauf kann es zur Dysfunktion oder dem Versagen eines Organs (z. B. Nierenversagen, Leberversagen, Atemversagen, zentralnervöse Defizite und Herz-/Kreislaufversagen) bis hin zum Multiorganversagen kommen. Hiervon kann prinzipiell jedes Organ betroffen sein, am häufigsten tritt Organdysfunktion und -Versagen bei der Lunge, der Niere, dem Herz-Kreislaufsystem, dem Gerinnungssystem, dem zentralnervösen System, endokrinen Drüsen und der Leber auf. Eine Sepsis kann mit einem „Acute Respiratory Distress Syndrome” (nachfolgend als ARDS bezeichnet) einhergehen. Ein ARDS kann auch unabhängig von einer Sepsis auftreten. ”Septischer Schock” bezeichnet das Auftreten einer behandlungspflichtigen Blutdruckerniedrigung, die eine weitere Organschädigung begünstigt und mit einer Verschlechterung der Prognose einhergeht.
Krankheitserreger können Bakterien (gram-negativ und gram-positiv), Pilze, Viren und/oder Eukaryonten sein. Eintrittspforte bzw. Primärinfektion können z. B. Pneumonie, Harnwegsinfekt, Peritonitis sein. Die Infektion kann, muß aber nicht zwingend, mit einer Bakteriämie einhergehen.
Sepsis wird definiert als das Vorliegen einer Infektion und eines ”systemic inflammatory response syndrome” (nachfolgend mit ”SIRS” bezeichnet). SIRS tritt im Rahmen von Infekten, aber auch von anderen Zuständen wie Verletzungen, Verbrennungen, Schock, Operationen, Ischämie, Pankreatitis, Reanimation oder Tumoren auf. Nach der Definition des ACCP/SCCM Consensus Conference Committee von 1992 (Crit. Care Med. 1992, 20, 864–874) werden die zur Diagnose ”SIRS” erforderlichen Symptome zur Diagnose und Meßparameter beschrieben (u. a. veränderte Körpertemperatur, erhöhte Herzfrequenz, Atemschwierigkeiten und verändertes Blutbild). In der späteren (2001) SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference wurden die Kriterien im Wesentlichen beibehalten, in Details jedoch verfeinert (Levy et al., Crit. Care Med. 2003, 31, 1250–1256).
DIC und SIRS können im Rahmen einer Sepsis, aber auch infolge von Operationen, Tumorerkrankungen, Verbrennungen oder anderen Verletzungen auftreten. Bei der DIC kommt es an der Oberfläche von geschädigten Endothelzellen, Fremdkörperoberflächen oder verletztem extravaskulärem Gewebe zur massiven Aktivierung des Gerinnungssystems. Als Folge kommt es zur Gerinnung in kleinen Gefäßen verschiedener Organe mit Hypoxie und anschließender Organdysfunktion. Sekundär kommt es zum Verbrauch von Gerinnungsfaktoren (z. B. Faktor X, Prothrombin, Fibrinogen) und Plättchen, wodurch die Gerinnungsfähigkeit des Blutes herabgesetzt wird und schwere Blutungen auftreten können.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können darüber hinaus auch zur Verhinderung von Koagulation ex vivo eingesetzt werden, z. B. zur Konservierung von Blut- und Plasmaprodukten, zur Reinigung/Vorbehandlung von Kathetern und anderen medizinischen Hilfsmitteln und Geräten, einschließlich extrakorporaler Kreisläufe, zur Beschichtung künstlicher Oberflächen von in vivo oder ex vivo eingesetzten medizinischen Hilfsmitteln und Geräten oder bei biologischen Proben, die Blutplättchen enthalten.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Beschichtung von medizinischen Instrumenten und Implantaten, z. B. Kathetern, Prothesen, Stents oder künstlichen Herzklappen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können dabei fest an die Oberfläche gebunden sein oder über einen bestimmten Zeitraum aus einer Trägerbeschichtung in die unmittelbare Umgebung zur lokalen Wirkung freigesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend eine erfindungsgemäße Verbindung und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe der zuvor genannten Erkrankungen. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft und vorzugsweise genannt:
Kalziumkanalblocker, z. B. Amlodipin Besilat (z. B. Norvasc^®), Felodipin, Diltiazem, Verapamil, Nifedipin, Nicardipin, Nisoldipin und Bepridil;
Iomerizin;
Statine, z. B. Atorvastatin, Fluvastatin, Lovastatin, Pitavastatin, Pravastatin, Rosuvastatin, und Simvastatin;
Cholesterinabsorption-Inhibitoren, z. B. Ezetimibe und AZD4121;
Cholesteryl Ester Transfer Protein (”CETP”) Inhibitoren, z. B. Torcetrapib;
Niedrigmolekualre Heparine, z. B. Dalteparin Natrium, Ardeparin, Certoparin, Enoxaparin, Pamaparin, Tinzaparin, Reviparin und Nadroparin;
Weitere Antikoagulanzien, z. B. Warfarin, Marcumar, Fondaparinux;
Antiarrhythmika, z. B. Dofetilid, Ibutilid, Metoprolol, Metoprololtartrat, Propranolol, Atenolol, Ajmalin, Disopyramid, Prajmalin, Procainamid, Quinidin, Spartein, Aprindine, Lidocain, Mexiletin, Tocamid, Encamid, Flecamid, Lorcamid, Moricizin, Propafenon, Acebutolol, Pindolol, Amiodaron, Bretylium-Tosylat, Bunaftin, Sotalol, Adenosin, Atropin und Digoxin;
Alpha-adrenerge Agonisten, z. B. Doxazosin-Mesylat, Terazoson und Prazosin;
Beta-adrenerge Blocker, z. B. Carvedilol, Propranolol, Timolol, Nadolol, Atenolol, Metoprolol, Bisoprolol, Nebivolol, Betaxolol, Acebutolol und Bisoprolol;
Aldosteron-Antagonisten, z. B. Eplerenon und Spironolacton;
Angiotensin-converting-enzyme Inhbitoren (”ACE-Inhibitoren”), z. B. Moexipril, Quinapril-Hydrochlorid, Ramipril, Lisinopril, Benazepril-Hydrochlorid, Enalapril, Captopril, Spirapril, Perindopril, Fosinopril und Trandolapril,;
Angiotensin II Receptorbiockers (”ARBs”), z. B. Olmesartan-Medoxomil, Candesartan, Valsartan, Telmisartan, Irbesartan, Losartan und Eprosartan,;
Endothelinantagonisten, z. B. Tezosentan, Bosentan und Sitaxsentan-Natrium;
Neutral Endopeptidaseinhibitoren, z. B. Candoxatril und Ecadotril;
Phosphodiesteraseinhibitoren, z. B. Milrinoon, Theophyllin, Vinpocetin, EHNA (erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine), Sildenafil, Vardenafil und Tadalafil;
Fibrinolytika, z. B. Reteplase, Alteplase und Tenecteplase;
GP IIb/IIIa-Antagonisten, z. B. Integrillin, Abciximab und Tirofiban;
Direkte Thrombininhibitoren, z. B. AZD0837, Argatroban, Bivalirudin und Dabigatran;
Indirekte Thrombininhibitoren, z. B. Odiparcil;
Direkte und indirekte Faktor Xa Inhibitoren, z. B. Fondaparinux-Natrium, Apixaban, Razaxaban, Rivaroxaban (BAY 59-7939), KFA-1982, DX-9065a, AVE3247, Otamixaban (XRP0673), AVE6324, SAR377142, Idraparinux, SSR126517, DB-772d, DT-831j, YM-150, 813893, LY517717 und DU-1766.;
Direkte und indirekte Faktor Xa/IIa Inhibitoren, z. B. Enoxaparin-Natrium, AVE5026, SSR128428, SSR128429 und BIBI-986 (Tanogitran);
Lipoprotein-assoziierte Phospholipase A2 (”LpPLA2”) Modulatoren;
Diuretika, z. B. Chlorthalidon, Ethacrynsäure, Furosemid, Amilorid, Chlorothiazid, Hydrochlorothiazid, Methylchtothiazid und Benzthiazid;
Nitrate, z. B. Isosorbide-5-Mononitrat;
Thromboxan-Antagonisten, z. B. Seratrodast, Picotamid und Ramatroban;
Plättchenaggregations-Inhibitoren, z. B. Clopidogrel, Tiklopidin, Cilostazol, Aspirin, Abciximab, Limaprost, Eptifibatide und CT-50547;
Cyklooxygenase-Inhibitoren, z. B. Meloxicam, Rofecoxib und Celecoxib;
B-Typ Natriuretic Peptide, z. B. Nesiritid und Ularitide;
NV1FGF-Modulatoren, z. B. XRP0038;
HT1B/5-HT2A-Antagonisten, z. B. SL65.0472;
Guanylatcyclase-Aktivatoren, z. B. Ataciguat (HMR1766) und HMR1069;
e-NOS Transkriptions-Enhancers, z. B. AVE9488 and AVE3085;
Anti-atherogene Substanzen, z. B. AGI-1067:
CPU-Inhibitoren, z. B. AZD9684;
Renininhibitoren, z. B. Aliskirin und VNP489;
Inhibitoren der Adenosindiphosphat-induzierten Plättchenaggregation, z. B. Clopidogrel, Tiklopidin, Prasugrel und AZD6140;
NHE-1 Inhibitoren, z. B. AVE4454 und AVE4890.
Antibiotische Therapie: Verschiedene Antibiotika oder antifungale Medikamenten-Kombinationen kommen in Frage, entweder als kalkulierte Therapie (vor Vorliegen des mikrobiellen Befundes) oder als spezifische Therapie; Flüssigkeitstherapie, z. B. Kristalloide oder kolloidale Flüssigkeiten; Vasopressoren, z. B. Norepinephrine, Dopamine oder Vasopressin; Inntrope Therapie, z. B. Dobutamin; Kortikosteroide, z. B. Hydrokortison, oder Fludrokortison; rekombinantes humanes aktivierte Protein C, Xigris; Blutprodukte, z. B. Erythrozytenkonzentrate, Thrombozytenkonzentrate, Erythropietin oder Fresh Frozen Plasma; Maschinelle Beatmung bei sepsis-induziertem Acute Lung Injury (ALI) bzw. Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS), z. B. Permissive Hyperkapnie, niedrigere Tidalvolumina; Sedierung: z. B. Diazepam, Lorazepam, Midazolam oder Propofol. Opioide: z. B. Fentanyl, Hydromorphon, Morphin, Meperidin oder Remifentanil. NSAIDs: z. B. Ketorolac, Ibuprofen oder Acetaminophen. Neuromuskuläre Blockade: z. B. Pancuronium; Glukose-Kontrolle, z. B. Insulin, Glukose; Nierenersatzverfahren, z. B. kontinuierliche veno-venöse-Hämofiltration oder intermittierende Hämodialyse. Dopamin niedrig-dosiert zur renalen Protektion; Antikoagulantien, z. B. zur Thromboseprophylaxe oder bei Nierenersatzverfahren, z. B. unfraktionierte Heparine, low molecular weight Heparine, Heparinoide, Hirudin, Bivalirudin oder Argatroban; Bikarbonat-Therapie; Streßulkusprophylaxe, z. B. H2-Rezeptorinhibitoren, Antazida
Medikamente bei proliferativen Erkrankungen: Urazil, Chlormethin, Cyklophosphamid, Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Pipobroman, Triethylenemelamin, Triethylenethiophosphoramin, Busulfan, Carmustine, Lomustine, Streptozocin, Dacarbazine, Methotrexate, 5-Fluorouracil, Floxuridine, Cytarabine, 6-Mercaptopurine, 6-Thioguanine, Fludarabine phosphate, Pentostatine, Vinblastine, Vincristine, Vindesine, Bleomycin, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Paclitaxel, Mithramycin, Deoxycoformycin, Mitomycin-C, L-Asparaginase, Interferons, Etoposide, Teniposide 17.alpha.-Ethinylestradiol, Diethylstilbestrol, Testosterone, Prednisone, Fluoxymesterone, Dromostanolone propionate, Testolactone, Megestrolacetate, Tamoxifen, Methylprednisolone, Methyltestosterone, Prednisolone, Triamcinolone, Chlorotrianisene, Hydroxyprogesterone, Aminoglutethimide, Estranrustine, Medroxyprogesteroneacetate, Leuprolide, Flutamide, Toremifene, Goserelin, Cisplatin, Carboplatin, Hydroxyurea, Amsacrine, Procarbazine, Mitotane, Mitoxantrone, Levamisole, Navelbene, Anastrazole, Letrazole, Capecitabine, Reloxafine, Droloxafine, Hexamethylmelamine, Oxaliplatin (Eloxatin^®), Iressa (gefmitib, Zdl839), XELODA^® (capecitabine), Tarceva^® (erlotinib), Azacitidine (5-Azacytidine; 5-AzaC), Temozolomide (Temodar^®), Gemcitabine (e. g., GEMZAR^® (gemcitabine HCl)), Vasostatin oder eine Kombination zweier oder mehrerer der oben genannten.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Verhinderung der Blutkoagulation in vitro, insbesondere bei Blutkonserven oder biologischen Proben, die Blutplättchen enthalten, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine antikoagulatorisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Verbindung zugegeben wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z. B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z. B. Tabletten (nicht überzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z. B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z. B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u. a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
Bevorzugt ist die orale Applikation.
Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z. B. Inhalationsarzneiformen (u. a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u. a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z. B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z. B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z. B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, vorzugsweise zusammen mit einem oder mehreren inerten nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 5 bis 250 mg je 24 Stunden zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Menge etwa 5 bis 100 mg je 24 Stunden.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt.
Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen. Die Angabe ”w/v” bedeutet ”weight/volume” (Gewicht/Volumen). So bedeutet beispielsweise ”10% w/v”: 100 ml Lösung oder Suspension enthalten 10 g Substanz.
A) Beispiele
Abkürzungen:

ca.

circa

CDI

Carbonyldiimidazol

d

Tag(e), Dublett (bei NMR)

DC

Dünnschicht-Chromatographie

DCI

direkte chemische Ionisation (bei MS)

dd

Doppeltes Dublett (bei NMR)

DMAP

4-Dimethylaminopyridin

DMF

N,N-Dimethylformamid

DMSO

Dimethylsulfoxid

DPPA

Diphenylphosphorazidat

DSC

Disuccinimidylcarbonat

d. Th.

der Theorie (bei Ausbeute)

eq.

Äquivalent(e)

ESI

Elektrospray-Ionisation (bei MS)

h

Stunde(n)

HATU

O-(7-Azabenzotnazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorphosphat

HPLC

Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie

LC-MS

Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie

LDA

Lithiumdiisopropylamid

m

Multiplett (bei NMR)

min

Minute(n)

MS

Massenspektroskopie

NMR

Kernresonanzspektroskopie

PYBOP

Benzotriazol-1-yloxy-tris(pyrrolidino)phosphonium-Hexafluorophosphat

q

Quartett (bei NMR)

RP

reverse phase (bei HPLC)

RT

Raumtemperatur

R_t

Retentionszeit (bei HPLC)

s

Singulett (bei NMR)

t

Triplett (bei NMR)

THF

Tetrahydrofuran

Präparative Diastereomerentrennung:

Methode 1A: Phase: Sunfire C18OBD, 5 μm 150 mm × 19 mm, Eluent: Wasser/Acetonitril 40:60; Fluss: 25 ml/min, T: 40°C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 2A: Phase: Sunfire C18OBD, 5 μm 150 mm × 19 mm, Eluent: Wasser/Acetonitril 45:55; Fluss: 25 ml/min, T: 40°C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 3A: Phase: Sunfire C18OBD, 5 μm 150 mm × 19 mm, Eluent: Wasser/Acetonitril 47:53; Fluss: 25 ml/min, T: 40°C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 4A: Phase: Sunfire C18OBD, 5 μm 150 mm × 19 mm, Eluent: Wasser/0.1% Trifluressigsäure/Acetonitril 56:14:30; Fluss: 25 ml/min, T: 40°C; UV-Detektion: 210 nm.

LC-MS-Methoden:

Methode 1B: Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo Hypersil GOLD 1.9 μ 50 mm × 1 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A → 0.1 min 90% A → 1.5 min 10% A → 2.2 min 10% A; Ofen: 50°C; Fluss: 0.33 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 2B: Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Gemini 3 μ 30 mm × 3.00 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A → 2.5 min 30% A → 3.0 min 5% A → 4.5 min 5% A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min. 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 3B: Gerätetyp MS: Waters (Micromass) Quattro Micro; Gerätetyp HPLC: Agilent 1100 Serie; Säule: Thermo Hypersil GOLD 3 μ 20 mm × 4 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100% A → 3.0 min 10% A → 4.0 min 10% A → 4.01 min 100% A (Flow 2.5 ml) → 5.00 min 100% A; Ofen: 50°C; Fluss: 2 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 4B: Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 mm × 1 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A → 1.2 min 5% A → 2.0 min 5% A; Ofen: 50°C; Fluss: 0.40 ml/min; UV-Detektion: 210–400 nm.
Methode 5B: Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 mm × 1 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A → 1.2 min 5% A → 2.0 min 5% A; Ofen: 50°C; Fluss: 0.40 ml/min; UV-Detektion: 210–400 nm.
Methode 6B: Gerätetyp MS: Waters ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex Onyx Monolithic C18, 100 mm × 3 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 2 min 65% A → 4.5 min 5% A -> 6 min 5% A; Fluss: 2 ml/min; Ofen: 40°C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 7B: Instrument: Micromass Quattro Micro MS mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Thermo Hypersil GOLD 3 μ 20 mm × 4 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100%A → 3.0 min 10% A 4.0 min 10% A → 4.01 min 100%A → 5.00 min 100% A; Ofen: 50°C; Fluss: 2 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 8B: Instrument: Micromass Platform LCZ mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Thermo HyPURITY Aquastar 3 μ 50 mm × 2.1 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100% A → 0.2 min 100% A → 2.9 min 30% A → 3.1 min 10% A → 5.5 min 10% A; Ofen: 50°C; Fluss: 0.8 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 9B: Gerätetyp MS: Waters ZQ; Gerätetyp HPLC: Agilent 1100 Series; UV DAD; Säule: Thermo Hypersil GOLD 3 μ 20 mm × 4 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100% A → 3.0 min 10% A → 4.0 min 10% A → 4.1 min 100% Fluss: 2.5 ml/min; Ofen: 55°C; Fluss 2/ml; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 10B: Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex Synergi 2.5 μ MAX-RP 100A Mercury 20 mm × 4 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A → 0.1 min 90% A → 3.0 min 5% A → 4.0 min 5% A → 4.01 min 90% A; Fluss: 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 210 nm.

Präparative Enantiomerentrennung:

Methode 1C: Phase: Daicel Chiralpak AS-H, 5 μm 250 mm × 20 mm, Eluent: iso-Hexan/Ethanol 50:50; Fluss: 15 ml/min, Temperatur: 30°C; UV-Detektion: 220 nm.

Analytische Enantiomerentrennung:

Methode 1D: Phase: Daicel Chiralpak AS-H, 5 μm 250 mm × 4.6 mm; Eluent: iso-Hexan/Ethanol 30:70 + 0.2% Trifluoressigsäure + 1% Wasser; Fluss: 1 ml/min; Temperatur: 40°C; UV-Detektion: 220 nm.

Als Mikrowellenreaktor wurde ein ”single mode” Gerät vom Typ Emrys^TM Optimizer verwendet.
Ausgangsverbindungen
Allgemeine Methode 1A: Suzuki-Kupplung
Eine Mischung des entsprechenden Brompyridins in Toluol (1.8 ml/mmol) wird unter Argon bei RT mit Tetrakis-(triphenylphosphin)-palladium (0.02 eq.), mit einer Lösung der entsprechenden Arylboronsäure (1.2 eq.) in Ethanol (0.5 ml/mmol) und mit einer Lösung aus Kaliumfluorid (2.0 eq.) in Wasser (0.2 ml/mmol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird mehrere Stunden bis zur weitgehend vollständigen Umsetzung unter Rückfluß gerührt. Nach Zugabe von Essigsäureethylester und Phasentrennung wird die organische Phase einmal mit Wasser und einmal mit gesättigter, wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, getrocknet (Magnesiumsulfat), filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird mittels Flash-Chromatographie (Kieselgel-60, Eluent: Dichlormethan-Methanol-Gemische) aufgereinigt.
Allgemeine Methode 2A: Hydrierung des Pyridins
Eine Lösung des Pyridins in Ethanol (9 ml/mmol) wird unter Argon mit Palladium auf Aktivkohle (angefeuchtet mit ca. 50% Wasser, 0.3 g/mmol) versetzt und bei 60°C über Nacht in einer 50 bar Wasserstoff-Atmosphäre hydriert. Anschließend wird der Katalysator über eine Filterschicht abfiltriert und mehrmals mit Ethanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum eingeengt.
Allgemeine Methode 3A: Umsetzung mit Carbamoylchloriden
Eine Lösung des Piperidins in Dichlormethan (2.5 ml/mmol) wird unter Argon bei 0°C tropfenweise mit N,N-Diisopropylethylamin (1.2 eq.) und dem entsprechenden Carbamoylchlorid (1.2 eq.) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei RT gerührt. Nach Zugabe von Wasser und Phasentrennung wird die organische Phase dreimal mit Wasser und einmal mit gesättigter, wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und im Vakuum eingeengt.
Allgemeine Methode 4A: Methylesterverseifung/Epimerisierung
Zu einer Lösung des entsprechenden Methylesters (1.0 eq.) in Methanol (35–40 ml/mmol) wird bei RT Kalium-tert.-butylat (10 eq.) gegeben. Die Mischung wird über Nacht bei 60°C gerührt. Bei unvollständiger Umsetzung wird Wasser (1.0 eq.) zugesetzt und bis zum vollständigen Umsatz bei 60°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird im Vakuum das Methanol entfernt, der Rückstand mit Wasser versetzt und mit wässriger 1 N Salzsäure-Lösung sauer (pH 1) gestellt. Die Mischung wird mit Essigsäureethylester extrahiert, die organische Phase mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt.
Beispiel 1A
5-(4-Ethylphenyl)pyridin-3-carbonsäureethylester
Nach der Allgemeinen Methode 1A wurden 29 g (126 mmol) 5-Bromnicotinsäureethylester und 23 g (152 mmol, 1.2 eq.) 4-Ethylphenylboronsäure umgesetzt. Ausbeute: 32 g (82% d. Th.)
LC-MS (Methode 6B): R_t = 3.80 min; MS (ESIpos): m/z = 256 [M+H]⁺.
Beispiel 2A
5-(4-Ethylphenyl)piperidin-3-carbonsäureethylester [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
Nach der Allgemeinen Methode 2A wurden 24 g (71 mmol) 5-(4-Ethylphenyl)pyridin-3-carbonsäureethylester hydriert. Ausbeute: 15 g (81% d. Th.)
LC-MS (Methode 7B): R_t = 1.78 min und 1.91 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 262 [M+H]⁺.
Beispiel 3A
5-(4-Ethylphenyl)-1-(morpholin-4-ylcarbonyl)piperidin-3-carbonsäureethylester [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
Nach der Allgemeinen Methode 3A wurden 10.0 g (36.0 mmol) 5-(4-Ethylphenyl)piperidin-3-carbonsäureethylester mit 7.0 g (46.8 mmol, 1.3 eq.) Morpholin-4-carbonylchlorid umgesetzt. Ausbeute: 12.0 g (89% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): R_t = 2.38 min und 2.48 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 375 [M+H]⁺.
Beispiel 4A
5-(4-Ethylphenyl)-1-(morpholin-4-ylcarbonyl)piperidin-3-carbonsäure [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 4A wurden 3.4 g (11.7 mmol) 5-(4-Ethylphenyl)-1-(morpholin-4-ylcarbonyl)piperidin-3-carbonsäureethylester (Beispiel 3A) verseift. Die Reaktion führte selektiv zum cis-Isomer. Ausbeute: 3.2 g (89% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): R_t = 2.06 min; MS (ESIpos): m/z = 347 [M+H]⁺.
Beispiel 5A
[3-(4-Ethylphenyl)-5-(hydroxymethyl)piperidin-1-yl](morpholin-4-yl)methanon [racemisches cis-Isomer]
Unter Argon wurden 218 mg (5.77 mmol) Natriumborhydrid in 28 ml Tetrahydrofuran vorgelegt und bei 0°C tropfenweise mit einer Lösung von 1.00 g (2.89 mmol) 5-(4-Ethylphenyl)-1-(morpholin-4-ylcarbonyl)piperidin-3-carbonsäure [racemisches cis-Isomer] in 14.0 ml Tetrahydrofuran versetzt. Anschließend wurde 0.98 ml (7.74 mmol) Bortrifluorid-Diethylether-Komplex zugesetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 N wässriger Hydrogenchlorid-Lösung beendet, mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt.
Ausbeute: 917 mg (95% d. Th.)
LC-MS (Methode 3B): R_t = 1.95 min; MS (ESIpos): m/z = 333 [M+H]⁺.
Beispiel 6A
5-(4-Ethylphenyl)-1-(morpholin-4-ylcarbonyl)piperidin-3-carbaldehyd [racemisches cis/trans-Isomerengemisch]
105 mg (0.316 mmol) des Alkohols aus Beispiel 5A in 1.5 ml Dichlormethan wurden bei RT mit 161 mg (0.379 mmol) Dess-Martin Periodinan versetzt und anschließend 1 h gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung extrahiert, die wässrige Phase nochmals mit Dichlormethan gewaschen und die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Die Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in der Folgestufe eingesetzt. Ausbeute: ca. 80.0 mg (77% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): R_t = 1.85 und 2.21 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 331 [M+H]⁺.
Beispiel 7A
5-[4-(Trifluormethyl)phenyl]pyridin-3-carbonsäuremethylester
Nach der Allgemeinen Methode 1A wurden 28 g (132 mmol) 5-Bromnicotinsäuremethylester und 30 g (158 mmol, 1.2 eq.) 4-Trifluormethylphenylboronsäure umgesetzt. Ausbeute: 32 g (85% d. Th.)
LC-MS (Methode 8B): R_t = 2.27 min; MS (ESIpos): m/z = 282 [M+H]⁺.
Beispiel 8A
5-[4-(Trifluormethyl)phenyl]piperidin-3-carbonsäuremethylester [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
Nach der Allgemeinen Methode 2A wurden 32 g (112 mmol) 5-[4-(Trifluormethyl)phenyl]pyridin-3-carbonsäuremethylester hydriert. Ausbeute: 26 g (82% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): R_t = 1.35 und 1.41 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 288 [M+H]⁺.
Beispiel 9A
1-(Morpholin-4-ylcarbonyl)-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-3-carbonsäuremethylester [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
Nach der Allgemeinen Methode 3A wurden 9.25 g (32.2 mmol) 5-[4-(Trifluormethyl)phenyl]piperidin-3-carbonsäuremethylester mit 9.63 g (64.7 mmol) Morpholin-4-carbonylchlorid umgesetzt. Man erhielt so 16.3 g Rohprodukt in 76%-iger Reinheit (LC-MS), welches ohne weitere Reinigungsoperationen umgesetzt wurde.
LC-MS (Methode 9B): R_t = 1.19 und 1.22 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 401 [M+H]⁺.
Beispiel 10A
1-(Morpholin-4-ylcarbonyl)-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-3-carbonsäure [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 4A wurden 22.19 g (39.90 mmol) der Verbindung aus Beispiel 10A und 44.78 g (399.0 mmol) Kalium-tert.-butylat umgesetzt. Die Reaktion führte selektiv zum cis-Isomer. Ausbeute: 18.29 g (100% d. Th.)
LC-MS (Methode 7B): R_t = 1.95 min; MS (ESIpos): m/z = 387 [M+H]⁺.
Beispiel 11A
{3-(Hydroxymethyl)-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl}(morpholin-4-yl)methanon [racemisches cis-Isomer]
Unter Argon wurden 1.33 g (35.1 mmol) Natriumborhydrid in 150 ml Tetrahydrofuran vorgelegt und bei 0°C tropfenweise mit einer Lösung von 7.00 g (17.6 mmol) {3-(Hydroxymethyl)-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl}(morpholin-4-yl)methanon [racemisches cis-Isomer] in 4.0 ml Tetrahydrofuran versetzt. Anschließend wurden 6.0 ml (47.4 mmol) Bortrifluorid-Diethylether-Komplex zugesetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 N wässriger Hydrogenchlorid-Lösung beendet, mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt.
Ausbeute: 6.49 g (99% d. Th.)
LC-MS (Methode 1B): R_t = 1.06 min; MS (ESIpos): m/z = 373 [M+H]⁺.
Beispiel 12A
1-(Morpholin-4-ylcarbonyl)-5-[4-(trifluormethyl)cyclohexa-1,5-dien-1-yl]piperidin-3-carbaldehyd [racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
Unter Argon wurde eine Lösung von 3.00 g (8.06 mmol) des Alkohols aus Beispiel 12A in 180 ml Dichlormethan mit 5.72 ml (80.6 mmol) Dimethylsulfoxid und 7.02 ml (40.3 mmol) N,N'-Diisopropylethylamin versetzt. Anschließend wurden bei –20°C 5.13 g (32.2 mmol) Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex zugegeben und über Nacht gerührt wobei langsam auf RT erwärmt wurde. Aufgrund unvollständigen Umsatzes wurde erneut auf –20°C gekühlt und 2.56 g (16.1 mmol) Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex, 2.86 ml (40.3 mmol) Dimethylsulfoxid und 3.51 ml (20.1 mmol) N,N'-Diisopropylethylamin zugegeben. Es wurde langsam auf RT erwärmt und anschließend die Reaktionslösung mit Dichlormethan verdünnt, mit Wasser gewaschen, und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration und Einengen im Vakuum wurde das Rohprodukt mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 1.54 g (45% d. Th.) LC-MS (Methode 5B): R_t = 0.86 und 1.00 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 371 [M+H]⁺.
Beispiel 13A
Diethyl-[(5-phenylpyridin-2-yl)methyl]phosphonat
200 mg (0.649 mmol) Diethyl-[(5-brompyridin-2-yl)methyl]phosphonat [M. V. Chelliah et al., J. Med. Chem. 2007, 21, 5147–5160] in 16.5 ml 1,2-Dimethoxyethan wurden mit 37.5 mg (0.032 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium versetzt. Anschließend wurden 119 mg (0.974 mmol) Phenylboronsäure sowie 166 mg (1.98 mmol) Natriumhydrogencarbonat in 7.5 ml Wasser zugegeben. Nach 2 h Rühren unter Rückfluss wurde die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt, der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen und mit gesättigter, wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 100 mg (50% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): R_t = 1.87 min; MS (ESIpos): m/z = 306 [M+H]⁺.
Beispiel 14A
Diethyl-{[5-(2-methoxyphenyl)pyridin-2-yl]methyl}phosphonat
200 mg (0.649 mmol) Diethyl-[(5-brompyridin-2-yl)methyl]phosphonat [M. V. Chelliah et al., J. Med. Chem. 2007, 21, 5147–5160] in 16.5 ml 1,2-Dimethoxyethan wurden mit 37.5 mg (0.032 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium versetzt. Anschließend wurden 148 mg (0.974 mmol) 2-Methoxyphenylboronsäure sowie 166 mg (1.98 mmol) Natriumhydrogencarbonat in 7.5 ml Wasser zugegeben. Nach 2 h Rühren unter Rückfluss wurde die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt, der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen und mit gesättigter, wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 174 mg (72% d. Th.)
LC-MS (Methode 1B): R_t = 1.04 min; MS (ESIpos): m/z = 336 [M+H]⁺.
Beispiel 15A
Diethyl-{[5-(3-chlorphenyl)pyridin-2-yl]methyl}phosphonat
200 mg (0.649 mmol) Diethyl-[(5-brompyridin-2-yl)methyl]phosphonat [M. V. Chelliah et al., J. Med. Chem. 2007, 21, 5147–5160] in 16.5 ml 1,2-Dimethoxyethan wurden mit 37.5 mg (0.032 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium versetzt. Anschließend wurden 152 mg (0.974 mmol) 2-Chlorphenylboronsäure sowie 166 mg (1.98 mmol) Natriumhydrogencarbonat in 7.5 ml Wasser zugegeben. Nach 2 h Rühren unter Rückfluss wurde die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt, der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen und mit gesättigter, wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 166 mg (75% d. Th.)
LC-MS (Methode 10B): R_t = 1.77 min; MS (ESIpos): m/z = 340 [M+H]⁺.
Ausführungsbeispiele
Allgemeine Methode 1: Horner-Wadsworth-Emmons Reaktion
Eine Lösung aus dem entsprechenden Phosphonat (1.2 eq.) in Tetrahydrofuran (5–10 ml/mmol) wird unter Argon bei 0°C tropfenweise mit n-Butyllithium (1.1 eq., 2.5 M in n-Hexan) versetzt. Nach 10 min wird der Aldehyd (1.0 eq.) in Tetrahydrofuran (5–10 ml/mmol) zugegeben und anschließend über Nacht gerührt, wobei die Reaktionslösung langsam auf RT erwärmt wird. Die Reaktion wird durch langsame Zugabe von gesättigter, wässriger Ammoniumchlorid-Lösung beendet, mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat oder Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird mittels präparativer HPLC gereinigt.
Beispiel 1
{3-(4-Ethylphenyl)-5-[(E)-2-{5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}vinyl]piperidin-1-yl}-(morpholin-4-yl)methanon [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 1 wurden 108 mg (0.291 mmol) Diethyl-({5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}methyl)phosphonat [M. C. Clasby et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 129–138] und 80.0 mg (ca. 0.242 mmol) der Verbindung aus Beispiel 6A umgesetzt. Ausbeute: 58 mg (44% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): R_t = 3.10 min; MS (ESIpos): m/z = 550 [M+H]⁺;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ = 8.92 (s, 1H), 8.16 (dd, 3H), 8.07 (br s, 2H), 7.83-7.68 (m, 2H), 7.54 (d, 1H), 7.27-7.20 (m, 2H), 7.20-7.14 (m, 2H), 6.83 (dd, 1H), 6.72-6.62 (m, 1H), 3.78 (d, 1H), 3.64 (d, 1H), 3.58 (br s, 4H), 3.17 (br s, 4H), 2.86-2.69 (m, 3H), 2.62-2.54 (m, 3H), 2.03 (br s, 1H), 1.76-1.62 (m, 1H), 1.17 (t, 3H).
Beispiel 2
Morpholin-4-yl{3-[4-(trifluormethyl)phenyl]-5-[(E)-2-{5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}vinyl]piperidin-1-yl}methanon [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 1 wurden 148 mg (0.389 mmol) Diethyl-({5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}methyl)phosphonat [M. C. Clasby et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 129–138] und 120 mg (0.324 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A umgesetzt. Das Rohprodukt wurde mittels Diastereomerentrennung nach Methode 1A gereinigt. Ausbeute: 109 mg (57% d. Th.)
LC-MS (Methode 5B): R_t = 1.37 min; MS (ESIpos): m/z = 590 [M+H]⁺;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ = 8.92 (d, 1H), 8.16 (dd, 1H), 8.07 (br s, 2H), 7.81-7.66 (m, 4H), 7.63-7.48 (m, 3H), 6.92-6.77 (m, 1H), 6.74-6.62 (m, 1H), 3.78 (d, 1H), 3.68 (d, 1H), 3.58 (d, 4H), 3.19 (br s, 4H), 3.07-2.84 (m, 2H), 2.83-2.71 (m, 1H), 2.61 (d, 3H), 2.11 (br s, 1H), 1.75 (q, 1H).
Beispiel 3
Morpholin-4-yl{3-[4-(trifluormethyl)phenyl]-5-[(E)-2-{5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}vinyl]piperidin-1-yl}methanon [racemisches trans-Isomer].
Nach der Allgemeinen Methode 1 wurden 148 mg (0.389 mmol) Diethyl-({5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}methyl)phosphonat [M. C. Clasby et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 129–138] und 120 mg (0.324 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A umgesetzt. Das Rohprodukt wurde mittels Diastereomerentrennung nach Methode 1A gereinigt. Ausbeute: 20.7 mg (10% d. Th.)
LC-MS (Methode 5B): R_t = 1.35 min; MS (ESIpos): m/z = 590 [M+H]⁺;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ = 8.93 (d, 1H), 8.19 (dd, 1H), 8.08 (br s, 2H), 7.81-7.67 (m, 4H), 7.61-7.54 (m, 3H), 7.02 (dd, 1H), 6.70 (d, 1H), 3.71-3.38 (m, 6H), 3.33 (dd, 1H), 3.27-3.12 (m, 4H), 3.11-3.01 (m, 2H), 2.80 (br s, 1H), 2.23-2.09 (m, 1H), 2.09-1.98 (m, 1H).
Beispiel 4
Morpholin-4-yl(3-{(Z)-2-[3'-(trifluormethyl)biphenyl-4-yl]vinyl}-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl)methanon [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 1 wurden 148 mg (0.389 mmol) Diethyl-({5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}methyl)phosphonat [M. C. Clasby et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 129–138] und 120 mg (0.324 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A umgesetzt. Das Rohprodukt wurde mittels Diastereomerentrennung nach Methode 1A gereinigt. Ausbeute: 7.0 mg (4% d. Th.)
LC-MS (Methode 5B): R_t = 1.43 min; MS (ESIpos): m/z = 590 [M+H]⁺;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ = 8.98 (d, 1H), 8.20 (dd, 1H), 8.10 (br s, 2H), 7.82-7.72 (m, 2H), 7.69 (d, 2H), 7.59-7.48 (m, 3H), 6.57 (d, 1H), 5.73 (dd, 1H), 3.83 (d, 1H), 3.75-3.65 (m, 2H), 3.51 (t, 5H), 3.20 (d, 4H), 3.00-2.89 (m, 1H), 2.89-2.80 (m, 1H), 2.79-2.71 (m, 1H), 2.05 (d, 1H), 1.66 (q, 1H).
Beispiel 5
Morpholin-4-yl{3-[4-(trifluormethyl)phenyl]-5-[(E)-2-{5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}vinyl]piperidin-1-yl}methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Enantiomerentrennung von 70.0 mg der Verbindung aus Beispiel 2 nach Methode 1C ergab 22.0 mg des Beispiels 5 (Enantiomer 1) und 22.0 mg des Beispiels 6 (Enantiomer 2).
HPLC (Methode 1D): R_t = 4.19 min, > 99.0% ee;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ = 8.92 (d, 1H), 8.16 (dd, 1H), 8.07 (br s, 2H), 7.84-7.65 (m, 4H), 7.63-7.44 (m, 3H), 6.97-6.76 (m, 1H), 6.74-6.62 (m, 1H), 3.78 (d, 1H), 3.68 (d, 1H), 3.58 (br s, 4H), 3.19 (br s, 4H), 3.04-2.94 (m, 1H), 2.94-2.85 (m, 1H), 2.83-2.73 (m, 1H), 2.60 (br s, 1H), 2.09 (d, 1H), 1.75 (q, 1H).
Beispiel 6
Morpholin-4-yl{3-[4-(trifluormethyl)phenyl]-5-[(E)-2-{5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}vinyl]piperidin-1-yl}methanon [enantiomerenreines cis-Isomer]
Enantiomerentrennung von 70.0 mg der Verbindung aus Beispiel 2 nach Methode 1C ergab 22.0 mg des Beispiels 5 (Enantiomer 1) und 22.0 mg des Beispiels 6 (Enantiomer 2).
HPLC (Methode 1D): R_t = 5.28 min, > 92.5% ee;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ = 8.92 (d, 1H), 8.16 (dd, 1H), 8.07 (br s, 2H), 7.83-7.66 (m, 4H), 7.63-7.48 (m, 3H), 6.91-6.78 (m, 1H), 6.74-6.63 (m, 1H), 3.78 (d, 1H), 3.68 (d, 1H), 3.58 (br s, 4H), 3.19 (br s, 4H), 2.97 (d, 1H), 2.94-2.85 (m, 1H), 2.83-2.73 (m, 1H), 2.60 (d, 1H), 2.09 (d, 1H), 1.75 (q, 1H).
Beispiel 7
(3-{(E)-2-[5-(2-Methoxyphenyl)pyridin-2-yl]vinyl}-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl)(morpholin-4-yl)methanon [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 1 wurden 163 mg (0.437 mmol) des Phosphonats aus Beispiel 14A und 135 mg (0.364 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A umgesetzt. Das Rohprodukt wurde mittels Diastereomerentrennung nach Methode 2A gereinigt. Ausbeute: 96.0 mg (47% d. Th.)
LC-MS (Methode 4B): R_t = 1.26 min; MS (ESIpos): m/z = 552 [M+H]⁺;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ = 8.62 (d, 1H), 7.86 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.58 (d, 2H), 7.45 (d, 1H), 7.42-7.33 (m, 2H), 7.15 (d, 1H), 7.06 (t, 1H), 6.82-6.74 (m, 1H), 6.67-6.61 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.75 (br s, 1H), 3.68 (d, 1H), 3.58 (t, 4H), 3.23-3.14 (m, 4H), 3.03-2.94 (m, 1H), 2.94-2.85 (m, 1H), 2.82-2.72 (m, 1H), 2.65-2.57 (m, 1H), 2.18-2.08 (m, 1H), 2.12-2.07 (m, 1H), 1.73 (q, 1H).
Beispiel 8
Morpholin-4-yl{3-[(E)-2-(5-phenylpyridin-2-yl)vinyl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl}methanon [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 1 wurden 100 mg (0.321 mmol) des Phosphonats aus Beispiel 13A und 99 mg (0.267 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A umgesetzt. Das Produkt wurde durch Ausrühren des Rohprodukts in Acetonitril erhalten. Ausbeute: 82.0 mg (58% d. Th.)
LC-MS (Methode 5B): R_t = 1.27 min; MS (ESIpos): m/z = 522 [M+H]⁺;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ = 8.84 (d, 1H), 8.04 (dd, 1H), 7.72 (dd, 4H), 7.58 (d, 2H), 7.53-7.46 (m, 3H), 7.46-7.37 (m, 1H), 6.85-6.76 (m, 1H), 6.70-6.60 (m, 1H), 3.78 (d, 1H), 3.68 (d, 1H), 3.58 (br s, 4H), 3.19 (br s, 4H), 3.02-2.85 (m, 1H), 2.82-2.71 (m, 1H), 2.09 (d, 1H), 1.74 (q, 1H).
Beispiel 9
(3-{(E)-2-[5-(3-Chlorphenyl)pyridin-2-yl]vinyl}-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl)(morpholin-4-yl)methanon [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 1 wurden 165 mg (0.486 mmol) des Phosphonats aus Beispiel 15A und 150 mg (0.405 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A umgesetzt. Ausbeute: 82.0 mg (58% d. Th.)
LC-MS (Methode 5B): R_t = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 556 [M+H]⁺;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ = 8.87 (d, 1H), 8.09 (dd, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.75-7.64 (m, 3H), 7.58 (d, 2H), 7.55-7.44 (m, 3H), 6.87-6.78 (m, 1H), 6.73-6.61 (m, 1H), 3.77 (d, 1H), 3.68 (d, 1H), 3.57 (d, 4H), 3.19 (br s, 4H), 3.04-2.94 (m, 1H), 2.94-2.84 (m, 1H), 2.83-2.72 (m, 1H), 2.60 (d, 1H), 2.08 (d, 1H), 1.74 (q, 1H).
Beispiel 10
{3-[(E)-2-(6-Methoxychinolin-2-yl)vinyl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl}(morpholin-4-yl)methanon [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 1 wurden 100 mg (0.324 mmol) Diethyl-[(6-methoxychinolin-2-yl)methyl]phosphonat [M. C. Clasby et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 1544–1448] und 100 mg (0.270 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A umgesetzt. Das Produkt wurde durch Ausrühren des Rohprodukts in Acetonitril erhalten. Ausbeute: 79.0 mg (58% d. Th.)
LC-MS (Methode 1B): R_t = 1.24 min; MS (ESIpos): m/z = 526 [M+H]⁺;
¹H-NMR (500 MHz, CHCl₃-d): δ = 7.99 (d, 1H), 7.93 (d, 1H), 7.60 (d, 2H), 7.46 (d, 1H), 7.41-7.31 (m, 3H), 7.05 (d, 1H), 6.83-6.73 (m, 1H), 6.73-6.64 (m, 1H), 3.97-3.86 (m, 5H), 3.70 (t, 4H), 3.32 (d, 4H), 3.01 (t, 1H), 2.79 (td, 2H), 2.73-2.61 (m, 1H), 2.26 (d, 1H), 1.73 (q, 1H).
Beispiel 11
Morpholin-4-yl{3-[(E)-2-phenylvinyl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl}methanon [racemisches cis-Isomer]
Nach der Allgemeinen Methode 1 wurden 111 mg (0.486 mmol) Phenylmethanphosphorsäurediethylester und 150 mg (0.405 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A umgesetzt. Das Rohprodukt wurde mittels Diastereomerentrennung nach Methode 3A gereinigt. Ausbeute: 76.8 mg (39% d. Th.)
LC-MS (Methode 4B): R_t = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 445 [M+H]⁺;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ = 7.70 (d, 2H), 7.57 (d, 2H), 7.42 (d, 2H), 7.32 (t, 2H), 7.25-7.15 (m, 1H), 6.52 (d, 1H), 6.28 (dd, 1H), 3.82-3.62 (m, 2H), 3.61-3.42 (m, 6H), 3.18 (d, 4H), 3.05-2.82 (m, 2H), 2.72 (t, 1H), 2.05 (d, 1H), 1.69 (q, 3H).
Beispiel 12
Morpholin-4-yl{3-[(E)-2-(pyridin-4-yl)vinyl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl}methanon [racemisches cis-Isomer]
Unter Argon wurde eine Lösung von 134 mg (0.343 mmol) Triphenyl(pyridin-4-ylmethyl)phosphoniumchlorid [P. Carsky, S. Huenig, I. Stemmler, D. Scheutzow, Liebigs Ann. Chem. 1980, 2, 291–304] in 2.0 ml Tetrahydrofuran bei 0°C langsam mit 35.3 mg (0.315 mmol) Kalium-tert.-butylat versetzt. Nach 10 min wurden 106 mg (0.286 mmol) Aldehyd aus Beispiel 12A in 3.0 ml Tetrahydrofuran zugegeben und anschließend über Nacht gerührt, wobei die Reaktionslösung langsam auf RT erwärmt wurde. Die Reaktion wurde durch langsame Zugabe von gesättigter, wässriger Ammoniumchlorid-Lösung beendet, mit Wasser verdünnt und Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde mittels Diastereomerentrennung nach Methode 4A gereinigt. Ausbeute: 51.8 mg (41% d. Th.)
LC-MS (Methode 4B): R_t = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 446 [M+H]⁺;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ = 8.76 (d, 2H), 7.94 (d, 2H), 7.71 (d, 2H), 7.57 (d, 2H), 7.02 (dd, 1H), 6.77 (d, 1H), 3.81 (d, 1H), 3.67 (d, 1H), 3.57 (d, 4H), 3.19 (d, 4H), 3.05-2.87 (m, 2H), 2.60-2.81 (m, 2H), 2.10 (d, 1H), 1.73 (q, 1H), 1.87-1.61 (m, 1H).
B) Bewertung der physiologischen Wirksamkeit
Abkürzungen:

BSA

Rinderserum-Albumin

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle Medium

EGTA

Ethylenglykol-glykol-bis-(2-aminoäthyl)-N,N,N',N'-tetra-essigsäure

FCS

Fetal Calf Serum

HEPES

4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure

[3H]haTRAP

tritiated high affinity thrombin receptor activating peptide

PRP

Plättchenreiches Plasma

Die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen kann in folgenden Assaysystemen gezeigt werden:
1.) In vitro Assays
1.a) Zellulärer, funktioneller in vitro-Test
Die Identifizierung von Antagonisten des humanen Protease Aktivierten Rezeptors 1 (PAR-1) sowie die Quantifizierung der Wirksamkeit der hier beschriebenen Substanzen erfolgt mit Hilfe einer rekombinanten Zelllinie. Die Zelle leitet sich ursprünglich von einer embryonalen Nierenzelle des Menschen (HEK293; ATCC: American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108, USA) ab. Die Testzelllinie exprimiert konstitutiv eine modifizierte Form des calciumsensitiven Photoproteins Aequorin, das nach Rekonstitution mit dem Co-Faktor Coelenterazin bei Erhöhungen der freien Calcium-Konzentration im inneren mitochondrialen Kompartiment Licht emittiert (Rizzuto R, Simpson AW, Brini M, Pozzan T.; Nature 1992, 358, 325–327). Zusätzlich exprimiert die Zelle stabil den endogenen humanen PAR-1-Rezeptor sowie den endogenen purinergen Rezeptor P2Y2. Die resultierende PAR-1-Testzelle reagiert auf Stimulation des endogenen PAR-1 oder P2Y2-Rezeptors mit einer intrazellulären Freisetzung von Calcium-Ionen, die durch die resultierende Aequorin-Lumineszens mit einem geeigneten Luminometer quantifiziert werden kann (Milligan G, Marshall F, Rees S, Trends in Pharmacological Sciences 1996, 17, 235–237).
Für die Prüfung der Substanz-Spezifität wird deren Wirkung nach Aktivierung des endogenen PAR-1-Rezeptors mit der Wirkung nach Aktivierung des endogenen purinergen P2Y2-Rezeptors verglichen, der den gleichen intrazellulären Signalweg nutzt.
Testablauf: Die Zellen werden zwei Tage (48 Std.) vor dem Test in Kulturmedium (DMEM F12, ergänzt mit 10% FCS, 2 mM Glutamine, 20 mM HEPES, 1.4 mM Pyruvat, 0.1 mg/ml Gentamycin, 0.15% Na-Bicarbonat; BioWhittaker Cat.# BE04-687Q; B-4800 Verviers, Belgien) in 384-Loch-Mikrotiterplatten ausplattiert und in einem Zellinkubator (96% Luftfeuchtigkeit, 5% v/v CO₂, 37°C) gehalten. Am Testtag wird das Kulturmedium durch eine Tyrodelösung (in mM: 140 Natriumchlorid, 5 Kaliumchlorid, 1 Magnesiumchlorid, 2 Calciumchlorid, 20 Glucose, 20 HEPES), das zusätzlich den Co-Faktor Coelenterazin (25 μM) und Glutathion (4 mM) enthält, ausgetauscht und die Mikrotiterplatte anschließend für weitere 3–4 Stunden inkubiert. Dann werden die Testsubstanzen auf die Mikrotiterplatte pipettiert und 5 Minuten nach Übertragung der Testsubstanzen in die Wells der Mikrotiterplatte wird die Platte in das Luminometer transferiert, eine PAR-1-Agonist-Konzentration, die EC₅₀ entspricht, zugeschossen und sofort das resultierende Lichtsignal im Luminometer gemessen. Zur Unterscheidung einer Antagonist-Substanzwirkung von einer toxischen Wirkung wird unmittelbar anschließend der endogene purinerge Rezeptor mit Agonist aktiviert (ATP, 10 μM Endkonzentration) und das resultierende Lichtsignal gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle A gezeigt: Tabelle A:

Beispiel-Nr. IC₅₀ [nm]

5 2.0

7 1.9

9 2.2
1.b) PAR-1 Rezeptor Bindungsassay
Thrombozytenmembranen werden mit 12 nM [3H]haTRAP und Testsubstanz in verschiedenen Konzentrationen in einem Puffer (50 mM Tris pH 7.5, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM EGTA, 0.1% BSA) bei Raumtemperatur für 80 min inkubiert. Danach wird der Ansatz auf eine Filterplatte übertragen und zweimal mit Puffer gewaschen. Nach Zugabe von Scintillationsflüssigkeit wird die Radioaktivität auf dem Filter in einem beta-Counter vermessen.
1.c) Thrombozytenaggregation in Plasma
Zur Bestimmung der Thrombozytenaggregation wird Blut von gesunden Probanden beiderlei Geschlechts, die innerhalb der letzten zehn Tage keine die Thrombozytenaggregation beeinflussende Medikation erhalten hatten, verwendet. Das Blut wird in Monowetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) die als Antikoagulans Natrium Citrat 3.8% (1 Teil Citrat + 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen. Zur Gewinnung von plättchenreichem Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140 g für 20 min zentrifugiert.
Für die Aggregationsmessungen werden Aliquots des plättchenreichen Plasmas mit aufsteigenden Konzentrationen an Prüfsubstanz 10 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Aggregation durch Zugabe eines Thrombin-Rezeptor Agonisten (TRAP6, SFLLRN) in einem Aggregometer ausgelöst und mittels der turbidimetrischen Methode nach Born (Born, G. V. R., Cross M. J., The Aggregation of Blood Platelets; J. Physiol. 1963, 168, 178–195) bei 37°C bestimmt. Die SFLLRN-Konzentration, die zur maximalen Aggregation führt, wird gegebenenfalls jeweils für jeden Spender individuell ermittelt.
Zur Berechnung der inhibitorischen Wirkung wird die maximale Zunahme der Lichttransmission (Amplitude der Aggregationskurve in %) innerhalb 5 Minuten nach Zugabe des Agonisten in Gegenwart und Abwesenheit von Prüfsubstanz ermittelt und die Inhibition berechnet. Aus den Inhibitionskurven wird die Konzentration berechnet, die die Aggregation zu 50% hemmt.
1.d) Thrombozytenaggregation in Puffer
Zur Bestimmung der Thrombozytenaggregation wird Blut von gesunden Probanden beiderlei Geschlechts, die innerhalb der letzten zehn Tage keine die Thrombozytenaggregation beeinflussende Medikation erhalten hatten, verwendet. Das Blut wird in Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) die als Antikoagulans Natriumcitrat 3.8% (1 Teil Citrat + 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen. Zur Gewinnung von plättchenreichem Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140 g für 20 min zentrifugiert. Zu dem PRP wird ein Viertel des Volumens ACD-Puffer (44.8 mM Natriumcitrat, 20.9 mM Citronensäure, 74.1 mM Glucose und 4 mM Kaliumchlorid) zugegeben und 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Das Thrombozyten-Pellet wird mit Wasch-Puffer resuspendiert und 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Die Thrombozyten werden in Inkubation-Puffer resuspendiert und auf 200000 Z/μl eingestellt. Vor Versuchsbeginn wird Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, Endkonzentration je 2 mM (Stammlösung 2 M, 1:1000 Verdünnung) zugegeben. Besonderheit: bei ADP-induzierter Aggregation wird nur Calciumchlorid zugegeben. Folgende Agonisten können eingesetzt werden: TRAP6-Trifluoracetat- Salz, Kollagen, Humanes α-Thrombin und U-46619. Die Konzentration des Agonisten wird zu jedem Spender ausgetestet.
Testdurchführung: Es werden 96er-Loch Mikrotiterplatten verwendet. Die Prüfsubstanz wird in DMSO verdünnt und 2 μl je Loch vorgelegt. 178 μl Thrombozyten-Suspension werden zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert. 20 μl Agonist werden zugegeben und die Messung im Spectramax, OD 405 nm, sofort gestartet. Die Kinetik wird in 11 Messungen von je 1 Minute bestimmt. Zwischen den Messungen wird 55 Sekunden geschüttelt.
1.e) Thrombozytenaggregation in fibrinogendepletiertem Plasma
Zur Bestimmung der Thrombozytenaggregation wird Blut von gesunden Probanden beiderlei Geschlechts, die innerhalb der letzten zehn Tage keine die Thrombozytenaggregation beeinflussende Medikation erhalten hatten, verwendet. Das Blut wird in Monowetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) die als Antikoagulans Natriumcitrat 3.8% (1 Teil Citrat + 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen.
Herstellung von fibrinogendepletiertem Plasma: Zur Gewinnung von plättchenarmem Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140 g für 20 min abzentrifugiert. Das plättchenarme Plasma wird im Verhältnis 1:25 mit Reptilase (Roche Diagnostic, Deutschland) versetzt und vorsichtig invertiert. Es folgen 10 min Inkubation bei 37°C im Wasserbad mit direkt folgender Inkubation auf Eis für 10 min. Das Plasma-Reptilase Gemisch wird bei 1300 g für 15 min zentrifugiert und der Überstand (fibrinogendepletiertes Plasma) wird gewonnen.
Thrombozyten-Isolierung: Zur Gewinnung von plättchenreichem Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140 g für 20 min zentrifugiert. Zu dem PRP wird ein Viertel des Volumens ACD-Puffer (44.8 mM Natriumcitrat, 20.9 mM Citronensäure, 74.1 mM Glucose und 4 mM Kaliumchlorid) zugegeben und 10 Minuten bei 1300 g zentrifugiert. Das Thrombozyten-Pellet wird mit Wasch-Puffer resuspendiert und 10 Minuten bei 1300 g zentrifugiert. Die Thrombozyten werden in Inkubation-Puffer resuspendiert und auf 400000 Z/μl eingestellt und Calciumchloridlösung mit einer Endkonzentration von 5 mM (1/200 Verdünnung) zugegeben.
Für die Aggregationsmessungen werden Aliquots (98 μl fibrinogendepletiertes Plasma und 80 μl Thrombozytensuspension) mit aufsteigenden Konzentrationen an Prüfsubstanz 10 min bei RT inkubiert. Anschließend wird die Aggregation durch Zugabe von humanem alpha Thrombin in einem Aggregometer ausgelöst und mittels der turbidimetrischen Methode nach Born (Born, G. V. R., Cross M. J., The Aggregation of Blood Platelets; J. Physiol. 1963, 168, 178–195) bei 37°C bestimmt. Die alpha Thrombin Konzentration, die gerade eben zur maximalen Aggregation führt, wird jeweils für jeden Spender individuell ermittelt.
Zur Berechnung der inhibitorischen Wirkung wird die Zunahme der maximalen Lichttransmission (Amplitude der Aggregationskurve in %) innerhalb 5 Minuten nach Zugabe des Agonisten in Gegenwart und Abwesenheit von Prüfsubstanz ermittelt und die Ihnibition berechnet. Aus den Inhibitionskurven wird die Konzentration berechnet, die die Aggregation zu 50% hemmt.
1.f) Stimulation gewaschener Thrombozyten und Analyse in der Durchflusszytometrie
Isolierung gewaschener Thrombozyten: Humanes Vollblut wird mittels Venenpunktion von freiwilligen Spender gewonnen und in Monowetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) überführt, die als Antikoagulans Natriumcitrat enthalten (1 Teil Natriumcitrat 3.8% + 9 Teile Vollblut). Die Monowetten werden bei 900 Umdrehungen pro Minute und 4°C über einen Zeitraum von 20 Minuten zentrifugiert (Heraeus Instruments, Deutschland; Megafuge 1.0RS). Das plättchenreiche Plasma wird vorsichtig abgenommen und in ein 50 ml-Falconröhrchen überführt. Nun wird das Plasma mit ACD-Puffer (44 mM Natriumcitrat, 20.9 mM Zitronensäure, 74.1 mM Glucose) versetzt. Das Volumen des ACD-Puffers entspricht einem Viertel des Plasmavolumens. Durch zehnminütige Zentrifugation bei 2500 Umdrehungen und 4°C werden die Thrombozyten sedimentiert. Danach wird der Überstand vorsichtig abdekantiert und verworfen. Die präzipitierten Thrombozyten werden zunächst vorsichtig mit einem Milliliter Waschpuffer (113 mM Natriumchlorid, 4 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 24 mM Natriumdihydrogenphosphat, 4 mM Kaliumchlorid, 0.2 mM Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure, 0.1% Glucose) resuspendiert und dann mit Waschpuffer auf ein Volumen aufgefüllt, das dem der Plasmamenge entspricht. Der Waschvorgang wird ein zweites Mal durchgeführt. Nachdem die Thrombozyten durch eine erneute zehnminütige Zentrifugation bei 2500 Umdrehungen und 4°C präzipitiert worden sind, werden sie vorsichtig in einem Milliliter Inkubationspuffer (134 mM Natriumchlorid, 12 mM Natriumhydrogencarbonat, 2.9 mM Kaliumchlorid, 0.34 mM Natriumdihydrogencarbonat, 5 mM HEPES, 5 mM Glucose, 2 mM Calciumchlorid und 2 mM Magnesiumchlorid) resuspendiert und mit Inkubationspuffer auf eine Konzentration von 300.000 Thrombozyten pro μl eingestellt.
Färbung und Stimulierung der humanen Thrombozyten mit humanem α-Thrombin in Gegenwart oder Abwesenheit eines PAR-1-Antagonisten: Die Thrombozytensuspension wird mit der zu prüfenden Substanz bzw. des entsprechenden Lösungsmittels für 10 Minuten bei 37°C vorinkubiert (Eppendorf, Deutschland; Thermomixer Comfort). Durch Zugabe des Agonisten (0.5 μM bzw. 1 μM α-Thrombin; Kordia, Niederlande, 3281 NIH Units/mg; oder 30 μg/ml Thrombin receptor activating peptide (TRAP6); Bachem, Schweiz) bei 37° und unter Schütteln von 500 Umdrehungen pro Minute wird die Thrombozytenaktivierung ausgelöst. Zu den Zeitpunkten 0, 1, 2.5, 5, 10 und 15 Minuten wird jeweils ein Aliquot von 50 μl entnommen und in einen Milliliter einfach-konzentrierte CellFix^TM-Lösung (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, USA) überführt. Zur Fixierung der Zellen werden sie 30 Minuten bei 4°C in der Dunkelheit inkubiert. Durch eine zehnminütige Zentrifugation bei 600 g und 4°C werden die Thrombozyten präzipitiert. Der Überstand wird verworfen und die Thrombozyten werden in 400 μl CellWash^TM (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, USA) resuspendiert. Ein Aliquot von 100 μl wird in ein neues FACS-Röhrchen überführt. 1 μl des thrombozyten-identifizierenden Antikörpers und 1 μl des aktivierungszustands-detektierenden Antikörpers werden mit CellWash^TM auf ein Volumen von 100 μl aufgefüllt. Diese Antikörperlösung wird dann zur Thrombozytensuspension gegeben und 20 Minuten bei 4°C in der Dunkelheit inkubiert. Im Anschluss an die Färbung wird das Ansatzvolumen durch Zugabe von weiteren 400 μl CellWash^TM erhöht.
Zur Identifizierung der Thrombozyten wird ein fluorescein-isothiocyanat-konjugierter Antikörper eingesetzt, der gegen das humane Glykoprotein IIb (CD41) gerichtet ist (Immunotech Coulter, Frankreich; Cat. No. 0649). Mit Hilfe des phycoerythrin-konjugierten Antikörpers, der gegen das humane Glykoprotein P-Selektin (Immunotech Coulter, Frankreich; Cat. No. 1759) gerichtet ist, lässt sich der Aktivierungszustand der Thrombozyten bestimmen. P-Selektin (CD62P) ist in den α-Granula ruhender Thrombozyten lokalisiert. Es wird jedoch nach in-vitro- bzw. in-vivo-Stimulierung zur äußeren Plasmamembran translokalisiert.
Durchflusszytometrie und Auswertung der Daten: Die Proben werden im Gerät FACSCalibur^TM Flow Cytometry System der Firma Becton Dickinson Immunocytometry Systems, USA, vermessen und mit Hilfe der Software CellQuest, Version 3.3 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, USA) ausgewertet und graphisch dargestellt. Das Maß der Thrombozytenaktivierung wird durch den Prozentsatz der CD62P-positiven Thrombozyten (CD41-positive Ereignisse) bestimmt. Es werden von jeder Probe 10.000 CD41-positive Ereignisse gezählt.
Die inhibitorische Wirkung der zu prüfenden Substanzen wird anhand der Reduktion der Thrombozytenaktivierung berechnet, die sich auf die Aktivierung durch den Agonisten bezieht.
1.g) Thrombozytenaggregationsmessung mit der Parallelplattenflußkammer
Zur Bestimmung der Thrombozytenaggregation wird Blut von gesunden Probanden beiderlei Geschlechts, die innerhalb der letzten zehn Tage keine die Thrombozytenaggregation beeinflussende Medikation erhalten hatten, verwendet. Das Blut wird in Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) die als Antikoagulans Natriumcitrat 3.8% (1 Teil Citrat + 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen. Zur Gewinnung von plättchenreichem Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140 g für 20 min zentrifugiert. Zu dem PRP wird ein Viertel des Volumens ACD-Puffer (44.8 mM Natriumcitrat, 20.9 mM Citronensäure, 74.1 mM Glucose und 4 mM Kaliumchlorid) zugegeben und 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Das Thrombozyten-Pellet wird mit Wasch-Puffer resuspendiert und 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Für die Perfusionsstudie wird eine Mischung von 40% Erythrozyten und 60% gewaschene Thrombozyten (200.000/μl) hergestellt und in HEPES-Tyrode Puffer suspendiert. Die Messung der Thrombozytenaggregation unter Flußbedingungen wird mittels der Parallelplattenflußkammer durchgeführt (B. Nieswandt et al., EMBO J. 2001, 20, 2120–2130; C. Weeterings, Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 2006, 26, 670–675; JJ Sixma, Thromb. Res. 1998, 92, 43–46). Glasobjektträger werden mit 100 μl humaner α-Thrombinlösung (gelöst in Tris-Puffer) über Nacht bei 4°C benetzt (α-Thrombin in verschiedenen Konzentrationen, z. B. 10 bis 50 μg/ml) und abschließend mittels 2% BSA abgeblockt.
Rekonstituiertes But wird über die Thrombin-benetzten Glasobjektträger über 5 Minuten mit konstanter Flußrate geleitet (z. B. Scherrate 300/Sekunde) und mittels Mikroskop-Videosystem beobachtet und aufgezeichnet. Die inhibitorische Wirkung der zu prüfenden Substanzen wird morphometrisch anhand der Reduktion der Plättchenaggregatsbildung ermittelt. Alternativ kann die Inhibierung der Plättchenaktivierung durch Durchflußzytometrie, z. B. über p-Selektin-Expression (CD62p), bestimmt werden (siehe Methode 1.f).
2.) Ex vivo Assay
2.a) Thrombozytenaggregation (Primaten, Meerschweinchen)
Meerschweinchen oder Primaten werden in wachem oder narkotisiertem Zustand oral, intravenös oder intraperitoneal mit Prüfsubstanzen in geeigneter Formulierung behandelt. Als Kontrolle werden andere Meerschweinchen oder Primaten in identischer Weise mit dem entsprechenden Vehikel behandelt. Nach je nach Applikationsart unterschiedlich langer Zeit wird aus den tief narkotisierten Tieren Blut durch Punktion des Herzens oder der Aorta gewonnen. Das Blut wird in Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) die als Antikoagulans Natriumcitrat 3.8% (1 Teil Citratlösung + 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen. Zur Gewinnung von plättchenreichem Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140 g für 20 min zentrifugiert.
Die Aggregation wird durch Zugabe eines Thrombin-Rezeptor Agonisten (TRAP6, SFLLRN, 50 μg/ml; Konzentration wird in jedem Experiment je nach Tierart ermittelt) in einem Aggregometer ausgelöst und mittels der turbidimetrischen Methode nach Born (Born, G. V. R., Cross M. J., The Aggregation of Blood Platelets; J. Physiol. 1963, 168, 178–195) bei 37°C bestimmt.
Zur Aggregationsmessung wird die maximale Zunahme der Lichttransmission (Amplitude der Aggregationskurve in %) innerhalb 5 Minuten nach Zugabe des Agonisten ermittelt. Die inhibitorische Wirkung der verabreichten Prüfsubstanzen in den behandelten Tieren wird durch die Reduktion der Aggregation, bezogen auf den Mittelwert der Kontrolltiere, berechnet.
3.) In vivo Assays
3.a) Thrombosemodelle
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Thrombosemodellen in geeigneten Tierspezies, in denen die Thrombin-induzierte Plättchenaggregation über den PAR-1-Rezeptor vermittelt wird, untersucht werden. Als Tierspezies eignen sich Meerschweinchen und insbesondere Primaten (vergleiche: Lindahl, A. K., Scarborough, R. M., Naughton, M. A., Harker, L. A., Hanson, S. R., Thromb Haemost 1993, 69, 1196; Cook JJ, Sitko GR, Bednar B, Condra C, Mellott MJ, Feng D-M, Nutt RF, Shager JA, Gould RJ, Connolly TM, Circulation 1995, 91, 2961–2971; Kogushi M, Kobayashi H, Matsuoka T, Suzuki S, Kawahara T, Kajiwara A, Hishinuma I, Circulation 2003, 108 Suppl. 17, IV-280; Derian CK, Damiano BP, Addo MF, Darrow AL, D'Andrea MR, Nedelman M, Zhang H-C, Maryanoff BE, Andrade-Gordon P, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 304, 855–861). Alternativ können Meerschweinchen verwendet werden, die mit Inhibitoren von PAR-3 und/oder PAR-4 vorbehandelt werden (Leger AJ et al., Circulation 2006, 113, 1244–1254), oder transgene PAR-3- und/oder PAR-4-Knockdown-Meerschweinchen.
3.b) Gerinnungsstörung und Organdysfunktion bei Disseminierter Intravasaler Gerinnung (DIC)
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Modellen für DIC und/oder Sepsis in geeigneten Tierspezies untersucht werden. Als Tierspezies eignen sich Meerschweinchen und insbesondere Primaten, bei Untersuchung der endothelvermittelten Effekte auch Mäuse und Ratten (vergleiche: Kogushi M, Kobayashi H, Matsuoka T. Suzuki S, Kawahara T, Kajiwara A, Hishinuma I, Circulation 2003, 108 Suppl. 17, IV-280; Derian CK, Damiano BP, Addo MF, Darrow AL, D'Andrea MR, Nedelman M, Zhang H-C, Maryanoff BE, Andrade-Gordon P. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 304, 855–861; Kaneider NC et al., Nat Immunol, 2007, 8, 1303–12; Camerer E et al., Blood, 2006, 107, 3912–21; Riewald M et al., J Biol Chem, 2005, 280, 19808–14.). Alternativ können Meerschweinchen verwendet werden, die mit Inhibitoren von PAR-3 und/oder PAR-4 vorbehandelt werden (Leger AJ et al., Circulation 2006, 113, 1244–1254), oder transgene PAR-3- und/oder PAR-4-Knockdown-Meerschweinchen.
3.b.1) Thrombin-Antithrombin-Komplexe
Thrombin-Antithrombin-Komplexe (nachfolgend als „TAT” bezeichnet) sind ein Maß für das durch Gerinnungsaktivierung endogen gebildete Thrombin. TAT werden mittels eines ELISA-Assays bestimmt (Enzygnost TAT micro, Dade-Behring). Aus Citratblut wird durch Zentrifugation Plasma gewonnen. Zu 50 μl Plasma wird 50 μl TAT-Probenpuffer gegeben, kurz geschüttelt und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben werden abgesaugt, und das Well 3-malig mit Waschpuffer gewaschen (300 μl/Well). Die Platte wird zwischen den Waschgängen abgeklopft. Es wird Konjugatlösung (100 μl) hinzugegeben und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben werden abgesaugt, und das Well 3-malig mit Waschpuffer gewaschen (300 μl/Well). Anschließend wird chromogenes Susbtrat hinzugegeben (100 μl/Well), 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert, Stopplösung hinzugegeben (100 μl/Well), und die Farbbildung bei 492 nm gemessen (Saphire Plate reader).
3.b.2) Parameter für Organdysfunktion
Es werden verschiedene Parameter bestimmt, aufgrund derer Rückschlüsse auf die Funktionseinschränkung verschiedener innerer Organe durch die LPS-Gabe gezogen werden können, und der therapeutische Effekt von Prüfsubstanzen abgeschätzt werden kann. Citratblut oder ggf. Lithium-Heparin-Blut wird zentrifugiert, und die Parameter aus dem Plasma bestimmt. Folgende Parameter werden typischerweise erhoben: Kreatinin, Harnstoff, Aspartat-Aminotransferase (AST), Alanin-Aminotransferase (ALT), Gesamt-Bilirubin, Laktatdehydrogenase (LDH), Gesamt-Protein, Gesamt-Albumin und Fibrinogen. Die Werte geben Aufschluss auf die Funktion der Niere, der Leber, des Kreislaufes und der Gefäße.
3.b.3) Parameter für Entzündung
Das Ausmaß der durch Endotoxin ausgelösten Entzündungsreaktion lässt sich aus dem Anstieg von Entzündungsmediatoren im Plasma nachweisen, z. B. Interleukine (1, 6, 8 und 10), Tumomekrosefaktor alpha oder Monocyte Chemoattractant Protein-1. Hierzu können ELISAs oder das Luminex-System verwendet werden.
3.c) Antitumor Wirksamkeit
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Modellen für Krebs getestet werden, z. B. im humanen Brustkrebs-Modell in immundefizienten Mäusen (vergleiche: S. Even-Ram et. al., Nature Medicine, 1988, 4, 909–914).
3.d) Antiangiogenetische Wirksamkeit
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in in vitro und in vivo Modellen für Angiogenese getestet werden (vergleiche: Caunt et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2003, 10, 2097–2102; Haralabopoulos et al., Am J Physiol, 1997, C239–C245; Tsopanoglou et al., JBC, 1999, 274, 23969–23976; Zania et al., JPET, 2006, 318, 246–254).
3.e) Blutdruck- und Herzfrequenz-modulierende Wirkung
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in in vivo Modellen hinsichtlich Ihrer Wirkung auf den arteriellen Blutdruck und die Herzfrequenz untersucht werden. Hierzu werden Ratten (z. B. Wistar) mit implantierbaren Radiotelemetrieeinheiten instrumentiert, und es wird ein elektronisches Datenaquisitions- und Speicherungs-System (Data Sciences, MN, USA), bestehend aus einem chronisch implantierbaren Transducer/Transmitter-Einheit in Verbindung mit einem Flüssigkeits-gefüllten Katheter, verwendet. Der Transmitter wird in die Peritonealhöhle implantiert und der Sensor-Katheter in der deszendierenden Aorta positioniert. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können appliziert werden (z. B. oral oder intravenös). Vor Behandlung wird der mittlere arterielle Blutdruck und die Herzfrequenz der unbehandelten und behandelten Tiere gemessen und sichergestellt, dass diese im Bereich von ca. 131–142 mmHg und 279–321 Schläge/Minute liegen. PAR-1-aktivierendes Peptid (SFLLRN; z. B. Dosen zwischen 0.1 und 5 mg/kg) wird intravenös verabreicht. Der Blutdruck und die Herzfrequenz werden in verschiedenen Zeitintervallen und Zeiträumen mit und ohne PAR-1-aktivierendem Peptid sowie mit und ohne einer der erfindungsgemäßen Verbindungen gemessen (vergleiche: Cicala C et al., The FASER Journal, 2001, 15, 1433–5; Stasch JP et al., British Journal of Pharmacology 2002, 135, 344–355).
4.) Bestimmung der Löslichkeit
Herstellung der Ausgangslösung (Urlösung):
Mindestens 1.5 mg der Testsubstanz werden in ein Wide Mouth 10 mm Screw V-Vial (Fa. Glastechnik Gräfenroda GmbH, Art.-Nr. 8004-WM-H/V15 μ) mit passender Schraubkappe und Septum genau eingewogen, mit DMSO zu einer Konzentration von 50 mg/ml versetzt und 30 Minuten mittels eines Vortexers geschüttelt.
Herstellung der Kalibrierlösungen:
Die notwendigen Pipettierschritte erfolgen in 1.2 ml 96er Deep Well Plate (DWP) mittels eines Liquid-Handling-Roboters. Als Lösemittel wird ein Gemisch aus Acetonitril/Wasser 8:2 verwendet.
Herstellung der Ausgangslösung für Kalibrierlösungen (Stammlösung): 10 μl der Urlösung werden mit 833 μl des Lösemittelgemisch versetzt (Konzentration = 600 μg/ml) und homogenisiert. Es werden von jeder Testsubstanz 1:100 Verdünnungen in separaten DWP's hergestellt und wiederum homogenisiert.

Kalibrierlösung 5 (600 ng/ml): 30 μl der Stammlösung werden mit 270 μl Lösemittelgemisch versetzt und homogenisiert.
Kalibrierlösung 4 (60 ng/ml): 30 μl der Kalibrierlösung 5 werden mit 270 μl Lösemittelgemisch versetzt und homogenisiert.
Kalibrierlösung 3 (12 ng/ml): 100 μl der Kalibrierlösung 4 werden mit 400 μl Lösemittelgemisch versetzt und homogenisiert.
Kalibrierlösung 2 (1.2 ng/ml): 30 μl der Kalibrierlösung 3 werden mit 270 μl Lösemittelgemisch versetzt und homogenisiert.
Kalibrierlösung 1 (0.6 ng/ml): 150 μl der Kalibrierlösung 2 werden mit 150 μl Lösemittelgemisch versetzt und homogenisiert.

Herstellung der Probenlösungen:
Die notwendigen Pipettierschritte erfolgen in 1.2 ml 96er DWP mittels eines Liquid-Handling-Roboters. 10.1 μl der Stammlösung werden mit 1000 μl PBS-Puffer pH 6.5 versetzt. (PBS-Puffer pH 6.5: 61.86 g Natriumchlorid, 39.54 g Natriumdihydrogenphosphat und 83.35 g 1 N Natronlauge werden in einen 1 Liter-Messkolben eingewogen, mit Wasser aufgefüllt und ca. 1 Stunde gerührt. Von dieser Lösung werden 500 ml in einen 5 Liter-Messkolben gegeben und mit Wasser aufgefüllt. Es wird mit 1 N Natronlauge auf pH 6.5 einstellen.)
Durchführung:
Die notwendigen Pipettierschritte erfolgen in 1.2 ml 96er DWP mittels eines Liquid-Handling-Roboters. Die so hergestellten Probenlösungen werden 24 Stunden bei 1400 rpm mittels eines temperierbaren Schüttlers bei 20°C geschüttelt. Von diesen Lösungen werden jeweils 180 μl abgenommen und in Beckman Polyallomer Centrifuge Tubes überführt. Diese Lösungen werden 1 Stunde mit ca. 223.000 × g zentrifugiert. Von jeder Probenlösung werden 100 μl des Überstandes abgenommen und 1:10 und 1:1000 mit PBS-Puffer 6.5 verdünnt.
Analytik:
Die Proben werden mittels HPLC/MS-MS analysiert. Quantifiziert wird über eine Fünf-Punkt-Kalibrationskurve der Testverbindung. Die Löslichkeit wird in mg/l ausgedrückt. Analysensequenz: 1) Blank (Lösemittelgemisch); 2) Kalibrierlösung 0.6 ng/ml; 3) Kalibrierlösung 1.2 ng/ml; 4) Kalibrierlösung 12 ng/ml; 5) Kalibrierlösung 60 ng/ml; 6) Kalibrierlösung 600 ng/ml; 7) Blank (Lösemittelgemisch); 8) Probenlösung 1:1000; 9) Probenlösung 1:10.
HPLC/MS-MSMethode:

HPLC: Agilent 1100, quat. Pumpe (G1311A), Autosampler CTC HTS PAL, Degaser (G1322A) und Säulenthermostat (G1316A); Säule: Oasis HLB 20 mm × 2.1 mm, 25 μ; Temperatur: 40°C; Eluent A: Wasser + 0.5 ml Ameisensäure/l; Eluent B: Acetonitril + 0.5 ml Ameisensäure/l; Flussrate: 2.5 ml/min; Stoptime 1.5 min; Gradient: 0 min 95% A, 5% B; Rampe: 0–0.5 min 5% A, 95% B; 0.5–0.84 min 5% A, 95% B; Rampe: 0.84–0.85 min 95% A, 5% B; 0.85–1.5 min 95% A, 5% B.
MS/MS: WATERS Quattro Micro Tandem MS/MS; Z-Spray API-Interface; HPLC-MS-Eingangssplitter 1:20; Messung im ESI-Mode.

C) Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäßen Substanzen können folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:
Tablette:
Zusammensetzung:
100 mg der Verbindung des Beispiels 1, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke, 10 mg Polyvinylpyrolidon (PVP 25) (Fa. BASF, Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.
Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm.
Herstellung:
Die Mischung aus der Verbindung des Beispiels 1, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat für 5 min. gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben).
Orale Suspension:
Zusammensetzung:
1000 mg der Verbindung des Beispiels 1, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel (Xanthan gum) (Fa. FMC, USA) und 99 g Wasser.
Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Suspension.
Herstellung:
Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, die Verbindung des Beispiels 1 wird der Suspension zugefügt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluss der Quellung des Rhodigels wird ca. 6 h gerührt.
Intravenös applizierbare Lösung:
Zusammensetzung:
1 mg der Verbindung von Beispiel 1, 15 g Polyethylenglykol 400 und 250 g Wasser für Injektionszwecke.
Herstellung:
Die Verbindung von Beispiel 1 wird zusammen mit Polyethylenglykol 400 in dem Wasser unter Rühren gelöst. Die Lösung wird sterilfiltriert (Porendurchmesser 0.22 μm) und unter aseptischen Bedingungen in hitzesterilisierte Infusionsflaschen abgefüllt. Diese werden mit Infusionsstopfen und Bördelkappen verschlossen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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- WO 2007/130898 [0013]
- WO 2007/101270 [0013]

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Claims

Verbindung der Formel
in welcher R¹ für Phenyl steht, wobei Phenyl substituiert sein kann mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Monofluormethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl, Monofluormethoxy, Difluormethoxy, Trifluormethoxy, Monofluormethylsulfanyl, Difluormethylsulfanyl, Trifluormethylsulfanyl, Methylsulfonyl, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy und C₁-C₄-Alkoxycarbonyl, R² für Phenyl, Naphtyl oder 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl steht, wobei Phenyl, Naphtyl und Heteroaryl substituiert sein können mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Hydroxy, Amino, Monofluormethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl, Monofluormethoxy, Difluormethoxy, Trifluormethoxy, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, C₁-C₆-Alkylamino, Phenyl und 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, worin Phenyl und Heteroaryl substituiert sein können mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Hydroxy, Amino, Monofluormethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl, Monofluormethoxy, Difluormethoxy, Trifluormethoxy, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy und C₁-C₆-Alkylamino, R³ für C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Alkoxy, C₁-C₆-Alkylamino, C₃-C₇-Cycloalkyl, 4- bis 7-gliedriges Heterocyclyl, Phenyl, 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, C₃-C₇-Cycloalkyloxy, C₃-C₇-Cycloalkylamino, 4- bis 7-gliedriges Heterocyclylamino, Phenylamino oder 5- oder 6-gliedriges Heteroarylamino steht, wobei Alkyl, C₂-C₆-Alkoxy und Alkylamino substituiert sein können mit einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy, Amino, Cyano, C₁-C₄-Alkoxy, C₁-C₄-Alkoxycarbonyl, C₃-C₇-Cycloalkyl, 4- bis 6-gliedriges Heterocyclyl, Phenyl und 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, und wobei Cycloalkyl, Heterocyclyl, Phenyl, Heteroaryl, Cycloalkyloxy, Cycloalkylamino, Heterocyclylamino, Phenylamino und Heteroarylamino substituiert sein können mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Oxo, Hydroxy, Amino, Monofluormethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl, Monofluormethoxy, Difluormethoxy, Trifluormethoxy, Monofluormethylsulfanyl, Difluormethylsulfanyl, Trifluormethylsulfanyl, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, C₁-C₆-Alkylamino, C₁-C₄-Alkoxycarbonyl, C₁-C₄-Alkylaminocarbonyl und Cyclopropyl, worin Alkyl substituiert sein kann mit einem Substituenten Hydroxy, oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ für Phenyl steht, wobei Phenyl substituiert ist mit 1 bis 2 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Methyl, Ethyl und Methoxy, R² für Phenyl, Pyridyl oder Chinolinyl steht, wobei Phenyl, Pyridyl und Chinolinyl substituiert sein können mit einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy, Phenyl und Pyridyl, worin Phenyl und Pyridyl substituiert sein können mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Methyl, Ethyl, Methoxy und Ethoxy, R³ für Morpholin-4-yl, 1,1-Dioxidothiomorpholin-4-yl, 3-Hydroxyazetidiny-1-yl, 3-Hydroxypyrrolidin-1-yl, 4-Cyanopiperidin-1-yl oder 4-Hydroxypiperidin-1-yl steht, oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ für Phenyl steht, wobei Phenyl substituiert ist mit einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trifluormethyl und Ethyl, R² für Phenyl, Pyridyl oder Chinolinyl steht, wobei Phenyl und Pyridyl substituiert sein können mit einem Substituenten Phenyl, worin Phenyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Trifluormethyl und Methoxy, und wobei Chinolinyl substituiert ist mit einem Substituenten Methoxy, R³ für Morpholin-4-yl steht, oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten -R¹ und -CH=CH-R² in cis-Position zueinander stehen.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel
in welcher R¹ und R³ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung aufweisen, mit einer Verbindung der Formel
in welcher R² die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung aufweist, und Y für -P(=O)(OCH₂CH₃)₂ oder -P⁺(Phenyl)₃X^– steht, wobei X^– für eine Halogenid, bevorzugt Bromid oder Chlorid, steht, umgesetzt wird.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, thromboembolischen Erkrankungen und/oder von Tumorerkrankungen.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verhinderung der Blutkoagulation in vitro.
Arzneimittel enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit einem inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff.
Arzneimittel enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit einem weiteren Wirkstoff.
Arzneimittel nach Anspruch 10 oder 11 zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, thromboembolischen Erkrankungen und/oder von Tumorerkrankungen.
Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von thromboembolischen Erkrankungen bei Menschen und Tieren unter Verwendung einer antikoagulatorisch wirksamen Menge mindestens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 10 bis 12 oder eines nach Anspruch 7 oder 8 erhaltenen Arzneimittels.
Verfahren zur Verhinderung der Blutkoagulation in vitro, dadurch gekennzeichnet, dass eine antikoagulatorisch wirksame Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zugegeben wird.