-
Die
Erfindung betrifft neue substituierte Piperidine, Verfahren zu ihrer
Herstellung, ihre Verwendung zur Behandlung und/oder Prophylaxe
von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln
zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere
von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und von Tumorerkrankungen.
-
Thrombozyten
(Blutplättchen) sind ein wesentlicher Faktor sowohl in
der physiologischen Blutstillung (Hämostase) als auch bei
thromboembolischen Erkrankungen. Insbesondere im arteriellen System
kommt Thrombozyten eine zentrale Bedeutung in der komplexen Interaktion
zwischen Blutkomponenten und Gefäßwand zu. Unerwünschte
Thrombozytenaktivierung kann durch Bildung plättchenreicher
Thromben zu thromboembolischen Erkrankungen und thrombotischen Komplikationen
mit lebensbedrohlichen Zuständen führen.
-
Einer
der potentesten Plättchenaktivatoren ist die Blutgerinnungsprotease
Thrombin, die an verletzten Blutgefäßwänden
gebildet wird und neben der Fibrinbildung zur Aktivierung von Thrombozyten,
Endothelzellen und mesenchymalen Zellen führt (Vu
TKH, Hung DT, Wheaton VI, Coughlin SR, Cell 1991, 64, 1057–1068). An
Thrombozyten in vitro und in Tiermodellen hemmen Thrombin-Inhibitoren
die Plättchenaggregation bzw. die Bildung plättchenreicher
Thromben. Beim Menschen können arterielle Thrombosen erfolgreich
mit Inhibitoren der Thrombozytenfunktion sowie Thrombin-Inhibitoren
verhindert oder behandelt werden (Bhatt DL, Topol EJ, Nat.
Rev. Drug Discov. 2003, 2, 15–28). Deshalb besteht
eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass Antagonisten der Thrombinwirkung
auf Blutplättchen die Bildung von Thromben und das Auftreten
von klinischen Folgen wie Herzinfarkt und Schlaganfall vermindern.
Weitere zelluläre Thrombinwirkungen, z. B. auf Gefäßendothel-
und -glattmuskelzellen, Leukozyten und Fibroblasten, sind möglicherweise
für entzündliche und proliferative Erkrankungen
verantwortlich.
-
Die
zellulären Effekte von Thrombin werden zumindest teilweise über
eine Familie G-Proteingekoppelter Rezeptoren (Protease Activated
Receptors, PARs) vermittelt, deren Prototyp der PAR-1-Rezeptor darstellt. PAR-1
wird durch Bindung von Thrombin und proteolytische Spaltung seines
extrazellulär liegenden N-Terminus aktiviert. Durch die
Proteolyse wird ein neuer N-Terminus mit der Aminosäurensequenz
SFLLRN... freigelegt, der als Agonist („Tethered Ligand”)
zur intramolekularen Rezeptoraktivierung und Übertragung
intrazellulärer Signale führt. Von der Tethered-Ligand
Sequenz abgeleitete Peptide können als Agonisten des Rezeptors eingesetzt
werden und führen auf Thrombozyten zur Aktivierung und
Aggregation. Andere Proteasen sind ebenfalls in der Lage, PAR-1
zu aktivieren, hierunter z. B. Plasmin, Faktor VIIa, Faktor Xa,
Trypsin, aktiviertes Protein C (aPC), Tryptase, Cathepsin G, Proteinase
3, Granzyme A, Elastase und Matrixmetalloprotease 1 (MMP-1).
-
Im
Gegensatz zur Inhibition der Proteaseaktivität von Thrombin
mit direkten Thrombin-Inhibitoren sollte eine Blockade des PAR-1
zur Hemmung der Thrombozytenaktivierung ohne Verminderung der Gerinnungsfähigkeit
des Blutes (Antikoagulation) führen.
-
Antikörper
und andere selektive PAR-1-Antagonisten hemmen die Thrombin-induzierte
Aggregation von Thrombozyten in vitro bei niedrigen bis mittleren
Thrombinkonzentrationen (Kahn ML, Nakanishi-Matsui M, Shapiro
MJ, Ishihara H, Coughlin SR, J. Clin. Innest. 1999, 103, 879–887).
Ein weiterer Thrombinrezeptor mit möglicher Bedeutung für
die Pathophysiologie thrombotischer Prozesse, PAR-4, wurde auf humanen
und tierischen Thrombozyten identifiziert. In experimentellen Thrombosen
an Tieren mit einem dem Menschen vergleichbaren PAR-Expressionsmuster
reduzieren PAR-1-Antagonisten die Bildung plättchenreicher
Thromben (Derian CK, Damiano BP, Addo MF, Darrow AL, D'Andrea
MR, Nedelman M, Zhang H-C, Maryanoff BE, Andrade-Gordon P. J. Pharmacol.
Exp. Ther. 2003, 304, 855–861).
-
In
den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Substanzen auf ihre plättchenfunktionshemmende
Wirkung geprüft, in der Praxis haben sich aber nur wenige
Plättchenfunktionshemmer bewährt. Es besteht daher ein
Bedarf an Pharmazeutika, die spezifisch eine gesteigerte Plättchenreaktion
hemmen ohne das Blutungsrisiko erheblich zu erhöhen und
damit das Risiko von thromboembolischen Komplikationen vermindern.
-
Effekte
von Thrombin, die über den Rezeptor PAR-1 vermittelt werden,
haben Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf während und
nach operativer koronarer Bypassanlage (CABG) sowie anderer Operationen und
insbesondere Operationen mit extrakorporalem Kreislauf (z. B. Herz-Lungenmaschine).
Im Verlauf der Operation kann es aufgrund der prä- oder
intraoperativen Medikation mit gerinnungshemmenden und/oder plättchenhemmenden
Substanzen zu Blutungskomplikationen kommen. Aus diesem Grunde muss
beispielsweise eine Medikation mit Clopidogrel mehrere Tage vor
einer CABG pausiert werden. Außerdem kann es wie erwähnt
(z. B. aufgrund des ausgedehnten Kontaktes zwischen Blut und künstlichen
Oberflächen bei Einsatz einer extrakorporalen Zirkulation
oder bei Bluttransfusionen) zur Ausbildung einer disseminierten
intravaskulären Gerinnung oder Verbrauchskoagulopathie
(DIC) kommen, die sekundär zu Blutungskomplikationen führen
kann. Im weiteren Verlauf kommt es häufig zur Restenose
der angelegten venösen oder arteriellen Bypässe
(bis hin zum Verschluß) aufgrund von Thrombose, Intimafibrose,
Arteriosklerose, Angina pectoris, Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz,
Arrhythmien, transitorische ischämische Attacke (TIA) und/oder
Schlaganfall.
-
Der
Rezeptor PAR-1 wird im Menschen auch auf anderen Zellen exprimiert,
hierunter z. B. Endothelzellen, glatte Gefäßmuskelzellen
und Tumorzellen. Bösartige Tumorerkrankungen (Krebs) haben
eine hohe Inzidenz und sind im Allgemeinen mit einer hohen Sterblichkeit verbunden.
Gegenwärtige Therapien erreichen nur in einem Bruchteil
der Patienten eine Vollremission und sind typischerweise mit schweren
Nebenwirkungen verbunden. Daher besteht ein hoher Bedarf an effektiveren
und sichereren Therapien. Der PAR-1-Rezeptor trägt zur
Entstehung, dem Wachstum, der Invasivität und der Metastasierung
von Krebs bei. Außerdem vermittelt auf Endothelzellen exprimiertes
PAR-1 Signale, die in Gefäßwachstum münden
(„Angiogenese”), ein Vorgang, der zur Ermöglichung
von Tumorwachstum über ca. 1 mm3 hinaus
unerläßlich ist. Angiogenese trägt auch
zur Enstehung oder Verschlimmerung anderer Erkrankungen bei, hierunter
z. B. hämatopoetische Krebserkrankungen, die zur Erblindung
führende Makuladegeneration und diabetische Retinopathie,
entzündliche Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis und
Colitis.
-
Sepsis
(oder Septikämie) ist eine häufige Erkrankung
mit hoher Letalität. Anfängliche Symptome der Sepsis
sind typischerweise unspezifisch (z. B. Fieber, reduziertes Allgemeinbefinden),
im weiteren Verlauf kann es jedoch zur generalisierten Aktivierung
des Gerinnungssystems kommen (”Disseminated Intravascular coagulation„ oder ”Verbrauchskoagulopathie” (DIC))
mit Mikrothrombosierung in verschiedenen Organen und sekundärer
Blutungskomplikationen. DIC kann auch unabhängig von einer
Sepsis auftreten, z. B. im Rahmen von Operationen oder bei Tumorerkrankungen.
-
Die
Therapie der Sepsis besteht einerseits in der konsequenten Beseitigung
der infektiösen Ursache, z. B. durch operative Herdsanierung
und Antibinse. Andererseits besteht sie in der temporären
intensivmedizinischen Unterstützung der beeinträchtigten
Organsysteme. Therapien der verschiedenen Stadien dieser Erkrankung
sind z. B. in folgender Publikation beschrieben (Dellinger
et al., Crit. Care Med. 2004, 32, 858–873). Für
die DIC existieren keine erwiesenermaßen effektive Therapien.
-
Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue PAR-1-Antagonisten
zur Behandlung von Erkrankungen, wie z. B. Herz-Kreislauf-Erkrankungen
und thromboembolischen Erkrankungen, sowie Tumorerkrankungen bei
Menschen und Tieren zur Verfügung zu stellen.
-
WO 2006/012226 ,
WO 2007/130898 und
WO 2007/101270 beschreiben
strukturell ähnliche Piperidine als 11-β HSD1
Inhibitoren zur Behandlung von unter anderem Diabetes, thromboembolischen
Erkrankungen und Schlaganfall.
-
Gegenstand
der Erfindung sind Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 für Phenyl steht,
wobei Phenyl
substituiert sein kann mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig
voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Monofluormethyl,
Difluormethyl, Trifluormethyl, Monofluormethoxy, Difluormethoxy, Trifluormethoxy,
Monofluormethylsulfanyl, Difluormethylsulfanyl, Trifluormethylsulfanyl,
Methylsulfonyl, C
1-C
4-Alkyl,
C
1-C
4-Alkoxy und
C
1-C
4-Alkoxycarbonyl,
R
2 für Phenyl, Naphtyl oder 5- bis
10-gliedriges Heteroaryl steht,
wobei Phenyl, Naphtyl und Heteroaryl
substituiert sein können mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig
voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen,
Cyano, Hydroxy, Amino, Monofluormethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl,
Monofluormethoxy, Difluormethoxy, Trifluormethoxy, C
1-C
4-Alkyl, C
1-C
4-Alkoxy, C
1-C
6-Alkylamino, Phenyl und 5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl,
worin Phenyl und Heteroaryl substituiert sein können
mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Hydroxy, Amino, Monofluormethyl,
Difluormethyl, Trifluormethyl, Monofluormethoxy, Difluormethoxy,
Trifluormethoxy, C
1-C
4-Alkyl,
C
1-C
4-Alkoxy und
C
1-C
6-Alkylamino,
R
3 für C
1-C
6-Alkyl, C
1-C
6-Alkoxy, C
1-C
6-Alkylamino, C
3-C
7-Cycloalkyl, 4- bis 7-gliedriges Heterocyclyl,
Phenyl, 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, C
3-C
7-Cycloalkyloxy, C
3-C
7-Cycloalkylamino, 4- bis 7-gliedriges Heterocyclylamino,
Phenylamino oder 5- oder 6-gliedriges Heteroarylamino steht,
wobei
Alkyl, C
2-C
6-Alkoxy
und Alkylamino substituiert sein können mit einem Substituenten
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Hydroxy,
Amino, Cyano, C
1-C
4-Alkoxy,
C
1-C
4-Alkoxycarbonyl,
C
3-C
7-Cycloalkyl,
4- bis 6-gliedriges Heterocyclyl, Phenyl und 5- oder 6-gliedriges
Heteroaryl,
und
wobei Cycloalkyl, Heterocyclyl, Phenyl,
Heteroaryl, Cycloalkyloxy, Cycloalkylamino, Heterocyclylamino, Phenylamino
und Heteroarylamino substituiert sein können mit 1 bis
3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Oxo, Hydroxy, Amino,
Monofluormethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl, Monofluormethoxy,
Difluormethoxy, Trifluormethoxy, Monofluormethylsulfanyl, Difluormethylsulfanyl,
Trifluormethylsulfanyl, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, C
1-C
4-Alkyl, C
1-C
4-Alkoxy, C
1-C
6-Alkylamino,
C
1-C
4-Alkoxycarbonyl,
C
1-C
4-Alkylaminocarbonyl
und Cyclopropyl,
worin Alkyl substituiert sein kann mit einem
Substituenten Hydroxy,
und ihre Salze, ihre Solvate und die
Solvate ihrer Salze.
-
Erfindungsgemäße
Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze,
Solvate und Solvate der Salze; die von Formel (I) umfassten Verbindungen
der nachfolgend genannten Formeln und deren Salze, Solvate und Solvate
der Salze sowie die von Formel (I) umfassten, nachfolgend als Ausführungsbeispiele
genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der
Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) umfassten, nachfolgend
genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate
der Salze handelt.
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen können
in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen
(Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung umfasst deshalb
die Enantiomeren oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen.
Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren
lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter
Weise isolieren.
-
Sofern
die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren
Formen vorkommen können, umfasst die vorliegenden Erfindung
sämtliche tautomere Formen.
-
Als
Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche
Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt.
Umfasst sind aber auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen
selbst nicht geeignet sind aber beispielsweise für die
Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen
verwendet werden können.
-
Physiologisch
unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen
umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren,
Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z. B. Salze der
Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure,
Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethan sulfonsäure,
Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure,
Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure,
Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure,
Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure
und Benzoesäure.
-
Physiologisch
unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen
umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und
vorzugsweise Alkalimetallsalze (z. B. Natrium- und Kaliumsalze),
Erdalkalisalze (z. B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze,
abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen,
wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin,
Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin,
Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin,
Arginin, Lysin, Ethylendiamin, N-Methylpiperidin und Cholin.
-
Als
Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen
Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem
Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen
einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate,
bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.
-
Außerdem
umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen
Verbindungen. Der Begriff ”Prodrugs” umfasst Verbindungen,
welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können,
jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper zu
erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden
(beispielsweise metabolisch oder hydrolytisch).
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit
nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:
- Alkyl
per se und ”Alk” und ”Alkyl” in
Alkoxy, Alkylamino, Alkoxycarbonyl und Alkylaminocarbonyl stehen
für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis
6 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für
Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl
und n-Hexyl.
- Alkoxy steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxy,
Ethoxy, n-Propoxy, iso-Propoxy, n-Butoxy, tert-Butoxy, n-Pentoxy
und n-Hexoxy.
- Alkylamino steht für einen Alkylaminorest mit einem
oder zwei (unabhängig voneinander gewählten) Alkylsubstituenten,
beispielhaft und vorzugsweise für Methylamino, Ethylamino,
n-Propylamino, iso-Propylamino, tert-Butylamino, N,N-Dimethylamino,
N,N-Diethylamino, N-Ethyl-N-methylamino, N-Methyl-N-n-propylamino, N-iso-Propyl-N-n-propylamino
und N-tert-Butyl-N-methylamino. C1-C4-Alkylamino steht beispielsweise für
einen Monoalkylaminorest mit 1 bis 4 Koh lenstoffatomen oder für
einen Dialkylaminorest mit jeweils 1 bis 4 Kohlenstoffatomen pro
Alkylsubstituent.
- Alkoxycarbonyl steht beispielhaft und vorzugsweise für
Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, n-Propoxycarbonyl, iso-Propoxycarbonyl,
n-Butoxycarbonyl und tert-Butoxycarbonyl.
- Alkylaminocarbonyl steht für einen Alkylaminocarbonylrest
mit einem oder zwei (unabhängig voneinander gewählten)
Alkylsubstituenten, beispielhaft und vorzugsweise für Methylaminocarbonyl,
Ethylaminocarbonyl, n-Propylaminocarbonyl, iso-Propylaminocarbonyl,
tert-Butylaminocarbonyl, N,N-Dimethylaminocarbonyl, N,N-Diethylaminocarbonyl,
N-Ethyl-N-methylaminocarbonyl, N-Methyl-N-n-propylaminocarbonyl,
N-iso-Propyl-N-n-propylaminocarbonyl und N-tert-Butyl-N-methylaminocarbonyl.
C1-C4-Alkylaminocarbonyl
steht beispielsweise für einen Monoalkylaminocarbonylrest
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder für einen Dialkylaminocarbonylrest
mit jeweils 1 bis 4 Kohlenstoffatomen pro Alkylsubstituent.
- Cycloalkyl steht für eine monocyclische Cycloalkylgruppe
mit in der Regel 3 bis 7, bevorzugt 5 oder 6 Kohlenstoffatomen,
beispielhaft und vorzugsweise für Cycloalkyl seien genannt
Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cycloheptyl.
- Cycloalkyloxy steht für eine monocyclische Cycloalkyloxygruppe
mit in der Regel 3 bis 7, bevorzugt 5 oder 6 Kohlenstoffatomen,
beispielhaft und vorzugsweise für Cycloalkyloxy seien genannt
Cyclopropyloxy, Cyclobutyloxy, Cyclopentyloxy und Cyclohexyloxy.
- Cycloalkylamino steht für eine monocyclische Cycloalkylaminogruppe
mit in der Regel 3 bis 7, bevorzugt 3 oder 4 Kohlenstoffatomen,
beispielhaft und vorzugsweise für Cycloalkylamino seien
genannt Cyclopropylamino, Cyclobutylamino, Cyclopentylamino und
Cyclohexylamino.
- Heterocyclyl steht für einen monocyclischen oder bicyclischen,
heterocyclischen Rest mit 4 bis 7 Ringatomen und bis zu 3, vorzugsweise
bis zu 2 Heteroatomen und/oder Heterogruppen aus der Reihe N, O,
S, SO, SO2, wobei ein Stickstoffatom auch
ein N-Oxid bilden kann. Die Heterocyclyl-Reste können gesättigt
oder teilweise ungesättigt sein. Bevorzugt sind 5- oder
6-gliedrige, monocyclische gesättigte Heterocyclylreste
mit bis zu zwei Heteroatomen aus der Reihe O, N und S, beispielhaft
und vorzugsweise für Oxetanyl, Azetidinyl, Pyrrolidin-2-yl,
Pyrrolidin-3-yl, Pyrrolinyl, Tetrahydrofuranyl, Tetrahydrothienyl,
Pyranyl, Piperidin-1-yl, Piperidin-2-yl, Piperidin-3-yl, Piperidin-4-yl,
1,2,5,6-Tetrahydropyridin-3-yl, 1,2,5,6-Tetrahydropyridin-4-yl,
Thiopyranyl, Morpholin-1-yl, Morpholin-2-yl, Morpholin-3-yl, Piperazin-1-yl,
Piperazin-2-yl.
- Heterocyclylamino steht für einen monocyclischen oder
bicyclischen, heterocyclischen Heterocyclylamino-Rest mit 4 bis
7 Ringatomen und bis zu 3, vorzugsweise bis zu 2 Heteroatomen und/oder
Heterogruppen aus der Reihe N, O, S, SO, SO2,
wobei ein Stickstoffatom auch ein N-Oxid bilden kann. Die Heterocyclyl-Reste können
gesättigt oder teilweise ungesättigt sein. Bevorzugt
sind 5- oder 6-gliedrige, monocyclische gesättigte Heterocyclylreste
mit bis zu zwei Heteroatomen aus der Reihe O, N und S, beispielhaft
und vorzugsweise für Oxetanylamino, Azetidinylamino, Pyrrolidin-2-yl-amino,
Pyrrolidin-3-yl-amino, Tetrahydrofuranylamino, Tetrahydrothienylamino,
Pyranylamino, Piperidin-2-yl-amino, Piperidin-3-yl-amino, Piperidin-4-yl-amino,
1,2,5,6-Tetrahydropyridin-3-yl-amino, 1,2,5,6-Tetrahydropyridin-4-yl-amino,
Thiopyranylamino, Morpholin-2-yl-amino, Morpholin-3-yl-amino, Piperazin-2-yl-amino.
- Heteroaryl steht für einen aromatischen, mono- oder
bicyclischen Rest mit 5 bis 10 Ringatomen und bis zu 5 Heteroatomen
aus der Reihe S, O und N, wobei ein Stickstoffatom auch ein N-Oxid
bilden kann. Bevorzugt sind Heteroaryle mit 5 oder 6 Ringatomen
und bis zu 4 Heteroatomen, beispielhaft und vorzugsweise seinen genannt
Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Oxadiazolyl,
Pyrazolyl, Imidazolyl, Triazolyl, Pyridyl, Pyrimidyl, Pyridazinyl,
Pyrazinyl, Indolyl, Indazolyl, Benzofuranyl, Benzothiophenyl, Chinolinyl,
Isochinolinyl.
- Heteroarylamino steht für einen aromatischen, monocyclischen
Heteroarylamino-Rest mit in der Regel 5 oder 6 Ringatomen und bis
zu 4 Heteroatomen aus der Reihe S, O und N, wobei ein Stickstoffatom
auch ein N-Oxid bilden kann, beispielhaft und vorzugsweise für
Thienylamino, Furylamino, Pyrrolylamino, Thiazolylamino, Oxazolylamino,
Isoxazolylamino, Oxadiazolylamino, Pyrazolylamino, Imidazolylamino,
Pyridylamino, Pyrimidylamino, Pyridazinylamino, Pyrazinylamino.
- Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom und Jod, vorzugsweise
für Fluor und Chlor.
-
In
den Verbindungen der Formel (I) bedeutet die geschlängelte
Linie zu R2, dass R2 sowohl
in cis- als auch in trans-Position zum Piperidinring an die Doppelbindung
gebunden sein kann.
-
Bevorzugt
sind Verbindungen der Formel (I), in welcher
R1 für
Phenyl steht,
wobei Phenyl substituiert ist mit 1 bis 3 Substituenten,
unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Trifluormethyl, Trifluormethoxy, C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkoxy und C1-C4-Alkoxycarbonyl,
R2 für
Phenyl, Pyridyl oder Chinolinyl steht,
wobei Phenyl, Pyridyl
und Chinolinyl substituiert sein können mit 1 bis 2 Substituenten,
unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe
bestehend aus Halogen, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkoxy, Phenyl
und Pyridyl,
worin Phenyl und Pyridyl substituiert sein können
mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy,
C1-C4-Alkyl und C1-C4-Alkoxy,
R3 für C3-C7-Cycloalkyl, 4- bis 7-gliedriges Heterocyclyl,
Phenyl, 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, C3-C7-Cycloalkyloxy, C3-C7-Cycloalkylamino, 4- bis 7-gliedriges Heterocyclylamino,
Phenylamino oder 5- oder 6-gliedriges Heteroarylamino steht,
wobei
Cycloalkyl, Heterocyclyl, Phenyl, Heteroaryl, Cycloalkyloxy, Cycloalkylamino,
Heterocyclylamino, Phenylamino und Heteroarylamino substituiert
sein können mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig
voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen,
Cyano, Oxo, Hydroxy, Amino, Trifluormethyl, Difluormethoxy, Trifluormethoxy,
Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy,
Dimethylamino, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Dimethylaminocarbonyl
und Cyclopropyl,
worin Methyl und Ethyl substituiert sein können
mit einem Substituenten Hydroxy,
und ihre Salze, ihre Solvate
und die Solvate ihrer Salze.
-
Bevorzugt
sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
R1 für Phenyl steht,
wobei Phenyl
substituiert ist mit 1 bis 2 Substituenten, unabhängig
voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trifluormethyl,
Trifluormethoxy, Methyl, Ethyl und Methoxy,
R2 für
Phenyl, Pyridyl oder Chinolinyl steht,
wobei Phenyl, Pyridyl
und Chinolinyl substituiert sein können mit einem Substituenten
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano,
Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy,
Phenyl und Pyridyl,
worin Phenyl und Pyridyl substituiert sein
können mit 1 bis 3 Substituenten, unabhängig voneinander
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Cyano,
Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Methyl, Ethyl, Methoxy und Ethoxy,
R3 für Morpholin-4-yl, 1,1-Dioxidothiomorpholin-4-yl,
3-Hydroxyazetidiny-1-yl, 3-Hydroxypyrrolidin-1-yl, 4-Cyanopiperidin-1-yl
oder 4-Hydroxypiperidin-1-yl steht,
und ihre Salze, ihre Solvate
und die Solvate ihrer Salze.
-
Bevorzugt
sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
R1 für Phenyl steht,
wobei Phenyl
substituiert ist mit einem Substituenten ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Trifluormethyl und Ethyl,
R2 für Phenyl, Pyridyl oder Chinolinyl
steht,
wobei Phenyl und Pyridyl substituiert sein können
mit einem Substituenten Phenyl,
worin Phenyl substituiert sein
kann mit 1 bis 2 Substituenten, unabhängig voneinander
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Trifluormethyl
und Methoxy,
und
wobei Chinolinyl substituiert ist mit
einem Substituenten Methoxy,
R3 für
Morpholin-4-yl steht,
und ihre Salze, ihre Solvate und die
Solvate ihrer Salze.
-
Bevorzugt
sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher die Substituenten
-R1 und -CH=CH-R2 in cis-Position
zueinander stehen.
-
Bevorzugt
sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher der Piperidinring
und der Substituent -R2 an der Doppelbindung
in trans-Position zueinander stehen.
-
Bevorzugt
sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R1 für
Phenyl steht, wobei Phenyl substituiert ist mit einem Substituenten
in para-Position zur Verknüpfungsstelle an den Piperidinring,
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trifluormethyl,
Trifluormethoxy und Ethyl.
-
Bevorzugt
sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R1 für
Phenyl steht, wobei Phenyl substituiert ist mit einem Substituenten
in para-Position zur Verknüpfungsstelle an den Piperidinring,
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trifluormethyl
und Ethyl.
-
Bevorzugt
sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher
R2 für Phenyl, Pyridyl oder Chinolinyl
steht,
wobei Phenyl und Pyridyl substituiert sein können
mit einem Substituenten Phenyl,
worin Phenyl substituiert sein
kann mit 1 bis 2 Substituenten, unabhängig voneinander
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Trifluormethyl
und Methoxy,
und
wobei Chinolinyl substituiert ist mit
einem Substituenten Methoxy.
-
Bevorzugt
sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R2 für
5-[3-(Trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl steht.
-
Bevorzugt
sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R3 für
Morpholin-4-yl, 1,1-Dioxidothiomorpholin-4-yl, 3-Hydroxyazetidiny-1-yl,
3-Hydroxypyrrolidin-1-yl, 4-Cyanopiperidin-1-yl oder 4-Hydroxypiperidin-1-yl
steht.
-
Bevorzugt
sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R3 für
Morpholin-4-yl steht.
-
Die
in den jeweiligen Kombinationen bzw. bevorzugten Kombinationen von
Resten im einzelnen angegebenen Reste-Definitionen werden unabhängig
von den jeweiligen angegebenen Kombinationen der Reste beliebig
auch durch Reste-Definitionen anderer Kombinationen ersetzt.
-
Ganz
besonders bevorzugt sind Kombinationen von zwei oder mehreren der
oben genannten Vorzugsbereiche.
-
Gegenstand
der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen
der Formel (I), oder ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate
ihrer Salze, wobei Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 und R
3 die oben
angegebene Bedeutung aufweisen,
mit Verbindungen der Formel
in welcher
R
2 die oben angegebene Bedeutung aufweist,
und
Y für -P(=O)(OCH
2CH
3)
2 oder -P
+(Phenyl)
3X
– steht,
wobei
X
– für eine Halogenid, bevorzugt
Bromid oder Chlorid, steht,
umgesetzt werden.
-
Die
Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln,
in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von –10°C
bis 40°C bei Normaldruck.
-
Inerte
Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Diethylether,
Dioxan, Tetrahydrofuran oder 1,2-Dimethoxyethan, bevorzugt ist Tetrahydrofuran.
-
Basen
sind beispielsweise metallorganische Verbindungen wie n-Butyllithium,
Phenyllithium, oder Natrium- oder Kaliummethanolat oder Kalium-tert.-butylat,
bevorzugt ist n-Butyllithium oder Kalium-tert.-butylat.
-
Die
Verbindungen der Formel (III) sind bekannt oder lassen sich nach
bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen
synthetisieren.
-
Die
Verbindungen der Formel (II) sind bekannt oder können hergestellt
werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 und R
3 die oben
angegebene Bedeutung aufweisen,
mit einem Oxidationsmittel
umgesetzt werden.
-
Die
Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln,
gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich
von –40°C bis 40°C bei Normaldruck.
-
Inerte
Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe
wie Methylenchlorid, Trichlormethan oder 1,2-Dichlorethan, bevorzugt
ist Methylenchlorid.
-
Oxidationsmittel
sind beispielsweise Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex und DMSO, Oxalylchlorid
und DMSO, Dess-Martin Periodinan, Tetrapropylammoniumperruthenat/N-Methylmorpholin
N-Oxid und Molsieb, bevorzugt ist Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex
und DMSO oder Dess-Martin Periodinan.
-
Basen
sind beispielsweise Triethylamin, Diisopropylethylamin oder N-Methylmorpholin,
bevorzugt ist Diisopropylethylamin.
-
Die
Verbindungen der Formel (IV) sind bekannt oder können hergestellt
werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 und R
3 die oben
angegebene Bedeutung aufweisen,
mit einem Reduktionsmittel
umgesetzt werden.
-
Die
Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln,
bevorzugt in einem Temperaturbereich von –30°C
bis 80°C bei Normaldruck.
-
Inerte
Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Diethylether,
Tetrahydrofuran, Dioxan oder 1,2-Dimethoxyethan, bevorzugt ist Tetrahydrofuran.
-
Reduktionsmittel
sind beispielsweise Lithiumaluminiumhydrid, Natriumborhydrid in
Verbindung mit Bortrifluorid-Diethyletherat, Lithiumborhydrid, Boran-THF-Komplex,
Boran-Dimethylsulfid-Komplex, bevorzugt ist Natriumborhydrid in
Verbindung mit Bortrifluorid-Diethyletherat.
-
Die
Verbindungen der Formel (V) sind bekannt oder können hergestellt
werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 und R
3 die oben
angegebene Bedeutung aufweisen, und
R
6 für
Methyl oder Ethyl steht,
mit einer Base umgesetzt werden.
-
Die
Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln,
in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von
Raumtemperatur bis zum Rückfluss der Lösungsmittel
bei Normaldruck.
-
Inerte
Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe
wie Methylenchlorid, Trichlormethan, Tetrachlormethan oder 1,2-Dichlorethan,
Ether wie Diethylether, Methyl-tert-butylether, 1,2-Dimethoxyethan,
Dioxan oder Tetrahydrofuran, oder andere Lösungsmittel
wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Acetonitril oder Pyridin,
oder Gemische von Lösungsmitteln, oder Gemische von Lösungsmittel
mit Wasser, bevorzugt ist ein Gemisch aus Tetrahydrofuran und Wasser.
-
Basen
sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium-, Lithium- oder
Kaliumhydroxid, oder Alkalicarbonate wie Cäsiumcarbonat,
Natrium- oder Kaliumcarbonat, bevorzugt ist Lithiumhydroxid.
-
Die
Verbindungen der Formel (VI) sind bekannt oder können hergestellt
werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 und R
6 die oben
angegebene Bedeutung aufweisen,
mit Verbindungen der Formel
in welcher
R
3 die oben angegebene Bedeutung aufweist,
und
X
1 für Halogen, bevorzugt
Brom oder Chlor, oder Hydroxy steht,
umgesetzt werden.
-
Die
Umsetzung erfolgt, wenn X1 für
Halogen steht, im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln,
gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich
von –30°C bis 50°C bei Normaldruck.
-
Inerte
Lösungsmittel sind beispielsweise Tetrahydrofuran, Methylenchlorid,
Pyridin, Dioxan oder Dimethylformamid, bevorzugt ist Tetrahydrofuran.
-
Basen
sind beispielsweise Triethylamin, Diisopropylethylamin oder N-Methylmorpholin,
bevorzugt ist Triethylamin oder Diisopropylethylamin.
-
Die
Umsetzung erfolgt, wenn X1 für
Hydroxy steht, im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln,
in Gegenwart eines Dehydratisierungsreagenzes, gegebenenfalls in
Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von –30°C
bis 50°C bei Normaldruck.
-
Inerte
Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe
wie Dichlormethan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol,
Nitromethan, Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es
möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen.
Besonders bevorzugt ist Dichlormethan oder Dimethylformamid.
-
Als
Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide
wie z. B. N,N'-Diethyl-, N,N,'-Dipropyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid,
N-(3-Dimethylaminoisopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDC),
N-Cyclohexylcarbodiimid N'-propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder
Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen
wie 2-Ethyl-5-phenyl-1,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert-Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat,
oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-1-ethoxy-carbonyl-1,2-dihydrochinolin,
oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat,
oder Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat,
oder O-(Benzotrtazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetra-methyluroniumhexafluorophosphat (HBTU),
2-(2-Oxo-1-(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat
(TPTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyl-uroniumhexafluorophosphat
(HATU), oder 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), oder Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat
(BOP), oder N-Hydroxysuccinimid, oder Mischungen aus diesen, mit
Basen.
-
Basen
sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z. B. Natrium- oder Kaliumcarbonat,
oder -hydrogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine
z. B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin
oder Diisopropylethylamin.
-
Vorzugsweise
wird die Kondensation mit HATU oder mit EDC in Gegenwart von HOBt
durchgeführt.
-
Die
Verbindungen der Formel (VIII) sind bekannt oder lassen sich nach
bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen
synthetisieren.
-
Die
Verbindungen der Formel (VII) sind bekannt oder können
hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 und R
6 die oben
angegebene Bedeutung aufweisen,
hydriert werden.
-
Die
Hydrierung erfolgt im Allgemeinen mit einem Reduktionsmittel in
inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls unter Zusatz von
Säure wie Mineralsäuren und Carbonsäuren,
bevorzugt Essigsäure, bevorzugt in einem Temperaturbereich
von Raumtemperatur bis zum Rückfluss der Lösungsmittel
und in einem Druckbereich von Normaldruck bis 100 bar, bevorzugt
bei 50–80 bar.
-
Reduktionsmittel
sind beispielsweise Wasserstoff mit Palladium auf Aktivkohle, mit
Rhodium auf Aktivkohle, mit Ruthenium auf Aktivkohle oder daraus
gemischte Katalysatorn, oder Wasserstoff mit Palladium auf Aluminiumoxid
oder mit Rhodium auf Aluminiumoxid, bevorzugt ist Wasserstoff mit
Palladium auf Aktivkohle oder mit Rhodium auf Aktivkohle.
-
Inerte
Lösungsmittel sind beispielsweise Alkohole wie Methanol,
Ethanol, n-Propanol, iso-Propanol, n-Butanol oder tert-Butanol,
bevorzugt ist Methanol oder Ethanol.
-
Die
Verbindungen der Formel (IX) sind bekannt oder können hergestellt
werden, indem Verbindungen der Formel
in welcher
R
6 die oben angegebene Bedeutung aufweist,
mit
Verbindungen der Formel
in welcher
R
1 die oben angegebene Bedeutung aufweist,
umgesetzt
werden.
-
Die
Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln,
in Gegenwart eines Katalysators, gegebenenfalls in Gegenwart eines
Zusatzreagenzes, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur
bis zum Rückfluss des Lösungsmittels bei Normaldruck.
-
Inerte
Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran
oder 1,2-Dimethoxyethan, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Xylol oder
Toluol, oder andere Lösungsmittel wie Nitrobenzol, Dimethylformamid,
Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid oder N-Methylpyrrolidon, gegebenenfalls
wird diesen Lösungsmitteln etwas Wasser zugesetzt. Bevorzugt
ist Toluol mit Wasser oder eine Mischung aus 1,2-Dimethoxyethan,
Dimethylformamid und Wasser.
-
Katalysatoren
sind beispielsweise für Suzuki-Reaktionsbedingungen übliche
Palladium-Katalysatoren, bevorzugt sind Katalysatoren wie z. B.
Dichlorbis(triphenylphosphin)-palladium, Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0),
Palladium(II)acetat oder Bis-(diphenylphosphanferrocenyl)-palladium-(II)-chlorid.
-
Zusatzreagenzien
sind beispielsweise Kaliumacetat, Cäsium-, Kalium- oder
Natriumcarbonat, Bariumhydroxid, Kalium-tert-butylat, Cäsiumfluorid,
Kaliumfluorid oder Kaliumphosphat, bevorzugt sind Kaliumfluorid oder
Natriumcarbonat.
-
Die
Verbindungen der Formeln (X) und (XI) sind bekannt oder lassen sich
nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen
synthetisieren.
-
In
den Verbindungen der oben genannten Verfahren sind freie Aminogruppen
gegebenenfalls während der Umsetzung durch dem Fachmann
bekannte Schutzgruppen geschützt, bevorzugt ist eine tert-Butoxycarbonyl-Schutzgruppe.
Diese Schutzgruppen werden nach der Umsetzung durch dem Fachmann
bekannte Reaktionen abgespalten, bevorzugt ist die Umsetzung mit
Trifluoressigsäure oder konzentierter Salzsäure.
-
Die
Herstellung der Verbindungen der Formel (I) kann durch folgendes
Syntheseschema verdeutlicht werden.
-
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen ein nicht
vorhersehbares, wertvolles pharmakologisches und pharmakokinetisches
Wirkspektrum. Es handelt sich dabei um selektive Antagonisten des PAR-1-Rezeptors,
die insbesondere als Thrombozytenaggregationshemmer, als Hemmer
der Endothelproliferation und als Hemmer des Tumorwachstums wirken.
-
Sie
eigenen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung
und/oder Prophylaxe von Krankheiten bei Menschen und Tieren.
-
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen
Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen,
vorzugsweise von thromboembolischen Erkrankungen und/oder thromboembolischen
Komplikationen.
-
Zu
den „thromboembolischen Erkrankungen” im Sinne
der vorliegenden Erfindung zählen insbesondere Erkrankungen
wie Herzinfarkt mit ST-Segment-Erhöhung (STEMI) und ohne
ST-Segment-Erhöhung (non-STEMI), stabile Angina Pectoris,
instabile Angina Pectoris, Reokklusio nen und Restenosen nach Koronarinterventionen
wie Angioplastie, Stentimplantation oder aortokoronarem Bypass,
periphere arterielle Verschlusskrankheiten, Lungenembolien, tiefe
venöse Thrombosen und Nierenvenenthrombosen, transitorische ischämische
Attacken sowie thrombotischer und thromboembolischer Hirnschlag.
-
Die
Substanzen eignen sich daher auch zur Prävention und Behandlung
von kardiogenen Thromboembolien, wie beispielsweise Hirn-Ischämien,
Schlaganfall (Stroke) und systemischen Thromboembolien und Ischämien,
bei Patienten mit akuten, intermittierenden oder persistierenden
Herzarrhythmien, wie beispielsweise Vorhofflimmern, und solchen,
die sich einer Kardioversion unterziehen, ferner bei Patienten mit
Herzklappen-Erkrankungen oder mit intravasalen Körpern,
wie z. B. künstlichen Herzklappen, Kathetern, intraaortale
Ballongegenpulsation und Schrittmachersonden.
-
Thromboembolische
Komplikationen treten ferner auf bei mikroangiopathischen hämolytischen
Anämien, extrakorporalen Blutkreisläufen, wie
z. B. Hämodialyse, Hämofiltration, ventricular
assist devices und Kunstherz, sowie Herzklappenprothesen.
-
Außerdem
kommen die erfindungsgemäßen Verbindungen auch
zur Beeinflussung der Wundheilung, für die Prophylaxe und/oder
Behandlung von atherosklerotischen Gefäßerkrankungen
und entzündlichen Erkrankungen wie rheumatische Erkrankungen
des Bewegungsapparats, koronaren Herzkrankheiten, von Herzinsuffizienz,
von Bluthochdruck, von entzündlichen Erkrankungen, wie
z. B. Asthma, COPD, entzündlichen Lungenerkrankungen, Glomerulonephritis
und entzündlichen Darmerkrankungen in Betracht, darüber
hinaus ebenso für die Prophylaxe und/oder Behandlung der
Alzheimer'schen Erkrankung, Autoimmunerkrankungen, Morbus Crohn
und Kolitis Ulzerosa.
-
Außerdem
können die erfindungsgemäßen Verbindungen
zur Inhibition des Tumorwachstums und der Metastasenbildung, bei
Mikroangiopathien, altersbedingter Makuladegeneration, diabetischer
Retinopathie, diabetischer Nephropathie und anderen mikrovaskulären
Erkrankungen sowie zur Prävention und Behandlung thromboembolischer
Komplikationen, wie beispielsweise venöser Thromboembolien,
bei Tumorpatienten, insbesondere solchen, die sich größeren
chirurgischen Eingriffen oder einer Chemo- oder Radiotherapie unterziehen,
eingesetzt werden.
-
Weiterhin
eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen
zur Behandlung von Krebs. Krebserkrankungen schließen unter
anderem ein: Karzinome (hierunter Brustkrebs, hepatozelluläre
karzinome, Lunkenkrebs, kolorektaler Krebs, Kolonkrebs und Melanome),
Lympohome (z. B. Non-Hodgkin-Lymphome und Mykosis fungoides), Leukämien,
Sarkome, Mesotheliome, Hirnkrebs (z. B. Gliome), Germinome (z. B.
Hodenkrebs und Ovarialkrebs), Choriokarzinome, Nierenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs,
Schilddrüsenkrebs, Kopf- und Halskrebs, Endometrieum-Krebs,
Zervix-Krebs, Blasenkrebs, Magenkrebs und multiples Myelom.
-
Außerdem
vermittelt auf Endothelzellen exprimiertes PAR-1 Signale, die in
Gefäßwachstum münden („Angiogenese”),
ein Vorgang, der zur Ermöglichung von Tumorwachstum über
ca. 1 mm3 hinaus unerläßlich ist.
Induktion der Angiogenese ist auch bei anderen Erkrankungen relevant,
hierunter Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises (z. B. rheumatoide
Arthritis), bei Lungenerkrankungen (z. B. Lungenfibrose, pulmonale
Hypertonie, insbesondere pulmonalarterielle Hypertonie, Erkrankungen,
die durch Lungengefäßverschlüsse charakterisiert
sind), Arteriosklerose, Plaqueruptur, diabetische Retinopathie und
feuchte Makuladegeneration.
-
Darüber
hinaus sind die erfindungsgemäßen Verbindungen
zur Behandlung von Sepsis geeignet. Sepsis (oder Septikämie)
ist eine häufige Erkrankung mit hoher Letalität.
Anfängliche Symptome der Sepsis sind typischerweise unspezifisch
(z. B. Fieber, reduziertes Allgemeinbefinden), im weiteren Verlauf
kann es jedoch zur generalisierten Aktivierung des Gerinnungssystems
kommen (”Disseminated Intravascular coagulation”,
oder ”Verbrauchskoagulopathie”, nachfolgend als ”DIC” bezeichnet)
mit Mikrothrombosierung in verschiedenen Organen und sekundärer
Blutungskomplikationen. Außerdem kann es zur endothelialen
Schädigung mit Erhöhung der Gefäßpermeabilität
und Austritt von Flüssigkeit und Proteinen in den Extravasalraum kommen.
Im weiteren Verlauf kann es zur Dysfunktion oder dem Versagen eines
Organs (z. B. Nierenversagen, Leberversagen, Atemversagen, zentralnervöse
Defizite und Herz-/Kreislaufversagen) bis hin zum Multiorganversagen
kommen. Hiervon kann prinzipiell jedes Organ betroffen sein, am
häufigsten tritt Organdysfunktion und -Versagen bei der
Lunge, der Niere, dem Herz-Kreislaufsystem, dem Gerinnungssystem,
dem zentralnervösen System, endokrinen Drüsen
und der Leber auf. Eine Sepsis kann mit einem „Acute Respiratory
Distress Syndrome” (nachfolgend als ARDS bezeichnet) einhergehen.
Ein ARDS kann auch unabhängig von einer Sepsis auftreten. ”Septischer
Schock” bezeichnet das Auftreten einer behandlungspflichtigen
Blutdruckerniedrigung, die eine weitere Organschädigung
begünstigt und mit einer Verschlechterung der Prognose einhergeht.
-
Krankheitserreger
können Bakterien (gram-negativ und gram-positiv), Pilze,
Viren und/oder Eukaryonten sein. Eintrittspforte bzw. Primärinfektion
können z. B. Pneumonie, Harnwegsinfekt, Peritonitis sein.
Die Infektion kann, muß aber nicht zwingend, mit einer
Bakteriämie einhergehen.
-
Sepsis
wird definiert als das Vorliegen einer Infektion und eines ”systemic
inflammatory response syndrome” (nachfolgend mit ”SIRS” bezeichnet).
SIRS tritt im Rahmen von Infekten, aber auch von anderen Zuständen
wie Verletzungen, Verbrennungen, Schock, Operationen, Ischämie,
Pankreatitis, Reanimation oder Tumoren auf. Nach der Definition
des ACCP/SCCM Consensus Conference Committee von 1992 (Crit.
Care Med. 1992, 20, 864–874) werden die zur Diagnose ”SIRS” erforderlichen
Symptome zur Diagnose und Meßparameter beschrieben (u.
a. veränderte Körpertemperatur, erhöhte
Herzfrequenz, Atemschwierigkeiten und verändertes Blutbild).
In der späteren (2001) SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International
Sepsis Definitions Conference wurden die Kriterien im Wesentlichen
beibehalten, in Details jedoch verfeinert (Levy et al.,
Crit. Care Med. 2003, 31, 1250–1256).
-
DIC
und SIRS können im Rahmen einer Sepsis, aber auch infolge
von Operationen, Tumorerkrankungen, Verbrennungen oder anderen Verletzungen
auftreten. Bei der DIC kommt es an der Oberfläche von geschädigten
Endothelzellen, Fremdkörperoberflächen oder verletztem
extravaskulärem Gewebe zur massiven Aktivierung des Gerinnungssystems.
Als Folge kommt es zur Gerinnung in kleinen Gefäßen
verschiedener Organe mit Hypoxie und anschließender Organdysfunktion.
Sekundär kommt es zum Verbrauch von Gerinnungsfaktoren
(z. B. Faktor X, Prothrombin, Fibrinogen) und Plättchen,
wodurch die Gerinnungsfähigkeit des Blutes herabgesetzt
wird und schwere Blutungen auftreten können.
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen können
darüber hinaus auch zur Verhinderung von Koagulation ex
vivo eingesetzt werden, z. B. zur Konservierung von Blut- und Plasmaprodukten,
zur Reinigung/Vorbehandlung von Kathetern und anderen medizinischen
Hilfsmitteln und Geräten, einschließlich extrakorporaler Kreisläufe,
zur Beschichtung künstlicher Oberflächen von in
vivo oder ex vivo eingesetzten medizinischen Hilfsmitteln und Geräten
oder bei biologischen Proben, die Blutplättchen enthalten.
-
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen
Verbindungen zur Beschichtung von medizinischen Instrumenten und
Implantaten, z. B. Kathetern, Prothesen, Stents oder künstlichen
Herzklappen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen
können dabei fest an die Oberfläche gebunden sein
oder über einen bestimmten Zeitraum aus einer Trägerbeschichtung
in die unmittelbare Umgebung zur lokalen Wirkung freigesetzt werden.
-
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen
Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen,
insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
-
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen
Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung
und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten
Erkrankungen.
-
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung
und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten
Erkrankungen, unter Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge
einer erfindungsgemäßen Verbindung.
-
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend
eine erfindungsgemäße Verbindung und einen oder
mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder
Prophylaxe der zuvor genannten Erkrankungen. Als geeignete Kombinationswirkstoffe
seien beispielhaft und vorzugsweise genannt:
Kalziumkanalblocker,
z. B. Amlodipin Besilat (z. B. Norvasc®),
Felodipin, Diltiazem, Verapamil, Nifedipin, Nicardipin, Nisoldipin
und Bepridil;
Iomerizin;
Statine, z. B. Atorvastatin,
Fluvastatin, Lovastatin, Pitavastatin, Pravastatin, Rosuvastatin,
und Simvastatin;
Cholesterinabsorption-Inhibitoren, z. B. Ezetimibe
und AZD4121;
Cholesteryl Ester Transfer Protein (”CETP”)
Inhibitoren, z. B. Torcetrapib;
Niedrigmolekualre Heparine,
z. B. Dalteparin Natrium, Ardeparin, Certoparin, Enoxaparin, Pamaparin,
Tinzaparin, Reviparin und Nadroparin;
Weitere Antikoagulanzien,
z. B. Warfarin, Marcumar, Fondaparinux;
Antiarrhythmika, z.
B. Dofetilid, Ibutilid, Metoprolol, Metoprololtartrat, Propranolol,
Atenolol, Ajmalin, Disopyramid, Prajmalin, Procainamid, Quinidin,
Spartein, Aprindine, Lidocain, Mexiletin, Tocamid, Encamid, Flecamid, Lorcamid,
Moricizin, Propafenon, Acebutolol, Pindolol, Amiodaron, Bretylium-Tosylat,
Bunaftin, Sotalol, Adenosin, Atropin und Digoxin;
Alpha-adrenerge
Agonisten, z. B. Doxazosin-Mesylat, Terazoson und Prazosin;
Beta-adrenerge
Blocker, z. B. Carvedilol, Propranolol, Timolol, Nadolol, Atenolol,
Metoprolol, Bisoprolol, Nebivolol, Betaxolol, Acebutolol und Bisoprolol;
Aldosteron-Antagonisten,
z. B. Eplerenon und Spironolacton;
Angiotensin-converting-enzyme
Inhbitoren (”ACE-Inhibitoren”), z. B. Moexipril,
Quinapril-Hydrochlorid, Ramipril, Lisinopril, Benazepril-Hydrochlorid,
Enalapril, Captopril, Spirapril, Perindopril, Fosinopril und Trandolapril,;
Angiotensin
II Receptorbiockers (”ARBs”), z. B. Olmesartan-Medoxomil,
Candesartan, Valsartan, Telmisartan, Irbesartan, Losartan und Eprosartan,;
Endothelinantagonisten,
z. B. Tezosentan, Bosentan und Sitaxsentan-Natrium;
Neutral
Endopeptidaseinhibitoren, z. B. Candoxatril und Ecadotril;
Phosphodiesteraseinhibitoren,
z. B. Milrinoon, Theophyllin, Vinpocetin, EHNA (erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine),
Sildenafil, Vardenafil und Tadalafil;
Fibrinolytika, z. B.
Reteplase, Alteplase und Tenecteplase;
GP IIb/IIIa-Antagonisten,
z. B. Integrillin, Abciximab und Tirofiban;
Direkte Thrombininhibitoren,
z. B. AZD0837, Argatroban, Bivalirudin und Dabigatran;
Indirekte
Thrombininhibitoren, z. B. Odiparcil;
Direkte und indirekte
Faktor Xa Inhibitoren, z. B. Fondaparinux-Natrium, Apixaban, Razaxaban,
Rivaroxaban (BAY 59-7939), KFA-1982, DX-9065a, AVE3247, Otamixaban
(XRP0673), AVE6324, SAR377142, Idraparinux, SSR126517, DB-772d,
DT-831j, YM-150, 813893, LY517717 und DU-1766.;
Direkte und
indirekte Faktor Xa/IIa Inhibitoren, z. B. Enoxaparin-Natrium, AVE5026,
SSR128428, SSR128429 und BIBI-986 (Tanogitran);
Lipoprotein-assoziierte
Phospholipase A2 (”LpPLA2”) Modulatoren;
Diuretika,
z. B. Chlorthalidon, Ethacrynsäure, Furosemid, Amilorid,
Chlorothiazid, Hydrochlorothiazid, Methylchtothiazid und Benzthiazid;
Nitrate,
z. B. Isosorbide-5-Mononitrat;
Thromboxan-Antagonisten, z.
B. Seratrodast, Picotamid und Ramatroban;
Plättchenaggregations-Inhibitoren,
z. B. Clopidogrel, Tiklopidin, Cilostazol, Aspirin, Abciximab, Limaprost,
Eptifibatide und CT-50547;
Cyklooxygenase-Inhibitoren, z. B.
Meloxicam, Rofecoxib und Celecoxib;
B-Typ Natriuretic Peptide,
z. B. Nesiritid und Ularitide;
NV1FGF-Modulatoren, z. B. XRP0038;
HT1B/5-HT2A-Antagonisten,
z. B. SL65.0472;
Guanylatcyclase-Aktivatoren, z. B. Ataciguat
(HMR1766) und HMR1069;
e-NOS Transkriptions-Enhancers, z. B.
AVE9488 and AVE3085;
Anti-atherogene Substanzen, z. B. AGI-1067:
CPU-Inhibitoren,
z. B. AZD9684;
Renininhibitoren, z. B. Aliskirin und VNP489;
Inhibitoren
der Adenosindiphosphat-induzierten Plättchenaggregation,
z. B. Clopidogrel, Tiklopidin, Prasugrel und AZD6140;
NHE-1
Inhibitoren, z. B. AVE4454 und AVE4890.
-
Antibiotische
Therapie: Verschiedene Antibiotika oder antifungale Medikamenten-Kombinationen kommen
in Frage, entweder als kalkulierte Therapie (vor Vorliegen des mikrobiellen
Befundes) oder als spezifische Therapie; Flüssigkeitstherapie,
z. B. Kristalloide oder kolloidale Flüssigkeiten; Vasopressoren,
z. B. Norepinephrine, Dopamine oder Vasopressin; Inntrope Therapie,
z. B. Dobutamin; Kortikosteroide, z. B. Hydrokortison, oder Fludrokortison;
rekombinantes humanes aktivierte Protein C, Xigris; Blutprodukte,
z. B. Erythrozytenkonzentrate, Thrombozytenkonzentrate, Erythropietin
oder Fresh Frozen Plasma; Maschinelle Beatmung bei sepsis-induziertem
Acute Lung Injury (ALI) bzw. Acute Respiratory Distress Syndrome
(ARDS), z. B. Permissive Hyperkapnie, niedrigere Tidalvolumina;
Sedierung: z. B. Diazepam, Lorazepam, Midazolam oder Propofol. Opioide:
z. B. Fentanyl, Hydromorphon, Morphin, Meperidin oder Remifentanil.
NSAIDs: z. B. Ketorolac, Ibuprofen oder Acetaminophen. Neuromuskuläre
Blockade: z. B. Pancuronium; Glukose-Kontrolle, z. B. Insulin, Glukose;
Nierenersatzverfahren, z. B. kontinuierliche veno-venöse-Hämofiltration
oder intermittierende Hämodialyse. Dopamin niedrig-dosiert
zur renalen Protektion; Antikoagulantien, z. B. zur Thromboseprophylaxe oder
bei Nierenersatzverfahren, z. B. unfraktionierte Heparine, low molecular
weight Heparine, Heparinoide, Hirudin, Bivalirudin oder Argatroban;
Bikarbonat-Therapie; Streßulkusprophylaxe, z. B. H2-Rezeptorinhibitoren,
Antazida
-
Medikamente
bei proliferativen Erkrankungen: Urazil, Chlormethin, Cyklophosphamid,
Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Pipobroman, Triethylenemelamin,
Triethylenethiophosphoramin, Busulfan, Carmustine, Lomustine, Streptozocin,
Dacarbazine, Methotrexate, 5-Fluorouracil, Floxuridine, Cytarabine,
6-Mercaptopurine, 6-Thioguanine, Fludarabine phosphate, Pentostatine,
Vinblastine, Vincristine, Vindesine, Bleomycin, Dactinomycin, Daunorubicin,
Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Paclitaxel, Mithramycin, Deoxycoformycin,
Mitomycin-C, L-Asparaginase, Interferons, Etoposide, Teniposide
17.alpha.-Ethinylestradiol, Diethylstilbestrol, Testosterone, Prednisone,
Fluoxymesterone, Dromostanolone propionate, Testolactone, Megestrolacetate,
Tamoxifen, Methylprednisolone, Methyltestosterone, Prednisolone,
Triamcinolone, Chlorotrianisene, Hydroxyprogesterone, Aminoglutethimide,
Estranrustine, Medroxyprogesteroneacetate, Leuprolide, Flutamide,
Toremifene, Goserelin, Cisplatin, Carboplatin, Hydroxyurea, Amsacrine,
Procarbazine, Mitotane, Mitoxantrone, Levamisole, Navelbene, Anastrazole,
Letrazole, Capecitabine, Reloxafine, Droloxafine, Hexamethylmelamine, Oxaliplatin
(Eloxatin®), Iressa (gefmitib,
Zdl839), XELODA® (capecitabine),
Tarceva® (erlotinib), Azacitidine (5-Azacytidine;
5-AzaC), Temozolomide (Temodar®),
Gemcitabine (e. g., GEMZAR® (gemcitabine
HCl)), Vasostatin oder eine Kombination zweier oder mehrerer der
oben genannten.
-
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Verhinderung
der Blutkoagulation in vitro, insbesondere bei Blutkonserven oder
biologischen Proben, die Blutplättchen enthalten, das dadurch
gekennzeichnet ist, dass eine antikoagulatorisch wirksame Menge
der erfindungsgemäßen Verbindung zugegeben wird.
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen können
systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können
sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z. B. oral, parenteral,
pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal,
conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.
-
Für
diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen
Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
-
Für
die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende
schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen
Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen
in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster
Form enthalten, wie z. B. Tabletten (nicht überzogene oder überzogene
Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden
oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung
der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren),
in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten,
Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln),
Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole
oder Lösungen.
-
Die
parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes
geschehen (z. B. intravenös, intraarteriell, intrakardial,
intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption
(z. B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder
intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen
sich als Applikationsformen u. a. Injektions- und Infusionszubereitungen
in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten
oder sterilen Pulvern.
-
Bevorzugt
ist die orale Applikation.
-
Für
die sonstigen Applikationswege eignen sich z. B. Inhalationsarzneiformen
(u. a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen,
-sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten,
Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen,
Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen),
lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische
Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume,
Streupuder, Implantate oder Stents.
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen können
in die angeführten Applikationsformen überführt
werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten,
nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen.
Zu diesen Hilfsstoffen zählen u. a. Trägerstoffe
(beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol),
Lösungsmittel (z. B. flüssige Polyethylenglycole),
Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecylsulfat,
Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon),
synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin),
Stabilisatoren (z. B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure),
Farbstoffe (z. B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide)
und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.
-
Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens
eine erfindungsgemäße Verbindung, vorzugsweise
zusammen mit einem oder mehreren inerten nichttoxischen, pharmazeutisch
geeigneten Hilfsstoff enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor
genannten Zwecken.
-
Im
Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler
Applikation Mengen von etwa 5 bis 250 mg je 24 Stunden zur Erzielung
wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die
Menge etwa 5 bis 100 mg je 24 Stunden.
-
Trotzdem
kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen
abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht,
Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem
Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu
welchem die Applikation erfolgt.
-
Die
Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern
nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile.
Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und
Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen
beziehen sich jeweils auf das Volumen. Die Angabe ”w/v” bedeutet ”weight/volume” (Gewicht/Volumen).
So bedeutet beispielsweise ”10% w/v”: 100 ml Lösung
oder Suspension enthalten 10 g Substanz.
-
A) Beispiele
-
Abkürzungen:
-
-
- ca.
- circa
- CDI
- Carbonyldiimidazol
- d
- Tag(e), Dublett (bei
NMR)
- DC
- Dünnschicht-Chromatographie
- DCI
- direkte chemische
Ionisation (bei MS)
- dd
- Doppeltes Dublett
(bei NMR)
- DMAP
- 4-Dimethylaminopyridin
- DMF
- N,N-Dimethylformamid
- DMSO
- Dimethylsulfoxid
- DPPA
- Diphenylphosphorazidat
- DSC
- Disuccinimidylcarbonat
- d. Th.
- der Theorie (bei Ausbeute)
- eq.
- Äquivalent(e)
- ESI
- Elektrospray-Ionisation
(bei MS)
- h
- Stunde(n)
- HATU
- O-(7-Azabenzotnazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-Hexafluorphosphat
- HPLC
- Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
- LC-MS
- Flüssigchromatographie-gekoppelte
Massenspektroskopie
- LDA
- Lithiumdiisopropylamid
- m
- Multiplett (bei NMR)
- min
- Minute(n)
- MS
- Massenspektroskopie
- NMR
- Kernresonanzspektroskopie
- PYBOP
- Benzotriazol-1-yloxy-tris(pyrrolidino)phosphonium-Hexafluorophosphat
- q
- Quartett (bei NMR)
- RP
- reverse phase (bei
HPLC)
- RT
- Raumtemperatur
- Rt
- Retentionszeit (bei
HPLC)
- s
- Singulett (bei NMR)
- t
- Triplett (bei NMR)
- THF
- Tetrahydrofuran
-
Präparative Diastereomerentrennung:
-
- Methode 1A: Phase: Sunfire C18OBD, 5 μm 150 mm × 19
mm, Eluent: Wasser/Acetonitril 40:60; Fluss: 25 ml/min, T: 40°C;
UV-Detektion: 210 nm.
- Methode 2A: Phase: Sunfire C18OBD, 5 μm 150 mm × 19
mm, Eluent: Wasser/Acetonitril 45:55; Fluss: 25 ml/min, T: 40°C;
UV-Detektion: 210 nm.
- Methode 3A: Phase: Sunfire C18OBD, 5 μm 150 mm × 19
mm, Eluent: Wasser/Acetonitril 47:53; Fluss: 25 ml/min, T: 40°C;
UV-Detektion: 210 nm.
- Methode 4A: Phase: Sunfire C18OBD, 5 μm 150 mm × 19
mm, Eluent: Wasser/0.1% Trifluressigsäure/Acetonitril 56:14:30;
Fluss: 25 ml/min, T: 40°C; UV-Detektion: 210 nm.
-
LC-MS-Methoden:
-
- Methode 1B: Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters
UPLC Acquity; Säule: Thermo Hypersil GOLD 1.9 μ 50
mm × 1 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure,
Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure;
Gradient: 0.0 min 90% A → 0.1 min 90% A → 1.5
min 10% A → 2.2 min 10% A; Ofen: 50°C; Fluss:
0.33 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
- Methode 2B: Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp
HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Gemini
3 μ 30 mm × 3.00 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5
ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5
ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A → 2.5
min 30% A → 3.0 min 5% A → 4.5 min 5% A; Fluss:
0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min. 2 ml/min; Ofen: 50°C;
UV-Detektion: 210 nm.
- Methode 3B: Gerätetyp MS: Waters (Micromass) Quattro
Micro; Gerätetyp HPLC: Agilent 1100 Serie; Säule: Thermo
Hypersil GOLD 3 μ 20 mm × 4 mm; Eluent A: 1 l
Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril
+ 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100% A → 3.0
min 10% A → 4.0 min 10% A → 4.01 min 100% A (Flow
2.5 ml) → 5.00 min 100% A; Ofen: 50°C; Fluss:
2 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
- Methode 4B: Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule:
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 mm × 1 mm;
Eluent A: 1 l Wasser + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure, Eluent
B: 1 l Acetonitril + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure; Gradient:
0.0 min 90% A → 1.2 min 5% A → 2.0 min 5% A; Ofen:
50°C; Fluss: 0.40 ml/min; UV-Detektion: 210–400
nm.
- Methode 5B: Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule:
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 mm × 1 mm;
Eluent A: 1 l Wasser + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure, Eluent
B: 1 l Acetonitril + 0.25 ml 99%ige Ameisensäure; Gradient:
0.0 min 90% A → 1.2 min 5% A → 2.0 min 5% A; Ofen:
50°C; Fluss: 0.40 ml/min; UV-Detektion: 210–400
nm.
- Methode 6B: Gerätetyp MS: Waters ZQ; Gerätetyp
HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex Onyx Monolithic
C18, 100 mm × 3 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige
Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige
Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A → 2 min 65%
A → 4.5 min 5% A -> 6
min 5% A; Fluss: 2 ml/min; Ofen: 40°C; UV-Detektion: 210
nm.
- Methode 7B: Instrument: Micromass Quattro Micro MS mit HPLC
Agilent Serie 1100; Säule: Thermo Hypersil GOLD 3 μ 20
mm × 4 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure,
Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure;
Gradient: 0.0 min 100%A → 3.0 min 10% A 4.0 min 10% A → 4.01
min 100%A → 5.00 min 100% A; Ofen: 50°C; Fluss:
2 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
- Methode 8B: Instrument: Micromass Platform LCZ mit HPLC Agilent
Serie 1100; Säule: Thermo HyPURITY Aquastar 3 μ 50
mm × 2.1 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure,
Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure;
Gradient: 0.0 min 100% A → 0.2 min 100% A → 2.9
min 30% A → 3.1 min 10% A → 5.5 min 10% A; Ofen:
50°C; Fluss: 0.8 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
- Methode 9B: Gerätetyp MS: Waters ZQ; Gerätetyp
HPLC: Agilent 1100 Series; UV DAD; Säule: Thermo Hypersil
GOLD 3 μ 20 mm × 4 mm; Eluent A: 1 l Wasser +
0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril +
0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100% A → 3.0
min 10% A → 4.0 min 10% A → 4.1 min 100% Fluss:
2.5 ml/min; Ofen: 55°C; Fluss 2/ml; UV-Detektion: 210 nm.
- Methode 10B: Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp
HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex Synergi 2.5 μ MAX-RP
100A Mercury 20 mm × 4 mm; Eluent A: 1 l Wasser + 0.5 ml
50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 l Acetonitril + 0.5 ml
50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A → 0.1
min 90% A → 3.0 min 5% A → 4.0 min 5% A → 4.01
min 90% A; Fluss: 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV-Detektion: 210
nm.
-
Präparative Enantiomerentrennung:
-
- Methode 1C: Phase: Daicel Chiralpak AS-H, 5 μm
250 mm × 20 mm, Eluent: iso-Hexan/Ethanol 50:50; Fluss: 15
ml/min, Temperatur: 30°C; UV-Detektion: 220 nm.
-
Analytische Enantiomerentrennung:
-
- Methode 1D: Phase: Daicel Chiralpak AS-H, 5 μm
250 mm × 4.6 mm; Eluent: iso-Hexan/Ethanol 30:70 + 0.2% Trifluoressigsäure
+ 1% Wasser; Fluss: 1 ml/min; Temperatur: 40°C; UV-Detektion:
220 nm.
-
Als
Mikrowellenreaktor wurde ein ”single mode” Gerät
vom Typ EmrysTM Optimizer verwendet.
-
Ausgangsverbindungen
-
Allgemeine Methode 1A: Suzuki-Kupplung
-
Eine
Mischung des entsprechenden Brompyridins in Toluol (1.8 ml/mmol)
wird unter Argon bei RT mit Tetrakis-(triphenylphosphin)-palladium
(0.02 eq.), mit einer Lösung der entsprechenden Arylboronsäure
(1.2 eq.) in Ethanol (0.5 ml/mmol) und mit einer Lösung
aus Kaliumfluorid (2.0 eq.) in Wasser (0.2 ml/mmol) versetzt. Das
Reaktionsgemisch wird mehrere Stunden bis zur weitgehend vollständigen
Umsetzung unter Rückfluß gerührt. Nach
Zugabe von Essigsäureethylester und Phasentrennung wird
die organische Phase einmal mit Wasser und einmal mit gesättigter,
wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, getrocknet
(Magnesiumsulfat), filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt
wird mittels Flash-Chromatographie (Kieselgel-60, Eluent: Dichlormethan-Methanol-Gemische)
aufgereinigt.
-
Allgemeine Methode 2A: Hydrierung des
Pyridins
-
Eine
Lösung des Pyridins in Ethanol (9 ml/mmol) wird unter Argon
mit Palladium auf Aktivkohle (angefeuchtet mit ca. 50% Wasser, 0.3
g/mmol) versetzt und bei 60°C über Nacht in einer
50 bar Wasserstoff-Atmosphäre hydriert. Anschließend
wird der Katalysator über eine Filterschicht abfiltriert
und mehrmals mit Ethanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden
im Vakuum eingeengt.
-
Allgemeine Methode 3A: Umsetzung mit Carbamoylchloriden
-
Eine
Lösung des Piperidins in Dichlormethan (2.5 ml/mmol) wird
unter Argon bei 0°C tropfenweise mit N,N-Diisopropylethylamin
(1.2 eq.) und dem entsprechenden Carbamoylchlorid (1.2 eq.) versetzt.
Das Reaktionsgemisch wird bei RT gerührt. Nach Zugabe von
Wasser und Phasentrennung wird die organische Phase dreimal mit
Wasser und einmal mit gesättigter, wässriger Natriumchlorid-Lösung
gewaschen, getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und im Vakuum eingeengt.
-
Allgemeine Methode 4A: Methylesterverseifung/Epimerisierung
-
Zu
einer Lösung des entsprechenden Methylesters (1.0 eq.)
in Methanol (35–40 ml/mmol) wird bei RT Kalium-tert.-butylat
(10 eq.) gegeben. Die Mischung wird über Nacht bei 60°C
gerührt. Bei unvollständiger Umsetzung wird Wasser
(1.0 eq.) zugesetzt und bis zum vollständigen Umsatz bei
60°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird im Vakuum
das Methanol entfernt, der Rückstand mit Wasser versetzt
und mit wässriger 1 N Salzsäure-Lösung
sauer (pH 1) gestellt. Die Mischung wird mit Essigsäureethylester
extrahiert, die organische Phase mit Magnesiumsulfat getrocknet,
filtriert und im Vakuum eingeengt.
-
Beispiel 1A
-
5-(4-Ethylphenyl)pyridin-3-carbonsäureethylester
-
Nach
der Allgemeinen Methode 1A wurden 29 g (126 mmol) 5-Bromnicotinsäureethylester
und 23 g (152 mmol, 1.2 eq.) 4-Ethylphenylboronsäure umgesetzt.
Ausbeute: 32 g (82% d. Th.)
LC-MS (Methode 6B): Rt =
3.80 min; MS (ESIpos): m/z = 256 [M+H]+.
-
Beispiel 2A
-
5-(4-Ethylphenyl)piperidin-3-carbonsäureethylester
[racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 2A wurden 24 g (71 mmol) 5-(4-Ethylphenyl)pyridin-3-carbonsäureethylester
hydriert. Ausbeute: 15 g (81% d. Th.)
LC-MS (Methode 7B): Rt = 1.78 min und 1.91 min (cis-/trans-Isomere);
MS (ESIpos): m/z = 262 [M+H]+.
-
Beispiel 3A
-
5-(4-Ethylphenyl)-1-(morpholin-4-ylcarbonyl)piperidin-3-carbonsäureethylester
[racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 3A wurden 10.0 g (36.0 mmol) 5-(4-Ethylphenyl)piperidin-3-carbonsäureethylester
mit 7.0 g (46.8 mmol, 1.3 eq.) Morpholin-4-carbonylchlorid umgesetzt.
Ausbeute: 12.0 g (89% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): Rt = 2.38 min und 2.48 min (cis-/trans-Isomere);
MS (ESIpos): m/z = 375 [M+H]+.
-
Beispiel 4A
-
5-(4-Ethylphenyl)-1-(morpholin-4-ylcarbonyl)piperidin-3-carbonsäure
[racemisches cis-Isomer]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 4A wurden 3.4 g (11.7 mmol) 5-(4-Ethylphenyl)-1-(morpholin-4-ylcarbonyl)piperidin-3-carbonsäureethylester
(Beispiel 3A) verseift. Die Reaktion führte selektiv zum
cis-Isomer. Ausbeute: 3.2 g (89% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B):
Rt = 2.06 min; MS (ESIpos): m/z = 347 [M+H]+.
-
Beispiel 5A
-
[3-(4-Ethylphenyl)-5-(hydroxymethyl)piperidin-1-yl](morpholin-4-yl)methanon
[racemisches cis-Isomer]
-
Unter
Argon wurden 218 mg (5.77 mmol) Natriumborhydrid in 28 ml Tetrahydrofuran
vorgelegt und bei 0°C tropfenweise mit einer Lösung
von 1.00 g (2.89 mmol) 5-(4-Ethylphenyl)-1-(morpholin-4-ylcarbonyl)piperidin-3-carbonsäure
[racemisches cis-Isomer] in 14.0 ml Tetrahydrofuran versetzt. Anschließend
wurde 0.98 ml (7.74 mmol) Bortrifluorid-Diethylether-Komplex zugesetzt
und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe
von 1 N wässriger Hydrogenchlorid-Lösung beendet,
mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische
Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und
im Vakuum eingeengt.
Ausbeute: 917 mg (95% d. Th.)
LC-MS
(Methode 3B): Rt = 1.95 min; MS (ESIpos):
m/z = 333 [M+H]+.
-
Beispiel 6A
-
5-(4-Ethylphenyl)-1-(morpholin-4-ylcarbonyl)piperidin-3-carbaldehyd
[racemisches cis/trans-Isomerengemisch]
-
105
mg (0.316 mmol) des Alkohols aus Beispiel 5A in 1.5 ml Dichlormethan
wurden bei RT mit 161 mg (0.379 mmol) Dess-Martin Periodinan versetzt
und anschließend 1 h gerührt. Die Reaktionslösung
wurde mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung
extrahiert, die wässrige Phase nochmals mit Dichlormethan
gewaschen und die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat
getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Die Verbindung wurde
ohne weitere Reinigung in der Folgestufe eingesetzt. Ausbeute: ca. 80.0
mg (77% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): Rt =
1.85 und 2.21 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 331 [M+H]+.
-
Beispiel 7A
-
5-[4-(Trifluormethyl)phenyl]pyridin-3-carbonsäuremethylester
-
Nach
der Allgemeinen Methode 1A wurden 28 g (132 mmol) 5-Bromnicotinsäuremethylester
und 30 g (158 mmol, 1.2 eq.) 4-Trifluormethylphenylboronsäure
umgesetzt. Ausbeute: 32 g (85% d. Th.)
LC-MS (Methode 8B):
Rt = 2.27 min; MS (ESIpos): m/z = 282 [M+H]+.
-
Beispiel 8A
-
5-[4-(Trifluormethyl)phenyl]piperidin-3-carbonsäuremethylester
[racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 2A wurden 32 g (112 mmol) 5-[4-(Trifluormethyl)phenyl]pyridin-3-carbonsäuremethylester
hydriert. Ausbeute: 26 g (82% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): Rt = 1.35 und 1.41 min (cis-/trans-Isomere);
MS (ESIpos): m/z = 288 [M+H]+.
-
Beispiel 9A
-
1-(Morpholin-4-ylcarbonyl)-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-3-carbonsäuremethylester
[racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 3A wurden 9.25 g (32.2 mmol) 5-[4-(Trifluormethyl)phenyl]piperidin-3-carbonsäuremethylester
mit 9.63 g (64.7 mmol) Morpholin-4-carbonylchlorid umgesetzt. Man
erhielt so 16.3 g Rohprodukt in 76%-iger Reinheit (LC-MS), welches
ohne weitere Reinigungsoperationen umgesetzt wurde.
LC-MS (Methode
9B): Rt = 1.19 und 1.22 min (cis-/trans-Isomere);
MS (ESIpos): m/z = 401 [M+H]+.
-
Beispiel 10A
-
1-(Morpholin-4-ylcarbonyl)-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-3-carbonsäure
[racemisches cis-Isomer]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 4A wurden 22.19 g (39.90 mmol) der Verbindung
aus Beispiel 10A und 44.78 g (399.0 mmol) Kalium-tert.-butylat umgesetzt.
Die Reaktion führte selektiv zum cis-Isomer. Ausbeute: 18.29
g (100% d. Th.)
LC-MS (Methode 7B): Rt =
1.95 min; MS (ESIpos): m/z = 387 [M+H]+.
-
Beispiel 11A
-
{3-(Hydroxymethyl)-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl}(morpholin-4-yl)methanon
[racemisches cis-Isomer]
-
Unter
Argon wurden 1.33 g (35.1 mmol) Natriumborhydrid in 150 ml Tetrahydrofuran
vorgelegt und bei 0°C tropfenweise mit einer Lösung
von 7.00 g (17.6 mmol) {3-(Hydroxymethyl)-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl}(morpholin-4-yl)methanon
[racemisches cis-Isomer] in 4.0 ml Tetrahydrofuran versetzt. Anschließend
wurden 6.0 ml (47.4 mmol) Bortrifluorid-Diethylether-Komplex zugesetzt
und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde durch
Zugabe von 1 N wässriger Hydrogenchlorid-Lösung
beendet, mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die
organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet,
filtriert und im Vakuum eingeengt.
Ausbeute: 6.49 g (99% d.
Th.)
LC-MS (Methode 1B): Rt = 1.06
min; MS (ESIpos): m/z = 373 [M+H]+.
-
Beispiel 12A
-
1-(Morpholin-4-ylcarbonyl)-5-[4-(trifluormethyl)cyclohexa-1,5-dien-1-yl]piperidin-3-carbaldehyd
[racemisches cis-/trans-Isomerengemisch]
-
Unter
Argon wurde eine Lösung von 3.00 g (8.06 mmol) des Alkohols
aus Beispiel 12A in 180 ml Dichlormethan mit 5.72 ml (80.6 mmol)
Dimethylsulfoxid und 7.02 ml (40.3 mmol) N,N'-Diisopropylethylamin
versetzt. Anschließend wurden bei –20°C
5.13 g (32.2 mmol) Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex zugegeben und über
Nacht gerührt wobei langsam auf RT erwärmt wurde.
Aufgrund unvollständigen Umsatzes wurde erneut auf –20°C
gekühlt und 2.56 g (16.1 mmol) Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex,
2.86 ml (40.3 mmol) Dimethylsulfoxid und 3.51 ml (20.1 mmol) N,N'-Diisopropylethylamin
zugegeben. Es wurde langsam auf RT erwärmt und anschließend
die Reaktionslösung mit Dichlormethan verdünnt,
mit Wasser gewaschen, und die organische Phase über Magnesiumsulfat
getrocknet. Nach Filtration und Einengen im Vakuum wurde das Rohprodukt
mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 1.54 g (45%
d. Th.) LC-MS (Methode 5B): Rt = 0.86 und
1.00 min (cis-/trans-Isomere); MS (ESIpos): m/z = 371 [M+H]+.
-
Beispiel 13A
-
Diethyl-[(5-phenylpyridin-2-yl)methyl]phosphonat
-
200
mg (0.649 mmol) Diethyl-[(5-brompyridin-2-yl)methyl]phosphonat [M.
V. Chelliah et al., J. Med. Chem. 2007, 21, 5147–5160]
in 16.5 ml 1,2-Dimethoxyethan wurden mit 37.5 mg (0.032 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium
versetzt. Anschließend wurden 119 mg (0.974 mmol) Phenylboronsäure
sowie 166 mg (1.98 mmol) Natriumhydrogencarbonat in 7.5 ml Wasser
zugegeben. Nach 2 h Rühren unter Rückfluss wurde die
Reaktionslösung im Vakuum eingeengt, der Rückstand
in Ethylacetat aufgenommen und mit gesättigter, wässriger
Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über
Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das
Rohprodukt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute:
100 mg (50% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): Rt =
1.87 min; MS (ESIpos): m/z = 306 [M+H]+.
-
Beispiel 14A
-
Diethyl-{[5-(2-methoxyphenyl)pyridin-2-yl]methyl}phosphonat
-
200
mg (0.649 mmol) Diethyl-[(5-brompyridin-2-yl)methyl]phosphonat [M.
V. Chelliah et al., J. Med. Chem. 2007, 21, 5147–5160]
in 16.5 ml 1,2-Dimethoxyethan wurden mit 37.5 mg (0.032 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium
versetzt. Anschließend wurden 148 mg (0.974 mmol) 2-Methoxyphenylboronsäure
sowie 166 mg (1.98 mmol) Natriumhydrogencarbonat in 7.5 ml Wasser
zugegeben. Nach 2 h Rühren unter Rückfluss wurde
die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt, der Rückstand
in Ethylacetat aufgenommen und mit gesättigter, wässriger
Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über
Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das
Rohprodukt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute:
174 mg (72% d. Th.)
LC-MS (Methode 1B): Rt =
1.04 min; MS (ESIpos): m/z = 336 [M+H]+.
-
Beispiel 15A
-
Diethyl-{[5-(3-chlorphenyl)pyridin-2-yl]methyl}phosphonat
-
200
mg (0.649 mmol) Diethyl-[(5-brompyridin-2-yl)methyl]phosphonat [M.
V. Chelliah et al., J. Med. Chem. 2007, 21, 5147–5160]
in 16.5 ml 1,2-Dimethoxyethan wurden mit 37.5 mg (0.032 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium
versetzt. Anschließend wurden 152 mg (0.974 mmol) 2-Chlorphenylboronsäure
sowie 166 mg (1.98 mmol) Natriumhydrogencarbonat in 7.5 ml Wasser
zugegeben. Nach 2 h Rühren unter Rückfluss wurde
die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt, der Rückstand
in Ethylacetat aufgenommen und mit gesättigter, wässriger
Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über
Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das
Rohprodukt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute:
166 mg (75% d. Th.)
LC-MS (Methode 10B): Rt =
1.77 min; MS (ESIpos): m/z = 340 [M+H]+.
-
Ausführungsbeispiele
-
Allgemeine Methode 1: Horner-Wadsworth-Emmons
Reaktion
-
Eine
Lösung aus dem entsprechenden Phosphonat (1.2 eq.) in Tetrahydrofuran
(5–10 ml/mmol) wird unter Argon bei 0°C tropfenweise
mit n-Butyllithium (1.1 eq., 2.5 M in n-Hexan) versetzt. Nach 10
min wird der Aldehyd (1.0 eq.) in Tetrahydrofuran (5–10
ml/mmol) zugegeben und anschließend über Nacht
gerührt, wobei die Reaktionslösung langsam auf
RT erwärmt wird. Die Reaktion wird durch langsame Zugabe
von gesättigter, wässriger Ammoniumchlorid-Lösung
beendet, mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat oder Dichlormethan extrahiert.
Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet,
filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird mittels präparativer
HPLC gereinigt.
-
Beispiel 1
-
{3-(4-Ethylphenyl)-5-[(E)-2-{5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}vinyl]piperidin-1-yl}-(morpholin-4-yl)methanon
[racemisches cis-Isomer]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 1 wurden 108 mg (0.291 mmol) Diethyl-({5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}methyl)phosphonat
[M. C. Clasby et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 129–138]
und 80.0 mg (ca. 0.242 mmol) der Verbindung aus Beispiel 6A umgesetzt.
Ausbeute: 58 mg (44% d. Th.)
LC-MS (Methode 2B): Rt =
3.10 min; MS (ESIpos): m/z = 550 [M+H]+;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ =
8.92 (s, 1H), 8.16 (dd, 3H), 8.07 (br s, 2H), 7.83-7.68 (m, 2H),
7.54 (d, 1H), 7.27-7.20 (m, 2H), 7.20-7.14 (m, 2H), 6.83 (dd, 1H),
6.72-6.62 (m, 1H), 3.78 (d, 1H), 3.64 (d, 1H), 3.58 (br s, 4H),
3.17 (br s, 4H), 2.86-2.69 (m, 3H), 2.62-2.54 (m, 3H), 2.03 (br
s, 1H), 1.76-1.62 (m, 1H), 1.17 (t, 3H).
-
Beispiel 2
-
Morpholin-4-yl{3-[4-(trifluormethyl)phenyl]-5-[(E)-2-{5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}vinyl]piperidin-1-yl}methanon
[racemisches cis-Isomer]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 1 wurden 148 mg (0.389 mmol) Diethyl-({5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}methyl)phosphonat
[M. C. Clasby et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 129–138]
und 120 mg (0.324 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A umgesetzt.
Das Rohprodukt wurde mittels Diastereomerentrennung nach Methode
1A gereinigt. Ausbeute: 109 mg (57% d. Th.)
LC-MS (Methode
5B): Rt = 1.37 min; MS (ESIpos): m/z = 590
[M+H]+;
1H-NMR
(400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.92 (d,
1H), 8.16 (dd, 1H), 8.07 (br s, 2H), 7.81-7.66 (m, 4H), 7.63-7.48 (m,
3H), 6.92-6.77 (m, 1H), 6.74-6.62 (m, 1H), 3.78 (d, 1H), 3.68 (d,
1H), 3.58 (d, 4H), 3.19 (br s, 4H), 3.07-2.84 (m, 2H), 2.83-2.71
(m, 1H), 2.61 (d, 3H), 2.11 (br s, 1H), 1.75 (q, 1H).
-
Beispiel 3
-
Morpholin-4-yl{3-[4-(trifluormethyl)phenyl]-5-[(E)-2-{5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}vinyl]piperidin-1-yl}methanon
[racemisches trans-Isomer].
-
Nach
der Allgemeinen Methode 1 wurden 148 mg (0.389 mmol) Diethyl-({5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}methyl)phosphonat
[M. C. Clasby et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 129–138]
und 120 mg (0.324 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A umgesetzt.
Das Rohprodukt wurde mittels Diastereomerentrennung nach Methode
1A gereinigt. Ausbeute: 20.7 mg (10% d. Th.)
LC-MS (Methode
5B): Rt = 1.35 min; MS (ESIpos): m/z = 590
[M+H]+;
1H-NMR
(400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.93 (d,
1H), 8.19 (dd, 1H), 8.08 (br s, 2H), 7.81-7.67 (m, 4H), 7.61-7.54 (m,
3H), 7.02 (dd, 1H), 6.70 (d, 1H), 3.71-3.38 (m, 6H), 3.33 (dd, 1H),
3.27-3.12 (m, 4H), 3.11-3.01 (m, 2H), 2.80 (br s, 1H), 2.23-2.09
(m, 1H), 2.09-1.98 (m, 1H).
-
Beispiel 4
-
Morpholin-4-yl(3-{(Z)-2-[3'-(trifluormethyl)biphenyl-4-yl]vinyl}-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl)methanon
[racemisches cis-Isomer]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 1 wurden 148 mg (0.389 mmol) Diethyl-({5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}methyl)phosphonat
[M. C. Clasby et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 129–138]
und 120 mg (0.324 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A umgesetzt.
Das Rohprodukt wurde mittels Diastereomerentrennung nach Methode
1A gereinigt. Ausbeute: 7.0 mg (4% d. Th.)
LC-MS (Methode 5B):
Rt = 1.43 min; MS (ESIpos): m/z = 590 [M+H]+;
1H-NMR (400
MHz, DMSO-d6): δ = 8.98 (d, 1H),
8.20 (dd, 1H), 8.10 (br s, 2H), 7.82-7.72 (m, 2H), 7.69 (d, 2H), 7.59-7.48
(m, 3H), 6.57 (d, 1H), 5.73 (dd, 1H), 3.83 (d, 1H), 3.75-3.65 (m,
2H), 3.51 (t, 5H), 3.20 (d, 4H), 3.00-2.89 (m, 1H), 2.89-2.80 (m,
1H), 2.79-2.71 (m, 1H), 2.05 (d, 1H), 1.66 (q, 1H).
-
Beispiel 5
-
Morpholin-4-yl{3-[4-(trifluormethyl)phenyl]-5-[(E)-2-{5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}vinyl]piperidin-1-yl}methanon
[enantiomerenreines cis-Isomer]
-
Enantiomerentrennung
von 70.0 mg der Verbindung aus Beispiel 2 nach Methode 1C ergab
22.0 mg des Beispiels 5 (Enantiomer 1) und 22.0 mg des Beispiels
6 (Enantiomer 2).
HPLC (Methode 1D): Rt =
4.19 min, > 99.0%
ee;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.92 (d, 1H), 8.16 (dd,
1H), 8.07 (br s, 2H), 7.84-7.65 (m, 4H), 7.63-7.44 (m, 3H), 6.97-6.76
(m, 1H), 6.74-6.62 (m, 1H), 3.78 (d, 1H), 3.68 (d, 1H), 3.58 (br
s, 4H), 3.19 (br s, 4H), 3.04-2.94 (m, 1H), 2.94-2.85 (m, 1H), 2.83-2.73
(m, 1H), 2.60 (br s, 1H), 2.09 (d, 1H), 1.75 (q, 1H).
-
Beispiel 6
-
Morpholin-4-yl{3-[4-(trifluormethyl)phenyl]-5-[(E)-2-{5-[3-(trifluormethyl)phenyl]pyridin-2-yl}vinyl]piperidin-1-yl}methanon
[enantiomerenreines cis-Isomer]
-
Enantiomerentrennung
von 70.0 mg der Verbindung aus Beispiel 2 nach Methode 1C ergab
22.0 mg des Beispiels 5 (Enantiomer 1) und 22.0 mg des Beispiels
6 (Enantiomer 2).
HPLC (Methode 1D): Rt =
5.28 min, > 92.5%
ee;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.92 (d, 1H), 8.16 (dd,
1H), 8.07 (br s, 2H), 7.83-7.66 (m, 4H), 7.63-7.48 (m, 3H), 6.91-6.78
(m, 1H), 6.74-6.63 (m, 1H), 3.78 (d, 1H), 3.68 (d, 1H), 3.58 (br
s, 4H), 3.19 (br s, 4H), 2.97 (d, 1H), 2.94-2.85 (m, 1H), 2.83-2.73
(m, 1H), 2.60 (d, 1H), 2.09 (d, 1H), 1.75 (q, 1H).
-
Beispiel 7
-
(3-{(E)-2-[5-(2-Methoxyphenyl)pyridin-2-yl]vinyl}-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl)(morpholin-4-yl)methanon
[racemisches cis-Isomer]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 1 wurden 163 mg (0.437 mmol) des Phosphonats
aus Beispiel 14A und 135 mg (0.364 mmol) der Verbindung aus Beispiel
12A umgesetzt. Das Rohprodukt wurde mittels Diastereomerentrennung
nach Methode 2A gereinigt. Ausbeute: 96.0 mg (47% d. Th.)
LC-MS
(Methode 4B): Rt = 1.26 min; MS (ESIpos):
m/z = 552 [M+H]+;
1H-NMR
(400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.62 (d,
1H), 7.86 (dd, 1H), 7.71 (d, 2H), 7.58 (d, 2H), 7.45 (d, 1H), 7.42-7.33 (m,
2H), 7.15 (d, 1H), 7.06 (t, 1H), 6.82-6.74 (m, 1H), 6.67-6.61 (m,
1H), 3.79 (s, 3H), 3.75 (br s, 1H), 3.68 (d, 1H), 3.58 (t, 4H),
3.23-3.14 (m, 4H), 3.03-2.94 (m, 1H), 2.94-2.85 (m, 1H), 2.82-2.72
(m, 1H), 2.65-2.57 (m, 1H), 2.18-2.08 (m, 1H), 2.12-2.07 (m, 1H),
1.73 (q, 1H).
-
Beispiel 8
-
Morpholin-4-yl{3-[(E)-2-(5-phenylpyridin-2-yl)vinyl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl}methanon
[racemisches cis-Isomer]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 1 wurden 100 mg (0.321 mmol) des Phosphonats
aus Beispiel 13A und 99 mg (0.267 mmol) der Verbindung aus Beispiel
12A umgesetzt. Das Produkt wurde durch Ausrühren des Rohprodukts
in Acetonitril erhalten. Ausbeute: 82.0 mg (58% d. Th.)
LC-MS
(Methode 5B): Rt = 1.27 min; MS (ESIpos):
m/z = 522 [M+H]+;
1H-NMR
(400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.84 (d,
1H), 8.04 (dd, 1H), 7.72 (dd, 4H), 7.58 (d, 2H), 7.53-7.46 (m, 3H), 7.46-7.37
(m, 1H), 6.85-6.76 (m, 1H), 6.70-6.60 (m, 1H), 3.78 (d, 1H), 3.68
(d, 1H), 3.58 (br s, 4H), 3.19 (br s, 4H), 3.02-2.85 (m, 1H), 2.82-2.71
(m, 1H), 2.09 (d, 1H), 1.74 (q, 1H).
-
Beispiel 9
-
(3-{(E)-2-[5-(3-Chlorphenyl)pyridin-2-yl]vinyl}-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl)(morpholin-4-yl)methanon
[racemisches cis-Isomer]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 1 wurden 165 mg (0.486 mmol) des Phosphonats
aus Beispiel 15A und 150 mg (0.405 mmol) der Verbindung aus Beispiel
12A umgesetzt. Ausbeute: 82.0 mg (58% d. Th.)
LC-MS (Methode
5B): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 556
[M+H]+;
1H-NMR
(400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.87 (d,
1H), 8.09 (dd, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.75-7.64 (m, 3H), 7.58 (d, 2H), 7.55-7.44
(m, 3H), 6.87-6.78 (m, 1H), 6.73-6.61 (m, 1H), 3.77 (d, 1H), 3.68
(d, 1H), 3.57 (d, 4H), 3.19 (br s, 4H), 3.04-2.94 (m, 1H), 2.94-2.84
(m, 1H), 2.83-2.72 (m, 1H), 2.60 (d, 1H), 2.08 (d, 1H), 1.74 (q,
1H).
-
Beispiel 10
-
{3-[(E)-2-(6-Methoxychinolin-2-yl)vinyl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl}(morpholin-4-yl)methanon [racemisches
cis-Isomer]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 1 wurden 100 mg (0.324 mmol) Diethyl-[(6-methoxychinolin-2-yl)methyl]phosphonat
[M. C. Clasby et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16,
1544–1448] und 100 mg (0.270 mmol) der Verbindung
aus Beispiel 12A umgesetzt. Das Produkt wurde durch Ausrühren
des Rohprodukts in Acetonitril erhalten. Ausbeute: 79.0 mg (58%
d. Th.)
LC-MS (Methode 1B): Rt = 1.24
min; MS (ESIpos): m/z = 526 [M+H]+;
1H-NMR (500 MHz, CHCl3-d): δ =
7.99 (d, 1H), 7.93 (d, 1H), 7.60 (d, 2H), 7.46 (d, 1H), 7.41-7.31
(m, 3H), 7.05 (d, 1H), 6.83-6.73 (m, 1H), 6.73-6.64 (m, 1H), 3.97-3.86
(m, 5H), 3.70 (t, 4H), 3.32 (d, 4H), 3.01 (t, 1H), 2.79 (td, 2H),
2.73-2.61 (m, 1H), 2.26 (d, 1H), 1.73 (q, 1H).
-
Beispiel 11
-
Morpholin-4-yl{3-[(E)-2-phenylvinyl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl}methanon
[racemisches cis-Isomer]
-
Nach
der Allgemeinen Methode 1 wurden 111 mg (0.486 mmol) Phenylmethanphosphorsäurediethylester
und 150 mg (0.405 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A umgesetzt.
Das Rohprodukt wurde mittels Diastereomerentrennung nach Methode
3A gereinigt. Ausbeute: 76.8 mg (39% d. Th.)
LC-MS (Methode
4B): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 445
[M+H]+;
1H-NMR
(400 MHz, DMSO-d6): δ = 7.70 (d,
2H), 7.57 (d, 2H), 7.42 (d, 2H), 7.32 (t, 2H), 7.25-7.15 (m, 1H),
6.52 (d, 1H), 6.28 (dd, 1H), 3.82-3.62 (m, 2H), 3.61-3.42 (m, 6H),
3.18 (d, 4H), 3.05-2.82 (m, 2H), 2.72 (t, 1H), 2.05 (d, 1H), 1.69
(q, 3H).
-
Beispiel 12
-
Morpholin-4-yl{3-[(E)-2-(pyridin-4-yl)vinyl]-5-[4-(trifluormethyl)phenyl]piperidin-1-yl}methanon
[racemisches cis-Isomer]
-
Unter
Argon wurde eine Lösung von 134 mg (0.343 mmol) Triphenyl(pyridin-4-ylmethyl)phosphoniumchlorid
[P. Carsky, S. Huenig, I. Stemmler, D. Scheutzow, Liebigs
Ann. Chem. 1980, 2, 291–304] in 2.0 ml Tetrahydrofuran
bei 0°C langsam mit 35.3 mg (0.315 mmol) Kalium-tert.-butylat
versetzt. Nach 10 min wurden 106 mg (0.286 mmol) Aldehyd aus Beispiel
12A in 3.0 ml Tetrahydrofuran zugegeben und anschließend über Nacht
gerührt, wobei die Reaktionslösung langsam auf
RT erwärmt wurde. Die Reaktion wurde durch langsame Zugabe
von gesättigter, wässriger Ammoniumchlorid-Lösung
beendet, mit Wasser verdünnt und Dichlormethan extrahiert.
Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet,
filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde mittels
Diastereomerentrennung nach Methode 4A gereinigt. Ausbeute: 51.8 mg
(41% d. Th.)
LC-MS (Methode 4B): Rt =
0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 446 [M+H]+;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ =
8.76 (d, 2H), 7.94 (d, 2H), 7.71 (d, 2H), 7.57 (d, 2H), 7.02 (dd,
1H), 6.77 (d, 1H), 3.81 (d, 1H), 3.67 (d, 1H), 3.57 (d, 4H), 3.19
(d, 4H), 3.05-2.87 (m, 2H), 2.60-2.81 (m, 2H), 2.10 (d, 1H), 1.73
(q, 1H), 1.87-1.61 (m, 1H).
-
B) Bewertung der physiologischen Wirksamkeit
-
Abkürzungen:
-
-
- BSA
- Rinderserum-Albumin
- DMEM
- Dulbecco's Modified
Eagle Medium
- EGTA
- Ethylenglykol-glykol-bis-(2-aminoäthyl)-N,N,N',N'-tetra-essigsäure
- FCS
- Fetal Calf Serum
- HEPES
- 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure
- [3H]haTRAP
- tritiated high affinity
thrombin receptor activating peptide
- PRP
- Plättchenreiches
Plasma
-
Die
Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur
Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen kann in folgenden
Assaysystemen gezeigt werden:
-
1.) In vitro Assays
-
1.a) Zellulärer, funktioneller
in vitro-Test
-
Die
Identifizierung von Antagonisten des humanen Protease Aktivierten
Rezeptors 1 (PAR-1) sowie die Quantifizierung der Wirksamkeit der
hier beschriebenen Substanzen erfolgt mit Hilfe einer rekombinanten Zelllinie.
Die Zelle leitet sich ursprünglich von einer embryonalen
Nierenzelle des Menschen (HEK293; ATCC: American Type Culture Collection,
Manassas, VA 20108, USA) ab. Die Testzelllinie exprimiert konstitutiv
eine modifizierte Form des calciumsensitiven Photoproteins Aequorin,
das nach Rekonstitution mit dem Co-Faktor Coelenterazin bei Erhöhungen
der freien Calcium-Konzentration im inneren mitochondrialen Kompartiment Licht
emittiert (Rizzuto R, Simpson AW, Brini M, Pozzan T.; Nature
1992, 358, 325–327). Zusätzlich exprimiert die
Zelle stabil den endogenen humanen PAR-1-Rezeptor sowie den endogenen
purinergen Rezeptor P2Y2. Die resultierende PAR-1-Testzelle reagiert
auf Stimulation des endogenen PAR-1 oder P2Y2-Rezeptors mit einer
intrazellulären Freisetzung von Calcium-Ionen, die durch
die resultierende Aequorin-Lumineszens mit einem geeigneten Luminometer
quantifiziert werden kann (Milligan G, Marshall F, Rees
S, Trends in Pharmacological Sciences 1996, 17, 235–237).
-
Für
die Prüfung der Substanz-Spezifität wird deren
Wirkung nach Aktivierung des endogenen PAR-1-Rezeptors mit der Wirkung
nach Aktivierung des endogenen purinergen P2Y2-Rezeptors verglichen, der
den gleichen intrazellulären Signalweg nutzt.
-
Testablauf:
Die Zellen werden zwei Tage (48 Std.) vor dem Test in Kulturmedium
(DMEM F12, ergänzt mit 10% FCS, 2 mM Glutamine, 20 mM HEPES,
1.4 mM Pyruvat, 0.1 mg/ml Gentamycin, 0.15% Na-Bicarbonat; BioWhittaker
Cat.# BE04-687Q; B-4800 Verviers, Belgien) in 384-Loch-Mikrotiterplatten
ausplattiert und in einem Zellinkubator (96% Luftfeuchtigkeit, 5%
v/v CO
2, 37°C) gehalten. Am Testtag
wird das Kulturmedium durch eine Tyrodelösung (in mM: 140
Natriumchlorid, 5 Kaliumchlorid, 1 Magnesiumchlorid, 2 Calciumchlorid, 20
Glucose, 20 HEPES), das zusätzlich den Co-Faktor Coelenterazin
(25 μM) und Glutathion (4 mM) enthält, ausgetauscht
und die Mikrotiterplatte anschließend für weitere
3–4 Stunden inkubiert. Dann werden die Testsubstanzen auf
die Mikrotiterplatte pipettiert und 5 Minuten nach Übertragung
der Testsubstanzen in die Wells der Mikrotiterplatte wird die Platte
in das Luminometer transferiert, eine PAR-1-Agonist-Konzentration,
die EC
50 entspricht, zugeschossen und sofort
das resultierende Lichtsignal im Luminometer gemessen. Zur Unterscheidung
einer Antagonist-Substanzwirkung von einer toxischen Wirkung wird
unmittelbar anschließend der endogene purinerge Rezeptor
mit Agonist aktiviert (ATP, 10 μM Endkonzentration) und
das resultierende Lichtsignal gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle
A gezeigt: Tabelle A:
Beispiel-Nr. | IC50 [nm] |
5 | 2.0 |
7 | 1.9 |
9 | 2.2 |
-
1.b) PAR-1 Rezeptor Bindungsassay
-
Thrombozytenmembranen
werden mit 12 nM [3H]haTRAP und Testsubstanz in verschiedenen Konzentrationen
in einem Puffer (50 mM Tris pH 7.5, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM
EGTA, 0.1% BSA) bei Raumtemperatur für 80 min inkubiert.
Danach wird der Ansatz auf eine Filterplatte übertragen
und zweimal mit Puffer gewaschen. Nach Zugabe von Scintillationsflüssigkeit
wird die Radioaktivität auf dem Filter in einem beta-Counter
vermessen.
-
1.c) Thrombozytenaggregation in Plasma
-
Zur
Bestimmung der Thrombozytenaggregation wird Blut von gesunden Probanden
beiderlei Geschlechts, die innerhalb der letzten zehn Tage keine
die Thrombozytenaggregation beeinflussende Medikation erhalten hatten,
verwendet. Das Blut wird in Monowetten (Sarstedt, Nümbrecht,
Deutschland) die als Antikoagulans Natrium Citrat 3.8% (1 Teil Citrat
+ 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen. Zur Gewinnung von plättchenreichem
Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140 g für 20 min zentrifugiert.
-
Für
die Aggregationsmessungen werden Aliquots des plättchenreichen
Plasmas mit aufsteigenden Konzentrationen an Prüfsubstanz
10 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die
Aggregation durch Zugabe eines Thrombin-Rezeptor Agonisten (TRAP6,
SFLLRN) in einem Aggregometer ausgelöst und mittels der
turbidimetrischen Methode nach Born (Born, G. V. R., Cross
M. J., The Aggregation of Blood Platelets; J. Physiol. 1963, 168,
178–195) bei 37°C bestimmt. Die SFLLRN-Konzentration,
die zur maximalen Aggregation führt, wird gegebenenfalls
jeweils für jeden Spender individuell ermittelt.
-
Zur
Berechnung der inhibitorischen Wirkung wird die maximale Zunahme
der Lichttransmission (Amplitude der Aggregationskurve in %) innerhalb
5 Minuten nach Zugabe des Agonisten in Gegenwart und Abwesenheit
von Prüfsubstanz ermittelt und die Inhibition berechnet.
Aus den Inhibitionskurven wird die Konzentration berechnet, die
die Aggregation zu 50% hemmt.
-
1.d) Thrombozytenaggregation in Puffer
-
Zur
Bestimmung der Thrombozytenaggregation wird Blut von gesunden Probanden
beiderlei Geschlechts, die innerhalb der letzten zehn Tage keine
die Thrombozytenaggregation beeinflussende Medikation erhalten hatten,
verwendet. Das Blut wird in Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht,
Deutschland) die als Antikoagulans Natriumcitrat 3.8% (1 Teil Citrat
+ 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen. Zur Gewinnung von plättchenreichem
Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140 g für 20 min zentrifugiert.
Zu dem PRP wird ein Viertel des Volumens ACD-Puffer (44.8 mM Natriumcitrat,
20.9 mM Citronensäure, 74.1 mM Glucose und 4 mM Kaliumchlorid)
zugegeben und 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Das Thrombozyten-Pellet
wird mit Wasch-Puffer resuspendiert und 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert.
Die Thrombozyten werden in Inkubation-Puffer resuspendiert und auf
200000 Z/μl eingestellt. Vor Versuchsbeginn wird Calciumchlorid
und Magnesiumchlorid, Endkonzentration je 2 mM (Stammlösung
2 M, 1:1000 Verdünnung) zugegeben. Besonderheit: bei ADP-induzierter Aggregation
wird nur Calciumchlorid zugegeben. Folgende Agonisten können
eingesetzt werden: TRAP6-Trifluoracetat- Salz, Kollagen, Humanes α-Thrombin
und U-46619. Die Konzentration des Agonisten wird zu jedem Spender
ausgetestet.
-
Testdurchführung:
Es werden 96er-Loch Mikrotiterplatten verwendet. Die Prüfsubstanz
wird in DMSO verdünnt und 2 μl je Loch vorgelegt.
178 μl Thrombozyten-Suspension werden zugegeben und 10
Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert. 20 μl Agonist
werden zugegeben und die Messung im Spectramax, OD 405 nm, sofort
gestartet. Die Kinetik wird in 11 Messungen von je 1 Minute bestimmt.
Zwischen den Messungen wird 55 Sekunden geschüttelt.
-
1.e) Thrombozytenaggregation in fibrinogendepletiertem
Plasma
-
Zur
Bestimmung der Thrombozytenaggregation wird Blut von gesunden Probanden
beiderlei Geschlechts, die innerhalb der letzten zehn Tage keine
die Thrombozytenaggregation beeinflussende Medikation erhalten hatten,
verwendet. Das Blut wird in Monowetten (Sarstedt, Nümbrecht,
Deutschland) die als Antikoagulans Natriumcitrat 3.8% (1 Teil Citrat
+ 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen.
-
Herstellung
von fibrinogendepletiertem Plasma: Zur Gewinnung von plättchenarmem
Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140 g für 20 min abzentrifugiert.
Das plättchenarme Plasma wird im Verhältnis 1:25
mit Reptilase (Roche Diagnostic, Deutschland) versetzt und vorsichtig
invertiert. Es folgen 10 min Inkubation bei 37°C im Wasserbad
mit direkt folgender Inkubation auf Eis für 10 min. Das
Plasma-Reptilase Gemisch wird bei 1300 g für 15 min zentrifugiert
und der Überstand (fibrinogendepletiertes Plasma) wird
gewonnen.
-
Thrombozyten-Isolierung:
Zur Gewinnung von plättchenreichem Plasma wird das Citrat-Vollblut
bei 140 g für 20 min zentrifugiert. Zu dem PRP wird ein
Viertel des Volumens ACD-Puffer (44.8 mM Natriumcitrat, 20.9 mM
Citronensäure, 74.1 mM Glucose und 4 mM Kaliumchlorid)
zugegeben und 10 Minuten bei 1300 g zentrifugiert. Das Thrombozyten-Pellet
wird mit Wasch-Puffer resuspendiert und 10 Minuten bei 1300 g zentrifugiert.
Die Thrombozyten werden in Inkubation-Puffer resuspendiert und auf
400000 Z/μl eingestellt und Calciumchloridlösung
mit einer Endkonzentration von 5 mM (1/200 Verdünnung)
zugegeben.
-
Für
die Aggregationsmessungen werden Aliquots (98 μl fibrinogendepletiertes
Plasma und 80 μl Thrombozytensuspension) mit aufsteigenden
Konzentrationen an Prüfsubstanz 10 min bei RT inkubiert.
Anschließend wird die Aggregation durch Zugabe von humanem
alpha Thrombin in einem Aggregometer ausgelöst und mittels
der turbidimetrischen Methode nach Born (Born, G. V. R.,
Cross M. J., The Aggregation of Blood Platelets; J. Physiol. 1963,
168, 178–195) bei 37°C bestimmt. Die
alpha Thrombin Konzentration, die gerade eben zur maximalen Aggregation
führt, wird jeweils für jeden Spender individuell
ermittelt.
-
Zur
Berechnung der inhibitorischen Wirkung wird die Zunahme der maximalen
Lichttransmission (Amplitude der Aggregationskurve in %) innerhalb
5 Minuten nach Zugabe des Agonisten in Gegenwart und Abwesenheit
von Prüfsubstanz ermittelt und die Ihnibition berechnet.
Aus den Inhibitionskurven wird die Konzentration berechnet, die
die Aggregation zu 50% hemmt.
-
1.f) Stimulation gewaschener Thrombozyten
und Analyse in der Durchflusszytometrie
-
Isolierung
gewaschener Thrombozyten: Humanes Vollblut wird mittels Venenpunktion
von freiwilligen Spender gewonnen und in Monowetten (Sarstedt, Nümbrecht,
Deutschland) überführt, die als Antikoagulans Natriumcitrat
enthalten (1 Teil Natriumcitrat 3.8% + 9 Teile Vollblut). Die Monowetten
werden bei 900 Umdrehungen pro Minute und 4°C über
einen Zeitraum von 20 Minuten zentrifugiert (Heraeus Instruments,
Deutschland; Megafuge 1.0RS). Das plättchenreiche Plasma
wird vorsichtig abgenommen und in ein 50 ml-Falconröhrchen überführt.
Nun wird das Plasma mit ACD-Puffer (44 mM Natriumcitrat, 20.9 mM
Zitronensäure, 74.1 mM Glucose) versetzt. Das Volumen des
ACD-Puffers entspricht einem Viertel des Plasmavolumens. Durch zehnminütige
Zentrifugation bei 2500 Umdrehungen und 4°C werden die
Thrombozyten sedimentiert. Danach wird der Überstand vorsichtig
abdekantiert und verworfen. Die präzipitierten Thrombozyten
werden zunächst vorsichtig mit einem Milliliter Waschpuffer
(113 mM Natriumchlorid, 4 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 24 mM Natriumdihydrogenphosphat,
4 mM Kaliumchlorid, 0.2 mM Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure,
0.1% Glucose) resuspendiert und dann mit Waschpuffer auf ein Volumen
aufgefüllt, das dem der Plasmamenge entspricht. Der Waschvorgang
wird ein zweites Mal durchgeführt. Nachdem die Thrombozyten durch
eine erneute zehnminütige Zentrifugation bei 2500 Umdrehungen
und 4°C präzipitiert worden sind, werden sie vorsichtig
in einem Milliliter Inkubationspuffer (134 mM Natriumchlorid, 12
mM Natriumhydrogencarbonat, 2.9 mM Kaliumchlorid, 0.34 mM Natriumdihydrogencarbonat,
5 mM HEPES, 5 mM Glucose, 2 mM Calciumchlorid und 2 mM Magnesiumchlorid)
resuspendiert und mit Inkubationspuffer auf eine Konzentration von 300.000
Thrombozyten pro μl eingestellt.
-
Färbung
und Stimulierung der humanen Thrombozyten mit humanem α-Thrombin
in Gegenwart oder Abwesenheit eines PAR-1-Antagonisten: Die Thrombozytensuspension
wird mit der zu prüfenden Substanz bzw. des entsprechenden
Lösungsmittels für 10 Minuten bei 37°C
vorinkubiert (Eppendorf, Deutschland; Thermomixer Comfort). Durch
Zugabe des Agonisten (0.5 μM bzw. 1 μM α-Thrombin;
Kordia, Niederlande, 3281 NIH Units/mg; oder 30 μg/ml Thrombin
receptor activating peptide (TRAP6); Bachem, Schweiz) bei 37° und unter
Schütteln von 500 Umdrehungen pro Minute wird die Thrombozytenaktivierung
ausgelöst. Zu den Zeitpunkten 0, 1, 2.5, 5, 10 und 15 Minuten
wird jeweils ein Aliquot von 50 μl entnommen und in einen
Milliliter einfach-konzentrierte CellFixTM-Lösung
(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, USA) überführt.
Zur Fixierung der Zellen werden sie 30 Minuten bei 4°C
in der Dunkelheit inkubiert. Durch eine zehnminütige Zentrifugation
bei 600 g und 4°C werden die Thrombozyten präzipitiert.
Der Überstand wird verworfen und die Thrombozyten werden
in 400 μl CellWashTM (Becton Dickinson
Immunocytometry Systems, USA) resuspendiert. Ein Aliquot von 100 μl
wird in ein neues FACS-Röhrchen überführt.
1 μl des thrombozyten-identifizierenden Antikörpers
und 1 μl des aktivierungszustands-detektierenden Antikörpers
werden mit CellWashTM auf ein Volumen von
100 μl aufgefüllt. Diese Antikörperlösung
wird dann zur Thrombozytensuspension gegeben und 20 Minuten bei
4°C in der Dunkelheit inkubiert. Im Anschluss an die Färbung
wird das Ansatzvolumen durch Zugabe von weiteren 400 μl
CellWashTM erhöht.
-
Zur
Identifizierung der Thrombozyten wird ein fluorescein-isothiocyanat-konjugierter
Antikörper eingesetzt, der gegen das humane Glykoprotein
IIb (CD41) gerichtet ist (Immunotech Coulter, Frankreich; Cat. No. 0649).
Mit Hilfe des phycoerythrin-konjugierten Antikörpers, der
gegen das humane Glykoprotein P-Selektin (Immunotech Coulter, Frankreich;
Cat. No. 1759) gerichtet ist, lässt sich der Aktivierungszustand
der Thrombozyten bestimmen. P-Selektin (CD62P) ist in den α-Granula
ruhender Thrombozyten lokalisiert. Es wird jedoch nach in-vitro-
bzw. in-vivo-Stimulierung zur äußeren Plasmamembran
translokalisiert.
-
Durchflusszytometrie
und Auswertung der Daten: Die Proben werden im Gerät FACSCaliburTM Flow Cytometry System der Firma Becton
Dickinson Immunocytometry Systems, USA, vermessen und mit Hilfe
der Software CellQuest, Version 3.3 (Becton Dickinson Immunocytometry
Systems, USA) ausgewertet und graphisch dargestellt. Das Maß der
Thrombozytenaktivierung wird durch den Prozentsatz der CD62P-positiven Thrombozyten
(CD41-positive Ereignisse) bestimmt. Es werden von jeder Probe 10.000
CD41-positive Ereignisse gezählt.
-
Die
inhibitorische Wirkung der zu prüfenden Substanzen wird
anhand der Reduktion der Thrombozytenaktivierung berechnet, die
sich auf die Aktivierung durch den Agonisten bezieht.
-
1.g) Thrombozytenaggregationsmessung mit
der Parallelplattenflußkammer
-
Zur
Bestimmung der Thrombozytenaggregation wird Blut von gesunden Probanden
beiderlei Geschlechts, die innerhalb der letzten zehn Tage keine
die Thrombozytenaggregation beeinflussende Medikation erhalten hatten,
verwendet. Das Blut wird in Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht,
Deutschland) die als Antikoagulans Natriumcitrat 3.8% (1 Teil Citrat
+ 9 Teile Blut) enthalten, aufgenommen. Zur Gewinnung von plättchenreichem
Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140 g für 20 min zentrifugiert.
Zu dem PRP wird ein Viertel des Volumens ACD-Puffer (44.8 mM Natriumcitrat,
20.9 mM Citronensäure, 74.1 mM Glucose und 4 mM Kaliumchlorid)
zugegeben und 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Das Thrombozyten-Pellet
wird mit Wasch-Puffer resuspendiert und 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert.
Für die Perfusionsstudie wird eine Mischung von 40% Erythrozyten
und 60% gewaschene Thrombozyten (200.000/μl) hergestellt
und in HEPES-Tyrode Puffer suspendiert. Die Messung der Thrombozytenaggregation
unter Flußbedingungen wird mittels der Parallelplattenflußkammer
durchgeführt (B. Nieswandt et al., EMBO J. 2001,
20, 2120–2130; C. Weeterings, Arterioscler Thromb.
Vasc. Biol. 2006, 26, 670–675; JJ Sixma,
Thromb. Res. 1998, 92, 43–46). Glasobjektträger
werden mit 100 μl humaner α-Thrombinlösung
(gelöst in Tris-Puffer) über Nacht bei 4°C
benetzt (α-Thrombin in verschiedenen Konzentrationen, z.
B. 10 bis 50 μg/ml) und abschließend mittels 2%
BSA abgeblockt.
-
Rekonstituiertes
But wird über die Thrombin-benetzten Glasobjektträger über
5 Minuten mit konstanter Flußrate geleitet (z. B. Scherrate
300/Sekunde) und mittels Mikroskop-Videosystem beobachtet und aufgezeichnet.
Die inhibitorische Wirkung der zu prüfenden Substanzen
wird morphometrisch anhand der Reduktion der Plättchenaggregatsbildung
ermittelt. Alternativ kann die Inhibierung der Plättchenaktivierung
durch Durchflußzytometrie, z. B. über p-Selektin-Expression
(CD62p), bestimmt werden (siehe Methode 1.f).
-
2.) Ex vivo Assay
-
2.a) Thrombozytenaggregation (Primaten,
Meerschweinchen)
-
Meerschweinchen
oder Primaten werden in wachem oder narkotisiertem Zustand oral,
intravenös oder intraperitoneal mit Prüfsubstanzen
in geeigneter Formulierung behandelt. Als Kontrolle werden andere
Meerschweinchen oder Primaten in identischer Weise mit dem entsprechenden
Vehikel behandelt. Nach je nach Applikationsart unterschiedlich
langer Zeit wird aus den tief narkotisierten Tieren Blut durch Punktion
des Herzens oder der Aorta gewonnen. Das Blut wird in Monovetten
(Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) die als Antikoagulans
Natriumcitrat 3.8% (1 Teil Citratlösung + 9 Teile Blut)
enthalten, aufgenommen. Zur Gewinnung von plättchenreichem
Plasma wird das Citrat-Vollblut bei 140 g für 20 min zentrifugiert.
-
Die
Aggregation wird durch Zugabe eines Thrombin-Rezeptor Agonisten
(TRAP6, SFLLRN, 50 μg/ml; Konzentration wird in jedem Experiment
je nach Tierart ermittelt) in einem Aggregometer ausgelöst
und mittels der turbidimetrischen Methode nach Born (Born,
G. V. R., Cross M. J., The Aggregation of Blood Platelets; J. Physiol.
1963, 168, 178–195) bei 37°C bestimmt.
-
Zur
Aggregationsmessung wird die maximale Zunahme der Lichttransmission
(Amplitude der Aggregationskurve in %) innerhalb 5 Minuten nach
Zugabe des Agonisten ermittelt. Die inhibitorische Wirkung der verabreichten
Prüfsubstanzen in den behandelten Tieren wird durch die
Reduktion der Aggregation, bezogen auf den Mittelwert der Kontrolltiere,
berechnet.
-
3.) In vivo Assays
-
3.a) Thrombosemodelle
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen können
in Thrombosemodellen in geeigneten Tierspezies, in denen die Thrombin-induzierte
Plättchenaggregation über den PAR-1-Rezeptor vermittelt
wird, untersucht werden. Als Tierspezies eignen sich Meerschweinchen
und insbesondere Primaten (vergleiche: Lindahl, A. K., Scarborough,
R. M., Naughton, M. A., Harker, L. A., Hanson, S. R., Thromb Haemost
1993, 69, 1196; Cook JJ, Sitko GR, Bednar B, Condra
C, Mellott MJ, Feng D-M, Nutt RF, Shager JA, Gould RJ, Connolly
TM, Circulation 1995, 91, 2961–2971; Kogushi
M, Kobayashi H, Matsuoka T, Suzuki S, Kawahara T, Kajiwara A, Hishinuma
I, Circulation 2003, 108 Suppl. 17, IV-280; Derian
CK, Damiano BP, Addo MF, Darrow AL, D'Andrea MR, Nedelman M, Zhang
H-C, Maryanoff BE, Andrade-Gordon P, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003,
304, 855–861). Alternativ können Meerschweinchen
verwendet werden, die mit Inhibitoren von PAR-3 und/oder PAR-4 vorbehandelt
werden (Leger AJ et al., Circulation 2006, 113, 1244–1254),
oder transgene PAR-3- und/oder PAR-4-Knockdown-Meerschweinchen.
-
3.b) Gerinnungsstörung und Organdysfunktion
bei Disseminierter Intravasaler Gerinnung (DIC)
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen können
in Modellen für DIC und/oder Sepsis in geeigneten Tierspezies
untersucht werden. Als Tierspezies eignen sich Meerschweinchen und
insbesondere Primaten, bei Untersuchung der endothelvermittelten
Effekte auch Mäuse und Ratten (vergleiche: Kogushi
M, Kobayashi H, Matsuoka T. Suzuki S, Kawahara T, Kajiwara A, Hishinuma
I, Circulation 2003, 108 Suppl. 17, IV-280; Derian CK,
Damiano BP, Addo MF, Darrow AL, D'Andrea MR, Nedelman M, Zhang H-C,
Maryanoff BE, Andrade-Gordon P. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 304,
855–861; Kaneider NC et al., Nat Immunol,
2007, 8, 1303–12; Camerer E et al., Blood,
2006, 107, 3912–21; Riewald M et al.,
J Biol Chem, 2005, 280, 19808–14.). Alternativ können
Meerschweinchen verwendet werden, die mit Inhibitoren von PAR-3
und/oder PAR-4 vorbehandelt werden (Leger AJ et al., Circulation
2006, 113, 1244–1254), oder transgene PAR-3- und/oder
PAR-4-Knockdown-Meerschweinchen.
-
3.b.1) Thrombin-Antithrombin-Komplexe
-
Thrombin-Antithrombin-Komplexe
(nachfolgend als „TAT” bezeichnet) sind ein Maß für
das durch Gerinnungsaktivierung endogen gebildete Thrombin. TAT
werden mittels eines ELISA-Assays bestimmt (Enzygnost TAT micro,
Dade-Behring). Aus Citratblut wird durch Zentrifugation Plasma gewonnen.
Zu 50 μl Plasma wird 50 μl TAT-Probenpuffer gegeben,
kurz geschüttelt und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Proben werden abgesaugt, und das Well 3-malig mit Waschpuffer
gewaschen (300 μl/Well). Die Platte wird zwischen den Waschgängen
abgeklopft. Es wird Konjugatlösung (100 μl) hinzugegeben
und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben werden abgesaugt,
und das Well 3-malig mit Waschpuffer gewaschen (300 μl/Well). Anschließend
wird chromogenes Susbtrat hinzugegeben (100 μl/Well), 30
min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert, Stopplösung
hinzugegeben (100 μl/Well), und die Farbbildung bei 492
nm gemessen (Saphire Plate reader).
-
3.b.2) Parameter für Organdysfunktion
-
Es
werden verschiedene Parameter bestimmt, aufgrund derer Rückschlüsse
auf die Funktionseinschränkung verschiedener innerer Organe
durch die LPS-Gabe gezogen werden können, und der therapeutische
Effekt von Prüfsubstanzen abgeschätzt werden kann.
Citratblut oder ggf. Lithium-Heparin-Blut wird zentrifugiert, und
die Parameter aus dem Plasma bestimmt. Folgende Parameter werden
typischerweise erhoben: Kreatinin, Harnstoff, Aspartat-Aminotransferase
(AST), Alanin-Aminotransferase (ALT), Gesamt-Bilirubin, Laktatdehydrogenase
(LDH), Gesamt-Protein, Gesamt-Albumin und Fibrinogen. Die Werte
geben Aufschluss auf die Funktion der Niere, der Leber, des Kreislaufes
und der Gefäße.
-
3.b.3) Parameter für Entzündung
-
Das
Ausmaß der durch Endotoxin ausgelösten Entzündungsreaktion
lässt sich aus dem Anstieg von Entzündungsmediatoren
im Plasma nachweisen, z. B. Interleukine (1, 6, 8 und 10), Tumomekrosefaktor
alpha oder Monocyte Chemoattractant Protein-1. Hierzu können
ELISAs oder das Luminex-System verwendet werden.
-
3.c) Antitumor Wirksamkeit
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen können
in Modellen für Krebs getestet werden, z. B. im humanen
Brustkrebs-Modell in immundefizienten Mäusen (vergleiche: S.
Even-Ram et. al., Nature Medicine, 1988, 4, 909–914).
-
3.d) Antiangiogenetische Wirksamkeit
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen können
in in vitro und in vivo Modellen für Angiogenese getestet
werden (vergleiche: Caunt et al., Journal of Thrombosis
and Haemostasis, 2003, 10, 2097–2102; Haralabopoulos
et al., Am J Physiol, 1997, C239–C245; Tsopanoglou
et al., JBC, 1999, 274, 23969–23976; Zania et al., JPET,
2006, 318, 246–254).
-
3.e) Blutdruck- und Herzfrequenz-modulierende
Wirkung
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen können
in in vivo Modellen hinsichtlich Ihrer Wirkung auf den arteriellen
Blutdruck und die Herzfrequenz untersucht werden. Hierzu werden
Ratten (z. B. Wistar) mit implantierbaren Radiotelemetrieeinheiten
instrumentiert, und es wird ein elektronisches Datenaquisitions-
und Speicherungs-System (Data Sciences, MN, USA), bestehend aus
einem chronisch implantierbaren Transducer/Transmitter-Einheit in
Verbindung mit einem Flüssigkeits-gefüllten Katheter,
verwendet. Der Transmitter wird in die Peritonealhöhle
implantiert und der Sensor-Katheter in der deszendierenden Aorta
positioniert. Die erfindungsgemäßen Verbindungen
können appliziert werden (z. B. oral oder intravenös).
Vor Behandlung wird der mittlere arterielle Blutdruck und die Herzfrequenz
der unbehandelten und behandelten Tiere gemessen und sichergestellt,
dass diese im Bereich von ca. 131–142 mmHg und 279–321
Schläge/Minute liegen. PAR-1-aktivierendes Peptid (SFLLRN;
z. B. Dosen zwischen 0.1 und 5 mg/kg) wird intravenös verabreicht.
Der Blutdruck und die Herzfrequenz werden in verschiedenen Zeitintervallen
und Zeiträumen mit und ohne PAR-1-aktivierendem Peptid
sowie mit und ohne einer der erfindungsgemäßen
Verbindungen gemessen (vergleiche: Cicala C et al., The
FASER Journal, 2001, 15, 1433–5; Stasch JP et al., British
Journal of Pharmacology 2002, 135, 344–355).
-
4.) Bestimmung der Löslichkeit
-
Herstellung der Ausgangslösung
(Urlösung):
-
Mindestens
1.5 mg der Testsubstanz werden in ein Wide Mouth 10 mm Screw V-Vial
(Fa. Glastechnik Gräfenroda GmbH, Art.-Nr. 8004-WM-H/V15 μ)
mit passender Schraubkappe und Septum genau eingewogen, mit DMSO
zu einer Konzentration von 50 mg/ml versetzt und 30 Minuten mittels
eines Vortexers geschüttelt.
-
Herstellung der Kalibrierlösungen:
-
Die
notwendigen Pipettierschritte erfolgen in 1.2 ml 96er Deep Well
Plate (DWP) mittels eines Liquid-Handling-Roboters. Als Lösemittel
wird ein Gemisch aus Acetonitril/Wasser 8:2 verwendet.
-
Herstellung
der Ausgangslösung für Kalibrierlösungen
(Stammlösung): 10 μl der Urlösung werden
mit 833 μl des Lösemittelgemisch versetzt (Konzentration
= 600 μg/ml) und homogenisiert. Es werden von jeder Testsubstanz
1:100 Verdünnungen in separaten DWP's hergestellt und wiederum
homogenisiert.
- Kalibrierlösung 5 (600 ng/ml): 30 μl
der Stammlösung werden mit 270 μl Lösemittelgemisch
versetzt und homogenisiert.
- Kalibrierlösung 4 (60 ng/ml): 30 μl der Kalibrierlösung
5 werden mit 270 μl Lösemittelgemisch versetzt
und homogenisiert.
- Kalibrierlösung 3 (12 ng/ml): 100 μl der Kalibrierlösung
4 werden mit 400 μl Lösemittelgemisch versetzt
und homogenisiert.
- Kalibrierlösung 2 (1.2 ng/ml): 30 μl der Kalibrierlösung
3 werden mit 270 μl Lösemittelgemisch versetzt
und homogenisiert.
- Kalibrierlösung 1 (0.6 ng/ml): 150 μl der
Kalibrierlösung 2 werden mit 150 μl Lösemittelgemisch
versetzt und homogenisiert.
-
Herstellung der Probenlösungen:
-
Die
notwendigen Pipettierschritte erfolgen in 1.2 ml 96er DWP mittels
eines Liquid-Handling-Roboters. 10.1 μl der Stammlösung
werden mit 1000 μl PBS-Puffer pH 6.5 versetzt. (PBS-Puffer
pH 6.5: 61.86 g Natriumchlorid, 39.54 g Natriumdihydrogenphosphat
und 83.35 g 1 N Natronlauge werden in einen 1 Liter-Messkolben eingewogen,
mit Wasser aufgefüllt und ca. 1 Stunde gerührt.
Von dieser Lösung werden 500 ml in einen 5 Liter-Messkolben
gegeben und mit Wasser aufgefüllt. Es wird mit 1 N Natronlauge
auf pH 6.5 einstellen.)
-
Durchführung:
-
Die
notwendigen Pipettierschritte erfolgen in 1.2 ml 96er DWP mittels
eines Liquid-Handling-Roboters. Die so hergestellten Probenlösungen
werden 24 Stunden bei 1400 rpm mittels eines temperierbaren Schüttlers bei
20°C geschüttelt. Von diesen Lösungen
werden jeweils 180 μl abgenommen und in Beckman Polyallomer Centrifuge
Tubes überführt. Diese Lösungen werden
1 Stunde mit ca. 223.000 × g zentrifugiert. Von jeder Probenlösung
werden 100 μl des Überstandes abgenommen und 1:10
und 1:1000 mit PBS-Puffer 6.5 verdünnt.
-
Analytik:
-
Die
Proben werden mittels HPLC/MS-MS analysiert. Quantifiziert wird über
eine Fünf-Punkt-Kalibrationskurve der Testverbindung. Die
Löslichkeit wird in mg/l ausgedrückt. Analysensequenz:
1) Blank (Lösemittelgemisch); 2) Kalibrierlösung
0.6 ng/ml; 3) Kalibrierlösung 1.2 ng/ml; 4) Kalibrierlösung
12 ng/ml; 5) Kalibrierlösung 60 ng/ml; 6) Kalibrierlösung
600 ng/ml; 7) Blank (Lösemittelgemisch); 8) Probenlösung
1:1000; 9) Probenlösung 1:10.
-
HPLC/MS-MSMethode:
-
- HPLC: Agilent 1100, quat. Pumpe (G1311A), Autosampler CTC
HTS PAL, Degaser (G1322A) und Säulenthermostat (G1316A);
Säule: Oasis HLB 20 mm × 2.1 mm, 25 μ;
Temperatur: 40°C; Eluent A: Wasser + 0.5 ml Ameisensäure/l;
Eluent B: Acetonitril + 0.5 ml Ameisensäure/l; Flussrate:
2.5 ml/min; Stoptime 1.5 min; Gradient: 0 min 95% A, 5% B; Rampe:
0–0.5 min 5% A, 95% B; 0.5–0.84 min 5% A, 95%
B; Rampe: 0.84–0.85 min 95% A, 5% B; 0.85–1.5
min 95% A, 5% B.
- MS/MS: WATERS Quattro Micro Tandem MS/MS; Z-Spray API-Interface;
HPLC-MS-Eingangssplitter 1:20; Messung im ESI-Mode.
-
C) Ausführungsbeispiele für
pharmazeutische Zusammensetzungen
-
Die
erfindungsgemäßen Substanzen können folgendermaßen
in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:
-
Tablette:
-
Zusammensetzung:
-
100
mg der Verbindung des Beispiels 1, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50
mg Maisstärke, 10 mg Polyvinylpyrolidon (PVP 25) (Fa. BASF,
Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.
-
Tablettengewicht
212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm.
-
Herstellung:
-
Die
Mischung aus der Verbindung des Beispiels 1, Lactose und Stärke
wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser
granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat
für 5 min. gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen
Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben).
-
Orale Suspension:
-
Zusammensetzung:
-
1000
mg der Verbindung des Beispiels 1, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg
Rhodigel (Xanthan gum) (Fa. FMC, USA) und 99 g Wasser.
-
Einer
Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung
entsprechen 10 ml orale Suspension.
-
Herstellung:
-
Das
Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, die Verbindung des Beispiels
1 wird der Suspension zugefügt. Unter Rühren erfolgt
die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluss der Quellung des Rhodigels
wird ca. 6 h gerührt.
-
Intravenös applizierbare Lösung:
-
Zusammensetzung:
-
1
mg der Verbindung von Beispiel 1, 15 g Polyethylenglykol 400 und
250 g Wasser für Injektionszwecke.
-
Herstellung:
-
Die
Verbindung von Beispiel 1 wird zusammen mit Polyethylenglykol 400
in dem Wasser unter Rühren gelöst. Die Lösung
wird sterilfiltriert (Porendurchmesser 0.22 μm) und unter
aseptischen Bedingungen in hitzesterilisierte Infusionsflaschen
abgefüllt. Diese werden mit Infusionsstopfen und Bördelkappen
verschlossen.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 2006/012226 [0013]
- - WO 2007/130898 [0013]
- - WO 2007/101270 [0013]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Vu TKH, Hung
DT, Wheaton VI, Coughlin SR, Cell 1991, 64, 1057–1068 [0003]
- - Bhatt DL, Topol EJ, Nat. Rev. Drug Discov. 2003, 2, 15–28 [0003]
- - Kahn ML, Nakanishi-Matsui M, Shapiro MJ, Ishihara H, Coughlin
SR, J. Clin. Innest. 1999, 103, 879–887 [0006]
- - Derian CK, Damiano BP, Addo MF, Darrow AL, D'Andrea MR, Nedelman
M, Zhang H-C, Maryanoff BE, Andrade-Gordon P. J. Pharmacol. Exp.
Ther. 2003, 304, 855–861 [0006]
- - Dellinger et al., Crit. Care Med. 2004, 32, 858–873 [0011]
- - Crit. Care Med. 1992, 20, 864–874 [0090]
- - Levy et al., Crit. Care Med. 2003, 31, 1250–1256 [0090]
- - M. V. Chelliah et al., J. Med. Chem. 2007, 21, 5147–5160 [0129]
- - M. V. Chelliah et al., J. Med. Chem. 2007, 21, 5147–5160 [0130]
- - M. V. Chelliah et al., J. Med. Chem. 2007, 21, 5147–5160 [0131]
- - M. C. Clasby et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 129–138 [0133]
- - M. C. Clasby et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 129–138 [0134]
- - M. C. Clasby et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 129–138 [0135]
- - M. C. Clasby et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 129–138 [0136]
- - M. C. Clasby et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 1544–1448 [0142]
- - P. Carsky, S. Huenig, I. Stemmler, D. Scheutzow, Liebigs Ann.
Chem. 1980, 2, 291–304 [0144]
- - Rizzuto R, Simpson AW, Brini M, Pozzan T.; Nature 1992, 358,
325–327 [0146]
- - Milligan G, Marshall F, Rees S, Trends in Pharmacological
Sciences 1996, 17, 235–237 [0146]
- - Born, G. V. R., Cross M. J., The Aggregation of Blood Platelets;
J. Physiol. 1963, 168, 178–195 [0151]
- - Born, G. V. R., Cross M. J., The Aggregation of Blood Platelets;
J. Physiol. 1963, 168, 178–195 [0158]
- - B. Nieswandt et al., EMBO J. 2001, 20, 2120–2130 [0165]
- - C. Weeterings, Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 2006, 26,
670–675 [0165]
- - JJ Sixma, Thromb. Res. 1998, 92, 43–46 [0165]
- - Born, G. V. R., Cross M. J., The Aggregation of Blood Platelets;
J. Physiol. 1963, 168, 178–195 [0168]
- - Lindahl, A. K., Scarborough, R. M., Naughton, M. A., Harker,
L. A., Hanson, S. R., Thromb Haemost 1993, 69, 1196 [0170]
- - Cook JJ, Sitko GR, Bednar B, Condra C, Mellott MJ, Feng D-M,
Nutt RF, Shager JA, Gould RJ, Connolly TM, Circulation 1995, 91,
2961–2971 [0170]
- - Kogushi M, Kobayashi H, Matsuoka T, Suzuki S, Kawahara T,
Kajiwara A, Hishinuma I, Circulation 2003, 108 Suppl. 17, IV-280 [0170]
- - Derian CK, Damiano BP, Addo MF, Darrow AL, D'Andrea MR, Nedelman
M, Zhang H-C, Maryanoff BE, Andrade-Gordon P, J. Pharmacol. Exp.
Ther. 2003, 304, 855–861 [0170]
- - Leger AJ et al., Circulation 2006, 113, 1244–1254 [0170]
- - Kogushi M, Kobayashi H, Matsuoka T. Suzuki S, Kawahara T,
Kajiwara A, Hishinuma I, Circulation 2003, 108 Suppl. 17, IV-280 [0171]
- - Derian CK, Damiano BP, Addo MF, Darrow AL, D'Andrea MR, Nedelman
M, Zhang H-C, Maryanoff BE, Andrade-Gordon P. J. Pharmacol. Exp.
Ther. 2003, 304, 855–861 [0171]
- - Kaneider NC et al., Nat Immunol, 2007, 8, 1303–12 [0171]
- - Camerer E et al., Blood, 2006, 107, 3912–21 [0171]
- - Riewald M et al., J Biol Chem, 2005, 280, 19808–14. [0171]
- - Leger AJ et al., Circulation 2006, 113, 1244–1254 [0171]
- - S. Even-Ram et. al., Nature Medicine, 1988, 4, 909–914 [0175]
- - Caunt et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2003,
10, 2097–2102 [0176]
- - Haralabopoulos et al., Am J Physiol, 1997, C239–C245 [0176]
- - Tsopanoglou et al., JBC, 1999, 274, 23969–23976;
Zania et al., JPET, 2006, 318, 246–254 [0176]
- - Cicala C et al., The FASER Journal, 2001, 15, 1433–5;
Stasch JP et al., British Journal of Pharmacology 2002, 135, 344–355 [0177]