DE102009022349A1

DE102009022349A1 - Automatic separation of tissue layers

Info

Publication number: DE102009022349A1
Application number: DE200910022349
Authority: DE
Inventors: Frank Pretzsch; Ulrike Koropp; Andrea Dr.rer.nat. Heymer
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2009-05-15
Filing date: 2009-05-15
Publication date: 2010-12-02
Anticipated expiration: 2029-05-16
Also published as: WO2010130305A8; WO2010130305A1; DE102009022349B4; EP2430155A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum automatischen Abtrennen und Isolieren von Gewebezellen einer Gewebeschicht aus einem mehrschichtigen biologischen Gewebe des tierischen oder menschlichen Körpers, besonders Epithelzellen aus Hautbiopsaten, sowie eine Vorrichtung zur automatischen Durchführung dieses Verfahrens.The invention relates to a method for automatically separating and isolating tissue cells of a tissue layer from a multilayer biological tissue of the animal or human body, in particular epithelial cells from skin biopsies, and a device for automatically performing this method.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum automatischen Abtrennen und Isolieren von Gewebezellen einer Gewebeschicht aus einem mehrschichtigen biologischen Gewebe des tierischen oder menschlichen Körpers, besonders Epithelzellen aus Hautbiopsaten sowie eine Vorrichtung zur automatischen Durchführung dieses Verfahrens.The The invention relates to a method for automatic separation and Isolating tissue cells of a tissue layer from a multilayer biological Tissues of animal or human body, especially epithelial cells from skin biopsies and a device for automatically performing this Process.

Technisches GebietTechnical area

Die Erfindung betrifft das technische Gebiet des Tissue Engineering. Das Prinzip des Tissue Engineering besteht im Wesentlichen darin, aus biologischem Gewebe, das in einem separaten Verfahrensablauf aus dem menschlichen oder tierischen Körper in Form von Spendergewebe als sogenanntes Biopsat gewonnen werden kann, vitale Zellen oder Zellverbände zu isolieren und daraus neue Gewebe zu konstituieren. Die isolierten Zellen werden vermehrt und im Anschluss zum Aufbau neu konstituierter dreidimensionaler Gewebestrukturen, beispielsweise neu konstituierter Hautäquivalente, aufgebracht. Solche neu konstituierten Gewebe können dann als Testsysteme in der Forschung, insbesondere zur Wirkstofferforschung oder als Transplantate in der Medizin eingesetzt werden, um verlorene Organfunktionen zu ersetzen. Beispielsweise werden zweischichtige Hautmodelle bevorzugt als Testsysteme für Wirkstoffe, Chemikalien und Kosmetika eingesetzt und stellen eine Alternative zum Tierversuch dar.The This invention relates to the technical field of tissue engineering. Essentially, the principle of tissue engineering is from biological tissue, in a separate procedure from the human or animal body in the form of donor tissue can be obtained as a so-called biopsy, vital cells or cell aggregates to isolate and from it to constitute new tissues. The isolated ones Cells are multiplied and subsequently reconstituted to build Three-dimensional tissue structures, such as newly constituted Skin equivalents, applied. Such newly constituted tissues can then be used as test systems in research, in particular for research on active substances or as transplants used in medicine to help lost organ functions replace. For example, bilayer skin models are preferred as test systems for Active ingredients, chemicals and cosmetics are used and provide one Alternative to animal testing.

Es wird erwartet, dass der hohe Bedarf an Hauttestsystemen aus humanen primären Zellen und die Anforderungen an deren Reproduzierbarkeit kann letztlich nur durch eine Automatisierung des Herstellungsprozesses gewährleistet werden. Für den Aufbau von Hauttestsystemen werden zwei unterschiedliche primäre Zelltypen, und zwar Fibroblasten und Keratinozyten, benötigt, die bekanntermaßen aus mehrschichtigem Hautgewebe (insbesondere Präputiumbiopsate) isoliert werden.It The high demand for skin test systems is expected to be human primary Cells and the requirements for their reproducibility can ultimately only guaranteed by automation of the manufacturing process become. For the Building skin test systems become two distinct primary cell types, namely fibroblasts and keratinocytes, which are known to be multilayer skin tissue (especially prepuce biopsies) are isolated.

Stand der TechnikState of the art

Besonders im Zusammenhang mit der regenerativen Medizin besteht der Bedarf, biologische Laborprozesse unter Reinraumbedingungen GMP-konform zu automatisieren. Dadurch soll eine höhere Ausbeute, eine höhere Prozesssicherheit sowie eine standardisierbare Prozessoptimierung und Prozesskontrolle erreicht werden.Especially in the context of regenerative medicine there is a need biological laboratory processes under clean room conditions GMP compliant to automate. This should result in a higher yield, higher process reliability as well as a standardized process optimization and process control be achieved.

Eine Schwierigkeit besteht vor allem darin, die Vielzahl an unterschiedlichen vorbekannten manuellen Schritten und Handlungsabläufen der Gewebeaufbereitung und Zellisolation in zweckmäßig automatisierten Handhabungen umzusetzen. Eine besondere Herausforderung an die Automatisierung solcher Abläufe stellt dabei die Trennung verschiedener Gewebeschichten aus mehrschichtigen Gewebeverbänden dar, insbesondere die Abtrennung von Epithelschichten von Gewebeverbänden wie Hautbiopsaten.A Above all, the difficulty lies in the variety of different ones previously known manual steps and actions of the Tissue preparation and cell isolation in appropriately automated handling implement. A special challenge to the automation of such procedures In doing so, the separation of different tissue layers from multilayered tissue structures in particular the separation of epithelial layers of tissue composites such as Hautbiopsaten.

Im Zusammenhang mit der Isolation von Gewebeschichten verschiedener Zelltypen aus Spendergewebe, insbesondere Hautgewebe sind manuelle Verfahren bekannt, worin zur Trennung von Epidermis und Dermis eines Hautbiopsats unmittelbar nach Abtrennung von gegebenenfalls anhaftendem Fettgewebe mit einem Skalpell in circa 2 × 2 mm² kleine Stücke geschnitten und in eine Enzymlösung überführt wird. Diese soll die Verbindung zwischen Epidermis und Dermis, besonders die dazwischen angeordnete Basalmembran auflösen. Das vollständige Zerschneiden des Biopsates ist erforderlich, um dem Enzym eine Angriffsfläche zur Basalmembran zu bieten. Dieses manuelle Verfahren lässt sich nicht automatisieren. In bekannten Verfahren wird davon ausgegangen, dass sich das Biopsat nur durch einen ziehenden Schnitt auf der Epidermisseite zerschneiden lässt. Weiter ist eine für einen definierten Schnitt erforderliche Ausrichtung des Biopsats in reproduzierbarer Weise aufgrund der unterschiedlichen Biopsatgrößen und -beschaffenheit nicht realisierbar. Ein wesentliches Problem ergibt sich vor allem daraus, dass das zerschnittene Biopsatgewebe anschließend manuell in die beiden Gewebeschichten getrennt werden muss. Dies findet in den bekannten manuellen Verfahren an den einzelnen Biopsatstücken mittels einer Pinzette und unter optischer Kontrolle statt, wobei die Epidermisschicht mit der Pinzette von der etwas dickeren Dermisschicht abgezogen wird. Da Hautbiopsate dazu neigen, sich einzurollen, ist die Handhabung zusätzlich erschwert. Aktuell gibt es keine geeignete Technologie, um den qualitativen optischen Unterschied zwischen den beiden Gewebeschichten für ein automatisiertes, robotergestütztes Abziehen der Gewebeschichten voneinander auszuwerten.In connection with the isolation of tissue layers of different cell types from donor tissue, in particular skin tissue, manual methods are known in which for the separation of epidermis and dermis of a Hautbiopsats immediately after removal of any adhering fatty tissue with a scalpel in about 2 × 2 mm ² small pieces cut and in an enzyme solution is transferred. This is intended to dissolve the connection between epidermis and dermis, especially the basal membrane arranged therebetween. Complete cutting of the biopsy is required to provide the enzyme with a target to the basement membrane. This manual procedure can not be automated. In known methods it is assumed that the biopsy can be cut only by a pulling cut on the epidermis side. Furthermore, the orientation of the biopsy material required for a defined cut can not be reproduced in a reproducible manner because of the different biopsy sizes and properties. A major problem arises mainly from the fact that the cut biopsy tissue must then be manually separated into the two tissue layers. This takes place in the known manual method on the individual Biopsatstücken by means of tweezers and under optical control, wherein the epidermis layer is removed with the tweezers of the slightly thicker dermis layer. Since skin biopsies tend to curl up, handling is even more difficult. Currently, there is no suitable technology to evaluate the qualitative visual difference between the two tissue layers for automated, robotic tissue stripping.

In den manuellen Verfahren muss, um einzelne Epithelzellen aus der manuell abgetrennten Epithelschicht zu gewinnen, die Epithelschicht zunächst in einem weiteren Verfahrensschritt homogenisiert werden und im Anschluss einer Trypsinbehandlung unterzogen werden. Hier ist eine hohe Einwirkzeit erforderlich, um eine große Anzahl an vereinzelten Epithelzellen zu gewinnen. Die Inkubationszeit beträgt dabei bekanntermaßen zwischen 15 und 20 Minuten, insbesondere etwa 18 Minuten. Nachteilig ist dabei, dass das Enzym Trypsin schon nach wenigen Minuten einen schädlichen Einfluss auf die Zellvitalität der Epithelzellen, insbesondere Keratinozyten, hat.In The manual procedure needs to remove individual epithelial cells from the manually separated epithelial layer to gain the epithelial layer first in be homogenized in a further process step and subsequently be subjected to a trypsin treatment. Here is a high exposure time required a big one To gain the number of isolated epithelial cells. The incubation period is thereby known between 15 and 20 minutes, especially about 18 minutes. The disadvantage is doing that the enzyme trypsin already after a few minutes a harmful Influence on cell vitality epithelial cells, in particular keratinocytes.

Im bekannten Verfahren wird die Enzymreaktion nach Ende der definierten Inkubationsdauer abgestoppt. Die Suspension wird durch ein Zellsieb gegeben, abzentrifugiert, und die Zellen werden in einem spezifischen Nährmedium resuspendiert.In the known method, the enzyme Re stopped after the defined incubation period. The suspension is passed through a cell sieve, spun down, and the cells are resuspended in a specific nutrient medium.

Daneben, findet optional eine Aufbereitung der von der Epithelschicht befreiten weiteren Gewebeschicht, insbesondere der Dermisschicht statt.Besides, optionally finds a treatment of the freed from the epithelial layer another layer of tissue, especially the dermis layer instead.

Bisherige Lösungsansätze zur Automatisierung im Bereich der Zellkulturtechnik und des Tissue Engineering beschränken sich hauptsächlich auf die Kultivierung von Einzelzellen: Automatisierte Robotersysteme sind bekannt, die Zellkulturflaschen oder Bioreaktoren, insbesondere im Format standardisierter Multiwellplatten, handhaben können. Alle für die Zellkultur erforderlichen Schritte, Inkubation, Medienwechsel, Passagier- und Ernteprozesse werden automatisiert und gegebenenfalls auch unter GMP-konformen Bedingungen durchgeführt. Weder für die Zellextraktion der zu kultivierenden Zellen, noch für die Weiterverarbeitung der kultivierten Zellen stehen bisher automatisierbare Verfahren oder Mittel bereit.Previous Solutions to Automation in the field of cell culture technology and tissue engineering restrict mainly on the cultivation of single cells: Automated robot systems are known, the cell culture bottles or bioreactors, in particular in the format of standardized multiwell plates. All for cell culture required steps, incubation, media change, passenger and Harvest processes are automated and possibly also under GMP compliant conditions performed. Neither for cell extraction the cells to be cultivated, nor for the further processing of cultured cells are previously automated methods or Ready.

Aufgabenstellungtask

Der vorliegenden Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein automatisierbares Verfahren zum Abtrennen und Isolieren einer Gewebeschicht, besonders einer Epithelzellschicht von anderen Gewebeschichten eines Gewebeverbands bereitzustellen, der aus einer ersten Gewebeschicht, bevorzugt einer Epithelzellen enthaltenden Epithelschicht und mindestens einer weiteren Gewebeschicht besteht, wobei bevorzugt die Epithelschicht mit der mindestens einer weiteren Gewebeschicht über eine Basalmembran verbunden ist, die zwischen der Epithelschicht und der weiteren Gewebeschicht angeordnet ist. Das Verfahren soll vor allem technisch aufwändige und schlecht automatisierbare Handhabungsschritte, wie aus der manuellen Bearbeitung von Gewebestücken bekannt, vermeiden und eine einfache technische Realisierung in automatisierten robotergestützten Systemen ermöglichen. Die Epidermiszellen sollen abgetrennt und insbesondere isoliert werden von einem biologischen Gewebestück, wobei das Gewebestück bevorzugt ein Spendergewebe ist, besonders bevorzugt menschliches oder tierisches Hautgewebe, welches bevorzugt zumindest eine Epidermis und zumindest eine Dermisschicht aufweist.Of the The present invention is based on the technical problem automatable method for separating and isolating a tissue layer, especially an epithelial cell layer of other tissue layers of a To provide tissue composites of a first layer of tissue, preferably an epithelial layer containing epithelial cells and at least one further tissue layer, wherein preferably the epithelial layer with the at least one further tissue layer connected via a basement membrane is that between the epithelial layer and the further tissue layer is arranged. The process is mainly technically complex and poorly automated handling steps, as from the manual Processing of pieces of tissue known, avoid and a simple technical realization in automated robotics Enable systems. The epidermis cells are to be separated and in particular isolated are of a biological tissue piece, wherein the tissue piece is preferred Donor tissue is, more preferably human or animal Skin tissue, which preferably at least one epidermis and at least one Dermis layer has.

Ein damit verbundenes technisches Problem ist die Bereitstellung einer speziellen Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.One associated technical problem is the provision of a special device for carrying out this method.

Das technische Problem wird gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Trennung einer ersten Gewebeschicht aus einem mehrschichtigen biologischen Gewebeverband, bestehend aus der ersten Gewebeschicht und mindestens einer weiteren mit der ersten Gewebeschicht, insbesondere fest verbundenen Gewebeschicht, wobei die erste Gewebeschicht im Vergleich zu der weiteren Gewebeschicht mechanisch spröder und somit die weitere Gewebeschicht im Vergleich zu der ersten Gewebeschicht mechanisch zäher ist. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass durch Beaufschlagen des Gewebeverbandes mit einem oder mehreren abrupten Kraftimpulsen (Hacken) in der ersten Gewebeschicht Sprödbruch ausgelöst wird, so dass die dadurch aufgespaltene erste Gewebeschicht von der weiteren Gewebeschicht ablösbar wird. Insbesondere ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren ein Eindringen eines die Gewebeschichten an ihren Verbindungsstellen lösenden Agens durch die durch den Sprödbruch der integrierten erste Gewebeschicht, welche ansonsten ein Vordringen des Agens an die Gewebeverbindungsstellen verhindern würde. Außerdem ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren, dass die durch den Sprödbruch desintegrierte erste Gewebeschicht in „Bruchstücken” von der mindestens einen weiteren Gewebeschicht ablösbar wird, so dass durch einfache nachfolgende Handhabungsschritte ein Trennen der Gewebeschichten ermöglicht wird. Besonders liegen die Gewebebruchstücke der ersten Gewebeschicht in Suspension vor, während die vom Sprödbruch nicht erfassten weiteren Gewebeschichten als weitgehend zusammenhängendes Gewebe intakt bleiben so auf einfache Weise von der Suspension abtrennbar sind.The technical problem is solved by providing a method for separating a first Tissue layer of a multilayer biological tissue association, consisting of the first fabric layer and at least one other with the first tissue layer, in particular firmly connected tissue layer, wherein the first layer of tissue compared to the other layer of tissue mechanically brittle and thus the further tissue layer in comparison to the first tissue layer mechanically tougher is. The method is characterized in that by applying the Tissue association with one or more abrupt force pulses (hoes) in the first tissue layer brittle fracture triggered is, so that thereby split first tissue layer of the other fabric layer removable becomes. In particular, allows the inventive method penetration of the tissue layers at their joints be solved Agent by the brittle fracture the integrated first layer of tissue which otherwise penetrates of the agent to the tissue junctions. In addition, this allows inventive method, that by the brittle fracture disintegrated first layer of tissue in "fragments" of the at least one further tissue layer is removable, so that by simple subsequent handling steps separating allows the tissue layers becomes. The tissue fragments of the first tissue layer are especially located in suspension before while the brittle fracture unrecognized further tissue layers as largely coherent Tissue intact thus remain easily separable from the suspension are.

Das technische Problem wird in bevorzugter Ausgestaltung gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Isolierung von Epithelzellen aus einem Gewebeverband, bestehend aus einer die Epithelzellen enthaltenden Epithelzellschicht und mindestens einer mit der Epithelzellschicht über eine dazwischen liegende Basalmembran verbundenen weiteren Gewebeschicht, welches gekennzeichnet ist durch die zumindest folgenden Verfahrensschritte:

a) Die Integrität der Epithelzellschicht des Gewebeverbandes wird zerstört durch bevorzugt wiederholte Hackbewegungen einer Klinge, das heißt durch Beaufschlagen des Gewebeverbandes über die Klinge mit einem oder mehreren abrupten Kraftimpulsen, sodass die Epithelzellschicht, besonders an der Stelle des einwirkenden Kraftimpulses, bevorzugt im Wesentlichen, bis zur Basalmembran hin aufgespalten wird, wobei bevorzugt die mindestens eine darunterliegende weitere Gewebeschicht vollständig, oder bevorzugt im Wesentlichen intakt bleibt;
b) Inkontaktbringen des die aufgespaltete Epithelzellschicht aufweisenden Gewebeverbands mit einem die Basalmembran des Gewebeverbands lösenden Agens, sodass sich die Epithelzellschicht von dem Gewebeverband ablöst, wobei ein die mindestens eine weitere Gewebeschicht enthaltendes Restgewebe des Gewebeverbandes vollständig, bevorzugt im Wesentlichen, intakt bleibt;
c) Abtrennen der abgelösten Epithelzellschicht von dem die mindestens eine weitere Gewebeschicht enthaltenden Restgewebe des Gewebeverbandes.

The technical problem is solved in a preferred embodiment by the provision of a method for the isolation of epithelial cells from a tissue network consisting of an epithelial cell containing the epithelial cells and at least one connected to the epithelial cell layer via an intermediate basal membrane further tissue layer, which is characterized by at least the following steps:

a) The integrity of the epithelial cell layer of the tissue association is destroyed by preferably repeated hacking movements of a blade, that is, by applying the tissue association via the blade with one or more abrupt force pulses, so that the epithelial cell layer, especially at the location of the applied force pulse, preferably substantially until is split to the basement membrane, wherein preferably the at least one underlying further tissue layer completely, or preferably remains substantially intact;
b) contacting the tissue layer comprising the split-epithelial cell layer with an agent dissolving the basal membrane of the tissue composite such that the epithelial cell layer separates from the tissue composite, wherein a residual tissue of the tissue layer containing the at least one further tissue layer that remains complete, preferably substantially intact;
c) separating the detached epithelial cell layer from the residual tissue of the tissue association containing the at least one further tissue layer.

Bevorzugt findet das Hacken, das heißt das Beaufschlagen mit einem abrupten Kraftimpuls des Gewebeverbandes im Schritt a) wiederkehrend statt; die Wiederholfrequenz des Hackens beträgt in Schritt a) von 1 bis 5 Hz, bevorzugt von 3 bis 5 Hz. Andere Wiederholraten sind, je nach den Eigenschaften des zu bearbeitenden Gewebeverbands durch den Fachmann in Kenntnis der erfindungsgemäßen Lösung anpassbar, um gegebenenfalls das Hackergebnis zu verbessern, ohne dass der Erfindungsgedanke verlassen wird.Prefers finds the hacking, that is the application of an abrupt force impulse of the tissue association in step a) recurring instead; the repetition frequency of hacking is in step a) from 1 to 5 Hz, preferably from 3 to 5 Hz. Other repetition rates are, depending on the properties of the tissue to be processed mesh by the skilled person in the knowledge of the solution according to the invention adaptable to optionally to improve the hack result, without the idea of the invention will leave.

Die Erfindung sieht also vor, vor einem Auflösen des Gewebeverbands durch ein lösendes Agens die Integrität der Epithelzellschicht durch einen abrupten Kraftimpuls auf den Gewebeverband (Hacken) zu zerstören. Charakteristisch für diese neuartige Desintegrationsmethode ist, dass dabei die mit der Epithelzellschicht verbundene mindestens eine weitere Gewebeschicht nicht oder nicht wesentlich desintegriert wird und daher vollständig oder zumindest im Wesentlichen intakt bleibt. Das heißt, der Gewebeverband bleibt im Anschluss an Schritt a) als solcher mechanisch erhalten, was die automatisierte, insbesondere robotergestützte Weiterverarbeitung erleichtert.The The invention thus provides, prior to dissolution of the tissue composite by a solvent Agent's integrity the epithelial cell layer by an abrupt force pulse on the Tissue bandage (hoes) to destroy. Characteristic of This novel disintegration method is that with the Epithelial layer associated at least one further layer of tissue is not or not substantially disintegrated and therefore completely or at least essentially intact. That is, the fabric association remains following step a) as such mechanically obtained what facilitates automated, in particular robot-assisted further processing.

Die Erfindung macht sich die überraschende Erkenntnis zunutze, dass die mechanischen Eigenschaften der Epithelzellschicht sich von den mechanischen Eigenschaften von mit der Epithelzellschicht verbundenen weiteren Gewebeschichten unterscheiden. Insbesondere ist die Epithelzellschicht im Vergleich zu den damit verbundenen weiteren Gewebeschichten vergleichsweise spröde und die an eine Epithelzellschicht anhaftenden weiteren Gewebeschichten sind vergleichsweise zäh. Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, verursacht der abrupte Hackimpuls auf das Gewebe einen im Wesentlichen verformungslosen Sprödbruch in der Epithelzellschicht, während vergleichsweise zähe Gewebeschichten im Wesentlichen intakt bleiben. Der abrupte Hackimpuls kann keinen verformungsreichen Zähbruch in einem vergleichsweise zäheren Gewebe erzeugen.The Invention makes the surprising finding take advantage of the mechanical properties of the epithelial cell layer different from the mechanical properties of the epithelial cell layer distinguish further tissue layers. In particular, the epithelial cell layer Compared to the associated further tissue layers comparatively brittle and the further tissue layers adhered to an epithelial cell layer are comparatively tough. Without wanting to be bound by theory, it causes the abrupt Hack impulse on the tissue a substantially deformation-free brittle fracture in the epithelial cell layer while comparatively tough Tissue layers remain essentially intact. The abrupt Hackimpuls can not a deformation-rich Zähbruch in a comparatively tougher Create tissue.

Durch die vorliegende Erfindung wird dem Fachmann ermöglicht, die bisher bekanntermaßen nur durch eine ziehende Schnittführung erreichte Zerteilung des Gewebes durch eine bruchmechanische Be anspruchung zum Auftrennen der Epithelzellschicht im Gewebeverband zu ersetzen und durch die zu erreichbare Desintegration der Epithelzellschicht kann ein Gewebe auflösendes Agens unmittelbar an die der Epithelzellschicht anliegenden Basalmembran einwirken, wodurch diese aufgelöst werden kann, um den Gewebeverband aufzulösen und insbesondere die Epithelzellen an der mindestens einen weiteren Gewebeschicht des Gewebeverbands abzulösen.By the present invention is made possible for those skilled in the art, the previously known only through a pulling cut achieved fragmentation of the tissue by a fracture mechanical loading to replace the epithelial cell layer in tissue association and by the achievable disintegration of the epithelial cell layer can be a tissue dissolving Agent directly to the basal membrane adjacent to the epithelial cell layer act, which dissolve them can dissolve the tissue matrix and in particular the epithelial cells on the at least one further tissue layer of the tissue composite replace.

Die Erfinder fanden weiter überraschend, dass der vorteilhafte Effekt des abrupt wirkenden Kraftimpulses (Hacken) auf die Zerstörung der Integrität der Epithelzellschicht im Gewebeverband tatsächlich im Wesentlichen unabhängig von der Orientierung des Gewebestücks in Bezug auf die Hackrichtung ist. Es hat sich herausgestellt, dass es nicht, wie zunächst zu erwarten gewesen wäre, erforderlich ist, dass die zu desintegrierende Epithelzellschicht an der der Kraftimpulsrichtung zugewandten Oberfläche des Gewebeverbands angeordnet sein muss, um durch den erfindungsgemäßen Kraftimpuls die Desintegration der Epithelzellschicht zu erwirken. Es hat sich überraschend herausgestellt, dass auch die mit der Epithelzelleschicht im Gewebeverband verbundenen mindestens eine weitere Gewebeschicht die Kraftimpulswirkung auf die Epithelzellschicht leiten kann, um diese zu desintegrieren. Vorteilhafterweise kann so die Epithelzellschicht im Gewebeverband „aufgeschnitten” werden, ohne dass die konkrete Orientierung des Gewebestücks vorher festgelegt, oder bekannt sein muss. Dies ist ein weiterer entscheidender Vorteil gegenüber der bekannten Maßnahme der ziehenden Schnittführung auf dem gezielt orientierten und ausgebreiteten Gewebestück.The Inventors found further surprising that the beneficial effect of the abruptly acting force pulse (hoes) on the destruction of integrity the epithelial cell layer in tissue association actually substantially independent of the orientation of the piece of tissue in terms of the hack direction. It turned out that not it, like first would have been expected it is necessary that the epithelial cell layer to be disintegrated at the force pulse direction facing surface of the Tissue bandages must be arranged in order by the force pulse according to the invention to achieve the disintegration of the epithelial cell layer. It's surprising also found that with the epithelial cell layer in the tissue connected at least one further tissue layer, the force pulse effect can lead to the epithelial cell layer to disintegrate them. Advantageously, the epithelial cell layer can thus be "cut open" in tissue combination, without specifying the concrete orientation of the piece of fabric beforehand, or known have to be. This is another crucial advantage over the known measure the pulling cut on the purposefully oriented and spread fabric piece.

Die Erfindung sieht bevorzugt vor, dass das Hacken des Gewebeverbandes in Schritt a) innerhalb des Verfahrens über die im We sentlichen gesamte Oberfläche des Gewebeverbandes verteilt erfolgt, um möglichst die gesamte Epithelzellschicht zu desintegrieren, das heißt in wesentlichen Teilen im Wesentlichen bis zur Basalmembran hin aufzuspalten. In einer bevorzugten Variante der Erfindung wird dies erreicht, indem der Gewebeverband in Schritt a) auf einer Trägerfläche aufliegt, die im Wesentlichen senkrecht zur Hackbewegung, das heißt senkrecht zu der von der Klinge ausgeübten Kraftimpulsrichtung, bevorzugt schrittweise, verfahren, das heißt, verschoben wird. Dies erfolgt bevorzugt durch den Einsatz eines Kreuztisches, woraus die Trägerfläche angeordnet ist. Der Kreuztisch weist eine erste horizontale Achse und eine zweite, dazu senkrecht stehende horizontale Achse auf. Die Erfindung sieht bevorzugt vor, dass die Trägerfläche, und damit das darauf aufliegende Gewebestück, zumindest in den Intervallen zwischen den sich wiederholenden Hackbewegungen, vorzugsweise schrittweise in zumindest einer Achsenrichtung verfahren, das heißt verschoben wird, sodass mit jeder Hackbewegung ein anderer Oberflächenabschnitt des auf der Trägerfläche aufliegenden Gewebeverbandes mit dem abrupten Kraftimpuls der Klinge beaufschlagt wird.The invention provides preferably that the hacking of the tissue association in step a) takes place within the process on the We sentlichen entire surface of the tissue association in order to disintegrate as possible the entire epithelial cell layer, that is substantially split substantially in the basal membrane out , In a preferred variant of the invention, this is achieved by the tissue assembly rests in step a) on a support surface which is substantially perpendicular to the chopping motion, that is perpendicular to the force exerted by the blade force pulse direction, preferably stepwise, moved, that is, moved , This is preferably done by the use of a cross table, from which the support surface is arranged. The cross table has a first horizontal axis and a second perpendicular horizontal axis. The invention preferably provides that the carrier surface, and thus the tissue piece lying thereon, preferably at least in the intervals between the repetitive chopping movements, preferably stepwise in at least one axial direction, that is shifted, so that with each chopping movement another surface portion of the on the Carrier surface resting tissue association with the abrup th force pulse of the blade is applied.

In einer ersten Variante erfolgt das schnittweise Verfahren entlang der mindestens einen horizontalen Achse in Form eines regelmäßigen Musters (Scannen). In einer alternativen Variante erfolgt das Verfahren in zumindest einer Achsenrichtung nach ungeordneten, insbesondere quasi-stochastischen Verteilungsmustern. Der Vorteil der quasi-stochastischen Verteilung der Kraftimpulseinwirkung auf die Oberfläche des Gewebeverbandes besteht darin, dass unabhängig von der konkreten Lage des Gewebeverbandes auf der Trägerfläche eine im Mittel gleichgewichtete Desintegrationswirkung erreicht wird.In In a first variant, the cut-by-length method is carried out along the at least one horizontal axis in the form of a regular pattern (scanning). In an alternative variant, the method is carried out in at least an axis direction after disordered, in particular quasi-stochastic distribution patterns. The advantage of the quasi-stochastic distribution of the force impulse effect on the surface The fabric association is that regardless of the specific situation the fabric association on the support surface a on average, equally weighted disintegration effect is achieved.

Die Erfindung sieht bevorzugt vor, dass als die Basalmembran im Gewebeverband lösendes Agens ein Enzym oder eine Enzymmischung eingesetzt wird, die bevorzugt ausgewählt ist aus dem Enzym Dispase, Dispase-ähnlichen Enzymen und Mischungen davon. Bevorzugt wird das Inkontaktbringen des Gewebeverbands mit dem die Basalmembran lösenden Agens in Schritt b) durch eine Inkubation des Gewebeverbands mit diesem Agens realisiert. Bevorzugt erfolgt die Inkubation über einen Zeitraum von 3 bis 5 Stunden, besonders bevorzugt über einen Zeitraum von 4 Stunden.The Invention preferably provides that as the basal membrane in the tissue association solvent an enzyme or enzyme mixture is used which is preferred selected is from the enzyme dispase, dispase-like enzymes and mixtures from that. Preference is given to bringing the tissue composite into contact with that the basal membrane dissolves Agent in step b) by incubation of the tissue composite with realized this agent. The incubation preferably takes place over a period of time from 3 to 5 hours, more preferably over a period of 4 hours.

Gegenstand dieser Erfindung ist auch ein um mindestens einen weiteren Schritt ergänztes Verfahren, wonach in dem weiteren Schritt d) die in Schritt c) abgetrennte Epithelzellschicht mit einem den Zellverband der Epithelzellschicht lösenden Agens in Kontakt gebracht wird, sodass sich vereinzelte Epithelzellen aus der abgetrennten Epithelzellschicht ablösen.object This invention is also an at least one further step supplemented A method according to which in the further step d) that separated in step c) Epithelial cell layer with a cell structure of the epithelial cell layer be solved Agent is brought into contact, so that isolated epithelial cells detach from the separated epithelial cell layer.

Bevorzugt ist das den Zellverband der Epithelzellschicht lösende Agens ein Enzym oder Enzymgemisch, welches bevorzugt ausgewählt ist aus dem Enzym Trypsin, Trypsin-ähnlichen Enzymen und Mischungen davon. Vorzugsweise wird das Inkontaktbringen der abgetrennten Epithelzellschicht mit dem den Zellverband der Epithelzellschicht lösenden Agens in Schritt d) durch eine Inkubation der Epithelzellschicht mit diesem Agens realisiert. Bevorzugt findet die Inkubation über einen Zeitraum von etwa 3 bis etwa 10 Minuten, bevorzugt von 4 bis 6 Minuten, besonders bevorzugt von 5 Minuten statt.Prefers the agent dissolving the cell structure of the epithelial cell layer is an enzyme or Enzyme mixture, which is preferably selected from the enzyme trypsin, Trypsin-like Enzymes and mixtures thereof. Preferably, the contacting will occur the separated epithelial cell layer with which the cell group of Epithelial cell layer dissolving agent in step d) by incubation of the epithelial cell layer with this Realized agent. Preferably, the incubation takes place over a Time from about 3 to about 10 minutes, preferably from 4 to 6 minutes, more preferably 5 minutes instead.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein um ein mindestens einen weiteren Schritt erweitertes erfindungsgemäßes Verfahren, wobei in ei nem nachfolgenden oder alternativen Schritt e) das die mindestens eine weitere Gewebeschicht aufweisende Restgewebe mit einem den Gewebeverband lösenden Agens in Kontakt gebracht wird, sodass sich vereinzelte Gewebezellen der mindestens einen weiteren Gewebeschicht aus dem Restgewebe lösen.object The invention is also an at least one further step extended method according to the invention, wherein in a subsequent or alternative step e) the at least one further tissue layer having residual tissue with a tissue-dissolving agent is brought into contact, so that isolated tissue cells of detach at least one further layer of tissue from the remaining tissue.

Vorzugsweise wird das den Zellverband der mindestens einen weiteren Gewebeschicht lösende Agens im Schritt e) ein Enzym oder Enzymgemisch, ausgewählt aus dem Enzym Kollagenase, Kollagenase-ähnlichen Enzymen und Mischungen davon. Bevorzugt wird das Inkontaktbringen der mindestens einen weiteren Gewebeschicht mit dem den Zellverband der Gewebeschicht lösenden Agens in Schritt e) durch eine Inkubation der mindestens einen weiteren Gewebeschicht in dem Agens realisiert. Die Inkubation findet bevorzugt über einen Zeitraum von 1 bis 8 Stunden, besonders bevorzugt über einen Zeitraum von 3 bis 5 Stunden statt. Die Ausbeute der aus dem Zellverband der mindestens einen weiteren Gewebeschicht herausgelösten vereinzelten Gewebezellen hängt von der Inkubationsdauer ab.Preferably this becomes the cell structure of the at least one further layer of tissue releasing agent in step e) an enzyme or enzyme mixture selected from the enzyme collagenase, collagenase-like enzymes and mixtures from that. The contacting of the at least one is preferred another layer of tissue with which the cell structure of the tissue layer be solved Agent in step e) by incubation of the at least one other Tissue layer realized in the agent. The incubation preferably takes place over one Period of 1 to 8 hours, more preferably over one Period of 3 to 5 hours instead. The yield of the cell structure the isolated at least one further layer of tissue isolated Tissue cells hang from the incubation period.

Die Erfindung stellt somit ein Gesamtverfahren bereit, womit aus einem mindestens zwei Gewebeschichten enthaltenden Gewebeverband, bevorzugt in Form eines Spendergewebes, welches eine Epithelzellschicht und eine über eine Basalmembran verbundene weitere Gewebeschicht aufweist, bereit, um in automatisierbarer, insbesondere robotergestützter Weise eine einfache, schnelle und zuverlässige Isolation sowohl der Epithelzellen, als auch bevorzugt zusätzlich der Gewebezellen der weiteren Gewebeschicht von dem Gewebeverband ermöglicht. Ein solches Verfahren ist reproduzierbar, ge nügt High-Throughput-Erfordernissen und kann die Anforderungen an die GMP-Konformität erfüllen.The Thus, the invention provides an overall method, with which from a at least two tissue layers containing tissue, preferably in the form of a donor tissue, which has an epithelial cell layer and one over a basement membrane has associated further tissue layer, ready to order in an automatable, in particular robot-assisted way a simple, fast and reliable Isolation of both the epithelial cells, and preferably additionally the Tissue cells of the further tissue layer of the tissue association allows. Such a method is reproducible, meets high-throughput requirements and can meet the requirements for GMP compliance.

In einer bevorzugten Ausführung ist der Gewebeverband ein Spendergewebe des menschlichen oder tierischen Körpers; besonders bevorzugt ist der Gewebeverband Hautgewebe, insbesondere in Hautgewebebiopsat. Demgemäß ist die Epithelzellschicht bevorzugt eine Epidermisschicht und die zu isolierenden Epithelzellen sind bevorzugt Keratinozyten, die als solche aus dem Spendergewebe, insbesondere Hautgewebe, isolierbar sind. Ebenso ist die mindestens eine weitere Gewebeschicht des Gewebeverbandes bevorzugt eine Dermisschicht und die aus der mindestens einen weiteren Gewebeschicht isolierbaren Gewebezellen sind bevorzugt Fibroblasten.In a preferred embodiment The tissue association is a donor tissue of the human or animal body; Particularly preferred is the tissue association skin tissue, in particular in skin tissue biopsy. Accordingly, the Epithelial cell layer prefers an epidermis layer and the one to be isolated Epithelial cells are preferably keratinocytes, as such from the Donor tissue, especially skin tissue, are isolatable. As well is the at least one further tissue layer of the tissue association preferably a dermis layer and that of the at least one other Tissue layer isolatable tissue cells are preferably fibroblasts.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Schritts a), geeignete Vorrichtung zum Zerstören der Integrität einer Epithelzellschicht in einem Gewebestück eines Gewebeverbandes, bestehend aus einer die Epithelzellen enthaltenen Epithelzellschicht und mindestens einer mit der Epithelzellschicht über eine dazwischen liegende Basalmembran verbundenen weiteren Gewebeschicht, durch Beaufschlagen des Gewebeverbandes über eine Klinge mit einem abrupten Kraftimpuls (Hacken), wobei die Vorrichtung zumindest folgende Komponenten aufweist:

– Trägerfläche (10), welche über eine Kreuztisch-Lagerung an einer Basis (40) angeordnet ist, die zur Aufnahme des Gewebestücks geeignet ist und eine erste horizontale Verfahrachse (42) und eine dazu senkrecht angeordnete zweite horizontale Verfahrachse (44) aufweist;
– Klingenhebel (30), der an der Basis (40) schwenkbar gelagert ist und mindestens einen an dem zur Trägerfläche (10) hingewandten Ende angeordneten Klingenblock (25) aufweist, der mindestens eine Klinge (20) aufnimmt, welche durch Schwenken des Klingenhebels (30) auf die Trägerfläche (10) absenkbar ist;
– Antriebselement (35), welches mit dem Klingenhebel (30) in Kraftverbindung steht, um ein abruptes Absenken der mindestens einen Klinge (20) auf ein auf der Trägerfläche (10) aufgenommenes Gewebestück ermöglicht.

Another object of the invention is an apparatus for carrying out the method according to the invention, in particular for carrying out the step a), suitable device for destroying the integrity of an epithelial cell layer in a tissue piece of a tissue network consisting of an epithelial cell layer containing the epithelial cells and at least one with the epithelial cell layer an intermediate basal membrane associated further tissue layer, by applying the tissue association via a blade with an abrupt force pulse (chopping), the device at least the following Components comprising:

- support surface ( 10 ), which via a cross table storage at a base ( 40 ) is arranged, which is suitable for receiving the fabric piece and a first horizontal travel axis ( 42 ) and a perpendicular thereto arranged second horizontal axis ( 44 ) having;
- blade lever ( 30 ), at the base ( 40 ) is pivotally mounted and at least one of which to the support surface ( 10 ) end-facing arranged blade block ( 25 ), the at least one blade ( 20 ), which by pivoting the blade lever ( 30 ) on the support surface ( 10 ) is lowered;
Drive element ( 35 ), which with the blade lever ( 30 ) is in operative connection to an abrupt lowering of the at least one blade ( 20 ) on one on the support surface ( 10 ) recorded tissue piece allows.

Es ist bevorzugt vorgesehen, dass in dem Klingenblock mehrere Klingen angeordnet sind. In einer bevorzugten Ausführung sind die eingesetzten Klingen Skalpellmesser. Bevorzugt sind dies auswechselbare Skalpellklingen.It It is preferably provided that in the blade block a plurality of blades are arranged. In a preferred embodiment, the blades used are Scalpel knife. Preferably, these are replaceable scalpel blades.

Die Vorrichtung ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Klinge im Wesentlichen senkrecht auf die Trägerfläche absenkbar ist. Dies wird bewerkstelligt durch entsprechende Anordnungen des schwenkbar an der Basis gelagerten Klingenhebels. Die Schwenkachse des Klingenhebels liegt bevorzugt oberhalb der Ebene der Trägerfläche.The Device is preferably characterized in that the at least a blade is lowered substantially perpendicular to the support surface. this will accomplished by appropriate arrangements of the pivotally the base mounted blade lever. The pivot axis of the blade lever is preferably above the plane of the support surface.

Das zum Antrieb des Klingenhebels vorgesehene Antriebselement ist ein Kraftantrieb, der bevorzugt ausgewählt ist aus pneumatischen Antrieben, hydraulischen Antrieben und piezoelektrischen Antrieben und elektromagnetischen Antrieben. Dazu analoge Antriebskonzepte sind ebenfalls vom Gegenstand der Erfindung umfasst. Besonders bevorzugt ist der elektromagnetische Antrieb. Ein bevorzugtes Merkmal des Antriebselements ist die Fähigkeit, über die Klinge einen abrupten Kraftimpuls auf ein Gewebestück auszuwirken. In einer bevorzugten alternativen Ausführung wird auf die schwenkbare Lagerung des Klingenhebels verzichtet, um eine direkte Verbindung zwischen Klinge und Antriebselement zu erzeugen. In einer weiteren alternativen bevorzugten Ausführung wird auf den Klingenhebel verzichtet und das Antriebselement unmittelbar mit der Klinge verbunden.The provided for driving the blade lever drive element is a Power drive, which is preferably selected from pneumatic drives, hydraulic drives and piezoelectric drives and electromagnetic Drives. This analog drive concepts are also the subject of the invention. Particularly preferred is the electromagnetic Drive. A preferred feature of the drive member is the ability to control over Blade an abrupt force impact on a piece of tissue. In a preferred alternative embodiment, the pivotable mounting the blade lever dispensed to a direct connection between Create blade and drive element. In another alternative preferred embodiment is dispensed with the blade lever and the drive element immediately connected to the blade.

Eine besonders bevorzugte Ausführung der Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass zumindest an einer Stelle der die Klinge über den Klingenhebel mit dem Antriebselement verbindenden Wirkmechanik ein Endanschlag vorgesehen ist, der die durch das Absenken der Klinge auf die Trägerfläche ausübbare Hubbewegung zur Trägerfläche hin begrenzt. Dadurch kann bevorzugt erreicht werden, dass sich die Klinge bei der Hubbewegung, das heißt beim erfindungsgemäßen Hacken nicht oder nicht vollständig auf die Trägerfläche herabsenkt. Diese wird vorteilhafterweise dadurch an ihrer Oberfläche geschont und der Verschleiß von Trägerfläche und/oder Klinge minimiert. Gleichzeitig erlaubt der bevorzugt vorgesehene Endanschlag, dass ein vollständiges Durchtrennen des auf der Trägerfläche aufliegenden Gewebestücks aufgrund einer durch die Klinge verursachten Messerschneidwirkung vermieden oder verhindert wird. Im Vordergrund dieser Erfindung steht nicht die durch die herabfahrende Klinge erzeugte Messerschneidwirkung gegen die Trägerfläche, sondern bevorzugt der durch die Klinge im Gewebe erzeugte abrupte Kraftimpuls, welcher zum „Zerspringen” des vergleichsweise spröden Epithelgewebes im Gewebeverband des Gewebestücks führt. In einer bevorzugten Ausführung ist die Vorrichtung deshalb derart ausgelegt, dass eine messerschneidende Wirkung der Klinge ausgeschlossen ist. In einer bevorzugten Ausführung der Vorrichtung ist diese daher auch so ausgestaltet, dass ein sogenannter ziehender Schnitt auf dem Gewebestück verhindert wird. Der Fachmann kennt entsprechende geometrische Ausgestaltungen, insbesondere die Anordnung der Schwenkachse des Klingenhebels in Bezug auf die Trägerfläche und den Anstellwinkel der auf die Trägerfläche niederfahrenden Klinge, um entsprechende schneidende Bewegungen, die im Wesentlichen parallel zur Oberfläche des Gewebestücks verlaufen, vermeiden.A particularly preferred embodiment the device is characterized in that at least at one Put the blade over the blade lever with the drive element connecting action mechanism an end stop is provided by the lowering of the blade exercisable on the support surface lifting movement towards the support surface limited. This can preferably be achieved that the Blade in the lifting movement, that is when hacking according to the invention not or not completely lowered onto the support surface. This is advantageously thereby spared on its surface and the wear of Carrier surface and / or Blade minimized. At the same time allows the preferred provided End stop that a complete Cutting the resting on the support surface fabric piece due to a blade cutting action caused by the blade avoided or prevented. In the foreground of this invention does not stand the knife cutting action produced by the descending blade against the support surface, but prefers the abrupt momentum generated by the blade in the tissue, which to the "shattering" of the comparatively brittle Epithelial tissue in the tissue association of the tissue piece leads. In a preferred embodiment the device therefore designed such that a knife-cutting Effect of the blade is excluded. In a preferred embodiment of This device is therefore designed so that a so-called pulling section on the fabric piece is prevented. The expert knows appropriate geometrical configurations, in particular the arrangement the pivot axis of the blade lever with respect to the support surface and the angle of attack of the descending on the support surface Blade to appropriate cutting movements, essentially parallel to the surface of the fabric piece, avoid.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung, die weiter eine Steuereinheit, insbesondere geeignet zur Steuerung des Verfahrensablauf in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens aufweist, die mit dem Antriebselement (35) und Effektoren der horizontalen Kreuztisch-Achsen (42, 44) in Verbindung steht, bevorzugt in Wirkverbindung und/oder Steuerverbindung, die speziell ausgebildet ist, die Verschiebung der Trägerfläche (10) entlang der Achsen (42, 44) mit der von der Klinge (20) über die Antriebseinheit (35) ausgeführte Hubbewegung auf die Trägerfläche zu koordinieren, und zwar insbesondere in der Gestalt, dass nach bevorzugt jeder ausgeführten Hubbewegung der Klinge die Trägerfläche in zumindest einer der beiden horizontalen Achsen (42, 44) bevorzugt schrittweise verschiebbar ist.The subject matter of the invention is also a device, which furthermore has a control unit, in particular suitable for controlling the method sequence in step a) of the method according to the invention, which is connected to the drive element (FIG. 35 ) and effectors of the horizontal XY axis ( 42 . 44 ) is in communication, preferably in operative connection and / or control compound, which is specially designed, the displacement of the support surface ( 10 ) along the axes ( 42 . 44 ) with the of the blade ( 20 ) via the drive unit ( 35 ) coordinate to the carrier surface, in particular in the form that, after preferably each executed lifting movement of the blade, the carrier surface in at least one of the two horizontal axes ( 42 . 44 ) is preferably gradually displaced.

Die Steuereinheit ist vorzugsweise in Abhängigkeit von der verwendeten Antriebseinheit gewählt. Wird beispielsweise eine pneumatische Antriebseinheit verwendet, wird die Steuereinheit aus pneumatischen Steuerelementen, gegebenenfalls in Verbindung mit programmgesteuerten Ventilen, eingesetzt. Die Steuereinheit kann auch durch eine rein mechanische Wirkverbindung, beispielsweise eine mechanische Rastung oder Schrittfolgesteuerung, die über die Hubbewegung der Klinge getaktet wird, ausgeführt werden. Besonders bevorzugt ist eine über einen Rechner realisierte Steuerung, bevorzugt in Verbindung mit einem dazu geeigneten Computerprogramm, das auf dem Steuerrechner implementiert ist.The control unit is preferably selected as a function of the drive unit used. For example, if a pneumatic drive unit is used, the control unit is made of pneumatic controls, optionally in conjunction with programmable valves used. The control unit can also by a purely mechanical operative connection, for example a mechanical detent or step sequencer, the over the stroke movement of the blade is clocked to be executed. Particularly preferred is a controller implemented via a computer, preferably in conjunction with a computer program suitable for this purpose, which is implemented on the control computer.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Computerprogrammprodukt zur Steuerung der Koordination der Bewegung der Klinge mit der Bewegung der Trägerfläche.object The invention is therefore also a computer program product for control the coordination of the movement of the blade with the movement of the support surface.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch eine Anordnung zur automatischen, insbesondere robotergestützten Isolierung von Epithelzellen aus einem Gewebeverband, der aus einer die Epithelzellen enthaltenden Epithelzellschicht und mindestens einer mit der Epithelzellschicht über eine dazwischen liegende Basalmembran verbundenen weiteren Gewebeschicht besteht oder diese enthält, wobei die Vorrichtung zumindest die folgenden Komponenten enthält:

– Mittel zum Zerstören der Integrität der Epithelzellschicht des Gewebeverbands durch Beaufschlagen des Gewebeverbands über eine Klinge mit einem abrupten Kraftimpuls (Hacken), sodass die Epithelzellschicht im Wesentlichen bis zur Basalmembran hin aufgespalten wird;
– Mittel zum Inkontaktbringen des Gewebeverbands mit der aufgespalteten Epithelzellschicht mit einem die Basalmembran lösenden Agens, sodass sich die Epithelzellschicht von dem Gewebeverband ablöst; und
– Mittel zum Abtrennen der abgelösten Epithelzellschicht von dem die mindestens eine weitere Gewebeschicht enthaltenden Restgewebe des Gewebeverbandes.

The invention therefore also relates to an arrangement for automatic, in particular robot-assisted, isolation of epithelial cells from a tissue association consisting of or containing an epithelial cell layer containing the epithelial cells and at least one further tissue layer connected to the epithelial cell layer via an underlying basal membrane, the device at least contains the following components:

- Means for destroying the integrity of the epithelial cell layer of the tissue composite by applying the tissue composite via a blade with an abrupt force pulse (chopping), so that the epithelial cell layer is split substantially to the basement membrane;
- means for contacting the tissue composite with the split epithelial cell layer with a basement membrane solubilizing agent such that the epithelial cell layer separates from the tissue assembly; and
- means for separating the detached epithelial cell layer from the at least one further tissue layer containing residual tissue of the tissue association.

In bevorzugter Ausführung ist das Mittel zum Zerstören der Integrität der Epithelzellschicht des Gewebeverbands die hierin beschriebene erfindungsgemäße Vorrichtung.In preferred embodiment is the means to destroy of integrity the epithelial cell layer of the tissue composite described herein inventive device.

Bevorzugt enthält die Anordnung weiter:

– Mittel zum Abtrennen von Fettgewebe von dem Spendergewebe;
– Mittel zum Resuspendieren der vereinzelten Zellen und zum Abtrennen der Zellen von gegebenenfalls vorliegenden Geweberesten.

Preferably, the arrangement further contains:

- means for separating fatty tissue from the donor tissue;
- Means for resuspending the isolated cells and separating the cells from any tissue residues present.

Die Erfindung wird weiter durch die nachfolgenden Figuren sowie das Beispiel näher beschrieben, ohne dass diese beschränkend zu verstehen wären.The Invention is further by the following figures and the Example closer described, without these being limiting.

1 zeigt eine bevorzugte Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer Trägerfläche (10), welche auf der Basis (40) über den Kreuztisch mit den horizontalen Achsen (42, 44) gelagert ist und auf die mindestens eine der Klingen (20) bevorzugt senkrecht und bevorzugt ohne parallel zur Trägeroberfläche (10) verlaufenden Bewegungskomponente absenkbar ist. Die mindestens eine Klinge (20) ist über einen Klingenblock (25) an dem zur Trägerfläche hinweisenden Ende eines an der Basis (40) schwenkbar gelagerten Klingenhebels (30) kraftschlüssig fixiert. Der Klingenhebel (30) wirkt als Umlenkhebel der Kraftwirkung, die vom Antriebselement (35), die hier in Form eines Hubmagneten oder eines Pneumatikkolbens dargestellt ist, erzeugt wird. Durch Ausfahren des Hubkolbens aus dem Antriebselement (35) wird die mindestens eine Klinge (20) auf die Trägerfläche (10) abgesenkt. Die Trägerfläche (10) ist zur Aufnahme des zu bearbeitenden Gewebestücks geeignet. Befindet sich auf der Trägerfläche (10) das Gewebestück, fährt die mindestens eine Klinge (20) bei der Hubbewegung der aus den Elementen (35, 30 und 20) gebildeten Einheit auf das Gewebestück herab und übt auf dieses einen abrupten Kraftimpuls aus, ohne dies durch eine messerschneidende Wirkung zu zerschneiden. Optional ist der Trägerfläche (10) ein Handhabungselement (46) zugeordnet, das den automatischen Austrag und Eintrag der Trägerfläche (10) in die Vorrichtung durch ein rotorgestütztes System ermöglicht. 1 shows a preferred embodiment of the device according to the invention with a support surface ( 10 ), which are based on ( 40 ) via the cross table with the horizontal axes ( 42 . 44 ) is mounted on the at least one of the blades ( 20 ) preferably perpendicularly and preferably without parallel to the carrier surface ( 10 ) extending movement component is lowered. The at least one blade ( 20 ) is via a blade block ( 25 ) at the end of a base facing the support surface ( 40 ) pivotally mounted blade lever ( 30 ) fixed non-positively. The blade lever ( 30 ) acts as a reversing lever of the force acting by the drive element ( 35 ), which is shown here in the form of a solenoid or a pneumatic piston, is generated. By extending the reciprocating piston from the drive element ( 35 ), the at least one blade ( 20 ) on the support surface ( 10 ) lowered. The support surface ( 10 ) is suitable for receiving the piece of tissue to be processed. Located on the support surface ( 10 ) the fabric piece, drives the at least one blade ( 20 ) in the lifting movement of the elements ( 35 . 30 and 20 ) on the piece of tissue down and exerts on this an abrupt force pulse, without cutting it by a knife-cutting action. Optionally, the support surface ( 10 ) a handling element ( 46 ), the automatic discharge and entry of the support surface ( 10 ) into the device by a rotor-based system.

2 zeigt eine reale Ausführung der Vorrichtung nach 1 mit einer in den Klingenhebel am Klingenblock eingespannten Klinge. Auf der hellen quadratischen Trägerfläche liegt ein Gewebestück auf. 2 shows a real version of the device according to 1 with a blade clamped in the blade lever on the blade block. On the bright square support surface is a piece of fabric.

Beispiel: Vollautomatisierte Isolation von Fibroblasten und Keratinozyten aus Epidermis- und Dermisschichten von Hautbiopsaten.Example: Fully automated isolation of fibroblasts and keratinocytes from epidermis and dermis layers of skin biopsies.

In einem gegebenenfalls vorangehenden separaten Verfahrensablauf, der unabhängig von dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt wird, werden bevorzugt manuell operativ Hautgewebestücke (Biopsate) aus dem menschlichen oder tierischen Körper, bevorzugt aus dem lebenden menschlichen Körper, entnommen. Bevorzugt, sind dies Präputien.In an optionally preceding separate procedure, the independently of the method according to the invention carried out will be preferred manually operated skin tissue pieces (biopsies) from the human or animal body, preferably from the living human body, taken. Preferably, these are prepuce.

Die Gewebestücke befinden sich zu Prozessbeginn bevorzugt in einem Transportbecher in ca. 20 mL Transportmedium (bevorzugt DMEM + 1% Gentamycin). Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Biopsat zunächst durch einen Greifer, welcher das Biopsat aus dem Transportbecher nimmt und auf eine Verarbeitungsplattform ablegt, erfasst. Um das Biopsat zum automatisierten Greifen in eine definierte Lage zu bringen, wird der Transportbecher bevorzugt um ca. 40° aus der senkrechten Achse gekippt. Durch die Schwerkraft sinkt das Biopsat in die so entstandene Senke im Transportbecher ab, und damit in eine reproduzierbar definierte Lage. Das Biopsat kann so von einem entsprechend ausgelegten Greifer erfasst werden. Das Biopsat wird mit dem Greifer auf einer Verarbeitungsplattform abgelegt und für die Trennung der Gewebeschichten vorbereitet.The pieces of tissue are at the beginning of the process preferably in a transport cup in about 20 mL of transport medium (preferably DMEM + 1% gentamycin). In the context of the method according to the invention, the biopsy is first detected by a gripper which takes the biopsy from the transport cup and places it on a processing platform. To bring the biopsy for automated gripping in a defined position, the transport cup is preferably tilted by about 40 ° from the vertical axis. By gravity, the biopsy sinks into the resulting sink in the transport cup, and thus in a reproducible defined position. The biopsy can thus be detected by a suitably designed gripper. The biopsy is done with the gripper on a processing platform filed and prepared for the separation of the tissue layers.

Zur Fettreduktion, das heißt zur Abtrennung von am Biopsat anhaftendem Fettgewebe, wird auf die mechanischen Eigenschaften des Fettgewebes gegenüber dem Dermis- und Epidermisgewebe, insbesondere das Elastizitätsmodul, zurückgegriffen. Das Biopsat wird zunächst bevorzugt mittels Unterdruckansaugung automatisch in eine zylinderförmige Hülse überführt, welche so über dem Boden eines Einweggefäßes (Petrischale) positioniert ist, das zwischen Gefäßboden und Zylinderwand ein Spalt von weniger als 1 mm entsteht. Durch einen in der Zylinderhülse laufenden Kolben oder Stempel, wird das Biopsat auf den Boden gepresst. Dabei kann der enge Spalt zwischen Zylinder und Boden nur von dem zur Seite gepressten Fettgewebe durchdrungen werden, welches so durch den Spalt nach außen gedrückt und vom übrigen Gewebe (Epidermis- und Dermisschicht) räumlich getrennt wird.to Fat reduction, that is for the separation of adipose tissue adhering to the biopsy, is applied to the mechanical properties of the fatty tissue against the dermis and epidermis tissue, in particular the modulus of elasticity, resorted. The Biopsy will be first preferably converted by means of vacuum suction automatically into a cylindrical sleeve, which so over the bottom of a disposable vessel (Petri dish) is positioned between the bottom of the vessel and the cylinder wall Gap of less than 1 mm is formed. By a running in the cylinder sleeve Piston or stamp, the biopsy is pressed to the ground. there the narrow gap between the cylinder and the floor can only be from the Side-pressed fatty tissue are penetrated, which is so through the gap to the outside depressed and the rest Tissue (epidermis and dermis layer) spatial is disconnected.

Das ausgetretene Fettgewebe wird durch Abschneiden entfernt. Dazu wird an der Außenseite der Zylinderhülse ein Schneidring abgesenkt, der das unter der Zylinderhülse hervorquellende Fettgewebe abschneidet. Der Schneidring rotiert um die Achse der Zylinderhülse, um durch den ziehenden Schnitt die Schneidwirkung zu verbessern.The Excreted fatty tissue is removed by cutting. This will be on the outside of the cylinder sleeve lowered a cutting ring, which bulging under the cylinder sleeve Cut off fatty tissue. The cutting ring rotates about the axis of the Cylinder sleeve, to improve the cutting action by the pulling cut.

Der Schneidring ist mit dem im Inneren der Zylinderhülse verlaufenden Stempel mechanisch gekoppelt, sodass zeitlich unmittelbar nach dem Herunterpressen des Biopsats auf den Gefäßboden in einem Arbeitsgang das Schneiden des nach außen hervorquellenden Fettgewebes erfolgt: Das Quetschen und Schneiden wird innerhalb einer einzigen Hubbewegung über eine speziell ausgelegte Mitnehmerhülse, die mit dem Stempel und dem Schneidring gekoppelt ist, realisiert. Zur Beabstandung der Zylinderhülse vom Gefäßboden sind Abstandshalter oder Stege vorgesehen, welche die Breite des Spalts bestimmen. Der Spalt hat eine Breite von ca. 0,8 mm.Of the Cutting ring is mechanical with the running inside the cylinder sleeve punch coupled, so in time immediately after the press down of the biopsy on the bottom of the vessel one operation, the cutting of the outwardly swelling fatty tissue The squeezing and cutting takes place over a single stroke movement specially designed drive sleeve, which is coupled to the punch and the cutting ring realized. For spacing the cylinder sleeve from the bottom of the vessel Spacers or webs provided which the width of the gap determine. The gap has a width of approx. 0.8 mm.

Zur automatisierten Aufnahme und Handhabung des Biopsats verfügt der Fettseparator über eine Ansaugleitung zum Anlegen eines Unterdrucks, worüber das Biopsat in der Zylinderhülse festgehalten werden kann. Dadurch kann das Biopsat aus einer defilierten Lage angesaugt werden, bearbeitet werden und durch Positionierung des Fettseparators wieder an einen definierten Ort abgelegt werden. Es zeigt sich, dass durch die erfindungsgemäße Behandlung neben der Reduktion des Fettgewebeanteils im Biopsat eine für die weitere Bearbeitung günstige Abflachung und flächige Ausbreitung des Biopsats erreicht wird. Diese hat einen überraschend positiven Einfluss auf die Effizienz der weiteren Bearbeitung, insbesondere der Trennung der Gewebeschichten (Dermisschicht, Epidermisschicht).to automated capture and handling of the biopsy, the fat separator has a Suction line for applying a negative pressure, about which the biopsy is held in the cylinder sleeve can be. This allows the biopsy from a defiled position be sucked, processed and positioned by positioning the Fettseparators be put back to a defined location. It turns out that by the treatment according to the invention in addition to the reduction the fat tissue part in the biopsy a favorable for further processing flattening and areal Spread of the biopsy is achieved. This has a surprisingly positive Influence on the efficiency of further processing, in particular the separation of the tissue layers (dermis layer, epidermis layer).

Für die getrennte Isolierung der beiden Zelltypen Keratinozyten und Fibroblasten aus dem Hautbiopsat werden die beiden Hautschichten Epidermis und Dermis voneinander getrennt. Dies geschieht enzymatisch über das Enzym Dispase oder ein analog wirkendes Enzym, welches eine Auflösung der zwischen Epidermis- und Dermisschicht angeordneten Basalmembran bewirkt. Dazu wird das Biopsat so vorbereitet, dass das Enzym bis zur Basalmembran in das Gewebe eindringen kann. Bevorzugt wird dazu ein Gewebehacker eingesetzt, welcher ein Schneiden des flächig ausgebreiteten Biopsats mit definierter Schnitttiefe ermöglicht. Dabei wird die Oberfläche des Biopsats, welches aus der Epidermis besteht, nur bis zum darunterliegenden Dermisgewebe durchtrennt, das heißt, das darunterliegende Dermisgewebe bleibt durch das mechanische Schneiden bevorzugt unbeeinflusst. Aufgrund der vergleichsweise höheren Sprödigkeit der oben liegenden Epidermisschicht gegenüber der zäheren darunterliegenden Dermisschicht wird durch die Hackbewegung der Klinge von oben auf die Epidermis mechanisch mit hohem Impuls eingewirkt, sodass diese quasi „zerspringt” während die tiefer liegende Dermisschicht im Wesentlichen intakt bleibt.For the separated Isolation of the two cell types keratinocytes and fibroblasts the skin biopsy, the two layers of skin epidermis and dermis separated from each other. This happens enzymatically via the Enzyme dispase or an analogous enzyme, which is a resolution of between Epidermis and dermis layer arranged basal membrane causes. The biopsy is prepared in such a way that the enzyme reaches the basal membrane in the tissue can penetrate. Preference is given to a fabric hacker used, which is a cutting of the flat spread biopsy with defined cutting depth. The surface of the Biopsats, which consists of the epidermis, only to the underlying Dermis tissue is severed, that is, the underlying dermis tissue remains preferably unaffected by the mechanical cutting. Due to the comparatively higher brittleness the upper epidermis layer opposite the tougher underlying dermis layer is caused by the clipping motion of the blade from the top of the epidermis mechanically acted with a high pulse, so that it "bursts" while the deeper dermis layer remains essentially intact.

Die Größe der Epidermisstücke wird insbesondere durch das Verhältnis aus Hackfrequenz des Messerkopfs und der Bewegungsgeschwindigkeit des Messerkopfs über dem Biopsat sowie durch die Dauer des Hackvorganges bestimmt.The Size of the epidermis pieces becomes especially by the ratio from the chopping frequency of the cutter head and the speed of movement of the cutterhead Cutterhead over the biopsy as well as the duration of the hacking process.

Die Schneid- oder Hackwirkung des wiederkehrend bevorzugt mit einer Frequenz von ca. 2 bis 5 Hz hackenden Messers wird bevorzugt durch Verschieben des Gewebestücks auf einem Kreuztisch, welcher mit dem Hackmesser gekoppelt betrieben wird, ist auf das gesamte Gewebestück verteilt. Die Schnittführung ist damit regelmäßig, bevorzugt aber quasi-stochastisch auf der gesamten Gewebeoberfläche verteilt, sodass eine bevorzugt enge Verteilung der Größen der geschnittenen Epidermisstücke entsteht.The Cutting or Hackwirkung of recurring preferred with a Frequency of about 2 to 5 Hz chopping knife is preferred by Moving the fabric piece on a cross table, which is operated coupled with the cleaver, is on the entire fabric piece distributed. The cut is thus regularly, preferred but distributed virtually stochastically on the entire tissue surface, so that a preferred narrow distribution of the sizes of the cut epidermis pieces arises.

Anschließend wird für einen Zeitraum von 4 Stunden bei 37°C in einer Enzymlösung, Dispase (4 U/mL, 20 mL) inkubiert. Das Enzym kann durch die eingeschnittene Epidermisschicht leicht zur Basalmembran vordringen. Durch die enzymatische Zerstörung der Baselmembran löst sich die eingeschnittene Epidermis in Stücken von der darunterliegenden im Wesentlichen intakten zusammenhängenden Dermis. Die Epidermisstücke schwimmen bevorzugt auf.Subsequently, will for one Period of 4 hours at 37 ° C in an enzyme solution, Dispase (4 U / mL, 20 mL). The enzyme can be cut through the Epidermis layer slightly penetrate to the basal membrane. By the enzymatic destruction the Basel membrane dissolves the incised epidermis is in pieces from the underlying Essentially intact coherent Dermis. The epidermis pieces swim up preferably.

Die in Dispase suspendierten Epidermisstücke werden in dem nachfolgenden Schritt von der als zusammenhängendes Gewebestück erhaltenen Dermis abgetrennt. Dazu wird zunächst das Volumen der Dispaselösung durch Auffüllen mit Pufferlösung verdoppelt oder verdreifacht (auf 40 bis 60 ml) und die Dermis aus der Suspension der Epidermisstücke mittels eines Gewebegreifers automatisch entnommen und in ein separates Gefäß abgelegt. Epidermisgewebe und Dermisgewebe liegen nun in getrennten Gefäßen vor.The epidermis pieces suspended in Dispase are separated in the subsequent step from the dermis obtained as a coherent piece of tissue. For this purpose, the volume of the Dispaselösung is first doubled by filling with buffer solution or tripled (to 40 to 60 ml) and the Dermis is automatically removed from the suspension of the epidermis pieces by means of a tissue gripper and placed in a separate vessel. Epidermis and dermis tissues are now in separate vessels.

Zur Aufbereitung der Epidermisschicht zu vereinzelten Keratinozyten werden die Epidermisstücke mit Hilfe eines Gewebefilters, welcher an der Unterseite eines automatisierten Pipettenkopfs angebracht ist, abgetrennt, indem die Suspension über den Gewebefilter durch den Pipettenkopf abgesaugt wird, wobei die Epidermisstücke am Gewebefilter haften bleiben. Die Erhöhung des Lösungsvolumens durch das Auffüllen mit Pufferlösung unmittelbar vor der Filtration verbessert die Ausbeute an Epidermis erheblich.to Preparation of the epidermis layer to isolated keratinocytes become the epidermis pieces with the help of a fabric filter, which at the bottom of an automated Pipette head is attached, separated by placing the suspension over the Suction filter through the pipette head, the epidermis pieces adhere to the fabric filter stay. The increase of the solution volume the padding with buffer solution immediately before filtration significantly improves the yield of epidermis.

Anschließend werden die am Gewebefilter festgehaltenen Epidermisstücke mittels Puffer (PBS) durch Rückspülen des Gewebefilters über den Pipettenkopf in ein weiteres Gefäß überführt und dort mit einer weiteren Enzymlösung (Trypsin/EDTA, 1 mL, 0,5%) versetzt. Das Trypsin bewirkt, dass sich die Einzelzellen aus dem Gewebe verband der Epidermisstücke lösen. Nach Inkubation liegt (für circa 5 Minuten) eine Einzelzellsuspension aus Epidermiszellen vor.Then be the epidermis pieces held on the tissue filter by means of buffer (PBS) Backwashing the Fabric filter over transferred the pipette head in another vessel and there with another enzyme solution (Trypsin / EDTA, 1 mL, 0.5%). The trypsin causes that the single cells from the tissue bandaged to release the epidermis pieces. To Incubation is (for about 5 minutes) a single cell suspension of epidermal cells.

Nach Ablauf der Inkubationszeit wird die Enzymreaktion des Trypsins durch Zugabe von 10% FCS gestoppt. Da durch den optionalen Hackprozess bedingt schon kleine Epidermisstücke vorliegen können, kann der im manuellen Verfahren übliche Schritt der Homogenisierung der Gewebestücke vor der enzymatischen Behandlung ausbleiben. Die dadurch erreichte reduzierte mechanische Belastung der Zellen und die Verkürzung der Inkubationszeit in Trypsin auf circa 5 min führen zu einer gesteigerten Zellausbeute und Vitalität im Vergleich zum konventionellen manuellen Prozess.To Expiration of the incubation period, the enzyme reaction of trypsin by Addition of 10% FCS stopped. Because of the optional hacking process even small epidermis pieces can be present can be the usual in the manual procedure Step of homogenizing the pieces of tissue prior to enzymatic treatment fail. The resulting reduced mechanical stress of cells and shortening incubation time in trypsin at about 5 min lead to an increased Cell yield and vitality compared to the conventional manual process.

Zur Unterstützung der Zellisolation wird die erhaltene Suspension in einem nachfolgenden Schritt gegebenenfalls für ca. 20 Sek. mechanisch durchmischt (Vortex). Zur Abtrennung von eventuell vorhandenen Geweberesten wird die Suspension zunächst über dem Gewebefilter mit 100 μm Porengröße, welche die Einzelzellen passieren lässt, abgetrennt. Dazu wird an dem automatisierten Pipettenkopf ein zweiter dem Gewebefilter in Saugströmungsrichtung nachgeschalteter Einzelzellenfilter eingesetzt. Die Suspension wird in den Pipettenkopf gesaugt, wodurch die in der Suspension gegebenenfalls noch enthaltenen Gewebereste am Gewebefilter zurückgehalten und die Einzelzellen am nachgeschalteten Einzelzellenfilter festgehalten werden. Anschließend wird der Gewebefilter zusammen mit den daran anhaftenden Geweberesten von dem automatischen Pipettenkopf abgetrennt und gegebenenfalls verworfen. Die im Einzelzellenfilter im Pipettenkopf verbleibenden Einzelzellen werden durch Rückspülen des Einzelzellenfilters aus dem Pipettenkopf gespült. Dazu wird auf den Pipettenkopf anstelle des Gewebefilters eine Pipetten spitze gesetzt und die Einzelzellen durch Rückspülen des Einzelzellenfilters in die Pipettenspitze verbracht. Optional wird die Zellzahl in der Suspension bestimmt. Dazu wird ein Teil der Einzelzellsuspension aus der Pipettenspitze in eine Zellzählkammer dosiert und aus der in diesem Teilvolumen gefundenen Zellzahl auf die Gesamtzellzahl in der Pipettenspitze geschlossen. Gegebenenfalls wird durch Austausch der Suspendierlösung im Pipettenkopf in Abhängigkeit von der gefundenen Zellzahl neues Medium zudosiert, sodass eine Zellsuspension aus Epidermiszellen mit definierter Zellkonzentration erhalten wird.to support the cell isolation is the suspension obtained in a subsequent step if necessary for mechanically mixed (vortex) for approx. 20 sec. For the separation of Any existing tissue residues, the suspension is initially above the Tissue filter with 100 μm Pore size, which let the single cells pass, separated. For this purpose, a second is added to the automated pipette head the fabric filter in Saugströmungsrichtung used downstream single cell filter. The suspension will sucked into the pipette head, causing the suspension in the suspension if necessary retained tissue remains retained on the tissue filter and the individual cells be held on the downstream single cell filter. Subsequently, will the fabric filter together with the tissue remnants attached to it separated from the automatic pipette head and optionally discarded. The individual cells remaining in the single-cell filter in the pipette head be backwashed by the Single cell filter rinsed from the pipette head. This is done on the pipette head instead of the tissue filter a pipette tip set and the single cells by backwashing the Single cell filter spent in the pipette tip. Optional will determines the cell number in the suspension. This will be part of Single cell suspension from the pipette tip into a cell counting chamber dosed and from the number of cells found in this partial volume the total number of cells in the pipette tip is closed. Possibly is replaced by replacing the suspending solution in the pipette head dosed new medium from the number of cells found, so that a Cell suspension of epidermis cells with defined cell concentration is obtained.

Zur Aufbereitung der Dermisschicht zu Fibroblasten wird die Dermisschicht in einer Kollagenaselösung (20 mL) für einen Zeitraum von 1 bis 8 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellausbeute ist unter anderem abhängig von der Inkubationsdauer. Mit zunehmender Inkubationsdauer steigt der Grad der Auflösung des Dermisgewebes. Die Fibroblasten, die sich bei der Enzymbehandlung aus dem Gewebe herauslösen, werden durch analoge Filtrationsschritte mit Gewebefilter und Einzelzellenfilter, die optional mit dem automatisierten Pipettenkopf, wie vorstehend für die Epidermiszellen dargestellt, abgetrennt. Alternativ werden nicht aufgelöste Dermisgewebeteile bevorzugt mittels eines automatisierten Greifers entnommen. Die Dermiszellen werden anschließend optional mittels des automatisierten Pipettenkopfs auf eine bestimmte Zellkonzentration eingestellt.to Preparation of the dermis layer to fibroblasts becomes the dermis layer in a collagenase solution (20 mL) for incubated for 1 to 8 hours at 37 ° C. The cell yield depends among other things from the incubation period. With increasing incubation time increases the degree of dissolution of the dermis tissue. The fibroblasts that are involved in the enzyme treatment remove from the tissue, are determined by analogous filtration steps with tissue filters and single-cell filters, optional with the automated pipette head as above for the Epidermal cells shown, separated. Alternatively, not resolution Dermis tissue parts preferably removed by means of an automated gripper. The dermis cells are then optionally by means of the automated Pipette head set to a specific cell concentration.

Das automatisierte Verfahren ist so ausgelegt, dass es GMPkonform betrieben werden kann. Die Modularität der Einzelautomatisierungsschritte erlaubt eine hohe Flexibilität bezüglich des eingesetzten Gewebes und der gewünschten Anwendung, einschließlich der Möglichkeit einzelne Verarbeitungsschritte manuell auszuführen.The automated procedure is designed to operate GMP compliant can be. The modularity The individual automation steps allow a high degree of flexibility regarding the inserted tissue and the desired Application, including The possibility to execute individual processing steps manually.

Claims

A method of separating a first layer of tissue from a multi-layered biological tissue composite comprising the first layer of tissue and at least one further layer of tissue connected to the first layer of tissue, the first layer of tissue being mechanically more brittle and the further layer of tissue compared to the first layer of tissue is mechanically tougher, characterized in that by applying the tissue bond with one or more abrupt force pulses (chopping) in the first tissue layer brittle fracture is triggered, so that thereby split first tissue layer of the other Tissue layer is removable.

Process according to claim 1 for the isolation of epithelial cells from a tissue association consisting of one containing the epithelial cells Epithelial cell layer and at least one with the epithelial cell layer via a intervening basal membrane associated further tissue layer, containing the steps: a) Destroying the integrity of the epithelial cell layer the tissue association by applying the tissue association over a Blade with one or more abrupt force pulses (hoes), so that the epithelial cell layer substantially to the basal membrane is split; b) contacting the split Epithelial layer having tissue composite with a basement membrane be solved Agens, so that the epithelial cell layer separates from the tissue association; and c) Separating the detached Epithelial cell layer of which containing at least one further layer of tissue Residual tissue of the tissue association.

The method of claim 1 or 2, wherein the chopping the tissue association is recurring.

Method according to claim 3, wherein the repetition frequency of hacking from 2 to 5 Hz.

Method according to one of the preceding claims, wherein the hacking of the tissue association over the surface the fabric association is distributed.

The method of claim 5, wherein the tissue association rests on a support surface and the support surface substantially is moved perpendicular to the force exerted by the blade force pulse direction.

Method according to one of claims 2 to 6, wherein the Basal membrane solubilizing Agent in step b) an enzyme or an enzyme mixture selected from Dispase, dispase-like Enzymes and mixtures thereof.

Method according to one of claims 2 to 7, wherein the contacting of the tissue association with the basement membrane solubilizing agent in step b) an incubation of the tissue composite in the agent for a period of 3 to 5 hours.

The method of any one of claims 2 to 8, further comprising the step: d) contacting the separated epithelial cell layer with an agent dissolving the cell structure of the epithelial cell layer, so that isolated epithelial cells from the epithelial cell layer peel off.

The method of claim 9, wherein the cell assembly the epithelial cell layer dissolving Agent in step d) an enzyme or enzyme mixture selected from Trypsin, trypsin-like Enzymes and mixtures thereof.

The method of claim 9 or 10, wherein the contacting the epithelial cell layer with the cell dressing dissolving agent in step d) incubation of the epithelial cell layer in the agent via a Period is 4 to 6 min.

The method of any one of claims 2 to 11, further comprising the step: e) contacting the at least one further tissue layer of the residual tissue with a cell dressing dissolving agent, so that isolated tissue cells solve the at least one further layer of tissue from the residual tissue.

The method of claim 12, wherein the cell assembly the at least one further tissue layer-dissolving agent in step e) Enzyme or enzyme mixture selected from collagenase, collagenase-like Enzymes and mixtures thereof.

The method of claim 12 or 13, wherein the contacting the further tissue layer with the cell dressing dissolving agent in step e) an incubation of the at least one further tissue layer in the agent over a period of 1 to 8 hours.

Method according to one of the preceding claims, wherein the tissue association is a donor tissue from the human or animal Body is.

Method according to one of the preceding claims, wherein the tissue association is skin tissue.

Method according to one of the preceding claims, wherein the first layer of tissue is an epidermis layer and the ones to be isolated Epithelial keratinocytes are.

Method according to one of the preceding claims, wherein the further tissue layer is a dermis layer.

Method according to one of the preceding claims, wherein the cells of at least one further tissue layer fibroblasts are.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that in step a) avoids a knife-cutting action of the blade that will.

Device for destroying the integrity of a first cell layer in a tissue section of a tissue association by subjecting the tissue network to an abrupt force pulse (chipping), comprising: - on a base ( 40 ) Cross table-mounted carrier surface ( 10 ) for receiving the tissue piece with the first horizontal travel axis ( 42 ) and vertical second horizontal travel axis ( 44 ); - at the base ( 40 ) pivotally mounted blade lever ( 30 ) with at least one in the one to the carrier surface ( 10 ) end facing blade block ( 25 ), by pivoting the blade lever ( 30 ) on the support surface ( 10 ) lowerable blade ( 20 ); - with the blade lever ( 30 ) in drive connection ( 35 ) for abrupt lowering of the at least one blade ( 20 ) on one on the support surface ( 10 ) received tissue piece.

Apparatus according to claim 21, characterized in that the drive element ( 35 ) is a power drive, selected from pneumatic drive, hydraulic drive, piezoelectric drive and electromagnetic drive, is.

Apparatus according to claim 21 or 22, characterized in that in the blade block ( 25 ) several blades ( 20 ) are arranged.

Device according to one of claims 21 to 23, characterized in that the blade ( 20 ) substantially perpendicular to the support surface ( 10 ) is lowered.

Device according to one of claims 21 to 24, characterized in that at least at one point of the blade ( 20 ) over the blade lever ( 30 ) with the drive element ( 35 ) connecting action mechanism is provided an end stop, which by the lowering of the blade ( 20 ) on the support surface ( 10 ) Exerted stroke movement limited to the support surface.

Device according to one of claims 21 to 25, further comprising: - control unit, which with the drive element ( 35 ) and effectors of the horizontal XY axis ( 42 . 44 ) in order to control the displacement of the support surface ( 10 ) along the axes ( 42 . 44 ) in coordination with one of the blade ( 20 ) via the drive unit ( 35 ) executed lifting movement on the support surface ( 10 ).

Device according to claim 26, characterized in that the control unit is specially designed so that after each stroke movement of the blade ( 20 ) the support surface ( 10 ) in at least one of the horizontal axes ( 42 . 44 ) is gradually displaceable.

Arrangement for the automatic isolation of epithelial cells from a fabric association containing the components: - Medium to destroy of integrity the epithelial cell layer of the tissue composite by applying the Tissue bandages over a blade with an abrupt force pulse (hoes); - Medium for contacting the tissue composite with the split epithelial cell layer with a basal membrane dissolving Agent; and - Medium for separating the detached Epithelial cell layer of which the at least one further tissue layer containing residual tissue of the tissue association.

Arrangement according to claim 28, wherein the means for To destroy of integrity the epithelial cell layer of the tissue composite, the device according to one of claims 21 to 27 is.

Arrangement according to claim 28 or 29, further comprising: - Medium for separating fatty tissue from the donor tissue; - Medium to resuspend the isolated cells and to separate the Cells of any tissue residues present.