DE102009003780B4

DE102009003780B4 - Methanogenic microorganisms for the production of biogas

Info

Publication number: DE102009003780B4
Application number: DE102009003780.2A
Authority: DE
Inventors: Dr. Schmack Doris; Dr. Reuter Monika
Original assignee: Schmack Biogas GmbH
Current assignee: Schmack Biogas GmbH
Priority date: 2009-04-11
Filing date: 2009-04-11
Publication date: 2014-07-10
Anticipated expiration: 2029-04-12
Also published as: DE102009003780A1; WO2010115424A1

Abstract

Verfahren zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse in einem Fermentierungsreaktor, dadurch gekennzeichnet, dass der Biomasse ein Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum in Form einer Kultur von Mikroorganismen zugesetzt wird, wobei Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum zumindest 10–4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmachen.Process for generating biogas from biomass in a fermentation reactor, characterized in that a microorganism of the type Methanobacterium formicicum is added to the biomass in the form of a culture of microorganisms, microorganisms of the type Methanobacterium formicicum at least 10-4% of the total number of those present in the culture Identify microorganisms.

Description

Technisches Gebiet Technical area

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse unter Verwendung methanogener Mikroorganismens der Art Methanobacterium formicicum sowie methanogene Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum an sich. The invention relates to processes for the production of biogas from biomass using methanogenic microorganisms of the species Methanobacterium formicicum and methanogenic microorganisms of the species Methanobacterium formicicum per se.

Stand der Technik State of the art

Biogasanlagen erzeugen Methan durch einen mikrobiellen Abbauprozess von organischen Substanzen. Das Biogas entsteht dabei in einem mehrstufigen Prozess der Vergärung oder Faulung durch die Aktivität von anaeroben Mikroorganismen, d.h. unter Ausschluss von Luft. Biogas plants produce methane through a microbial decomposition process of organic substances. The biogas is produced in a multi-stage process of fermentation or digestion by the activity of anaerobic microorganisms, i. in the absence of air.

Das als Gärsubstrat verwendete organische Material besitzt aus chemischer Sicht einen hochmolekularen Aufbau, der in den einzelnen Verfahrensschritten einer Biogasanlage durch Stoffwechseltätigkeit der Mikroorganismen zu niedermolekularen Bausteinen abgebaut wird. Die bei der Fermentierung des organischen Gärsubstrats aktiven Populationen von Mikroorganismen sind bislang aber nur unzureichend charakterisiert. The organic material used as fermentation substrate has a high molecular structure from a chemical point of view, which is degraded in the individual process steps of a biogas plant by metabolic activity of microorganisms to low molecular weight building blocks. However, the populations of microorganisms which are active in the fermentation of the organic fermentation substrate have hitherto been insufficiently characterized.

Nach heutigem Kenntnisstand können vier nacheinander, aber auch parallel ablaufende und ineinander greifende biochemische Einzelprozesse unterschieden werden, die den Abbau von organischen Gärsubstraten zu den Endprodukten Methan und Kohlendioxid ermöglichen: Hydrolyse, Acidogenese, Acetogenese und Methanogenese. According to the current state of knowledge, it is possible to distinguish between four consecutive, but also parallel and interlocking biochemical single processes which enable the degradation of organic fermentation substrates to the end products methane and carbon dioxide: hydrolysis, acidogenesis, acetogenesis and methanogenesis.

In der Hydrolyse werden hochmolekulare, oft partikulär vorliegende, organische Verbindungen durch Exoenzyme (z.B. Cellulasen, Amylasen, Proteasen, Lipasen) fermentativer Bakterien in lösliche Spaltprodukte überführt. Dabei werden beispielsweise Fette in Fettsäuren, Kohlenhydrate, wie z.B. Polysaccharide, in Oligo- und Monosaccharide sowie Proteine in Oligopeptide beziehungsweise Aminosäuren zerlegt. Die daneben gebildeten gasförmigen Produkte bestehen überwiegend aus Kohlendioxid (CO₂). In hydrolysis, high molecular weight, often particulate, organic compounds are converted by exoenzymes (eg cellulases, amylases, proteases, lipases) fermentative bacteria into soluble fission products. For example, fats are broken down into fatty acids, carbohydrates, such as polysaccharides, into oligo- and monosaccharides and proteins into oligopeptides or amino acids. The gaseous products formed besides consist predominantly of carbon dioxide (CO ₂ ).

Fakultativ und obligat anaerob lebende Bakterien, oftmals identisch mit den hydrolysierenden Bakterien, verstoffwechseln in der Acidogenese die Hydrolyseprodukte (z.B. Mono-, Disaccharide, Di-, Oligopeptide, Aminosäuren, Glycerin, langkettige Fettsäuren) intrazellulär zu kurzkettigen Fett- oder Carbonsäuren, wie beispielsweise Butter-, Propion- und Essigsäure, zu kurzkettigen Alkoholen wie zum Beispiel Ethanol und zu den gasförmigen Produkten Wasserstoff und Kohlendioxid. Optional and obligate anaerobic bacteria, often identical to the hydrolyzing bacteria, metabolize in acidification the hydrolysis products (eg mono-, disaccharides, di-, oligopeptides, amino acids, glycerol, long-chain fatty acids) intracellularly to short chain fatty or carboxylic acids such as butter -, propionic and acetic acid, to short-chain alcohols such as ethanol and the gaseous products hydrogen and carbon dioxide.

In der sich anschließenden Acetogenese werden die in der Acidogenese gebildeten kurzkettigen Fett- und Carbonsäuren sowie die kurzkettigen Alkohole von acetogenen Bakterien aufgenommen und nach β-Oxidation als Essigsäure wieder ausgeschieden. Nebenprodukte der Acetogenese sind CO₂ und molekularer Wasserstoff (H₂). In the subsequent acetogenesis, the short-chain fatty acids and carboxylic acids formed in acidogenesis and the short-chain alcohols are taken up by acetogenic bacteria and excreted again as β-oxidation as acetic acid. By-products of acetogenesis are CO ₂ and molecular hydrogen (H ₂ ).

Die Produkte der Acetogenese wie Essigsäure aber auch andere Substrate wie Methanol und Formiat werden durch Methan-bildende Organismen in der obligat anaerob verlaufenden Methanogenese zu Methan und CO₂ umgesetzt. Das hier entstehende CO₂ und auch das während der übrigen Prozessschritte, wie z.B. der Hydrolyse, gebildete CO₂ kann wiederum durch Mikroorganismen mit dem angefallenen H₂ ebenfalls zu Methan umgesetzt werden. The products of acetogenesis such as acetic acid but also other substrates such as methanol and formate are converted by methane-forming organisms in the obligate anaerobic methanogenesis to methane and CO ₂ . The resulting here CO ₂ and also during the other process steps such as hydrolysis, CO ₂ formed in turn can also be converted by microorganisms with the incurred H ₂ to methane.

Die Erhöhung der Ausbeute an Endprodukten aus einer gegebenen Menge an Edukten stellt wie bei jeder chemischen Umsetzung auch im Fall der Herstellung von Biogas ein vordringliches Ziel der Prozessführung dar. Für die Erzeugung von Biogas aus Biomasse bedeutet dies, dass aus einer gegebenen Menge an organischem Gärsubstrat eine möglichst große Menge an Methan gebildet werden soll. Die durchschnittlich gebildeten Methanmengen (Methanproduktivität in Normkubikmeter pro m³ Arbeitsvolumen und Tag) von Biogasanlagen liegen zwischen 0,25 und 1,1 Nm³CH₄/m³d, wobei die meisten Anlagen eine Methanproduktivität im Bereich von 0,50 bis 0,75 Nm³CH₄/m³d aufweisen (aus „Ergebnisse des Biogas-Messprogramms“, 2005, Hrsgb. Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V., Gülzow). Substratspezifische Methanausbeuten (angegeben in Normkubikmeter pro Tonne zugeführtes Substrat) weisen einen sehr großen Wertebereich zwischen etwa 16 und 206 Nm³CH₄/t auf, da die Substrate, mit denen Biogasanlagen betrieben werden, sehr unterschiedlich sind (z.B. Gülle oder tierische Exkremente, Abfälle aus der Lebensmittelproduktion oder Grünabfall, nachwachsende Rohstoffe wie Silomais oder Zuckerrübenschnitzel) und damit einhergehend sehr unterschiedliche Energiegehalte aufweisen (aus „Ergebnisse des Biogas-Messprogramms“, 2005, Hrsgb. Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V., Gülzow). Daneben spielen für die substratspezifischen Methanausbeuten anlagenspezifische Parameter wie die Raumbelastung oder die hydraulische Verweilzeit eine Rolle. Increasing the yield of end products from a given amount of starting materials, as in any chemical reaction, is an urgent goal of process control even in the case of biogas production. For biogas production from biomass, this means that from a given amount of organic fermentation substrate a large amount of methane should be formed. The average amount of methane produced (methane productivity in standard cubic meters per m ³ working volume and day) of biogas plants is between 0.25 and 1.1 Nm ³ CH ₄ / m ³ d, with most plants having a methane productivity in the range from 0.50 to 0, 75 Nm ³ CH ₄ / m ³ d (from "Results of the Biogas Measurement Program", 2005, Hrsgb. Agency for Renewable Resources, Gülzow). Substrate-specific methane yields (expressed in standard cubic meters per ton of substrate supplied) have a very large range of values between about 16 and 206 Nm ³ CH ₄ / t, since the substrates used to operate biogas plants are very different (eg manure or animal excreta, waste from food production or green waste, renewable raw materials such as silage maize or sugar beet pulp) and consequently have very different energy contents (from "Results of the Biogas Measurement Program", 2005, Hrsgb. Agency of Renewable Resources eV, Gülzow). In addition, plant-specific parameters such as the space load or the hydraulic residence time play a role in the substrate-specific methane yields.

In der Regel soll eine möglichst hohe Raumbelastung der Fermenter erreicht werden. Die durchschnittlichen Raumbelastungen (angegeben in kg organischer Trockensubstanz pro Kubikmeter und Tag), unter denen Biogasanlagen betrieben werden, liegen bei 1 bis 3 kg oTR/m³d, wobei einstufige Anlagen in der Regel höhere Raumbelastungen aufweisen als mehrstufige Anlagen und eine Raumbelastung von 5,7 kg oTR/m³d der höchste Wert war, der gemessen wurde (aus „Ergebnisse des Biogas-Messprogramms“, 2005, Hrsgb. Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V., Gülzow). As a rule, the highest possible volume loading of the fermenter should be achieved. The average room loads (expressed in kg of dry matter per cubic meter per day), under which biogas plants are operated, are 1 to 3 kg oTR / m ³ d, whereby single-stage plants usually have higher room loads than multistage systems and a room load of 5 , 7 kg oTR / m ³ d was the highest value that was measured (from "Results of the Biogas Measurement Program", 2005, Hrsgb. Agency for Renewable Resources, Gülzow).

Unter der Raumbelastung eines Fermenters versteht man die Menge an dem Fermenter zugeführten Substrat, die in Kilogramm organischer Trockensubstanz pro Kubikmeter Fermentervolumen und pro Tag angegeben wird. Die Menge an erzeugtem Biogas hängt stark von der Raumbelastung des Fermenters ab, wobei mit steigender Raumbelastung eine zunehmend größere Menge an Biogas erzeugt wird. Eine hohe Raumbelastung macht den Prozess der Biogaserzeugung also zunehmend ökonomisch rentabler, führt andererseits aber zu einer zunehmenden Destabilisierung der biologischen Prozesse der Fermentierung. The volume loading of a fermenter is the amount of substrate fed to the fermenter, expressed in kilograms of dry organic matter per cubic meter of fermenter volume and per day. The amount of biogas produced depends strongly on the volume load of the fermenter, with increasing space load an increasingly larger amount of biogas is generated. A high space load makes the process of biogas production increasingly economically viable, but on the other hand leads to an increasing destabilization of the biological processes of fermentation.

Es besteht weiterhin ein Bedarf an Verfahren zur Erzeugung von Biogas, die eine gegenüber dem Stand der Technik erhöhte Ausbeute an Methan ermöglichen. There continues to be a need for methods for producing biogas which enable a higher yield of methane over the prior art.

Definitionen definitions

Unter dem Begriff „Biogas“ wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung das gasförmige Produkt des anaeroben biologischen Abbaus organischer Substrate verstanden. Es enthält in der Regel ca. 45–70 % Methan, 30–55 % Kohlendioxid, sowie geringe Mengen an Stickstoff, Schwefelwasserstoff und anderen Gasen. The term "biogas" is understood in the context of the present invention, the gaseous product of the anaerobic biodegradation of organic substrates. It usually contains about 45-70% methane, 30-55% carbon dioxide, as well as small amounts of nitrogen, hydrogen sulfide and other gases.

Die Begriffe „Fermentation“ oder „Fermentierung“ umfassen im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl anaerobe wie auch aerobe Stoffwechselprozesse, die unter Einwirkung von Mikroorganismen in einem technischen Prozess aus dem zugeführten Substrat zur Erzeugung eines Produktes, z.B. Biogas führen. Eine Abgrenzung zu dem Begriff „Gärung“ ist insofern gegeben, dass es sich bei diesem ausschließlich um annaerobe Prozesse handelt. The terms "fermentation" or "fermentation" in the context of the present invention include both anaerobic and aerobic metabolic processes which, under the action of microorganisms in a technical process from the supplied substrate to produce a product, e.g. Lead biogas. A differentiation from the term "fermentation" is given insofar as it is exclusively an annaerobic process.

Unter einem „Fermenter“ wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Behälter verstanden, in dem der mikrobiologische Abbau des Substrates bei gleichzeitiger Biogasbildung stattfindet. Die Begriffe „Reaktor“, „Gärbehälter“ und „Faulbehälter“ werden synonym verwendet. In the context of the present invention, a "fermenter" is understood to mean the container in which the microbiological degradation of the substrate takes place with simultaneous formation of biogas. The terms "reactor", "fermentor" and "digester" are used interchangeably.

Unter den Begriffen „Gärsubstrat“ oder „Substrat“ wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung organisches und biologisch abbaubares Material verstanden, das dem Fermenter zur Fermentation zugesetzt wird. Substrate können nachwachsende Rohstoffe, Wirtschaftsdünger, Substrate aus der weiterverarbeitenden Agrarindustrie, organische kommunale Reststoffe, Schlachtrückstände oder Grünschnitt sein. Beispiele für obengenannte Substrate sind Maissilage, Roggensilage, Zuckerrübenschnitzel, Melasse, Grassilage, Rinder- oder Schweinegülle, Rinder-, Schweine-, Hühner- oder Pferdemist, Biertreber, Apfel-, Obst- oder Rebentrester, Getreide-, Kartoffel- oder Obstschlempe. Organischer Abfall aus Biotonne, Speisereste, Marktabfälle, Fett aus Fettabscheidern, Panseninhalt, Schweinemageninhalt. The term "fermentation substrate" or "substrate" in the context of the present invention means organic and biodegradable material which is added to the fermenter for fermentation. Substrates can be renewable raw materials, farm fertilizers, substrates from the processing agricultural industry, organic municipal residues, slaughter residues or green waste. Examples of the above-mentioned substrates are maize silage, rye silage, sugar beet pulp, molasses, grass silage, cattle or pig manure, cattle, pork, chicken or horse dung, spent grains, apple, fruit or vine pomace, cereal, potato or fruit vat. Organic waste from bio-waste, leftovers, market wastes, grease from fat separators, rumen contents, pig stomach content.

Unter dem Begriff „Gärrückstand“ oder „Gärgut“ wird der Rückstand der Biogasgewinnung verstanden der den Fermenter verlässt und häufig in einem eigenen Behälter gelagert wird. The term "fermentation residue" or "digestate" is understood to be the residue of the biogas production leaving the fermenter and often stored in its own container.

Unter „Raumbelastung“ wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die pro Tag und Kubikmeter (m³) Arbeitsvolumen dem Fermenter zugeführte Menge an organischer Trockensubstanz (oTS) in kg angegeben. In the context of the present invention, "volume loading" is the amount of organic dry matter (oTS) supplied to the fermenter per day and cubic meter (m ³ ) working volume in kg.

Unter „organischer Trockensubstanz“ (oTS) wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der wasserfreie organische Anteil eines Stoffgemisches nach Entfernung der anorganischen Anteile und Trocknung bei 105 °C verstanden. In der Regel wird der Trockensubstanzanteil in % vom Substrat angegeben. In the context of the present invention, "dry organic substance" (OTS) is understood as meaning the anhydrous organic fraction of a substance mixture after removal of the inorganic constituents and drying at 105.degree. As a rule, the dry matter content in% is specified by the substrate.

Unter dem Begriff „Verweilzeit“ wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die durchschnittliche Aufenthaltszeit des Substrates im Fermenter verstanden. In the context of the present invention, the term "residence time" is understood to mean the average residence time of the substrate in the fermenter.

Unter dem Begriff „spezifische Biogasausbeute“ oder „spezifische Methanausbeute“ wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Menge an erzeugtem Biogas oder Methan (angegeben in Normkubikmeter Nm³ erzeugtem Gas) dividiert durch die Menge (in der Regel pro Tonne t) an eingesetzter organischer Trockensubstanz oder Substrat verstanden. In the context of the present invention, the term "specific biogas yield" or "specific methane yield" means the amount of biogas or methane produced (expressed in standard cubic meters Nm ³ gas produced) divided by the amount (usually per tonne) of the organic dry substance or substrate used.

Von dem Begriff „Nukleotidsequenz“ wird sowohl die DNA-Sequenz als auch die korrespondierende RNA-Sequenz umfasst. In der Erfindung angegebene RNA-Sequenzen unter der Verwendung der Basen A, U, C, G beziehen sich beispielsweise ebenso auf die korrespondierenden DNA-Sequenzen unter Verwendung der Basen A, T, C, G und umgekehrt. The term "nucleotide sequence" encompasses both the DNA sequence and the corresponding RNA sequence. For example, RNA sequences given in the invention using bases A, U, C, G also refer to the corresponding DNA sequences using bases A, T, C, G and vice versa.

Die Bestimmung der Nukleotid-Sequenz eines Mikroorganismus erfolgt mit Hilfe eines standardisierten Prozesses, durch den die einzelnen Nukleotide der DNA oder RNA des Mikroorganismus mit hoher Genauigkeit nachgewiesen werden können. Trotz der hohen Genauigkeit der Sequenzierungsverfahren können in einer Sequenz immer wieder einzelne Positionen vorliegen, für die die Bestimmung des an der jeweiligen Position vorliegenden Nukleotids nicht mit hinreichender Genauigkeit möglich war. In solchen Fällen ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung in der Nukelotidsequenz der Buchstabe „N“ angegeben. Wird nachfolgend in einer Nukelotidsequenz der Buchstabe „N“ verwendet, so steht dies als Kürzel für jedes denkbare Nukleotid, also für A, U, G oder C im Falle einer Ribonukleinsäure oder für A, T, G oder C im Falle einer Desoxyribonukleinsäure. The determination of the nucleotide sequence of a microorganism by means of a standardized process by which the individual nucleotides of the DNA or RNA of the microorganism can be detected with high accuracy. In spite of the high accuracy of the sequencing methods, individual positions can repeatedly be present in a sequence for which the determination of the nucleotide present at the respective position was not possible with sufficient accuracy. In such cases, the letter "N" is indicated in the nucleotide sequence in the context of the present invention. If the letter "N" is subsequently used in a nucleotide sequence, this stands for an abbreviation for any conceivable nucleotide, ie for A, U, G or C in the case of a ribonucleic acid or for A, T, G or C in the case of a deoxyribonucleic acid.

Der Begriff „Nukleotidmutation“ wie hier verwendet bedeutet eine Veränderung der Ausgangsnukleotidsequenz. Dabei können einzelne Nukleotide oder mehrere, direkt aufeinander folgende oder durch nicht veränderte Nukleotide unterbrochene Nukleotidsequenzen entfernt (Deletion), hinzugefügt (Insertion oder Addition) oder durch andere ersetzt (Substitution) werden. Der Begriff schließt auch jede mögliche Kombination der einzelnen genannten Veränderungen ein. The term "nucleotide mutation" as used herein means a change in the starting nucleotide sequence. In this case, individual nucleotides or a plurality of nucleotide sequences which are directly following one another or which are interrupted by unchanged nucleotides can be removed (deletion), added (insertion or addition) or replaced by others (substitution). The term also includes any combination of individual variations called.

Der Begriff „Deletion“ wie hier verwendet bedeutet das Entfernen von 1, 2 oder mehr Nukleotiden aus der jeweiligen Ausgangssequenz. The term "deletion" as used herein means the removal of 1, 2 or more nucleotides from the respective starting sequence.

Der Begriff „Insertion“ oder „Addition“ wie hier verwendet bedeutet das Hinzufügen von 1, 2 oder mehr Nukleotiden zu der jeweiligen Ausgangssequenz. The term "insertion" or "addition" as used herein means the addition of 1, 2 or more nucleotides to the respective starting sequence.

Der Begriff „Substitution“ wie hier verwendet bedeutet den Austausch eines an einer bestimmten Position vorhandenen Nukleotids durch einen anderes. The term "substitution" as used herein means the replacement of a nucleotide present at a particular position by another.

Unter dem Begriff „Mikroorganismus“ werden mikroskopisch kleine Lebewesen verstanden, die in der Regel Einzeller sind, aber auch Mehrzeller sein können. Beispiele für Mikroorganismen sind Bakterien, mikroskopische Algen, Pilze oder Protozoen. The term "microorganism" is understood microscopically small organisms, which are usually single-celled, but can also be multicellular. Examples of microorganisms are bacteria, microscopic algae, fungi or protozoa.

Unter den Bezeichnungen „Gattung“ von Mikroorganismen, „Art“ von Mikroorganismen und „Stamm“ von Mikroorganismen wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die entsprechende grundlegende Kategorie der biologischen Taxonomie, insbesondere der phylogenetischen Klassifikation verstanden. Gattungen, Arten und Stämme von Mikroorganismen werden u.a. anhand ihrer RNA-Sequenzen identifiziert und unterschieden. Unter eine bestimmte Gattung, eine bestimmte Art bzw. einen bestimmten Stamm fallen dabei nicht nur Mikroorganismen mit einer ganz bestimmten RNA-Sequenz, sondern auch bis zu einem gewissen Umfang deren genetische Varianten, wobei die genetische Varianz in der Reihe Stamm, Art, Gattung zunimmt. The terms "genus" of microorganisms, "type" of microorganisms and "strain" of microorganisms in the context of the present invention, the corresponding basic category of biological taxonomy, in particular the phylogenetic classification understood. Genera, species and strains of microorganisms are described i.a. identified and distinguished by their RNA sequences. Among a certain genus, a certain species or a particular strain fall not only microorganisms with a very specific RNA sequence, but also to a certain extent their genetic variants, the genetic variance in the series strain, species, genus increases ,

Die Definition einer „Art“ eines Bakteriens befindet sich im wissenschaftlichen Wandel und ist weder abgeschlossen noch sind die verschiedenen Konzepte unumstritten. In der vorliegenden Erfindung wird unter „Art“ das Artkonzept verstanden, das sich auf genomische und phylogenetische Analysen bezieht und in dem Review von Staley (Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 2006, 361, 1899–1909) beschrieben ist. Weitestgehend anerkannt ist, dass zwei bakterielle Spezies, die mehr als 70 % DNA-DNA-Hydridisierung oder mehr als 94 % durchschnittliche Nukleotididentität (ANI, average nucleotide identity) aufweisen, derselben Art angehören bzw. zwei Spezies, die weniger als 97 % Identität der 16S rRNA aufweisen, zwei unterschiedlichen Arten zuzuordnen sind. The definition of a "species" of a bacterium is undergoing scientific change and is neither complete nor are the various concepts uncontroversial. In the present invention, "species" is understood to be the species concept related to genomic and phylogenetic analyzes and reviewed in the review by Staley (Philos, Trans. R. Soc., Lond., B. Biol. Sci., 2006, 361, 1899 -1909). It is widely recognized that two bacterial species having more than 70% DNA-DNA hydride or more than 94% average nucleotide identity (ANI) belong to the same species, respectively two species having less than 97% identity 16S rRNA, are assigned to two different types.

Unter dem Begriff „Kultur“ versteht sich in diesem Zusammenhang eine Ansammlung von Mikroorganismen unter geschaffenen Bedingungen, die das Wachstum oder zumindest das Überleben der Mikroorganismen gewährleisten. Für Bakterien sind das z.B. Anreicherungskulturen oder Reinkulturen, Flüssigkulturen ebenso wie Kulturen auf festen Medien wie Nährböden, aber auch Dauerkulturen wie tiefgekühlte Glycerinkulturen, immobilisierte Kulturen wie z.B. Gelkulturen oder hochkonzentrierte Kulturen wie Zellpellets. The term "culture" in this context means an accumulation of microorganisms under conditions created that ensure the growth or at least the survival of the microorganisms. For bacteria, e.g. Enrichment cultures or pure cultures, liquid cultures as well as cultures on solid media such as culture media, but also permanent crops such as frozen glycerol cultures, immobilized cultures such. Gel cultures or highly concentrated cultures such as cell pellets.

Unter dem Begriff „Reinkultur“ eines Mikroorganismus wird die Nachkommenschaft einer einzelnen Zelle verstanden. Diese wird durch einen mehrstufigen Prozess aus einem Gemisch verschiedener Mikroorganismen isoliert. Der mehrstufige Prozess umfasst die Abtrennung einer einzelnen Zelle aus einer Zellpopulation und erfordert, dass auch die aus der Zelle durch Wachstum und Zellteilung hervorgehende Kolonie von anderen Einzelzellen oder Kolonien getrennt bleibt. Durch eine sorgfältige Abtrennung einer Kolonie, erneutes Suspendieren in Flüssigkeit und wiederholtes Ausstreichen können gezielt Reinkulturen von Mikroorganismen gewonnen werden. Die Isolierung einer Reinkultur kann auch in flüssigen Nährmedien erfolgen, sofern der gewünschte Organismus im Ausgangsmaterial zahlenmäßig überwiegt. Durch serienmäßige Verdünnung der Suspension in der Nährlösung lässt es sich schließlich erreichen, dass sich in der letzten Verdünnungsstufe nur noch eine Zelle befindet. Diese Zelle stellt dann die Basis für eine Reinkultur dar. Die Erläuterung des Begriffs „Reinkultur" und Verfahren zur Erzeugung derselben sind in „Allgemeine Mikrobiologie“ von Hans G. Schlegel, 7. überarbeitete Auflage, 1992, Georg Thieme Verlag, S. 205 aufgeführt, worauf hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird. The term "pure culture" of a microorganism is understood to mean the progeny of a single cell. This is isolated by a multi-step process from a mixture of different microorganisms. The multi-step process involves the separation of a single cell from a cell population and requires that the colony resulting from the cell through growth and cell division also remain separate from other single cells or colonies. By careful separation of a colony, resuspension in liquid and repeated spreading, pure cultures of microorganisms can be selectively obtained. The isolation of a pure culture can also be carried out in liquid nutrient media, provided that the desired organism outnumbered in the starting material. By serial dilution of the suspension in the nutrient solution, it can finally be achieved that only one cell remains in the last dilution stage. This cell then provides the basis for a pure culture. The explanation of the term "pure culture" and methods for producing the same are given in "General Microbiology" by Hans G. Schlegel, 7th revised edition, 1992, Georg Thieme Verlag, p , which is hereby incorporated by reference.

Unter dem Begriff „Mischkultur“ wird ein Gemisch verschiedener Mikroorganismen verstanden. Natürliche Populationen von Mikroorganismen sind in der Regel Mischkulturen. Mischkulturen können jedoch auch künstlich hergestellt werden z.B. durch die Vereinigung von mehreren Reinkulturen. The term "mixed culture" is understood to mean a mixture of different microorganisms. Natural populations of microorganisms are usually mixed cultures. However, mixed cultures can also be prepared artificially, e.g. through the union of several pure cultures.

Darstellung der Erfindung Presentation of the invention

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Erzeugung von Biogas bereitzustellen, das eine gegenüber dem Stand der Technik erhöhte Ausbeute an Methan ermöglicht. The object of the invention is to provide a process for the production of biogas, which allows an increased compared to the prior art yield of methane.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren zur Erzeugung von Biogas gemäß Anspruch 1 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung und den Beispielen. This object is achieved by the method for producing biogas according to claim 1. Further advantageous details, aspects and embodiments of the present invention will become apparent from the dependent claims, the description and the examples.

Die Frage, ob die Erzeugung von Biogas in einem bestimmten Fermenter unter bestimmten Bedingungen in einer befriedigenden Güte abläuft, lässt sich nicht alleine anhand der absoluten Menge an erzeugtem Biogas beurteilen. Die Menge an erzeugtem Biogas hängt stark von der Menge an zugeführtem Substrat ab, vor allem von der Menge an organischer Trockensubstanz, die in den Fermenter eingebracht wird. Dies drückt sich in den Messparametern „Raumbelastung“ und „spezifische Gasausbeute“ aus, die somit eine besondere Bedeutung für die Effizienz einer Anlage darstellen. Treten Instabilitäten des Fermentierungsprozesses auf, wie z.B. ein Absinken des pH-Wertes, ein starker Anstieg der Bildung von flüchtigen Fettsäuren oder die Akkumulation von Hemmstoffen wie z.B. Ammoniak oder Schwefelwasserstoff, so nimmt die spezifische Gasausbeute ab. The question of whether the production of biogas in a given fermenter under certain conditions is satisfactory, can not be judged solely on the basis of the absolute amount of biogas produced. The amount of biogas produced depends strongly on the amount of substrate supplied, especially on the amount of organic dry matter that is introduced into the fermenter. This is reflected in the measuring parameters "room load" and "specific gas yield", which are thus of particular importance for the efficiency of a system. If instabilities of the fermentation process occur, e.g. a decrease in pH, a sharp increase in the formation of volatile fatty acids or the accumulation of inhibitors such as e.g. Ammonia or hydrogen sulfide, the specific gas yield decreases.

Die Zusammensetzung der mikrobiellen Populationen in den verschiedenen Gärsubstraten sowie die Entwicklung der Organismenzusammensetzung während des Fermentationsprozesses ist größtenteils unbekannt, jedoch sehr variabel und unterliegt einem komplizierten dynamischen Prozeß, der auch durch die jeweiligen Prozessbedingungen beeinflusst wird. Zur Bestimmung der mikrobiellen Zusammensetzung sowie der Gesamtzahl von Mikroorganismen in einem Gärsubstrat wie auch der Bestimmung der Anteile verschiedener Arten von Mikroorganismen in dem Gärsubstrat sind dem Fachmann verschiedene Methoden bekannt, die beispielsweise in dem Überblicksartikel von Amann et al. (Microbiol. Review. 59, 143–169, 1995) beschrieben sind. Eine bevorzugte Methode zur Bestimmung der Mikroorganismenzusammensetzung unabhängig von einer vorherigen Kultivierung der Mikroorganismen ist zum Beispiel die Erstellung einer rDNA Klonbibliothek (z.B. auf der Basis von 16S rRNA) nach Nukleinsäureextraktion und PCR, die anschließend sequenziert werden kann. Mit Hilfe dieser Klonbibliothek kann beispielsweise durch in situ Hybridisierung mit spezifischen Fluoreszenz-markierten Oligonukleotidsonden die Zusammensetzung der mikrobiellen Population im Gärsubstrat ermittelt werden. Geeignete rRNA-basierende Oligonukleotidsonden sind aus dem oben erwähnten Review bekannt oder können beispielsweise mittels probeBase (Loy et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31, 514–516. Loy et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: D800–D804) oder dem ARB Programmpaket (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363–1371) gefunden werden. Eine quantitative Bestimmung des Anteils einzelner Mikroorganismen an der Gesamtpopulation kann in geeigneter Weise mit den Methoden quantitativer Dot Blot, in situ Hybridisierung oder der Hybridisierung von ganzen Zellen (whole cell hybrisization) durchgeführt werden. The composition of the microbial populations in the various fermentation substrates as well as the development of the organism composition during the fermentation process is largely unknown, but very variable and subject to a complicated dynamic process, which is also influenced by the respective process conditions. To determine the microbial composition and the total number of microorganisms in a fermentation substrate as well as the determination of the proportions of various types of microorganisms in the fermentation substrate, various methods are known to those skilled in the art, for example, in the review article by Amann et al. (Microbiol. Review., 59, 143-169, 1995). For example, a preferred method of determining the microorganism composition independent of prior culture of the microorganisms is to construct a rDNA clone library (e.g., based on 16S rRNA) after nucleic acid extraction and PCR, which can then be sequenced. Using this clone library, the composition of the microbial population in the fermentation substrate can be determined, for example, by in situ hybridization with specific fluorescence-labeled oligonucleotide probes. Suitable rRNA-based oligonucleotide probes are known from the review mentioned above or may be prepared, for example, by probe base (Loy et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31, 514-516, Loy et al., 2007 Nucleic Acids Res. 35: D800. D804) or the ARB program package (Ludwig et al., Nucleic Acids Research., 2004, 32, 1363-1371). A quantitative determination of the proportion of individual microorganisms in the total population can be carried out in a suitable manner with the methods of quantitative dot blot, in situ hybridization or whole cell hybridization.

Sämtliche nachfolgend beschriebenen, in einem Verfahren zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse zugesetzten Mikroorganismen werden bevorzugt in Form einer angereicherten Kultur dem Fermenter zugesetzt. Die Zugabe der Bakterienkultur kann in Form einer flüssigen Kultursuspension, bevorzugt in einem Anreicherungs- oder Selektionsmedium oder in Form trockener, gefriergetrockneter oder feuchter Zellpellets vorgenommen werden. Für methanogene Mikroorganismen liegen die Zellkonzentrationen, die in angereicherten Kulturen erreicht werden, in einem Konzentrationsbereich von ca. 10⁶ Zellen pro ml Kultur bis etwa 10¹³ Zellen pro ml Kultur. All of the microorganisms described below, added from a biomass in a process for producing biogas, are preferably added to the fermenter in the form of an enriched culture. The addition of the bacterial culture may take the form of a liquid culture suspension, preferably in an enrichment or selection medium or in the form of dry, freeze-dried or moist cell pellets be made. For methanogenic microorganisms, the cell concentrations achieved in enriched cultures are in a concentration range of about 10 ⁶ cells per ml of culture to about 10 ¹³ cells per ml of culture.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist auch eine immobilisierte Kultur von Mikroorganismen. Für sämtliche nachfolgend beschriebenen Mikroorganismen können als Trägermaterialien, auf denen der jeweilige Mikroorganismus immobilisiert wird, natürliche oder synthetische Polymere eingesetzt werden. Bevorzugt werden gelbildende Polymere verwendet. Diese haben den Vorteil, dass Bakterien innerhalb der Gelstruktur aufgenommen bzw. eingelagert werden können. Bevorzugt werden solche Materialien eingesetzt, die sich in Wasser langsam auflösen bzw. abgebaut werden, so dass die Freisetzung des jeweiligen Mikroorganismus über einen längeren Zeitraum hinweg erfolgt. A preferred embodiment is also an immobilized culture of microorganisms. For all microorganisms described below, natural or synthetic polymers can be used as carrier materials on which the particular microorganism is immobilized. Gel-forming polymers are preferably used. These have the advantage that bacteria can be taken up or stored within the gel structure. Preferably, those materials are used which dissolve slowly in water or are degraded, so that the release of the respective microorganism takes place over a longer period of time.

Beispiele für geeignete Polymere sind Polyanillin, Polypyrrol, Polyvinylpyrolidon, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyvinylalkohol, Polyethylen, Polypropylen, Epoxidharze, Polyethylenimine, Polysaccharide wie Agarose, Alginat oder Cellulose, Ethylcellulose, Methylcellulose, Carboxymethylethylcellulose, Celluloseacetate, Alkali-Cellulosesulfat, Copolymere aus Polystyrol und Maleinsäureanhydrid, Copolymere aus Styrol und Methylmethacrylat, Polystyrolsulfonat, Polyacrylate und Polymethacrylate, Polycarbonate, Polyester, Silikone, Cellulosephthalat, Proteine wie Gelatine, Gummi arabicum, Albumin oder Fibrinogen, Gemische aus Gelatine und Wasserglas, Gelatine und Polyphosphat, Gelatine und Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Methylvinylether, Celluloseacetatbutyrat, Chitosan, Polydialkyldimethylammoniumchlorid, Mischungen aus Polyacrylsäuren und Polydiallyldimethylammoniumchlorid sowie deren Gemische. Das Polymermaterial kann auch mit Hilfe üblicher Vernetzer wie Glutaraldehyd, Harnstoff/Formaldehydharzen oder Taninverbindungen vernetzt werden. Examples of suitable polymers are polyaniline, polypyrrole, polyvinylpyrrolidone, polystyrene, polyvinyl chloride, polyvinyl alcohol, polyethylene, polypropylene, epoxy resins, polyethyleneimines, polysaccharides such as agarose, alginate or cellulose, ethylcellulose, methylcellulose, carboxymethylethylcellulose, cellulose acetates, alkali cellulose sulfate, copolymers of polystyrene and maleic anhydride , Copolymers of styrene and methyl methacrylate, polystyrenesulfonate, polyacrylates and polymethacrylates, polycarbonates, polyesters, silicones, cellulose phthalate, proteins such as gelatin, gum arabic, albumin or fibrinogen, mixtures of gelatin and water glass, gelatin and polyphosphate, gelatin and copolymers of maleic anhydride and methyl vinyl ether, Cellulose acetate butyrate, chitosan, polydialkyldimethylammonium chloride, mixtures of polyacrylic acids and polydiallyldimethylammonium chloride and mixtures thereof. The polymer material can also be crosslinked using conventional crosslinkers such as glutaraldehyde, urea / formaldehyde resins or tannin compounds.

Alginate als Immobilisate erweisen sich als besonders vorteilhaft, da sie zum einen keinen negativen Einfluss auf die Aktivität der Mikroorganismen nehmen und da sie zum anderen durch Mikroorganismen langsam abgebaut werden. Durch den langsamen Abbau der Alginat-Immobilisate werden nach und nach die eingeschlossenen Mikroorganismen freigesetzt. Alginates as Immobilisate prove to be particularly advantageous because they do not have a negative influence on the activity of the microorganisms and because they are slowly degraded by other microorganisms. Due to the slow degradation of the alginate immobilizates, the trapped microorganisms are gradually released.

Für die Immobilisation werden die Mikroorganismen mit einem Polymergel vermengt und dann in einer geeigneten Härterlösung gehärtet. Dazu werden sie zunächst mit einer Gellösung vermischt und anschließend in eine Härterlösung aus geeigneter Höhe getropft. Die genauen Vorgehensweisen zur Immobilisation sind dem Fachmann bekannt. For immobilization, the microorganisms are mixed with a polymer gel and then cured in a suitable hardener solution. For this they are first mixed with a gel solution and then dropped into a hardener solution of suitable height. The exact procedures for immobilization are known to the person skilled in the art.

Es hat sich gezeigt, dass die nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen Eigenschaften aufweisen, aufgrund derer sich der Zusatz der Mikroorganismen während einer Fermentation zur Erzeugung von Biogas positiv auf die erzeugte Menge an Biogas, insbesondere Biomethan auswirkt, was die Rentabilität der entsprechenden Anlagen signifikant erhöht. It has been shown that the microorganisms described in more detail below have properties, as a result of which the addition of the microorganisms during a fermentation to produce biogas has a positive effect on the amount of biogas produced, in particular biomethane, which significantly increases the profitability of the corresponding plants.

Grundsätzlich kann der Zusatz von hierfür geeigneten Mikroorganismen zu jedem beliebigen Zeitpunkt des Fermentationsprozesses erfolgen, insbesondere können die Mikroorganismen zum Animpfen von Gärsubstrat bei der erstmaligen Inbetriebnahme oder einer Wiederinbetriebnahme eines Fermenters verwendet werden. Es können sämtliche, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen zum Animpfen von Gärsubstrat verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen können in Form einer Kultur einmalig oder mehrmalig in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen, bevorzugt jedoch wöchentlich oder monatlich, besonders bevorzugt täglich oder zweimal pro Woche in einer geeigneten Konzentration und Menge zugegeben werden. Geeignete Konzentrationen an Mikroorganismen und zugegebenen Mengen werden in den speziellen Ausführungsbeispielen erläutert. In principle, the addition of microorganisms suitable for this purpose can take place at any desired point in time of the fermentation process; in particular, the microorganisms can be used to inoculate fermentation substrate during initial startup or restart of a fermenter. All of the microorganisms described in more detail below can be used to inoculate fermentation substrate. The microorganisms according to the invention may be added in the form of a culture once or several times at regular or irregular intervals, but preferably weekly or monthly, more preferably daily or twice weekly, in a suitable concentration and amount. Suitable concentrations of microorganisms and amounts added are explained in the specific embodiments.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Mikroorganismen auch bei Störungen des Fermentationsprozesses zur Stabilisierung der Fermentation zugegeben. Solche Störungen können durch Überwachung bestimmter charakteristischer Parameter der Fermentierung frühzeitig erkannt werden. Charakteristische Parameter geben Auskunft über die Qualität eines ablaufenden Fermentierungsprozesses zur Herstellung von Biogas. Solche charakteristischen Parameter sind nicht nur die Menge an erzeugtem Biogas und der Methangehalt des erzeugten Biogases sondern beispielsweise auch der Wasserstoffgehalt des erzeugten Biogases, der pH-Wert des Gärsubstrats, das Redoxpotential des Gärsubstrats, der Carbonsäuregehalt des Gärsubstrats, die Anteile verschiedener Carbonsäuren im Gärsubstrat, der Wasserstoffgehalt des Gärsubstrats, der Anteil der Trockensubstanz am Gärsubstrat, der Anteil der organischen Trockensubstanz am Gärsubstrat, die Viskosität des Gärsubstrats und die Raumbelastung des Fermentierungsreaktors. Es können sämtliche, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen bei Störungen des Fermentationsprozesses zur Stabilisierung der Fermentation zugegeben werden. In a preferred embodiment, the microorganisms are added even in case of disturbances of the fermentation process to stabilize the fermentation. Such disorders can be detected early by monitoring certain characteristic parameters of the fermentation. Characteristic parameters provide information about the quality of an ongoing fermentation process for the production of biogas. Such characteristic parameters are not only the amount of biogas produced and the methane content of the biogas produced but also, for example, the hydrogen content of the biogas produced, the pH of the fermentation substrate, the redox potential of the fermentation substrate, the carboxylic acid content of the fermentation substrate, the proportions of various carboxylic acids in the fermentation substrate, the hydrogen content of the fermentation substrate, the proportion of dry matter in the fermentation substrate, the proportion of the organic dry matter in the fermentation substrate, the viscosity of the fermentation substrate and the volume loading of the fermentation reactor. It can all, Microorganisms described in more detail below may be added in case of disturbances in the fermentation process to stabilize the fermentation.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird zeitnah zur Zugabe der nachfolgend beschriebenen Mikroorganismen zusätzliche Biomasse in den Fermentierungsreaktor gegeben. Eine zeitnahe Zugabe von zusätzlicher Biomasse kann innerhalb einer Zeitspanne von 1 Sekunde bis hin zu 3 Tagen nach Zugabe von Mikroorganismen erfolgen oder sie kann gleichzeitig mit der Zugabe von Mikroorganismen erfolgen. Dabei kann die Raumbelastung im Fermentationsreaktor durch kontinuierliche Zugabe von neuem Substrat kontinuierlich gesteigert oder in etwa konstant gehalten werden, wobei die Fermentierung bei allen Raumbelastungen, bevorzugt bei einer Raumbelastung von ≥ 0.5 kg organischer Trockensubstanz pro m³ und Tag [kg oTS/m³d], weiter bevorzugt bei einer Raumbelastung von ≥ 4.0 kg oTS/m³d und besonders bevorzugt bei einer Raumbelastung von ≥ 8.0 kg oTS/m³d durchgeführt werden kann, was im Vergleich zum gegenwärtigen Stand der Technik einer Erhöhung der durchschnittlichen Raumbelastung um mehr als das Doppelte entspricht. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird daher die Raumbelastung im Fermentierungsreaktor durch kontinuierliche Zugabe von Biomasse kontinuierlich gesteigert. According to a further preferred embodiment, additional biomass is added to the fermentation reactor in a timely manner to the addition of the microorganisms described below. Timely addition of additional biomass may occur within a period of 1 second to 3 days after addition of microorganisms, or it may occur simultaneously with the addition of microorganisms. In this case, the space load in the fermentation reactor can be continuously increased or kept approximately constant by continuous addition of new substrate, the fermentation at all room loads, preferably at a space load of ≥ 0.5 kg of organic dry matter per m ³ and day [kg oTS / m ³ d ], more preferably at a room load of ≥ 4.0 kg oTS / m ³ d and particularly preferably at a room load of ≥ 8.0 kg oTS / m ³ d can be performed, which in comparison to the current state of the art by increasing the average room load by more as double the equivalent. According to a further preferred embodiment, therefore, the space load in the fermentation reactor is continuously increased by the continuous addition of biomass.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Gärsubstrat und Mikroorganismen kontinuierlich zugegeben. Der kontinuierliche Betrieb eines Fermentationsreaktors soll bei einer stabilen mikrobiellen Biozönose zu einer kontinuierlichen Produktion von Biogas führen, wobei das Aussetzen der Substratzugabe zur Fermentation infolge einer Prozessstörung vermindert werden soll. Auch in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können alle, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen eingesetzt werden. According to another embodiment, fermentation substrate and microorganisms are added continuously. The continuous operation of a fermentation reactor should result in a stable microbial biocenosis to a continuous production of biogas, the exposure of the substrate addition to the fermentation should be reduced as a result of a process disturbance. In this embodiment of the present invention, all the microorganisms described in more detail below can be used.

Ebenfalls ist die Ausführung des Fermentationsverfahrens und der damit zusammenhängenden Prozesse auch in einem diskontinuierlichen Betrieb, beispielsweise „Batch“-Fermentierung denkbar. So kann dem Gärsubstrat gemäß einer weiteren Ausführungsform während der Fermentierung ein Mikroorganismus beispielsweise in regelmäßigen Abständen zugegeben werden. Die Zugabe des Mikroorganismus in regelmäßigen Abständen führt zu einer Steigerung der Lebendzellzahl und somit zu einem verbesserten Ablauf der Methanbildung. Auch in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können alle, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen eingesetzt werden. Likewise, the execution of the fermentation process and the processes associated therewith are also conceivable in a discontinuous operation, for example "batch" fermentation. Thus, according to a further embodiment, during fermentation, a fermentation microorganism may be added to the fermentation substrate at regular intervals, for example. The addition of the microorganism at regular intervals leads to an increase in the Lebendzellzahl and thus to an improved course of methane production. In this embodiment of the present invention, all the microorganisms described in more detail below can be used.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Erzeugung von Biogas aus Biomasse unter konstanter Durchmischung des Gärsubstrats. Durch die konstante Durchmischung des Gärsubstrats können die zugegebenen Kulturen von Mikroorganismen besser im Gärsubstrat verteilt werden. Außerdem kann das gebildete Biogas besser aus dem Fermentationsprozess abgeführt werden. Die genannten Vorteile stellen sich im Zusammenhang mit sämtlichen, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen ein. According to a further embodiment, the production of biogas from biomass takes place with constant mixing of the fermentation substrate. Due to the constant mixing of the fermentation substrate, the added cultures of microorganisms can be better distributed in the fermentation substrate. In addition, the biogas formed can be better removed from the fermentation process. The stated advantages arise in connection with all the microorganisms described in more detail below.

Die konstante Durchmischung des Gärsubstrats führt zudem zu einer gleichmäßigen Wärmeverteilung im Fermentationsreaktor. Messungen der Temperatur im Fermentationsreaktor, die in periodischen Abständen, aber auch kontinuierlich durchgeführt wurden, ergaben, dass das Gärsubstrat in einem Temperaturbereich von 20°C bis 80°C, bevorzugt bei etwa 35 °C bis 60 °C, besonders bevorzugt bei 40°C bis 50°C effizient fermentiert wird. Diese Temperaturbereiche werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung daher im Zusammenhang mit sämtlichen, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen bevorzugt. Neben der Hydrolyse erfolgt insbesondere die letzte Stufe des Fermentationsprozesses, nämlich die Bildung von Methan durch methanogene Mikroorganismen, besonders effizient bei erhöhten Temperaturen. Für mehrstufige Biogasanlagen ist es auch sinnvoll, die unterschiedlichen Reaktoren bei unterschiedlichen Temperaturen zu betreiben, z.B. die erste Stufe unter mesophilen Bedingungen und die nachgeordneten Stufen, insbesondere die Methanogenese, bei thermophilen Bedingungen. Geeignete Bedingungen hierfür sind aus dem Stand der Technik bekannt (z.B. DE 10 2005 012 367 A1 ). The constant mixing of the fermentation substrate also leads to a uniform heat distribution in the fermentation reactor. Measurements of the temperature in the fermentation reactor, which were carried out at periodic intervals, but also continuously, showed that the fermentation substrate in a temperature range of 20 ° C to 80 ° C, preferably at about 35 ° C to 60 ° C, particularly preferably at 40 ° C is efficiently fermented to 50 ° C. These temperature ranges are therefore preferred in the context of the present invention in connection with all the microorganisms described in more detail below. In addition to the hydrolysis, in particular the last stage of the fermentation process, namely the formation of methane by methanogenic microorganisms, particularly efficient at elevated temperatures. For multi-stage biogas plants, it is also useful to operate the different reactors at different temperatures, eg the first stage under mesophilic conditions and the downstream stages, especially methanogenesis, under thermophilic conditions. Suitable conditions for this are known from the prior art (eg DE 10 2005 012 367 A1 ).

Sämtliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind nicht auf einstufige Verfahren zur Herstellung von Biogas beschränkt. Der Einsatz sämtlicher, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen kann auch in zwei- oder mehrstufigen Verfahren erfolgen. All embodiments of the present invention are not limited to one-step processes for the production of biogas. The use of all microorganisms described in more detail below can also be carried out in two or more stages.

Es sei nochmals darauf hingewiesen, dass sämtliche, nachfolgend näher beschriebenen Mikroorganismen einzeln oder in beliebigen Kombinationen in allen, oben erläuterten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Die obigen Ausführungen beziehen sich also auf alle nachfolgenden Mikroorganismen. It should again be pointed out that all of the microorganisms described in detail below can be used individually or in any combination in all the embodiments of the present invention explained above. The above statements therefore relate to all subsequent microorganisms.

Methanobacterium formicicum Methanobacterium formicicum

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Biogas aus Biomasse in einem Fermentierungsreaktor zur Verfügung. Der Biomasse wird erfindungsgemäß ein Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum in Form einer Kultur von Mikroorganismen zugesetzt, wobei Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum zumindest 10^–4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmachen. The present invention provides a method for producing biogas from biomass in a fermentation reactor. According to the invention, the biomass is added to a microorganism of the species Methanobacterium formicicum in the form of a culture of microorganisms, with microorganisms of the species Methanobacterium formicicum accounting for at least 10 ^-4 % of the total number of microorganisms present in the culture.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass durch die Zugabe von Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum zum Gärsubstrat die Menge an gebildetem Biogas deutlich erhöht werden kann. Bei konstanter Raumbelastung bewirkt die Zugabe von Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum eine deutliche Erhöhung der Menge an gebildetem Biogas. Der Einsatz von Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum führt daher zu einer Verbesserung von Effizienz und Wirkungsgrad von Biogasanlagen. Surprisingly, it has been shown that the addition of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum to the fermentation substrate, the amount of biogas formed can be significantly increased. At constant volume loading, the addition of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum causes a significant increase in the amount of biogas produced. The use of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum therefore leads to an improvement in the efficiency and efficiency of biogas plants.

Dem einschlägigen Fachmann ist bekannt, welche Stämme von Mikroorganismen unter den Begriff „Art Methanobacterium formicicum“ fallen. Im Zusammenhang mit der Herstellung von Biogas durch Fermentation organischer Substrate sind Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum bisher nicht bekannt. The person skilled in the art knows which strains of microorganisms fall under the term "species Methanobacterium formicicum". In connection with the production of biogas by fermentation of organic substrates, microorganisms of the species Methanobacterium formicicum are hitherto unknown.

Erfindungsgemäß wird ein Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum in Form einer Kultur von Mikroorganismen zugesetzt, die überwiegend aus Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum besteht. In Gärsubstraten von Biogasanlagen konnten Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum nur in Spuren von weniger als 10^–4 % Anteil an der gesamten Anzahl von anwesenden Mikroorgansimen nachgewiesen werden. Da für die Zugabe der Mikroorganismen die Menge an aus ihrem natürlichen Vorkommen isolierten Mikroorganismen nicht ausreicht, wird üblicherweise eine Vermehrung in Form einer Kultur vorgenommen. In der Praxis zeigt sich, dass die Zugabe der Mikroorganismen zu dem Gärsubstrat eines Fermenters am einfachsten direkt in Form einer Kultur von Mikroorganismen vorgenommen wird. According to the invention, a microorganism of the species Methanobacterium formicicum in the form of a culture of microorganisms is added, which consists predominantly of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum. In fermentation substrates of biogas plants, microorganisms of the species Methanobacterium formicicum could only be detected in traces of less than 10 ^-4 % of the total number of microorganisms present. Since the amount of microorganisms isolated from their natural occurrence is insufficient for the addition of the microorganisms, it is usually propagated in the form of a culture. In practice, it is found that the addition of the microorganisms to the fermentation substrate of a fermenter is most easily carried out directly in the form of a culture of microorganisms.

Die Zugabe der Kultur von Methanobacterium formicicum kann in Form einer Kultursuspension oder in Form trockener, gefriergetrockneter oder feuchter Zellpellets vorgenommen werden. The addition of the culture of Methanobacterium formicicum can be carried out in the form of a culture suspension or in the form of dry, freeze-dried or moist cell pellets.

Da die bereits angesprochenen verschiedenen positiven Effekte auf den Gärprozess mit der Mikroorganismenart Methanobacterium formicicum verbunden sind, sollte diese Art von Mikroorganismen in der zugegebenen Kultur in einer das natürliche Vorkommen übersteigenden Konzentration anwesend sein. Es können auch Mischkulturen, die Methanobacterium formicicum zusammen mit beliebigen anderen Mikroorganismen enthalten für die Zugabe verwendet werden. Voraussetzung ist lediglich, dass die Art Methanobacterium formicicum in einer gegenüber dem natürlichen Vorkommen angereicherten Konzentration anwesend ist. Since the already mentioned various positive effects on the fermentation process are associated with the microorganism species Methanobacterium formicicum, this type of microorganism should be present in the added culture in a concentration exceeding the natural abundance. Mixed cultures containing Methanobacterium formicicum along with any other microorganisms may also be used for the addition. All that is required is that the species Methanobacterium formicicum is present in a concentration which is enriched in relation to the natural occurrence.

Für die Bestimmung der Anteile verschiedener Arten von Mikroorganismen in Mischkulturen sind dem Fachmann verschiedene Methoden aus dem Stand der Technik bekannt. So kann beispielsweise mit Hilfe von Fluoreszenz-markierten Oligosonden spezifisch der Anteil von Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum in einer Mischung identifiziert werden. Wie bereits erwähnt, werden Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum bevorzugt in Form von Kulturen von Mikroorganismen dem Gärsubstrat zugesetzt, wobei die Kulturen von Mikroorganismen überwiegend aus Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum bestehen. Wird neben der Bestimmung der Anzahl an Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum auch die Gesamtzahl an Mikroorganismen bestimmt, so kann der Anteil an Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum in der Kultur in Prozent angegeben werden. Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum sind in einer Mischkultur dann die überwiegend anwesende Art von Mikroorganismen, wenn sie den höchsten prozentualen Anteil der verschiedenen in der Mischkultur anwesenden Arten von Mikroorganismen aufweisen. For the determination of the proportions of different types of microorganisms in mixed cultures, various methods known to the person skilled in the art are known. For example, the proportion of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum in a mixture can be specifically identified with the aid of fluorescence-labeled oligopeptides. As already mentioned, microorganisms of the species Methanobacterium formicicum are preferably added to the fermentation substrate in the form of cultures of microorganisms, the cultures of microorganisms consisting predominantly of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum. If, in addition to the determination of the number of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum, the total number of microorganisms is also determined, the percentage of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum in the culture can be stated as a percentage. Microorganisms of the species Methanobacterium formicicum are in a mixed culture then the predominantly present type of microorganisms, if they have the highest percentage of the different species of microorganisms present in the mixed culture.

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung machen Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum zumindest 10^–2 %, besonders bevorzugt zumindest 1 % der Gesamtzahl an in der zu dem Gärsubstrat zugegebenen Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen machen Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum zumindest 10 %, insbesondere zumindest 50 %, besonders bevorzugt zumindest 90 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. According to preferred embodiments of the present invention, microorganisms of the species Methanobacterium formicicum account for at least 10 ^-2 %, more preferably at least 1%, of the total number of microorganisms present in the culture added to the fermentation substrate. According to further preferred embodiments, microorganisms of the species Methanobacterium formicicum account for at least 10%, in particular at least 50%, particularly preferably at least 90%, of the total number of microorganisms present in the culture.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird eine Reinkultur eines Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum zugesetzt. Aufgrund der spezifischen Stoffwechselprozesse und -aktivitäten kann die Zugabe einer Reinkultur in besonderem Maße zu einer verbesserten Methan-Produktion beitragen. According to a further preferred embodiment, a pure culture of a microorganism of the species Methanobacterium formicicum is added. Due to the specific metabolic processes and activities, the addition of a pure culture can especially contribute to improved methane production.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum als Bestandteil zumindest einer immobilisierten Kultur von Mikroorganismen zugesetzt. Da für die Zugabe der Mikroorganismen die Menge an aus ihrem natürlichen Vorkommen isolierten Mikroorganismen nicht ausreicht, wird üblicherweise eine Vermehrung in Form einer Kultur vorgenommen. In der Praxis zeigt sich, dass die Zugabe der Mikroorganismen zu dem Gärsubstrat eines Fermenters am einfachsten in Form einer immobilisierten Kultur von Mikroorganismen vorgenommen wird. According to another preferred embodiment of the present invention, a microorganism of the species Methanobacterium formicicum is added as a constituent of at least one immobilized culture of microorganisms. Since the amount of microorganisms isolated from their natural occurrence is insufficient for the addition of the microorganisms, it is usually propagated in the form of a culture. In practice, it has been found that the addition of the microorganisms to the fermentation substrate of a fermenter is most easily carried out in the form of an immobilized culture of microorganisms.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, so dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum zwischen 10^–8 % und 50 % der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Insbesondere in Abhängigkeit von der Fermentergröße und damit in Abhängigkeit von der Menge an Gärsubstrat kann zur Erzielung der gewünschten Wirkung eine Zugabe von sehr stark unterschiedlichen Mengen an Mikroorganismen notwendig werden. According to a preferred embodiment of the present invention, the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is added in an amount to the fermentation substrate, so that after addition of the proportion of the microorganism of the species Methanobacterium formicicum between 10 ^-8 % and 50% of the total number of present in the fermentation substrate microorganisms accounts. In particular, depending on the fermenter size and thus as a function of the amount of fermentation substrate can be necessary to achieve the desired effect, an addition of very different amounts of microorganisms.

Besonders bevorzugt wird ein Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum zwischen 10^–6 % und 25 % der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Insbesondere bevorzugt wird der Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum zwischen 10^–4 % und 10 % der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Ganz besonders bevorzugt wird der Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum in einer Menge zu dem Gärsubstrat zugegeben, dass nach Zugabe der Anteil des Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum zwischen 10^–3 % und 1 % der Gesamtzahl an in dem Gärsubstrat anwesenden Mikroorganismen ausmacht. Particularly preferably, a microorganism of the species Methanobacterium formicicum is added in an amount to the fermentation substrate such that, after addition, the proportion of the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is between 10 ^-6 % and 25% of the total number of microorganisms present in the fermentation substrate. More preferably, the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is added to the fermentation substrate in an amount such that, after addition, the proportion of the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is between 10 ^-4 % and 10% of the total number of microorganisms present in the fermentation substrate. Most preferably, the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is added in an amount to the fermentation substrate, that after addition of the proportion of the microorganism of the species Methanobacterium formicicum accounts for between 10 ^-3 % and 1% of the total number of present in the fermentation substrate microorganisms.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum um einen Mikroorganismus des Stammes Methanobacterium sp., Klon SMS-sludge-11. In sämtlichen oben näher erläuterten Ausführungsformen, die sich mit der Zugabe eines Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum beschäftigen, wird also bevorzugt ein Mikroorganismus des Stammes Methanobacterium sp., Klon SMS-sludge-11 zugegeben. According to a particularly preferred embodiment of the present invention, the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is a microorganism of the strain Methanobacterium sp., Clone SMS-sludge-11. In all of the above-described embodiments, which deal with the addition of a microorganism of the species Methanobacterium formicicum, so preferably a microorganism of the strain Methanobacterium sp., Cloned SMS sludge-11 is added.

Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum um einen Mikroorganismus des Stammes Methanobacterium sp. 169. In sämtlichen oben näher erläuterten Ausführungsformen, die sich mit der Zugabe eines Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum beschäftigen, wird also bevorzugt ein Mikroorganismus des Stammes Methanobacterium sp. 169 zugegeben. According to a further particularly preferred embodiment of the present invention, the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is a microorganism of the strain Methanobacterium sp. 169. In all of the embodiments explained in more detail above, which deal with the addition of a microorganism of the species Methanobacterium formicicum, a microorganism of the strain Methanobacterium sp. 169 added.

Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum um einen Mikroorganismus des Stammes Archaeon Klon CG-4. In sämtlichen oben näher erläuterten Ausführungsformen, die sich mit der Zugabe eines Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum beschäftigen, wird also bevorzugt ein Mikroorganismus des Stammes Archaeon Klon CG-4 zugegeben. According to a further particularly preferred embodiment of the present invention, the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is a microorganism of the strain Archaeon clone CG-4. In all embodiments described above, which deal with the addition of a microorganism of the species Methanobacterium formicicum, so preferably a microorganism of the strain Archaeon clone CG-4 is added.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung eines Mikroorganismus der Art Methanobacterium formicicum zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt wird zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse ein Mikroorganismus des Stammes Methanobacterium sp. Klon SMS-sludge-11 verwendet. Ebenfalls bevorzugt wird zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse ein Mikroorganismus des Stammes Methanobacterium sp. 169 verwendet. Ebenfalls bevorzugt wird zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse ein Mikroorganismus des Stammes Archaeon Klon CG-4 verwendet. The present invention also encompasses the use of a microorganism of the species Methanobacterium formicicum for the fermentative production of biogas from biomass. Preference is given to the fermentative production of biogas from biomass, a microorganism of the strain Methanobacterium sp. Clone SMS-sludge-11 used. Also preferred for fermentative production of biogas from biomass is a microorganism of the strain Methanobacterium sp. 169 used. Also preferably, a microorganism of the strain Archaeon clone CG-4 is used for the fermentative production of biogas from biomass.

Die aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers gewonnenen Mikroorganismen Methanobacterium formicicum SBG4 wurden einer Sequenzanalyse unterzogen. Die ermittelte 16S rRNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst 1133 Nukleotide. Als nah verwandte 16S rRNA-Sequenz wurde die Sequenz des nicht kultivierten Methanobacterium sp. Klon SMS-sludge-11 identifiziert. Ein Vergleich der Sequenzen ergab, dass insgesamt 26 Austausche von Nukleotiden oder Deletionen vorliegen. Bei einer Länge der bestimmten Nukleotidsequenz von Methanobacterium formicicum SBG4 von 1133 Nukleotiden und einer Länge der Referenzsequenz von 1128 Nukleotiden errechnet sich mit Hilfe des FASTA-Algorithmus eine Übereinstimmung von 97,70 %. The microorganisms Methanobacterium formicicum SBG4 obtained from the fermentation substrate of a post-fermenter were subjected to a sequence analysis. The determined 16S rRNA sequence SEQ ID No. 1 comprises 1133 nucleotides. As a closely related 16S rRNA sequence, the sequence of uncultivated Methanobacterium sp. Clone SMS sludge-11 identified. A comparison of the sequences revealed that there are a total of 26 exchanges of nucleotides or deletions. At a length of the specific nucleotide sequence of Methanobacterium formicicum SBG4 of 1133 nucleotides and a length of the reference sequence of 1128 nucleotides calculated using the FASTA algorithm a match of 97.70%.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. The present invention also includes microorganisms having a nucleic acid having a nucleotide sequence containing a sequence region having more than 98.5% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. The nucleotide sequence particularly preferably contains a sequence region which has more than 99% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.

Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist der Mikroorganismus eine Nukleotidsequenz auf, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist und besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 entspricht. According to further preferred embodiments, the microorganism has a nucleotide sequence containing a sequence region having more than 99.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, and more preferably the nucleotide sequence contains a sequence region having greater than 99.8% sequence identity having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. According to a very particularly preferred embodiment, the nucleotide sequence contains a sequence region which corresponds to the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können gegenüber der Ausgangsnukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 an einer Position oder an zwei Positionen oder an drei Positionen oder an vier Positionen oder an fünf Positionen oder an sechs Positionen oder an sieben Positionen oder an acht Positionen oder an neun Positionen oder an zehn Positionen oder an elf Positionen oder an zwölf Positionen oder an 13 Positionen oder an 14 Positionen oder an 15 Positionen oder an 16 Positionen oder an 17 Positionen Nukleotidmutationen vorliegen. Die Bedeutung des Begriffs „Nukleotidmutation“ ist im Abschnitt „Definitionen“ des vorliegenden Textes erläutert. In preferred embodiments of the present invention, SEQ ID NO: 1 may be compared to the starting nucleotide sequence at one or two positions or at three positions or at four positions or at five positions or at six positions or at seven positions or at eight positions or at nine positions or at ten positions or at eleven positions or at twelve positions or at 13 positions or at 14 positions or at 15 positions or at 16 positions or at 17 positions nucleotide mutations. The meaning of the term "nucleotide mutation" is explained in the "Definitions" section of the present text.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. The present invention also encompasses a culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, in which culture of microorganisms a microorganism is present which has a nucleotide sequence containing a sequence range greater than 98.5 % Sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the microorganism constitutes at least 10 ^-4 % of the total number of microorganisms present in the culture.

Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Preferably, in the culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, a microorganism is present which has a nucleotide sequence with a sequence region having more than 99% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1.

Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist. According to further preferred embodiments, in the culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, a microorganism is present which has a nucleotide sequence with a sequence range of more than 99.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO. 1 has. Most preferably, the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 99.8% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.

Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 entspricht. According to a very particularly preferred embodiment, in the culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, a microorganism is present which has a nucleotide sequence which contains a sequence region which corresponds to the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 definiert wurde zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 definiert wurde in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum näher beschriebenen Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. The present invention also encompasses the use of a microorganism as defined above with respect to its nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 for the fermentative production of biogas from biomass. Preference is given to the use of a microorganism as defined above with regard to its nucleotide sequence SEQ ID No. 1 in a method described above in connection with microorganisms of the species Methanobacterium formicicum for the fermentative production of biogas from biomass.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht, in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum näher beschriebenen Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. The present invention also includes the use of a culture of microorganisms for the fermentative generation of biogas from biomass, wherein the culture of micro-organisms at least a micro-organism as defined above with respect to its nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, and wherein the microorganism is at least. 10 ^{- 4} % of the total number of microorganisms present in the culture. Preference is given to the use of a culture of microorganisms for the fermentative generation of biogas from biomass, wherein the culture of micro-organisms at least a micro-organism as defined above with respect to its nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, and wherein the microorganism is at least. 10 ^{- 4} % of the total number of microorganisms present in the culture, in a method described above in connection with microorganisms of the species Methanobacterium formicicum for the fermentative production of biogas from biomass.

Die aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers gewonnenen Mikroorganismen Methanobacterium formicicum SBG8 wurden einer Sequenzanalyse unterzogen. Die 16S rRNA-Sequenz SEQ ID Nr. 2 umfasst 903 Nukleotide. Als naher Verwandter wurde Methanobacterium sp. 169 identifiziert. Ein Vergleich der Nukleotidsequenzen ergab, dass insgesamt 22 Austausche von Nukleotiden oder Deletionen vorliegen. Bei einer Länge der bestimmten Nukleotidsequenz von Methanobacterium formicicum SBG8 von 903 Nukleotiden und einer Länge der Referenzsequenz von 911 Nukleotiden errechnet sich mit Hilfe des FASTA-Algorithmus eine Übereinstimmung von 97,56 %. The microorganisms Methanobacterium formicicum SBG8 obtained from the fermentation substrate of a post-fermenter were subjected to a sequence analysis. The 16S rRNA sequence SEQ ID NO: 2 comprises 903 nucleotides. As a close relative, Methanobacterium sp. 169 identified. A comparison of the nucleotide sequences revealed that a total of 22 exchanges of nucleotides or deletions are present. With a length of the specific nucleotide sequence of 903 nucleotides of Methanobacterium formicicum SBG8 and a length of the reference sequence of 911 nucleotides, a 97.56% match is calculated using the FASTA algorithm.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist. The present invention also includes microorganisms having a nucleic acid having a nucleotide sequence containing a sequence region having more than 98.5% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence particularly preferably contains a sequence region which has more than 99% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 2.

Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist der Mikroorganismus eine Nukleotidsequenz auf, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist und besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 entspricht. According to further preferred embodiments, the microorganism has a nucleotide sequence containing a sequence region having more than 99.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2, and more preferably the nucleotide sequence contains a sequence region having greater than 99.8% sequence identity having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. According to a very particularly preferred embodiment, the nucleotide sequence contains a sequence region which corresponds to the nucleotide sequence SEQ ID No. 2.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können gegenüber der Ausgangsnukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 an einer Position oder an zwei Positionen oder an drei Positionen oder an vier Positionen oder an fünf Positionen oder an sechs Positionen oder an sieben Positionen oder an acht Positionen oder an neun Positionen oder an zehn Positionen oder an elf Positionen oder an zwölf Positionen oder an 13 Positionen oder an 14 Positionen Nukleotidmutationen vorliegen. Die Bedeutung des Begriffs „Nukleotidmutation“ ist im Abschnitt „Definitionen“ des vorliegenden Textes erläutert. In preferred embodiments of the present invention, SEQ ID NO: 2 may be compared to the starting nucleotide sequence at one or two positions or at three positions or at four positions or at five positions or at six positions or at seven positions or at eight positions or at nine positions or nucleotide mutations at ten positions or at eleven positions or at twelve positions or at thirteen positions or at fourteen positions. The meaning of the term "nucleotide mutation" is explained in the "Definitions" section of the present text.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. The present invention also encompasses a culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, in which culture of microorganisms a microorganism is present which has a nucleotide sequence containing a sequence range greater than 98.5 % Sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the microorganism constitutes at least 10 ^-4 % of the total number of microorganisms present in the culture.

Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist. Preferably, in the culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, a microorganism having a nucleotide sequence with a sequence region having more than 99% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2 is present.

Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist. According to further preferred embodiments, in the culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, a microorganism is present which has a nucleotide sequence with a sequence range of more than 99.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO. 2 has. Most preferably, the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 99.8% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 2.

Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 entspricht. According to a very particularly preferred embodiment, in the culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, a microorganism is present which has a nucleotide sequence which contains a sequence region which corresponds to the nucleotide sequence SEQ ID No. 2.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 definiert wurde zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 definiert wurde in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum näher beschriebenen Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. The present invention also encompasses the use of a microorganism as defined above with respect to its nucleotide sequence SEQ ID NO: 2 for the fermentative production of biogas from biomass. Preference is given to the use of a microorganism as defined above with regard to its nucleotide sequence SEQ ID No. 2 in a method described above in connection with microorganisms of the species Methanobacterium formicicum for the fermentative production of biogas from biomass.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht, in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum näher beschriebenen Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. The present invention also includes the use of a culture of microorganisms for the fermentative production of biogas from biomass, wherein the culture of microorganisms comprises at least one microorganism as defined above with respect to its nucleotide sequence SEQ ID NO: 2 and wherein the microorganism constitutes at least 10 ^-4 % of the total number of microorganisms present in the culture. Preference is given to the use of a culture of microorganisms for the fermentative generation of biogas from biomass, wherein the culture of micro-organisms at least a micro-organism as defined above with respect to its nucleotide sequence SEQ ID NO: 2, and wherein the microorganism is at least. 10 ^{- 4} % of the total number of microorganisms present in the culture, in a method described above in connection with microorganisms of the species Methanobacterium formicicum for the fermentative production of biogas from biomass.

Die aus dem Gärsubstrat eines Nachgärers gewonnenen Mikroorganismen Methanobacterium formicicum SBG25 wurden einer Sequenzanalyse unterzogen. Die ermittelte 16S rRNA-Sequenz SEQ ID Nr. 3 umfasst 914 Nukleotide. Als nah verwandte Sequenz wurde eine 16S rRNA-Sequenz des nicht kultivierten Archaeon Klons CG-4 identifiziert. Ein Vergleich der Sequenzen ergab, dass insgesamt 27 Austausche von Nukleotiden oder Deletionen vorliegen. Bei einer Länge der bestimmten Nukleotidsequenz von Methanobacterium formicicum SBG25 von 914 Nukleotiden und einer Länge der Referenzsequenz von 928 Nukleotiden errechnet sich mit Hilfe des FASTA-Algorithmus eine Übereinstimmung von 97,05 %. The microorganisms Methanobacterium formicicum SBG25 obtained from the fermentation substrate of a postgrader were subjected to a sequence analysis. The determined 16S rRNA sequence SEQ ID NO: 3 comprises 914 nucleotides. As a closely related sequence, a 16S rRNA sequence of the uncultured Archaeon clone CG-4 was identified. A comparison of the sequences revealed that there are a total of 27 exchanges of nucleotides or deletions. At a length of the specific nucleotide sequence of 914 nucleotides of Methanobacterium formicicum SBG25 and a length of the reference sequence of 928 nucleotides, a 97.05% match is calculated using the FASTA algorithm.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mikroorganismen mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist. Besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 98,5 % oder mehr als 99,0 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist. The present invention also includes microorganisms having a nucleic acid having a nucleotide sequence containing a sequence region having more than 98% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. More preferably, the nucleotide sequence contains a sequence region having more than 98.5% or more than 99.0% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 3.

Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen weist der Mikroorganismus eine Nukleotidsequenz auf, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 99,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist und besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 entspricht. According to further preferred embodiments, the microorganism has a nucleotide sequence which contains a sequence region which has more than 99.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3, and more preferably the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 99.8% sequence identity having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. According to a very particularly preferred embodiment, the nucleotide sequence contains a sequence region which corresponds to the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können gegenüber der Ausgangsnukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 an einer Position oder an zwei Positionen oder an drei Positionen oder an vier Positionen oder an fünf Positionen oder an sechs Positionen oder an sieben Positionen oder an acht Positionen oder an neun Positionen oder an zehn Positionen oder an elf Positionen oder an zwölf Positionen oder an 13 Positionen oder an 14 Positionen oder an 15 Positionen oder an 16 Positionen oder an 17 Positionen oder an 18 Positionen oder an 19 Positionen Nukleotidmutationen vorliegen. Die Bedeutung des Begriffs „Nukleotidmutation“ ist im Abschnitt „Definitionen“ des vorliegenden Textes erläutert. In preferred embodiments of the present invention, SEQ ID NO: 3 may be compared to the starting nucleotide sequence at one or two positions or at three positions or at four positions or at five positions or at six positions or at seven positions or at eight positions or at nine positions or nucleotide mutations at ten positions or at eleven positions or at twelve positions or at 13 positions or at 14 positions or at 15 positions or at 16 positions or at 17 positions or at 18 positions or at 19 positions. The meaning of the term "nucleotide mutation" is explained in the "Definitions" section of the present text.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Kultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei in der Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend ist, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der mehr als 98 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist, wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. The present invention also encompasses a culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, wherein in the culture of microorganisms a microorganism is present which has a nucleotide sequence containing a sequence region having greater than 98% sequence identity having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, wherein the microorganism constitutes at least 10 ^-4 % of the total number of microorganisms present in the culture.

Bevorzugt ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 98,5 % oder mehr also 99,0 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist. Preferably, in the culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, a microorganism is present which has a nucleotide sequence with a sequence range of more than 98.5% or more, ie 99.0% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 3.

Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz mit einem Sequenzbereich besitzt, der mehr als 99,5 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist. Ganz besonders bevorzugt enthält die Nukleotidsequenz einen Sequenzbereich, der mehr als 99,8 % Sequenzidentität mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 aufweist. According to further preferred embodiments, in the culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, a microorganism is present which has a nucleotide sequence with a sequence range of more than 99.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID NO. 3 has. Most preferably, the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 99.8% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.

Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist in der zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse geeigneten Kultur von Mikroorganismen ein Mikroorganismus anwesend, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Sequenzbereich enthält, der der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 entspricht. According to a very particularly preferred embodiment, in the culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, a microorganism is present which has a nucleotide sequence which contains a sequence region which corresponds to the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 definiert wurde zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung eines Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 definiert wurde in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum näher beschriebenen Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. The present invention also encompasses the use of a microorganism as defined above with respect to its nucleotide sequence SEQ ID NO: 3 for the fermentative production of biogas from biomass. Preference is given to the use of a microorganism as defined above with regard to its nucleotide sequence SEQ ID No. 3 in a method described above in connection with microorganisms of the species Methanobacterium formicicum for the fermentative production of biogas from biomass.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht. Bevorzugt handelt es sich um die Verwendung einer Kultur von Mikroorganismen zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei die Kultur von Mikroorganismen zumindest einen Mikroorganismus wie er oben im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 definiert wurde umfasst und wobei der Mikroorganismus zumindest 10^–4 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmacht, in einem oben im Zusammenhang mit Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum näher beschriebenen Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse. The present invention also includes the use of a culture of microorganisms for the fermentative generation of biogas from biomass, wherein the culture of micro-organisms at least a micro-organism as defined above with respect to its nucleotide sequence SEQ ID NO: 3, and wherein the microorganism is at least. 10 ^{- 4} % of the total number of microorganisms present in the culture. Preference is given to the use of a culture of microorganisms for the fermentative generation of biogas from biomass, wherein the culture of micro-organisms at least a micro-organism as defined above with respect to its nucleotide sequence SEQ ID NO: 3, and wherein the microorganism is at least. 10 ^{- 4} % of the total number of microorganisms present in the culture, in a method described above in connection with microorganisms of the species Methanobacterium formicicum for the fermentative production of biogas from biomass.

Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen machen die genannten, in Bezug auf ihre Nukleotidsequenz charakterisierten Mikroorganismen zumindest 10^–2 %, bevorzugt zumindest 1 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. Besonders bevorzugt machen die Mikroorganismen zumindest 10 %, insbesondere bevorzugt zumindest 25 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. Ganz besonders bevorzugt machen die beschriebenen Mikroorganismen zumindest 50 %, insbesondere zumindest 75 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen aus. According to further preferred embodiments, said microorganisms characterized with respect to their nucleotide sequence constitute at least 10 ^-2 %, preferably at least 1%, of the total number of microorganisms present in the culture. Particularly preferably, the microorganisms make up at least 10%, particularly preferably at least 25%, of the total number of microorganisms present in the culture. Most preferably, the microorganisms described make up at least 50%, in particular at least 75%, of the total number of microorganisms present in the culture.

Ebenfalls bevorzugt sind Ausführungsformen, gemäß denen die oben genannten Mikroorganismen zumindest 90 % der Gesamtzahl an in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen ausmachen. Besonders bevorzugt handelt es sich um eine Reinkultur von Mikroorganismen geeignet zum Einsatz in einem Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Biogas aus Biomasse, wobei es sich um eine Reinkultur eines Mikroorganismus handelt, wie er oben in Bezug auf seine Nukleotidsequenz charakterisiert wurde. Also preferred are embodiments according to which the above-mentioned microorganisms make up at least 90% of the total number of microorganisms present in the culture. Particularly preferably it is a pure culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, which is a pure culture of a microorganism, as has been characterized above with respect to its nucleotide sequence.

Besonders bevorzugt handelt es sich in den oben beschriebenen Fällen um eine immobilisierte Kultur von Mikroorganismen. Most preferably, in the cases described above, it is an immobilized culture of microorganisms.

Wege zur Ausführung der Erfindung Ways to carry out the invention

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht als einschränkend aufzufassen. Sofern nicht anders angegeben, wurden molekularbiologische Standardmethoden verwendet, wie z.B. von Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben. The following examples illustrate the invention and are not to be construed as limiting. Unless otherwise indicated, standard molecular biology methods were used, such as e.g. by Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Methanobacterium formicicum SBG4 Methanobacterium formicicum SBG4

DNA-Isolierung DNA isolation

Aus dem Fermenter einer Biogasanlage wurden Substrat-Proben entnommen und in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Nach Abtrennung von nicht verdautem Pflanzenmaterial durch Zentrifugation (30 s, 3000 rpm (Umdrehungern pro Minute) in einer Tischzentrifuge) wurde ein Zellpellet durch Zentrifugation (30 min, 13000 rpm in einer Tischzentrifuge) gewonnen. Die Zellen wurden resuspendiert in 1300 µl salinem Extraktionspuffer (0,1 mol l^–1 EDTA, 0,15 mol l^–1 NaCl, der 30–40 mg mit Säure gewaschenes PVPP enthielt) und anschließend dreimal eingefroren (–80 °C) und aufgetaut (bei 56 °C). Nach Lyse der Zellen (30 min Inkubation bei 37 °C nach Zugabe von 20 µl einer Lysozymlösung von 10 mg/ml) wurden die Zellen nach Zugabe von Protease (20 µl einer 1 % igen (w/v) ProteinaseK Lösung) und SDS (100 µl einer 10 %igen Lösung) für 45 min bei 65 °C inkubiert. Die DNA wurde anschliessend mit einem Volumen Phenol, mit einem Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, (v/v/v)) und mit einem Volumen Chloroform extrahiert. Aus dem wässrigen Überstand wurde nach Zugabe von 1/10 Volumen einer Natriumacetat-Lösung (3,0 M, pH 5,2) die DNA mit 0,8 Volumen Isopropanol 30 Min. bei –20 °C gefällt. Die DNA wurde abzentrifugiert, zweimal mit 70 %igen Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur an Luft getrocknet. Substrate samples were taken from the fermenter of a biogas plant and transferred to an Eppendorf reaction vessel. After separation of undigested plant material by centrifugation (30 s, 3000 rpm (revolutions per minute) in a table centrifuge), a cell pellet was recovered by centrifugation (30 min, 13000 rpm in a bench centrifuge). The cells were resuspended in 1300 μl saline extraction buffer (0.1 mol ^-1 EDTA, 0.15 mol ^-1 NaCl containing 30-40 mg acid washed PVPP) and then three times frozen (-80 ° C) and Thawed (at 56 ° C). After lysis of the cells (incubation at 37 ° C. for 30 min after addition of 20 μl of a lysozyme solution of 10 mg / ml), the cells were incubated after addition of protease (20 μl of a 1% (w / v) proteinase K solution) and SDS ( 100 μl of a 10% solution) for 45 min at 65 ° C. The DNA was then extracted with one volume of phenol, one volume of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1, v / v / v), and one volume of chloroform. From the aqueous supernatant, after addition of 1/10 volume of a sodium acetate solution (3.0 M, pH 5.2), the DNA was precipitated with 0.8 volume of isopropanol for 30 min. At -20 ° C. The DNA was collected by centrifugation, washed twice with 70% ethanol and dried in air at room temperature.

Nukleotidsequenzbestimmung nucleotide sequence determination

Zur Bestimmung der 16S rRNA Sequenz wurde aus der isolierten DNA über PCR das Gen für die 16S rRNA amplifiziert. Dafür wurden die Primer mit den Sequenzen TCYGGTTGATCCTGCC und ACGGHTACCTTGTTACGACTT verwendet (angegeben in 5` → 3`Richtung; Y bedeutet C oder T; H bedeutet C, T oder A). Die als PCR-Produkte erhaltenen DNA-Stücke wurden dann in einen Klonierungsvektor kloniert (Ligation mit dem QIAGEN PCR-Cloning-Kit der Firma QIAGEN/Hilden unter Verwendung des Vektors p-Drive), in E. coli transformiert (gemäß QIAGEN PCR-Cloning-Handbook) und mittels Colony-PCR untersucht. Die erhaltenen Colony-PCR-Produkte wurden einer Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen-Analyse (RFLP) zur Auswahl geeigneter Klone unterzogen. Aus den jeweiligen Klonen wurde die entsprechende Plasmid-DNA isoliert und nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) sequenziert. To determine the 16S rRNA sequence, the gene for the 16S rRNA was amplified from the isolated DNA by PCR. For this purpose, the primers with the sequences TCYGGTTGATCCTGCC and ACGGHTACCTTGTTACGACTT were used (indicated in the 5 '→ 3' direction, Y is C or T, H is C, T or A). The pieces of DNA obtained as PCR products were then cloned into a cloning vector (ligation with the QIAGEN PCR cloning kit from QIAGEN / Hilden using the vector p-drive), transformed into E. coli (according to QIAGEN PCR cloning Handbook) and examined by colony PCR. The resulting colony PCR products were subjected to restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP) to select suitable clones. From the respective clones, the corresponding plasmid DNA was isolated and sequenced by the chain termination method (Sanger et al., 1977).

Sequenzanalyse sequence analysis

Nach der Sequenzanalyse der Kolonien konnte die 16S rDNA bzw. ihre Transformation in die korrespondierende 16S rRNA mit dem Programmpacket ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363–1371) phylogenetisch analysiert werden. Eine Analyse der klonierten 16S rDNA bzw. der korrespondierenden 16S rRNA Sequenz mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov zeigte, dass eine erhaltene Sequenz dem Organismus Methanobacterium sp. Klon SMS-sludge-11 als nächstem Verwandten zugeordnet werden kann. After sequence analysis of the colonies, the 16S rDNA or its transformation into the corresponding 16S rRNA could be phylogenetically analyzed with the program package ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research., 2004, 32, 1363-1371). An analysis of the cloned 16S rDNA or the corresponding 16S rRNA sequence using BLAST program (basic local alignment search tool) of the database www.ncbi.nlm.nih.gov showed that a sequence obtained the organism Methanobacterium sp. Clone SMS-sludge-11 can be assigned as nearest relative.

Isolierung und Anreicherung der Mikroorganismen Isolation and accumulation of microorganisms

Mikroorganismen Methanobacterium formicicum SBG4 wurden unter anaeroben Bedingungen mit Hilfe eines geeigneten Selektionsmediums (Medium 119 (DSMZ) geeignet für Methanobacterium formicium (DSMZ-Stamm: 1535)) aus dem Überstand von Material aus einem Nachgärer isoliert. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen erfolgte mit Hilfe von Verdünnungsreihen. Durch Wahl eines geeigneten Nährmediums (Medium 119 (DSMZ)) konnten die Bakterien Methanobacterium formicicum SBG4 vermehrt werden. Microorganisms Methanobacterium formicicum SBG4 were isolated under anaerobic conditions with the aid of a suitable selection medium (Medium 119 (DSMZ) suitable for Methanobacterium formicium (DSMZ strain: 1535)) from the supernatant of material from a post-fermenter. Further selection of the liquid cultures was carried out with the aid of dilution series. By selecting a suitable nutrient medium (Medium 119 (DSMZ)), the bacteria Methanobacterium formicicum SBG4 could be propagated.

Fermentation unter Zugabe von Mikroorganismen der Spezies Methanobacterium formicicum SBG4 Fermentation with addition of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum SBG4

Während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur ~40 °C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Monaten der zeitliche Verlauf des gesamten erzeugten Biogases in Normliter (Gasvolumen bei 273,15 K und 1013 mbar) je Tag (Nl/d) bestimmt. Der Fermentationsprozess lief unter ansonsten identischen Bedingungen, insbesondere unter gleicher Raumbelastung des Fermenters, einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und einmal unter mehrfacher Zugabe (z.B. 2 × wöchentlich). Zugegeben wurde jeweils die Zellmasse aus 1 l einer Vorkultur von Methanobacterium formicicum SBG4, die 5 Tage bei einer Temperatur von 40°C in Medium 119 (DSMZ) inkubiert worden war. During a fermentation process in a test fermenter with a volume of 150 l under realistic plant conditions (temperature ~ 40 ° C, average volume load of 3 to 3.5 kg oTS / m ³ d) was over a period of several months, the time course of the entire generated Biogas in standard liters (gas volume at 273.15 K and 1013 mbar) determined per day (Nl / d). The fermentation process was carried out under otherwise identical conditions, in particular under the same volume loading of the fermenter, once without the addition of microorganisms and once with multiple addition (eg 2 times a week). In each case, the cell mass was added from 1 l of a preculture of Methanobacterium formicicum SBG4, which had been incubated for 5 days at a temperature of 40 ° C. in medium 119 (DSMZ).

Ein Vergleich der Menge an erzeugtem Biogas zeigte, dass bei Zugabe von Mikroorganismen Methanobacterium formicicum SBG4 eine deutlich erhöhte Menge, mindestens aber eine um 5 % höhere Menge an erzeugtem Biogas aus einer vorgegebenen Menge an organischer Trockensubstanz erzeugt wird als ohne Zugabe von Mikroorganismen. A comparison of the amount of biogas produced showed that with the addition of microorganisms Methanobacterium formicicum SBG4 a significantly increased amount, but at least a 5% higher amount of biogas produced from a given amount of organic dry matter is generated than without the addition of microorganisms.

In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wurde eine Reinkultur von Methanobacterium formicicum SBG4 eingesetzt. Ebenso können aber auch Mischkulturen mit einem Anteil an Methanobacterium formicicum SBG4 verwendet werden. Insbesondere können Mischkulturen aus zwei oder drei Arten von Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zugegeben werden. In the described embodiment, a pure culture of Methanobacterium formicicum SBG4 was used. Likewise, mixed cultures with a proportion of Methanobacterium formicicum SBG4 can also be used. In particular, mixed cultures of two or three kinds of microorganisms selected from the group consisting of Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum and Clostridium sporosphaeroides can be added.

Der Einsatz von Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum führt zu einer deutlichen Verbesserung von Effizienz und Wirkungsgrad von Biogasanlagen. The use of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum leads to a significant improvement in the efficiency and efficiency of biogas plants.

Methanobacterium formicicum SBG8 Methanobacterium formicicum SBG8

DNA-Isolierung DNA isolation

Aus dem Fermenter einer Biogasanlage wurden Substrat-Proben entnommen und in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Nach Abtrennung von nicht verdautem Pflanzenmaterial durch Zentrifugation (30 s, 3000 rpm (Umdrehungern pro Minute) in einer Tischzentrifuge) wurde ein Zellpellet durch Zentrifugation (30 min, 13000 rpm in einer Tischzentrifuge) gewonnen. Die Zellen wurden resuspendiert in 1300 µl salinem Extraktionspuffer (0,1 mol l^–1 EDTA, 0,15 mol l^–1 NaCl, der 30–40 mg mit Säure gewaschenes PVPP enthielt) und anschließend dreimal eingefroren (–80 °C) und aufgetaut (bei 56 °C). Nach Lyse der Zellen (30 min Inkubation bei 37 °C nach Zugabe von 20 µl einer Lysozymlösung von 10 mg/ml) wurden die Zellen nach Zugabe von Protease (20 µl einer 1 % igen (w/v) ProteinaseK Lösung) und SDS (100 µl einer 10 %igen Lösung) für 45 min bei 65 °C inkubiert. Die DNA wurde anschliessend mit einem Volumen Phenol, mit einem Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, (v/v/v)) und mit einem Volumen Chloroform extrahiert. Aus dem wässrigen Überstand wurde nach Zugabe von 1/10 Volumen einer Natriumacetat-Lösung (3,0 M, pH 5,2) die DNA mit 0,8 Volumen Isopropanol 30 Min. bei –20 °C gefällt. Die DNA wurde abzentrifugiert, zweimal mit 70 %igen Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur an Luft getrocknet. Substrate samples were taken from the fermenter of a biogas plant and transferred to an Eppendorf reaction vessel. After separation of undigested plant material by centrifugation (30 s, 3000 rpm (revolutions per minute) in a bench top centrifuge), a cell pellet was recovered by centrifugation (30 min, 13000 rpm in a bench top centrifuge). The cells were resuspended in 1300 μl saline extraction buffer (0.1 mol ^-1 EDTA, 0.15 mol ^-1 NaCl containing 30-40 mg acid washed PVPP) and then three times frozen (-80 ° C) and Thawed (at 56 ° C). After lysis of the cells (incubation at 37 ° C. for 30 min after addition of 20 μl of a lysozyme solution of 10 mg / ml), the cells were incubated after addition of protease (20 μl of a 1% (w / v) proteinase K solution) and SDS ( 100 μl of a 10% solution) for 45 min at 65 ° C. The DNA was then extracted with one volume of phenol, one volume of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1, v / v / v), and one volume of chloroform. From the aqueous supernatant, after addition of 1/10 volume of a sodium acetate solution (3.0 M, pH 5.2), the DNA was precipitated with 0.8 volume of isopropanol for 30 min. At -20 ° C. The DNA was collected by centrifugation, washed twice with 70% ethanol and dried in air at room temperature.

Nukleotidsequenzbestimmung nucleotide sequence determination

Sequenzanalyse sequence analysis

Nach der Sequenzanalyse der Kolonien konnte die 16S rDNA bzw. ihre Transformation in die korrespondierende 16S rRNA mit dem Programmpacket ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363–1371) phylogenetisch analysiert werden. Eine Analyse der klonierten 16S rDNA bzw. der korrespondierenden 16S rRNA Sequenz mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov zeigte, dass eine erhaltene Sequenz dem Organismus Methanobacterium sp. 169 als nächstem Verwandten zugeordnet werden kann. After sequence analysis of the colonies, the 16S rDNA or its transformation into the corresponding 16S rRNA could be phylogenetically analyzed with the program package ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research., 2004, 32, 1363-1371). An analysis of the cloned 16S rDNA or the corresponding 16S rRNA sequence using BLAST program (basic local alignment search tool) of the database www.ncbi.nlm.nih.gov showed that a sequence obtained the organism Methanobacterium sp. 169 can be assigned as nearest relatives.

Mikroorganismen Methanobacterium formicicum SBG8 wurden unter anaeroben Bedingungen mit Hilfe eines geeigneten Selektionsmediums (Medium 119 (DSMZ) geeignet für Methanobacterium formicium (DSMZ-Stamm: 1535)) aus dem Überstand von Material aus einem Nachgärer isoliert. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen erfolgte mit Hilfe von Verdünnungsreihen. Durch Wahl eines geeigneten Nährmediums (Medium 119 (DSMZ)) konnten die Bakterien Methanobacterium formicicum SBG8 vermehrt werden. Microorganisms Methanobacterium formicicum SBG8 were isolated under anaerobic conditions with the aid of a suitable selection medium (medium 119 (DSMZ) suitable for Methanobacterium formicium (DSMZ strain: 1535)) from the supernatant of material from a post-fermenter. Further selection of the liquid cultures was carried out with the aid of dilution series. By selecting a suitable culture medium (Medium 119 (DSMZ)), the bacteria Methanobacterium formicicum SBG8 could be propagated.

Fermentation unter Zugabe von Mikroorganismen der Spezies Methanobacterium formicicum SBG8 Fermentation with addition of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum SBG8

Während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur ~40 °C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Monaten der zeitliche Verlauf des gesamten erzeugten Biogases in Normliter (Gasvolumen bei 273,15 K und 1013 mbar) je Tag (Nl/d) bestimmt. Der Fermentationsprozess lief unter ansonsten identischen Bedingungen, insbesondere unter gleicher Raumbelastung des Fermenters, einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und einmal unter mehrfacher Zugabe (z.B. 2 × wöchentlich). Zugegeben wurde jeweils die Zellmasse aus 1 l einer Vorkultur von Methanobacterium formicicum SBG8, die 5 Tage bei einer Temperatur von 40°C in Medium 119 (DSMZ) inkubiert worden war. During a fermentation process in a test fermenter with a volume of 150 l under realistic plant conditions (temperature ~ 40 ° C, average volume load of 3 to 3.5 kg oTS / m ³ d) was over a period of several months, the time course of the entire generated Biogas in standard liters (gas volume at 273.15 K and 1013 mbar) determined per day (Nl / d). The fermentation process was carried out under otherwise identical conditions, in particular under the same volume loading of the fermenter, once without the addition of microorganisms and once with multiple addition (eg 2 times a week). In each case, the cell mass was added from 1 l of a preculture of Methanobacterium formicicum SBG8, which had been incubated for 5 days at a temperature of 40 ° C. in medium 119 (DSMZ).

Ein Vergleich der Menge an erzeugtem Biogas zeigte, dass bei Zugabe von Mikroorganismen Methanobacterium formicicum SBG8 eine deutlich erhöhte Menge, mindestens aber eine um 5 % höhere Menge an erzeugtem Biogas aus einer vorgegebenen Menge an organischer Trockensubstanz erzeugt wird als ohne Zugabe von Mikroorganismen. A comparison of the amount of biogas produced showed that the addition of microorganisms Methanobacterium formicicum SBG8 a significantly increased amount, but at least a 5% higher amount of biogas produced from a given amount of organic dry matter is generated as without the addition of microorganisms.

In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wurde eine Reinkultur von Methanobacterium formicicum SBG8 eingesetzt. Ebenso können aber auch Mischkulturen mit einem Anteil an Methanobacterium formicicum SBG8 verwendet werden. Insbesondere können Mischkulturen aus zwei oder drei Arten von Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zugegeben werden. In the described embodiment, a pure culture of Methanobacterium formicicum SBG8 was used. However, mixed cultures with a proportion of Methanobacterium formicicum SBG8 can also be used. In particular, mixed cultures of two or three types of microorganisms selected from the group consisting of Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum and Clostridium sporosphaeroides.

Methanobacterium formicicum SBG25 Methanobacterium formicicum SBG25

DNA-Isolierung DNA isolation

Nukleotidsequenzbestimmung nucleotide sequence determination

Sequenzanalyse sequence analysis

Nach der Sequenzanalyse der Kolonien konnte die 16S rDNA bzw. ihre Transformation in die korrespondierende 16S rRNA mit dem Programmpacket ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363–1371) phylogenetisch analysiert werden. Eine Analyse der klonierten 16S rDNA bzw. der korrespondierenden 16S rRNA Sequenz mittels BLAST-Programm (basic local alignment search tool) der Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov zeigte, dass eine erhaltene Sequenz dem Organismus Archaeon Klon GC-4 als nächstem Verwandten zugeordnet werden kann. After sequence analysis of the colonies, the 16S rDNA or its transformation into the corresponding 16S rRNA could be phylogenetically analyzed with the program package ARB (Ludwig et al., Nucleic Acids Research., 2004, 32, 1363-1371). An analysis of the cloned 16S rDNA or the corresponding 16S rRNA sequence using BLAST program (basic local alignment search tool) of the database www.ncbi.nlm.nih.gov showed that a sequence obtained the next Archaeon clone GC-4 Relatives can be assigned.

Mikroorganismen Methanobacterium formicicum SBG25 wurden unter anaeroben Bedingungen mit Hilfe eines geeigneten Selektionsmediums (Medium 119 (DSMZ) geeignet für Methanobacterium formicium (DSMZ-Stamm: 1535)) aus dem Überstand von Material aus einem Nachgärer isoliert. Eine weitere Selektion der Flüssigkulturen erfolgte mit Hilfe von Verdünnungsreihen. Durch Wahl eines geeigneten Nährmediums (Medium 119 (DSMZ)) konnten die Bakterien Methanobacterium formicicum SBG25 vermehrt werden. Microorganisms Methanobacterium formicicum SBG25 were isolated under anaerobic conditions from the supernatant of material from a post-fermenter using an appropriate selection medium (Medium 119 (DSMZ) suitable for Methanobacterium formicium (DSMZ strain: 1535)). Further selection of the liquid cultures was carried out with the aid of dilution series. By selecting a suitable nutrient medium (Medium 119 (DSMZ)), the bacteria Methanobacterium formicicum SBG25 could be propagated.

Fermentation unter Zugabe von Mikroorganismen der Spezies Methanobacterium formicicum SBG25 Fermentation with addition of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum SBG25

Während eines Fermentationsprozesses in einem Versuchsfermenter mit einem Volumen von 150 l unter realistischen Anlagenbedingungen (Temperatur ~40 °C, durchschnittliche Raumbelastung von 3 bis 3,5 kg oTS/m³d) wurde über einen Zeitraum von mehreren Monaten der zeitliche Verlauf des gesamten erzeugten Biogases in Normliter (Gasvolumen bei 273,15 K und 1013 mbar) je Tag (Nl/d) bestimmt. Der Fermentationsprozess lief unter ansonsten identischen Bedingungen, insbesondere unter gleicher Raumbelastung des Fermenters, einmal ohne die Zugabe von Mikroorganismen ab und einmal unter mehrfacher Zugabe (z.B. 2 × wöchentlich). Zugegeben wurde jeweils die Zellmasse aus 1 l einer Vorkultur von Methanobacterium formicicum SBG25, die 5 Tage bei einer Temperatur von 40°C in Medium 119 (DSMZ) inkubiert worden war. During a fermentation process in a test fermenter with a volume of 150 l under realistic plant conditions (temperature ~ 40 ° C, average volume load of 3 to 3.5 kg oTS / m ³ d) was over a period of several months, the time course of the entire generated Biogas in standard liters (gas volume at 273.15 K and 1013 mbar) determined per day (Nl / d). The fermentation process was carried out under otherwise identical conditions, in particular under the same loading of the room Fermenter, once without the addition of microorganisms and once with multiple addition (eg 2 times a week). In each case, the cell mass was added from 1 l of a preculture of Methanobacterium formicicum SBG25, which had been incubated for 5 days at a temperature of 40 ° C. in medium 119 (DSMZ).

Ein Vergleich der Menge an erzeugtem Biogas zeigte, dass bei Zugabe von Mikroorganismen Methanobacterium formicicum SBG25 eine deutlich erhöhte Menge, mindestens aber eine um 5 % höhere Menge an erzeugtem Biogas aus einer vorgegebenen Menge an organischer Trockensubstanz erzeugt wird als ohne Zugabe von Mikroorganismen. A comparison of the amount of biogas produced showed that with the addition of microorganisms Methanobacterium formicicum SBG25 a significantly increased amount, but at least a 5% higher amount of biogas produced from a given amount of organic dry matter is generated as without the addition of microorganisms.

In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel wurde eine Reinkultur von Methanobacterium formicicum SBG25 eingesetzt. Ebenso können aber auch Mischkulturen mit einem Anteil an Methanobacterium formicicum SBG25 verwendet werden. Insbesondere können Mischkulturen aus zwei oder drei Arten von Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum und Clostridium sporosphaeroides zugegeben werden. In the described embodiment, a pure culture of Methanobacterium formicicum SBG25 was used. Likewise, mixed cultures with a proportion of Methanobacterium formicicum SBG25 can also be used. In particular, mixed cultures of two or three kinds of microorganisms selected from the group consisting of Paenibacillus macerans, Clostridium sartagoformum and Clostridium sporosphaeroides can be added.

Der Einsatz von Mikroorganismen der Art Methanobacterium formicicum führt zu einer deutlichen Verbesserung von Effizienz und Wirkungsgrad von Biogasanlagen. SEQUENCE LISTING

The use of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum leads to a significant improvement in the efficiency and efficiency of biogas plants. SEQUENCE LISTING

Claims

Process for the production of biogas from biomass in a fermentation reactor, characterized in that the biomass is added to a microorganism of the species Methanobacterium formicicum in the form of a culture of microorganisms, wherein microorganisms of the species Methanobacterium formicicum at least 10 ^-4 % of the total number present in the culture Make up microorganisms.

A method according to claim 1, characterized in that in the culture of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum account for at least 10 ^-2 % of the total number of microorganisms present in the culture.

A method according to claim 2, characterized in that constitute in the culture of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum at least 1% of the total number of microorganisms present in the culture.

A method according to claim 3, characterized in that constitute in the culture of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum at least 10% of the total number of microorganisms present in the culture.

A method according to claim 4, characterized in that constitute in the culture of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum at least 50% of the total number of microorganisms present in the culture.

A method according to claim 5, characterized in that constitute in the culture of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum at least 75% of the total number of microorganisms present in the culture.

A method according to claim 6, characterized in that constitute in the culture of microorganisms of the species Methanobacterium formicicum at least 90% of the total number of microorganisms present in the culture.

Method according to at least one of claims 1 to 7, characterized in that a pure culture of the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is added.

Method according to at least one of claims 1 to 8, characterized in that microorganisms of the species Methanobacterium formicicum are added to the biomass as a constituent of at least one immobilized culture of microorganisms.

Method according to at least one of claims 1 to 9, characterized in that in time for the addition of the microorganism of the species Methanobacterium formicicum additional biomass is added to the fermentation reactor.

Method according to at least one of claims 1 to 10, characterized in that the space load in the fermentation reactor is continuously increased by the continuous addition of biomass.

Method according to at least one of claims 1 to 11, characterized in that the production of biogas from biomass at a space load of ≥ 0.5 kg oTS / m ³ d, preferably ≥ 4.0 kg oTS / m ³ d, more preferably ≥ 8.0 kg oTS / m ³ d.

Method according to at least one of claims 1 to 12, characterized in that the production of biogas from biomass occurs under constant mixing of the fermentation substrate.

Method according to at least one of claims 1 to 13, characterized in that the production of biogas from biomass at a temperature of 20 ° C to 80 ° C, preferably at a temperature of 40 ° C to 50 ° C is performed.

Method according to at least one of claims 1 to 14, characterized in that the addition of fermentation substrate and the addition of the microorganism of the species Methanobacterium formicicum continuously.

A method according to at least one of claims 1 to 15, characterized in that the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is added in an amount to the fermentation substrate, that after addition of the proportion of Microorganism of the species Methanobacterium formicicum accounts for between 10 ^-8 % and 50% of the total number of present in the fermentation substrate microorganisms.

A method according to claim 16, characterized in that the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is added in an amount to the fermentation substrate, that after addition of the proportion of the microorganism of the species Methanobacterium formicicum between 10 ^-6 % and 25% of the total number present in the fermentation substrate Constitutes microorganisms.

A method according to claim 17, characterized in that the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is added in an amount to the fermentation substrate, that after addition of the proportion of the microorganism of the species Methanobacterium formicicum between 10 ^-4 % and 10% of the total number present in the fermentation substrate Constitutes microorganisms.

A method according to claim 18, characterized in that the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is added in an amount to the fermentation substrate, that after addition of the proportion of the microorganism of the species Methanobacterium formicicum between 10 ^-3 % and 1% of the total number present in the fermentation substrate Constitutes microorganisms.

Process according to at least one of Claims 1 to 19, characterized in that the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is a microorganism of the strain Methanobacterium sp. Clone SMS-sludge-11 trades.

Process according to at least one of Claims 1 to 19, characterized in that the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is a microorganism of the strain Methanobacterium sp. 169 acts.

Process according to at least one of Claims 1 to 19, characterized in that the microorganism of the species Methanobacterium formicicum is a microorganism of the strain Archaeon clone CG-4.

Microorganism comprising a nucleic acid having a nucleotide sequence, characterized in that the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 98.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.

Microorganism according to claim 23, characterized in that the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 99% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.

Microorganism according to claim 24, characterized in that the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 99.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.

Microorganism according to Claim 25, characterized in that the nucleotide sequence contains a sequence region which corresponds to the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.

Microorganism comprising a nucleic acid having a nucleotide sequence, characterized in that the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 98.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 2.

Microorganism according to claim 27, characterized in that the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 99% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 2.

Microorganism according to claim 28, characterized in that the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 99.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 2.

Microorganism according to Claim 29, characterized in that the nucleotide sequence contains a sequence region which corresponds to the nucleotide sequence SEQ ID No. 2.

Microorganism comprising a nucleic acid having a nucleotide sequence, characterized in that the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 98% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.

Microorganism according to claim 31, characterized in that the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 98.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.

Microorganism according to claim 32, characterized in that the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 99% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.

Microorganism according to claim 33, characterized in that the nucleotide sequence contains a sequence region which has more than 99.5% sequence identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.

Microorganism according to Claim 34, characterized in that the nucleotide sequence contains a sequence region which corresponds to the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.

Culture of microorganisms suitable for use in a process for the fermentative production of biogas from biomass, characterized in that a microorganism according to claims 23 to 35 is present in the culture of microorganisms, wherein the microorganism comprises at least 10 ^-4 % of the total number in the Culture of existing microorganisms.

Culture of microorganisms according to claim 36, characterized in that the microorganism constitutes at least 10 ^-2 % of the total number of microorganisms present in the culture.

Culture of microorganisms according to claim 37, characterized in that the microorganism constitutes at least 1% of the total number of microorganisms present in the culture.

Culture of microorganisms according to claim 38, characterized in that the microorganism constitutes at least 10% of the total number of microorganisms present in the culture.

Culture of microorganisms according to claim 39, characterized in that the microorganism constitutes at least 50% of the total number of microorganisms present in the culture.

Culture of microorganisms according to claim 40, characterized in that the microorganism constitutes at least 90% of the total number of microorganisms present in the culture.

Culture of microorganisms according to claim 41, characterized in that it is a pure culture of a microorganism according to claims 28 to 45.

Culture of microorganisms according to at least one of claims 36 to 42, characterized in that it is an immobilized culture of microorganisms.

Use of a microorganism according to at least one of claims 23 to 35 for the fermentative production of biogas from biomass.

Use according to claim 44, characterized in that it is a process for the fermentative generation of biogas from biomass according to at least one of claims 1 to 22nd

Use of a culture of microorganisms according to at least one of claims 36 to 43 for the fermentative production of biogas from biomass.

Use according to claim 46, characterized in that it is a process for the fermentative production of biogas from biomass biomass according to at least one of claims 1 to 22.