DE102008062791A1

DE102008062791A1 - Mikroskop

Info

Publication number: DE102008062791A1
Application number: DE200810062791
Authority: DE
Inventors: Ralf Dr. Netz; Tiemo Dr. Anhut
Original assignee: Carl Zeiss MicroImaging GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2008-12-19
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2010-07-01

Abstract

Bei Mikroskopen werden üblicherweise kaskadierte Strahlteiler eingesetzt, um Licht mehrach spektral aufzuspalten. Das hat den Nachteil, viel Bauraum zu benötigen. Das gilt erst reicht mit zusätzlichen Optiken zur Zwischenabbildung zwischen den Strahlteilern, was für einen hohen Lichtleitwert erforderlich ist. Darüber hinaus tritt an jeder Kaskadenstufe zwangläufig ein Lichtverlust auf, so dass die Übertragungseffizienz mit zunehmender Anzahl von Teilungen geringer wird. Die Erfindung soll eine mehrfache räumlich-spektrale Aufspaltung mit geringem Bauraumbedarf und insbesondere hoher Übertragungseffizienz ermöglichen. Zu diesem Zweck wird ein Mikroskop mit einem Strahlteiler (15) mit mehreren ebenen dichroitischen Schichten (17), von denen zumindest zwei mit einem von Null verschiedenen Winkel zueinander angeordnet sind, zur räumlichen Aufspaltung von Beleuchtungs- und/oder Probenlicht (S) in mindestens drei Strahlen, insbesondere mit wechselseitig verschiedenen Wellenlängenbereichen und/oder wechselseitig unterschiedlichen Polarisationsrichtungen, ausgerüstet. Fluoreszenzmikroskopie.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang, der eine Lichtquelle zur Beleuchtung einer Probe mit Beleuchtungslicht umfasst, und einem Detektionsstrahlengang, der mindestens einen Detektor zur Detektion von Probenlicht umfasst. Das Probenlicht kann an der Probe reflektiertes oder gestreutes Beleuchtungslicht oder von der Probe emittiertes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, das durch das Beleuchtungslicht angeregt wurde, sein. Die Erfindung betrifft insbesondere abtastende (engl. „scanning”) Mikroskope und Weitfeldmikroskope.
Im Stand der Technik ist beispielsweise ein Mikroskop in Form eines Laser-Scanning-Mikroskops (LSM) in der Veröffentlichung DE 197 52 753 A1 , deren Offenbarungsgehalt hier in vollem Umfang einbezogen wird, beschrieben. In Laser-Scanning-Mikroskopen werden üblicherweise Strahlteiler als Hauptstrahlteiler zur Trennung von Beleuchtungs- und Probenlicht in zwei separate Strahlen eingesetzt.
Im Falle der Fluoreszenzmikroskopie, sei es bei Scanning-Mikroskopen oder bei Weitfeldmikroskopen, wird als Hauptstrahlteiler typischerweise ein dichroitischer Spiegel als sogenannter Hauptfarbteiler verwendet, der das anregende Beleuchtungslicht und das emittierte Probenlicht aufgrund ihrer unterschiedlichen Wellenlängenbereiche mit hoher Effizienz in zwei Strahlen trennt. Es ist auch bekannt, im Detektionsstrahlengang einen oder mehrere sogenannte Nebenfarbteiler einzusetzen, die das Probenlicht räumlich auf jeweils zwei Strahlen mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen aufspalten. Zur Handhabung von mehr als zwei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen ist eine entsprechende Anzahl von kaskadierten Strahlteilern erforderlich. 1 zeigt einen Ausschnitt aus einem Detektionsstrahlengang eines Mikroskops, in dem mittels zweier kaskadierter Farbteiler drei verschiedene Wellenlängenbereiche separiert und auf drei Detektoren geleitet werden.
Eine Strahlteilerkaskade hat den Nachteil, viel Bauraum zu benötigen. Diese Problematik wird bei mehreren hintereinandergeschalteten Strahlteilern noch verschärft durch zusätzliche Optiken zur Zwischenabbildung, die für einen hohen Lichtleitwert insbesondere in der Multiphotonen-Mikroskopie erforderlich sind. Darüber hinaus tritt an jeder Kaskadenstufe zwangsläufig ein Lichtverlust auf, so dass die Übertragungseffizienz mit zunehmender Anzahl von Teilungen geringer wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop der eingangs genannten Art zu so verbessern, dass eine räumlich-spektrale Aufspaltung von Licht auf mehr als zwei Strahlen bei geringem Bauraumbedarf ermöglicht wird.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Mikroskop, welches die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist. Die erfindungsgemäße Lösung wird ergänzt durch einen Strahlteiler, welcher die in Anspruch 12 angegebenen Merkmale aufweist, und durch ein Verfahren, welches die in Anspruch 13 angegebenen Merkmale aufweist.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Erfindungsgemäß ist ein Mikroskop mit einem Strahlteiler mit mehreren ebenen dichroitischen Schichten, von denen zumindest zwei mit einem von Null verschiedenen Winkel zueinander angeordnet sind, zur räumlichen Aufspaltung von Beleuchtungs- und/oder Probenlicht in mindestens drei Strahlen, insbesondere mit wechselseitig verschiedenen Wellenlängenbereichen und/oder wechselseitig unterschiedlichen Polarisationsrichtungen, ausgerüstet. Die relative Anordnung der dichroitischen Schichten kann auch dadurch beschrieben werden, dass für zumindest zwei der Schichten die geometrischen Ebenen, entlang derer die Schichten ausgerichtet sind, einander wechselseitig schneiden. Durch diese Anordnung mehrerer nicht-paralleler dichroitischer Schichten wird die räumlich-spektrale Aufteilung in mehr als zwei Strahlen mit kurzen Strahlengängen und geringem Bauraumbedarf ermöglicht. Ein derartiger Strahlteiler wird nachfolgend als Mehrwege-Strahlteiler bezeichnet. Ein solches Mikroskop ist kompakter und effizienter als bekannte Geräte. Das Kriterium des wechselseitigen Schneidens der mathematischen Ebenen kann über zwei Schichten hinaus insbesondere für alle dichroitischen Schichten erfüllt sein.
Im Falle eines Scanning-Mikroskops, bei dem der Detektionsstrahlengang aus dem Beleuchtungsstrahlengang ausgekoppelt wird, kann der Detektionsstrahlengang vor oder nach einem Abtastmodul (engl. „scanning module”) ausgekoppelt werden. Die erfindungsgemäße Anordnung eines Mehrwege-Strahlteilers kann daher entsprechend zum Zweck einer direkten Detektion in nicht-descanntem Probenlicht (engl. „non-descanned detection”; NDD) oder zur konfokalen Detektion in descanntem Probenlicht (engl. „descanned detection”) erfolgen. Alternativ oder zusätzlich kann die erfindungsgemäße Anordnung eines Mehrwege-Strahlteilers in einem reinen Beobachtungsstrahlengang, beispielsweise im Durchlicht, erfolgen. Hierbei wird üblicherweise descanntes Probenlicht mehrfach räumlich-spektral aufgespaltet. Es ist aber auch denkbar, ein zusätzliches Abtastmodul im Beobachtungsstrahlengang synchron mit dem Abtastmodul des Beleuchtungsstrahlengangs zu betreiben.
Es ist vorgesehen, den Mehrwege-Strahlteiler vorteilhafterweise im Detektionsstrahlengang anzuordnen, wenn der Detektionsstrahlengang mehrere Detektoren zur konfokalen Detektion des in die Strahlen aufgespalteten Probenlichts aufweist. Dadurch kann auf eine Strahlteilerkaskade, insbesondere mit Zwischenabbildungen, verzichtet werden, so dass eine farbspezifische Detektion mit geringem Bauraumbedarf gelingt. Anstelle der Aufspaltung in unterschiedliche Wellenlängenbereiche ist es möglich, dass zwei oder mehr der aufgespalteten Strahlen denselben Wellenlängenbereich aufweisen, um die auf die einzelnen Detektoren fallende Intensität zu reduzieren. Dies kann insbesondere bei photonenzählenden Detektoren vorteilhaft sein. Alternativ oder zusätzlich können die dichroitischen Schichten als Polarisationsfilter ausgebildet sein, so dass in den aufgespalteten Strahlen unterschiedliche Polarisationsrichtungen vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist dem Mehrwege-Strahlteiler eine (für alle Anteile des Probenlichts gemeinsame) Optik vorgeschaltet ist, die das Probenlicht über den Strahlteiler mit identischer Schärfe auf die betreffenden Detektoren fokussiert. Dadurch kann die Strahlenganglänge und der benötigte Bauraum weiter reduziert werden, da auf eine eigene Fokussieroptik für jeden der Detektoren verzichtet werden kann. Besonders bevorzugt ist eine Weiterbildung, in der die optischen Weglängen der aufgespalteten Strahlen durch den Strahlteiler identisch sind, insbesondere in Verbindung mit einer bezüglich aller austretenden Strahlen symmetrischen Form des Strahlteilers. Auf diese Weise können die Detektoren kompakt um den Strahlteiler angeordnet werden, so dass nur minimaler Bauraum benötigt wird.
Es ist vorteilhafterweise möglich, den Mehrwege-Strahlteiler als Hauptstrahlteiler zur Auskopplung mehrerer Detektionsstrahlengänge aus dem Beleuchtungsstrahlengang anzuordnen. Dies kann alternativ oder zusätzlich zu der obengenannten Anordnung eines Strahlteilers mit mehreren nicht-parallelen dichroitischen Schichten im ausgekoppelten Detektionsstrahlengang erfolgen. Auf diese Weise können ohne Strahlteilerkaskade mehrere unabhängige Detektionsstrahlengänge verwendet werden, beispielsweise für unterschiedliche Wellenlängenbereiche und/oder unterschiedliche Polarisationsrichtungen.
Vorzugsweise sind die dichroitischen Schichten des Mehrwege-Strahlteilers so angeordnet, dass die aufgespalteten Strahlen beim Austritt aus dem Strahlteiler jeweils eine über den Querschnitt jedes aufgespalteten Strahls einheitliche optische Weglänge aufweisen. Dadurch werden in einem abbildenden (nicht-kollimierten) Strahlengang die gleichartige Handhabung und/oder die Auswertung der aufgespalteten Strahlen vereinfacht. Weiter vorzugsweise weist der Strahlteiler für alle aufgespalteten Strahlen eine identische optische Weglänge auf, sowohl bei der Anordnung des Strahlteilers in einem abbildenden Strahlengang als auch in einem kollimierten Strahlengang, sei es im Beleuchtungs- und/oder im Detektionsstrahlengang. Durch die Erhaltung des Gangunterschieds werden Auswertungen, die auf Phasenunterschieden zwischen mehreren unterschiedlich farbigen und/oder unterschiedlich polarisierten Strahlen beruhen, ermöglicht. Beispielsweise können durch Überlagerung mehrerer der aufgespalteten Strahlen Interferenzerscheinungen gemessen werden.
Vorteilhafterweise ist der Mehrwege-Strahlteiler derart drehbar ausgebildet, dass die Zuordnung der Wellenlängenbereiche zu den aufgespalteten Strahlen bei kongruenter Lage der aufgespalteten Strahlen einstellbar ist. Dadurch können unterschiedliche Eigenschaften der einzelnen Detektoren, beispielsweise die Fähigkeit eines Detektors zur Photonenzählung oder unterschiedliche spektrale Empfindlichkeiten, ausgenutzt werden.
Es kann zweckmäßig sein, dem Mehrwege-Strahlteiler mindestens einen weiteren Strahlteiler, insbesondere einen Mehrwege-Strahlteiler mit mehreren nicht-parallelen dichroitischen Schichten vor- oder nachzuschalten. Durch eine solche Teilerkaskade kann der benötigte Bauraum zumindest gegenüber einer Kaskade einfacher Strahlteiler noch signifikant reduziert werden.
Die Gestaltung des Mehrwege-Strahlteilers mit mehreren dichroitischen Schichten gelingt auf unterschiedliche Weise: In einer ersten Ausführungsform weist der Strahlteiler mindestens einen optisch durchlässigen, polyedrischen Körper, insbesondere ein Prisma, auf, der auf einer oder mehreren Außenflächen mit einer jeweiligen der dichroitischen Schichten verspiegelt ist.
In einer bevorzugten Ausgestaltung sind mehrere, insbesondere vier oder sechs, optisch durchlässige, polyedrische Körper zumindest näherungsweise zu einem vorzugsweise regelmäßigen Polyeder, insbesondere zu einem Würfel, zusammengefügt, wobei mindestens eine der dichroitischen Schichten zwischen zwei der Körper angeordnet ist. Die Anordnung vier dichroitischer Prismen zu einem Würfel ist als dichroitisches „Kreuzprisma” oder „X-cube” beispielsweise aus US 6,698,893 B2 bekannt. Ein aus polyedrischen Körpern und dichroitischen Schichten gefügter Polyeder hat den Vorteil einer hohen Übertragungseffizienz, da die Anzahl der optischen Grenzflächen gegenüber einer herkömmlichen Reihenschaltung mehrerer einfacher Teilerwürfel geringer ist. Ein, mehrere oder alle den Polyeder bildende Körper können aus mehreren Unterkörpern, insbesondere aus Prismen, zusammengesetzt sein. Zusätzlich zu einer oder mehreren inneren dichroitischen Schichten können auch eine oder mehrere Außenflächen des Polyeders mit einer oder mehreren jeweiligen dichroitischen Schichten verspiegelt sein. Die Anordnung mit fünf, sechs oder mehr polyedrischen Körpern hat den Vorteil, dass das einfallende Licht in mehr als drei ausgehende Strahlen separiert werden kann. So können prinzipiell alle drei Raumdimensionen ausgenutzt werden.
Beispielsweise kann der Strahlteiler im Falle von sechs Prismen, die einen Würfel formen, fünf gleichförmige Ausgangsflächen aufweisen.
Insbesondere können um einen zentralen inneren polyedrischen Körper, insbesondere einen Würfel, die übrigen polyedrischen Körper angeordnet sein, insbesondere in Prismenform, wobei sich die dichroitischen Schichten zwischen dem inneren und den übrigen Körpern befinden. Durch das Zusammenfügen ergibt sich der Mehrwege-Strahlteiler-Polyeder.
In einer zweiten Ausführungsform weist der Strahlteiler mindestens zwei dichroitische Spiegelplatten auf, die jeweils eine der dichroitischen Schichten bereitstellen und unter einem von Null verschiedenen Winkel zueinander angeordnet sind. Beispielsweise können zwei dichroitische Spiegelplatten ineinandergesteckt werden, indem die erste Platte halbiert und jeweils eine Hälfte auf Vor- beziehungsweise Rückseite der zweiten Spiegelplatte angeordnet wird, so dass eine Kreuzform entsteht.
Die Erfindung wird vorzugsweise in der Fluoreszenzmikroskopie verwendet, weiter vorzugsweise in der Multiphotonenmikroskopie (MPM). Das erfindungsgemäße Mikroskop kann vorteilhafterweise zur Detektion von Resonanzübergängen eines Fluorophors zu einem anderen Fluorophor im Rahmen einer Fluoreszenzresonanzenergieübertragungsmessung (engl. „fluorescence resonance energy transfer”; FRET) verwendet werden. Durch die hohe Übertragungseffizienz kann ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis und damit eine hohe Genauigkeit der Messung erreicht werden. So ist die effiziente Trennung unterschiedlicher spektraler Anteile bei Multiplex-CARS oder verwandten Raman-Techniken möglich. Beispielsweise kann die effiziente Trennung vorteilhaft beim sogenannten „ratiometric imaging” verwendet werden.
Die Erfindung umfasst vorteilhafterweise ein Laser-Scanning-Mikroskop, insbesondere in einer Ausführungsform, in der mindestens ein Detektor zur Detektion von non-descanntem Probenlicht angeordnet ist.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
In den Zeichnungen zeigen:
1 eine herkömmliche Strahlteilerkaskade mit drei Detektoren,
2 einen erfindungsgemäßen Dreifach-Strahlteiler in mehreren Varianten,
3 einen Ausschnitt aus einem LSM-Detektionsstrahlengang mit drei Detektoren,
4 ein Laser-Scanning-Mikroskop mit Kreuzprisma im nicht-descannten Detektionsstrahlengang,
5 ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit Kreuzprisma im descannten Detektionsstrahlengang,
6 einen Ausschnitt aus einem LSM-Detektionsstrahlengang mit fünf Detektoren,
7 einen Ausschnitt aus einem LSM-Detektionsstrahlengang mit vier Detektoren,
8 einen Ausschnitt aus einem ersten LSM-Detektionsstrahlengang mit fünf Detektoren,
9 einen Ausschnitt aus einem zweiten LSM-Detektionsstrahlengang mit fünf Detektoren,
10 einen Ausschnitt aus einem zweiten LSM-Detektionsstrahlengang mit sechs Detektoren und
11 einen Ausschnitt aus einem dritten LSM-Detektionsstrahlengang mit sechs Detektoren.
In allen Zeichnungen tragen übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen.
1 zeigt einen Ausschnitt aus einem bekannten Detektionsstrahlengang D eines LSM (nicht abgebildet), in dem mittels zweier kaskadierter Farbteiler 10.1, 10.2 drei verschiedene Wellenlängenbereiche W1, W2, W3 separiert und auf drei Detektoren 11.1, 11.2, 11.3 geleitet werden. Von der Lichtquelle 12, beispielsweise einer fluoreszierenden Probe (nicht abgebildet), gelangt mehrfarbiges Licht S über eine Kollimationsoptik 13 auf den ersten Farbteiler 10.1. Dieser koppelt einen beispielsweise blauen Wellenlängenbereich W1 über eine Fokussieroptik 14.1 auf den ersten Detektor 11.1 aus. Eine Überlagerung eines beispielsweise grünen und eines beispielsweise roten Wellenlängenbereiches W2, W3 gelangt durch den ersten Strahlteiler 10.1 in kollimierter Form zu dem zweiten Strahlteiler 10.2. Dieser koppelt den grünen Wellenlängenbereich W2 über eine Fokussieroptik 14.2 auf den zweiten Detektor 11.2 aus. Der verbleibende rote Wellenlängenbereich W3 fällt durch eine weitere Fokussieroptik 14.3 auf den dritten Detektor 11.3.
2 zeigt zwei mögliche Ausführungsformen eines Dreiwege-Strahlteilers 15 für ein erfindungsgemäßes Laser-Scanning-Mikroskop (nicht abgebildet). In Teilfigur 2A weist der Strahlteiler 15 zwei ineinandergesteckte dünne Farbteiler 10.1 und 10.2 auf. Jeder Farbteiler 10.1, 10.2 besteht aus einer einzelnen dichroitischen Spiegelplatte, die jeweils senkrecht zu ihrer optischen Achse einen Schlitz der halben Plattenkantenlänge aufweist. Die Spektralbereiche in Transmission beziehungsweise Reflexion ihrer dichroitischen Schichten (nicht abgebildet) überlappen einander nicht. Alternativ ist es möglich, für einen der Farbteiler 10.1 oder 10.2 zwei vollständig getrennte Spiegelplatten (nicht abgebildet) zu verwenden, die beidseits des jeweils anderen Farbteilers 10.2 beziehungsweise 10.1 angeordnet werden. In beiden Fällen ist es zweckmäßig, die Spiegelplatten 10.1 und 10.2 durch eine Fassung 10.3 zu fixieren. Um Verluste an den Vereinigungskanten zu verringern, sind die Substrate der Spiegelplatten 10.1 und 10.2 zweckmäßigerweise dünn, beispielsweise wie sogenannte Display-Gläser.
Leichter herzustellen als ineinandergesteckte Spiegelplatten ist die in Teilfigur 2B gezeigte Alternative, bei der zwischen vier gleichschenkligen Prismen 16.1, 16.2, 16.3 und 16.4 zwei einander kreuzende dichroitische Schichten 17.1 und 17.2 angeordnet sind. Die Prismen 16 und die dichroitischen Schichten 17 sind kompakt aneinandergefügt, so dass die Anzahl der optischen Übergänge minimal ist.
Einfallendes, mehrfarbiges Licht S wird von dem Dreiwege-Strahlteiler 15 räumlichspektral in drei Strahlen zerlegt, die beispielsweise disjunkte Wellenlängenbereiche W1, W2 und W3 aufweisen. Die Prismen stoßen mit ihren rechten Winkeln aufeinander, sind aber stets durch die dichroitischen Schichten voneinander getrennt. Beide Schichten setzen sich über den mittleren Kreuzungspunkt hinweg fort und nehmen jeweils zwei Prismenseitenflächen ein, also im Betrag die Fläche einer Raumdiagonale des Würfels, ein. Die Prismen können beispielsweise aus Glas, insbesondere aus Quarzglas bestehen.
Eine weitere Alternative stellt ein Dreiwege-Strahlteilerwürfel 15 dar, der aus einem inneren Würfel 18 und vier äußeren Prismen 16 zusammengefügt ist, wobei der innere Würfel 18 zweckmäßigerweise optisch homogen ist, beispielsweise aus demselben Material wie die Prismen besteht und auf zumindest vier Außenflächen Paare 17.1A, 17.1B und 17.2A, 17.2B von dichroitischen Schichten 17.1 und 17.2 trägt. Dabei erfolgt die spektrale Teilung des einfallenden Lichts S an der Oberfläche des inneren Würfels 18. Die optischen Wege der an einem der Schichtpaare reflektierten Lichtanteile eines aufgespalteten Strahls W_1/2/3 sind jedoch verschieden, was in einem abbildenden Strahlengang nachteilig sein kann. Beispielsweise können dadurch die Foki der beiden Strahlanteile an unterschiedlichen Positionen liegen, was unter Umständen problematisch für die Detektion sein kann. In einem kollimierten Strahlengang, beispielsweise als Hauptstrahlteiler eines LSM 1 oder durch Vorschaltung einer Kollimationsoptik 13, kann ein derartiger Strahlteiler 15 aber vorteilhafterweise zur Bauraumreduktion verwendet werden, ohne dass diese Nachteile auftreten. In einer nichtabbildenden Sammeloptik, beispielsweise im Falle einer direkten (nicht-descannten) Detektion in der nichtlinearen Mikroskopie, ist ebenso ein Einsatz des Mehrwege-Strahlteilers 15 möglich.
In 3 sind Ausschnitte aus Detektionsstrahlengängen D zweier verschiedener Mikroskope (nicht abgebildet) dargestellt, in denen erfindungsgemäß ein dichroitisches Kreuzprisma gemäß 2B als Dreiwege-Strahlteiler 15 zur räumlich-spektralen Aufspaltung von einfallendem Probenlicht S einer Lichtquelle 12 in einer Probe (nicht abgebildet) in wechselseitig verschiedene Wellenlängenbereiche W_1...3 auf drei Detektoren 11.1...3 dient. In Teilfigur 3A ist vor dem Strahlteiler 15 eine Kollimationsoptik 13 angeordnet, so dass das einfallende Licht als paralleles Strahlenbündel auf den Strahlteiler 15 und seine dichroitischen Schichten (der Übersicht halber nicht mit Bezugszeichen 17 versehen, siehe stattdessen 2B). In jedem aufgespalteten Strahl ist dem betreffenden Detektor 11.1, 11.2, 11.3 eine jeweilige Optik 14.1, 14.2, 14.3 zur Fokussierung des aus dem Strahlteiler 15 austretenden, kollimierten Strahlenbündels auf den betreffenden Detektor 11.1, 11.2, 11.3 vorgeschaltet. In der in Teilfigur 3B gezeigten, vorteilhaften Alternative ist dem Strahlteiler 15 anstelle einer Kollimationsoptik eine Fokussieroptik 29 vorgeschaltet. Dadurch kann auf detektorindividuelle Fokussieroptiken zwischen dem Strahlteiler 15 und den Detektoren 11 verzichtet werden, um die Kompaktheit des Detektionsstrahlengangs D zu erhöhen. Der Verständlichkeit halber sind die Detektoren 11 in der Zeichnung relativ weit vom Strahlteiler 15 entfernt dargestellt. Tatsächlich können die Detektoren 11 unmittelbar an den Strahlteiler 15 angrenzen. Auch sind die Strahlengänge nicht maßstäblich eingezeichnet, sondern nur grob angedeutet. Zweckmäßigerweise sind die optischen Weglängen von der Fokussieroptik 29 bis zu jedem der Detektoren 11.1, 11.2 und 11.3 identisch, um eine einheitliche Detektionseffizienz zu erreichen. Auf Optiken zur Zwischenabbildung kann verzichtet werden.
4 ist eine schematische Darstellung eines beispielhaften LSM 1, das mittels einer Steuereinheit 34 gesteuert wird. Das LSM 1 ist modular aus einem Beleuchtungsmodul L mit Lasern 23, einem Abtastmodul S (engl. „scanning module”), einem Detektionsmodul D und der Mikroskopeinheit M mit dem Mikroskopobjektiv 31 zusammengesetzt. Das Licht der Laser 23 kann durch Lichtklappen 24 und Abschwächer 25 von der Steuereinheit 34 beeinflusst werden, bevor es über Lichtleitfasern und Koppeloptiken 20 in die Abtasteinheit S eingespeist und vereinigt wird. Über den Hauptstrahlteiler 33 und die X-Y-Abtasteinheit 30, die zwei Galvanometerspiegel aufweist (nicht dargestellt), gelangt es durch das Mikroskopobjektiv 21 zur Probe 22, wo es ein Fokusvolumen (nicht abgebildet) beleuchtet. Dort erfolgt beispielsweise eine Zwei- oder Mehrphotonenanregung.
Von der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht gelangt durch das Mikroskopobjektiv 21 über den Hauptstrahlteiler 33 als nicht-descanntes Probenlicht in das Detektionsmodul D. Zur Fluoreszenzdetektion kann der Hauptstrahlteiler 30 beispielsweise als dichroitischer Farbteiler ausgebildet sein. Das Detektionsmodul D weist drei Detektionskanäle mit jeweils einem Photovervielfacher 11 auf. Ein Strahlteiler 15, der gemäß 2B als dichroitischer Multi-Prismen-Nebenfarbteiler aufgebaut ist und entsprechend 3B mit einer vorgeschalteten gemeinsamen Fokussieroptik 29 versehen ist, dient der räumlich-spektralen Aufspaltung des von der Probe 22 einfallenden Lichts auf die drei Detektoren 11. Aufgrund der Multiphotonenanregung kann Fluoreszenzlicht nur aus dem Fokusvolumen stammen. Auf konfokale Blenden kann daher verzichtet werden. Die Photovervielfacher 11 detektieren dennoch ausschließlich Licht aus dem Fokusvolumen. Der Strahlteiler 15 zerlegt das von der Probe 22 einfallende Licht räumlich-spektral in drei Strahlen mit wechselseitig unterschiedlichen Wellenlängenbereichen. Die Optik 29 fokussiert aufgrund gleicher optischer Wege alle spektralen Anteile des Probenlichts unabhängig von der Aufspaltung durch den Strahlteiler 15 gemeinsam auf die optische Entfernung der Detektoren 11, so dass jeweils nur ein Wellenlängenbereich den betreffenden Detektor 11 erreicht.
Das konfokal beleuchtete und aufgenommene Fokusvolumen der Probe 22 kann mittels der Abtasteinheit 30 über die Probe 22 bewegt werden, um pixelweise ein Bild aufzunehmen, indem die Galvanometerspiegel der Abtasteinheit 30 gezielt verdreht werden. Sowohl die Bewegung der Galvanometerspiegel als auch das Schalten der Beleuchtung mittels der Lichtklappen 24 oder der Abschwächer 25 werden unmittelbar von der Steuereinheit 34 gesteuert. Die Datenaufnahme von den Photovervielfachern 11 erfolgt ebenfalls über die Peripherieschnittstelle 4.
Der Detektionsstrahlengang mit dem Mehrwege-Strahlteiler 15 kann alternativ oder zusätzlich zur Anordnung im konfokalen Detektionsweg auch in einem direkten Detektionsweg in Vorwärts- oder Rückwärtsrichtung, wie sie bei nichtlinearen Techniken üblich ist, angeordnet sein.
5 ist eine schematische Darstellung eines beispielhaften LSM 1, das mittels einer Steuereinheit 34 gesteuert wird. Das LSM 1 ist modular aus einem Beleuchtungsmodul L mit Lasern 23, einem Abtastmodul S (engl. „scanning module”), einem Detektionsmodul D und der Mikroskopeinheit M mit dem Mikroskopobjektiv 31 zusammengesetzt. Das Licht der Laser 23 kann durch Lichtklappen 24 und Abschwächer 25 von der Steuereinheit 34 beeinflusst werden, bevor es über Lichtleitfasern und Koppeloptiken 20 in die Abtasteinheit S eingespeist und vereinigt wird. Über den Hauptstrahlteiler 33 und die X-Y-Abtasteinheit 30, die zwei Galvanometerspiegel aufweist (nicht dargestellt), gelangt es durch das Mikroskopobjektiv 21 zur Probe 22, wo es ein Fokusvolumen (nicht abgebildet) beleuchtet.
Von der Probe reflektiertes Licht oder emittiertes Fluoreszenzlicht gelangt durch das Mikroskopobjektiv 21 über die Abtasteinheit 30 durch den Hauptstrahlteiler 33 in das Detektionsmodul D. Zur Fluoreszenzdetektion kann der Hauptstrahlteiler 30 beispielsweise als dichroitischer Farbteiler ausgebildet sein. Das Detektionsmodul D weist drei Detektionskanäle mit jeweils einem Filter 28 und einem Photovervielfacher 11 auf. Ein Mehrwege-Strahlteiler 15, der gemäß 2B als dichroitischer Multi-Prismen-Nebenfarbteiler aufgebaut ist und entsprechend 3B mit einer vorgeschalteten gemeinsamen Fokussieroptik 29 versehen ist, dient der räumlich-spektralen Aufspaltung des von der Probe 22 einfallenden Lichts auf die drei Detektoren 11. Eine der gemeinsamen Optik 29 vorgeschaltete konfokale Lochblende 31 dient der Diskriminierung von Probenlicht, das nicht aus dem Fokusvolumen stammt. Die Photovervielfacher 11 detektieren daher ausschließlich Licht aus dem Fokusvolumen. Anstelle einer Lochblende 31 kann beispielsweise bei linienförmiger Beleuchtung auch eine Schlitzblende (nicht abgebildet) verwendet werden. Der Strahlteiler 15 zerlegt das von der Probe 22 einfallende Licht räumlichspektral in drei Strahlen mit wechselseitig unterschiedlichen Wellenlängenbereichen. Die Optik 29 fokussiert alle spektralen Anteile des Probenlichts unabhängig von der Aufspaltung durch den Strahlteiler 15 gemeinsam auf die optische Entfernung der Detektoren 11, so dass jeweils nur ein Wellenlängenbereich den betreffenden Detektor 11 erreicht.
Das konfokal beleuchtete und aufgenommene Fokusvolumen der Probe 22 kann mittels der Abtasteinheit 30 über die Probe 22 bewegt werden, um pixelweise ein Bild aufzunehmen, indem die Galvanometerspiegel der Abtasteinheit 30 gezielt verdreht werden. Sowohl die Bewegung der Galvanometerspiegel als auch das Schalten der Beleuchtung mittels der Lichtklappen 24 oder der Abschwächer 25 werden unmittelbar von der Steuereinheit 34 gesteuert. Die Datenaufnahme von den Photovervielfachern 11 erfolgt ebenfalls über die Peripherieschnittstelle 4.
Es ist möglich, in alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) sowohl eine descannte als auch eine nicht-descannte Detektion zu verwenden. Erfindungsgemäß können dabei ein oder mehrere Mehrwege-Strahlteiler in einem descannten und/oder in einem nicht-descannten Detektionsstrahlengang angeordnet sein.
In 6 ist ein Detektionsstrahlengang D mit fünf Detektoren 11.1/2/3/4/5 schematisch im Querschnitt dargestellt. Teilfigur 5A zeigt die Ansicht von vorn in Eingangsrichtung des einfallenden Strahls S. Teilfigur 5B zeigt die Ansicht von oben und Teilfigur 5C die Ansicht von rechts, bezogen auf Teilfigur 5A. Der Strahlteiler 15 ist ein Würfel, der aus sechs pyramidenförmigen optisch durchlässigen Körpern (der Übersicht halber nicht mit Bezugszeichen 16 versehen, siehe stattdessen entsprechend 2B) und vier dazwischenliegenden dichroitischen Schichten (der Übersicht halber nicht mit Bezugszeichen 17 versehen, siehe stattdessen entsprechend 2B) besteht. Die Körper 16 stoßen an den Pyramidenspitzen aufeinander, sind aber stets durch die dichrotischen Schichten voneinander getrennt. Jede der vier Schichten setzt sich über den mittleren Kreuzungspunkt hinweg fort und nimmt zwei Pyramidenseitenflächen, also im Betrag die Fläche einer halben Raumdiagonale des Würfels, ein. Die Detektoren 11 sind längs der Oberflächennormalen der fünf neben der Eintrittsfläche verbleibenden Würfelflächen angeordnet und blicken auf den Strahlteilerwürfel 16. Analog zu 3B ist der Strahlteiler 15 in einem abbildenden, nicht in einem kollimierten Strahlengang angeordnet. Es ist lediglich eine einzelne Abbildungsoptik 13 vor dem Strahlteiler 15 angeordnet, die jedoch aus mehreren optischen Komponenten bestehen kann. Fünf wechselseitig verschiedene Wellenlängenbereiche W_1/2/3/4/5 werden auf je einen der Detektoren 11.1/2/3/4/5 fokussiert und aufgrund identischer optischer Wege mit identischer Effizienz detektiert.
7 zeigt einen Detektionsstrahlengang D mit vier Detektoren 11. Einem Mehrwegestrahlteiler 15 ist in Reihe ein einfacher Zweiwegeteiler 10 vorgeschaltet. Der Mehrwegestrahlteiler 15 liegt im kollimierten Strahlengang. Das Transmissionsband des Zweiwegeteilers 10 überlappt mit den Transmissions- und Reflexionsbändern des Mehrwegeteilers 15, das Reflexionsband des Zweiwegeteilers 10 ist disjunkt. Durch den Mehrwege-Teiler 15 können ein herkömmlicher Zweiwege-Teiler eingespart und Zwischenabbildungen vermieden werden.
In 8 ist in Erweiterung der 6 dem ersten Zweiwegeteiler 10 ein weiterer Zweiwegeteiler 10 zur Farbseparation nachgeschaltet. Dadurch können mit fünf Detektoren 11.1/2/3/4/5 fünf wechselseitig unterschiedliche Wellenlängenbänder W_1...5 detektiert werden. Alternativ ist es in diesem Ausführungsbeispiel und in allen Ausführungsformen möglich, in mehreren oder gar allen Detektoren denselben Wellenlängenbereich zu detektieren, sei es zur Intensitätsreduktion oder zur simultanen Detektion mit unterschiedlichen Detektorarten oder -zählweisen.
9 zeigt eine Variante mit zwei Mehrwege-Strahlteilern 15A, 15B, die im kollimierten Strahlengang angeordnet sind, wobei fünf Detektoren 11.1/2/3/4/5 in einer Ebene angeordnet sind. Mit dieser Ausführungsform können zwei herkömmliche Zweiwege-Teiler eingespart und Zwischenabbildungen vermieden werden. Das gilt auch für die in 10 dargestellte Ausführungsform mit sechs Detektoren 11.1/2/3/4/5/6.
In 11 ist eine kompakte Ausführungsform mit zwei Mehrwege-Strahlteilern 15A, 15B und sechs Detektoren 11.1/2/3/4/5/6 dargestellt, die in einer Ebene angeordnet sind. Die Mehrwege-Strahlteilern 15A, 15B befinden sich im abbildenden Strahlengang einer gemeinsamen, dem Zweiwegeteiler 10 vorgeschalteten Fokussieroptik 29. Alle Detektoren 11 weisen identische optische Abstände von der Optik 29 auf und sind kompakt an den Ausgängen der Mehrwege-Strahlteilern 15A, 15B platziert. Die Transmissions- und Reflexionsbänder des Zweiwege-Teilers 10 sind disjunkt. Hingegen überlappt das Reflexionsband Zweiwege-Teilers 10 mit den Transmissions- und Reflexionsbändern des ersten Mehrwege-Strahlteilers 15A. Das Transmissionsband des Zweiwege-Teilers 10 überlappt mit den Transmissions- und Reflexionsbändern des zweiten Mehrwege-Strahlteilers 15B. Selbstverständlich kann diese Ausführungsform durch pyramidale Form der zusammengefügten optisch durchlässigen Körper 16 der Mehrwege-Strahlteiler 15A, 15B in Entsprechung zu 5 auf zehn Detektoren 11 erweitert werden. Auch ist es möglich, anstelle des Zweiwege-Teilers 10 einen weiteren Mehrwege-Teiler (nicht abgebildet) einzusetzen und an dessen dritten Ausgang einen weiteren Mehrwege-Teiler (nicht abgebildet) anzuschließen. Weisen in diesem Fall die drei äußeren Mehrwege-Teiler jeweils drei Ausgänge auf, so kann das einfallende Licht S in neun Strahlen aufgespaltet werden. Werden die drei äußeren Mehrwege-Teiler mit jeweils fünf Ausgängen versehen, so kann das einfallende Licht S in fünfzehn Strahlen aufgespaltet werden In allen Ausführungsformen der Erfindung kann der Mehrwege-Strahlteiler 15 drehbar ausgeführt sein, um die aufgespalteten Strahlen zwischen den Detektoren 11 umzuschalten. Dadurch können beispielsweise unterschiedliche Detektoreigenschaften wie Eignung zur Photonenzählung und spektrale Empfindlichkeit ausgenutzt werden. Außerdem eignen sich die Strahlteiler 15 dazu, die Menge des einfallenden Lichts S auf mehrere Detektionskanäle/Detektoren 11 zu aufzuspalten, um ein Überschreiten der maximalen Zählrate von photonenzählenden Detektoren 11 zu vermeiden.
Neben der nichtlinearen Fluoreszenzmikroskopie können ein oder mehrere Mehrwege-Strahlteiler 15 auch in anderen nichtlinearen Mikroskopieverfahren wie der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Mikroskopie (engl. „coherent anti-Stokes Raman Microscopy”; CARS) und/oder bei multimodaler Bildaufnahme eingesetzt werden.
Möglich ist außerdem ein Einsatz in der abbildenden Mikroskopie, bei der die Aufnahme mit Kameras erfolgt. Beispielsweise benutzt man für die normale Weitfeldmikroskopie oder bestimmte Varianten dieser, wie zum Beispiel die Aufnahme ausgewählter Schichten (engl. „Selective Plane Illumination Microscopy”; SPIM), oft verschiedene spektral getrennte Kanäle für die Bildaufnahme. Die Trennung kann vorteilhafterweise gemäß der Erfindung mit einem Mehrwege-Strahlteiler erfolgen.
Neben der reinen Abbildung kann mit einem oder mehreren Mehrwege-Strahlteilern 15 auch eine Auswertung der Fluoreszenzlebensdauer oder anderer Parameter, die die zu detektierende Strahlung charakterisieren, spektral erfolgen.

1: Mikroskop
10: Farbteiler
11: Detektor
12: Lichtquelle
13: Kollimationsoptik
14: Fokussieroptik
15: Strahlteiler
16: Optisch durchlässiger Körper
17: Dichroitische Schicht
18: Innerer Würfel
20: Kollimationsoptik
21: Mikroskopobjektiv
22: Probe
23: Laser
24: Lichtklappe
25: Abschwächer
26: Faserkoppler
27: Tubuslinse
28: Filter
29: Fokussieroptik
30: Scannerspiegel
31: Lochblende
33: Hauptstrahlteiler
34: Steuereinheit
D: Detektionsmodul
M: Mikroskop
L: Beleuchtungsmodul
S: Abtastmodul

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- DE 19752753 A1 [0002]
- US 6698893 B2 [0017]

Claims

Mikroskop (1) mit einem Beleuchtungsstrahlengang, der eine Lichtquelle (23) zur Beleuchtung einer Probe (22) mit Beleuchtungslicht umfasst, und einem Detektionsstrahlengang (D), der mindestens einen Detektor (11) zur Detektion von Probenlicht (S) umfasst, gekennzeichnet durch einen Strahlteiler (15) mit mehreren ebenen dichroitischen Schichten (17), von denen zumindest zwei mit einem von Null verschiedenen Winkel zueinander angeordnet sind, zur räumlichen Aufspaltung von Beleuchtungs- und/oder Probenlicht (S) in mindestens drei Strahlen.
Mikroskop (1) nach Anspruch 1, wobei der Strahlteiler (15) im Detektionsstrahlengang (D) angeordnet ist und der Detektionsstrahlengang (D) mehrere Detektoren (11) zur Detektion des in die Strahlen aufgespalteten Probenlichts (S) aufweist.
Mikroskop (1) nach Anspruch 2, wobei dem Strahlteiler (15) eine (für alle Anteile des Probenlichts gemeinsame) Optik (19) vorgeschaltet ist, die das Probenlicht (S) über den Strahlteiler (15) auf die betreffenden Detektoren (11) fokussiert.
Mikroskop (1) nach Anspruch 1, wobei der Strahlteiler (15) als Hauptstrahlteiler zur Auskopplung mehrerer Detektionsstrahlengänge (D) aus dem Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist.
Mikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die optischen Weglängen der aufgespalteten Strahlen durch den Strahlteiler (15) identisch sind.
Mikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Strahlteiler (15) derart drehbar ausgebildet ist, dass die aufgespalteten Strahlen miteinander vertauschbar sind.
Mikroskop (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dem Strahlteiler (15) mindestens ein weiterer Strahlteiler (10, 15), insbesondere ein Strahlteiler (15) mit mehreren dichroitischen Schichten (17), von denen zumindest zwei mit einem von Null verschiedenen Winkel zueinander angeordnet sind, vor- oder nachgeschaltet ist.
Mikroskop (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Strahlteiler (15) mindestens einen optisch durchlässigen, polyedrischen Körper (16, 18), insbesondere ein Prisma, aufweist, das auf einer oder mehreren Außenflächen mit einer jeweiligen der dichroitischen Schichten (17) verspiegelt ist.
Mikroskop (1) nach Anspruch 8, wobei mehrere, insbesondere vier oder sechs, optisch durchlässige, polyedrische Körper (16, 18) zumindest näherungsweise zu einem (regelmäßigen) Polyeder, insbesondere zu einem Würfel, zusammengefügt sind, wobei mindestens eine der dichroitischen Schichten (17) zwischen zwei der Körper (16, 18) angeordnet ist.
Mikroskop (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Strahlteiler (15) mindestens zwei dichroitische Spiegelplatten (10.1, 10.2) aufweist, die jeweils eine der dichroitischen Schichten (17) bereitstellen und unter einem von Null verschiedenen Winkel zueinander angeordnet sind.
Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der mindestens eine Detektor insbesondere zur Detektion von non-descanntem Probenlicht angeordnet ist.
Strahlteiler (15) mit mehreren optisch durchlässigen Körpern (16), insbesondere Prismen, und mehreren ebenen dichroitischen Schichten (17), von denen zumindest zwei mit einem von Null verschiedenen Winkel zueinander angeordnet sind, zur räumlichen Aufspaltung von einfallendem Licht (S) in mindestens vier Strahlen, wobei die Körper (16) zumindest näherungsweise zu einem (regelmäßigen) Polyeder, insbesondere zu einem Würfel, zusammengefügt sind, wobei mindestens eine der dichroitischen Schichten (17) zwischen zwei der Körper (16) angeordnet ist.
Verfahren zum Betrieb eines Laser-Scanning-Mikroskops (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei ein Resonanzübergang eines Fluorophors zu einem anderen Fluorophor detektiert wird.