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Die
Erfindung betrifft verkapselte Mikropartikel, mit einem Kern, der
Viren in freier oder an einen Träger gebundener Form enthält,
und einer Hülle, die den Kern umschließt. Die
Erfindung betrifft weiterhin ein dazugehöriges Herstellungsverfahren
für die Mikropartikel. Die Verkapselung dient insbesondere
der Verbesserung der UV-Stabilität und Erhöhung
der Aufnahmerate von Baculoviren durch einen Wirtsorganismus, die
zur Schädlingsbekämpfung eingesetzt werden.
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Technologischer Hintergrund
und Stand der Technik
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In
zunehmendem Maße wird beispielsweise im ökologischen
und integrierten Landbau der Einsatz von Viren zur Schädlingsbekämpfung
angestrebt. Der kommerzielle Einsatz viraler Partikel bedingt die
Notwendigkeit Formulierungen zu finden, die eine praktikable Handhabung
der Viren erlauben, das heißt, die jeweils einzusetzenden
Präparate müssen hinreichende Stabilität
im Einsatzfeld, eine ausreichende Dosierung an viralen Partikeln
besitzen sowie gegebenenfalls bestehenden Sicherheitsbestimmungen
genügen.
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So
stellt beispielsweise der Einsatz von Baculoviren im ökologischen
und integrierten Landbau eine bisher sehr bewährte biologische
Bekämpfungsstrategie dar. Diese beruht auf einer absoluten
Selektivität der Viren, ihrer Nützlingsschonung
bei gleichzeitig sehr guter Wirksamkeit gegen den Zielorganismus
und einer Ungiftigkeit gegenüber Anwender und Umwelt. Damit
vereinigen auf Baculoviren basierende biologische Insektizide positive ökologische
und ökonomische Aspekte. Aktuell sind aus der Familie der
Baculoviren mehrere hundert Arten bekannt, einige davon sind mittlerweile
als Insektizide zugelassen, so z. B. Baculoviren gegen den Baumwollkapselwurm,
Schwammspinner, Apfelwickler und Apfelschalenwickler. In Deutschland
besitzen derzeit nur Baculoviren aus der Gattung Granulovirus eine
Zulassung. Dabei handelt es sich um das Apfelschalenwickler-Granulovirus
und das Apfelwickler-Granulovirus.
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Der
ursprünglich nur in Europa vorkommende Apfelwickler (Cydia
pomonella L.) ist inzwischen weltweit verbreitet und stellt einen
der bedeutendsten Schädlinge in der Landwirtschaft dar.
Für seine Bekämpfung werden im konventionellen
Obstbau bevorzugt synthetische Insektizide eingesetzt, wohingegen
im ökologischen Obstbau Pheromone und Apfelwickler-Granuloviren
Anwendung finden. Auch im integrierten Obstbau vertraut man vermehrt
auf die Wirkung der Granuloviren. Dies soll unter anderem einer
zu schnellen Resistenzbildung gegen synthetische Insektizide entgegen
wirken.
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Granuloviren
haben generell die Eigenschaft, dass sie ausschließlich
die Larvenstadien ihres Wirtes (Insekten) befallen. Zur Entfaltung
ihrer Pathogenität müssen sie aktiv vom Wirt aufgenommen
werden um anschließend im Verdauungstrakt endocytotisch
in die Darmepithelzellen zu gelangen, wo sie in ihre virulente Form übergehen.
Dadurch werden die infizierten Larven innerhalb von 5 bis 9 Tage
abgetötet und verursachen keinen Schaden mehr am Apfel.
In der Praxis hat es sich jedoch gezeigt, dass die Aufnahmerate
des Virus zu gering ist, mit der Konsequenz, dass die Apfelwicklerlarve
nicht kurz nach dem Fressen oder/und dem Einbohren in den Apfel
abstirbt. Erschwerend kommt noch hinzu, dass die Halbwertszeit des
Apfelwickler-Granulovirus grundsätzlich nur bei zwei vollen
Sonnentagen liegt und damit die einzelnen Spritzungen spätestens nach
acht Tagen wiederholt werden müssen, damit ein ausreichender
Schutz der Äpfel gewährleistet ist. In sonnigen
Jahren kann dies bis zu 13 Wiederholungen und mehr für
den Landwirt bedeuten. Um diesen Nachteilen entgegenzuwirken wird
bisher zur Steigerung der Aufnahmerate des Virus die Zugabe von
Zucker (5 kg/ha) und zur Verbesserung seiner UV-Stabilität
die Zugabe von zum Beispiel 0,25% Magermilchpulver zur Spritzbrühe
empfohlen. Die genannten Zusätze werden in die hoch verdünnte
Spritzbrühe (Wasser und Virus) in erheblichen Mengen hinzugefügt,
damit sichergestellt ist, dass sich die gewünschten Verbesserungen
in Aufnahmerate und UV-Stabilität einstellen. Trotz vielversprechender
Lösungsansätze zur Verbesserung des Einsatzes
von Viren, insbesondere Baculoviren, als biologisches Schädlingsbekämpfungsmittel
im Landbau steht bisher noch kein Präparat zur Verfügung,
das allen Anforderungen der Praxis genügt.
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Arthurs
et al. beschreiben als Erste die Herstellung und Verwendung sprühgetrockneter,
ligninverkapselter Formulierungen des Granulovirus CpGV zur Bekämpfung
von Cydia pomonella, wobei die Formulierung TiO2 als
UV-Stabilisator und Zucker als Fraßlockstoff eingesetzt
ist (Evaluation of spray-dried lignin-based formulations
and adjuvants as solar protectants for the granulovirus of the codling moth,
Cydia pomonella (L) – Arthurs, S. P.; Lacey, L. A.; Behle,
R. W.; Yakima Agricultural Research Laborstory, USA; Journal of
Invertebrate Pathology (2006), 93(2), 88–95).
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Erfindungsgemäße
Lösung
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Die
Erfindung geht aus von verkapselten Mikropartikeln mit einem Kern,
der Viren in freier oder an einen Träger gebundener Form
enthält, und einer Hülle, die den Kern umschließt.
Die erfindungsgemäßen Mikropartikel zeichnen sich
dadurch aus, dass die Hülle zu mindestens 50 Gew.-% aus
einem oder mehreren Triacylglyceriden mit einer Kettenlänge
der Fettsäuren von C10 bis C24 besteht.
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Der
Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass gesättigte
oder ungesättigte Triacylglyceride mit einer Kettenlänge
der Fettsäuren mit einer Länge von 10 bis 24 Kohlenstoff-Atomen
die Verkapselung von Viren in freier oder an Träger gebundener
Form erlauben, ohne dass deren virale Aktivität gehemmt
ist. Die Materialwahl für die Hülle hat unter
anderem den Vorteil, dass sie eine schnelle Resorption der Viren nach
Aufnahme durch den Wirt ermöglichen, denn gerade diese
Fette passieren besonders einfach die Epithelzellen im Verdauungstrakt
der Schädlinge. Weiterhin ist die Triacylglycerid-Hülle
besonders dazu geeignet, als Matrix für weitere Additive
zu dienen, insbesondere wenn diese einen hydrophoben Charakter besitzen.
Unter Kern im Sinne der Erfindung werden alle von der Hülle
umfassten Bestandteile des Mikropartikels verstanden. Der Kern muss nicht
kompakt als ein vereinzeltes Teilchen vorliegen, sondern kann mehrere,
voneinander getrennte Fragmente beinhalten. Es ist also denkbar,
mehrere Trägerfragmente für die Viren mit einer
gemeinsamen Hülle zu verkapseln.
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Nach
einer bevorzugten Ausgestaltung besteht die Hülle zu mindestens
70 Gew.-% aus Triacylglyceriden.
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Triacylglyceride
sind Ester des dreiwertigen Alkohols Glycerin mit drei Fettsäuremolekülen.
Natürliche Fette bestehen zum überwiegenden Teil
aus Triacylglyceriden mit drei langkettigen Fettsäuren, die
meist aus unverzweigten Ketten mit 4 bis 26, typischerweise 12 bis
22 Kohlenstoff-Atomen bestehen. Für die erfindungsgemäßen
Zwecke eignen sich in besonderer Weise Fettsäuren mit 10
bis 24 Kohlenstoff-Atomen.
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Das
Triacylglycerid weist vorzugsweise einen Schmelzpunkt im Bereich
von 10 bis 100°C, insbesondere im Bereich von 25 bis 80°C,
besonders bevorzugt im Bereich von 25 bis 65°C auf.
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Bevorzugt
ist weiterhin, dass das Triacylglycerid Tripalmitin oder ein tripalmitin-haltiges
Gemisch von Triacylglyceriden, insbesondere Palmfett, ist. Palmfett
zeichnet sich zum einen durch seine geringen Gestehungskosten aus
und enthält zum anderen Carotin, welches, wie weiter unten
noch näher erläutert wird, als UV-Stabilisator
zum Schutz des biologischen Agens dienen kann. Weiterhin sind Tripalmitin oder
tripalmitin-haltige Gemische wie Palmfett Hauptinhaltsstoffe von
Apfelkernen und Blattwachsen und wirken somit an sich als Fraßlockstoff
für den Apfelwickler, sind also im Zusammenhang mit der Verwendung
des Apfelwickler-Granulovirus besonders bevorzugt.
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Die
Mikropartikel weisen vorzugsweise einen mittleren Durchmesser im
Bereich von 500 nm bis 500 μm, insbesondere von 1 bis 50 μm
auf. Mikropartikel dieser Größenordnung lassen
sich insbesondere mit den im Landbau bereits vorhandenen konventionellen
Sprühvorrichtungen austragen. Die Anzahl der Viren pro
Mikropartikel sollte vorzugsweise bei 1 bis 10, besonders bevorzugt
bei 1 bis 2 Viren pro Partikel liegen.
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Nach
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,
die sich insbesondere mit den zuvor genannten bevorzugten Ausführungsformen
kombinieren lässt, enthält die Hülle
einen Emulgator als Additiv. Vorzugsweise ist der Emulgator ein Mono-
und Diacylglycerid, Lecithin, Pektin, ein Zuckerester oder besteht
aus Gemischen derselben. Ein Anteil des Emulgators am Gesamtgewicht
des Mikropartikels liegt vorzugsweise zwischen 0,1 bis 15 Gew.-%.
Der Emulgator dient vornehmlich dazu, die Herstellung einer wässrigen,
die Mikropartikel enthaltenden Suspension zu erleichtern.
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform, die abermals auch in
Kombination mit allen zuvor genannten Ausführungsformen
realisierbar ist, sieht vor, dass die Hülle einen UV-Stabilisator
als Additiv enthält. Der UV-Stabilisator dient der Verbesserung der
Stabilität der Viren gegenüber natürlicher UV-Strahlung.
Vorzugsweise wird als UV-Stabilisator TiO2,
Carotinoide, Flavonoide, Magermilchpulver, mycosporin-artige Aminosäuren
(englisch: mycosporin-like amino acid MAA), Scytonemin oder Gemische derselben
eingesetzt. Der Einsatz von UV-Stabilisatoren ist insbesondere bei
dem Apfelwickler-Granulovirus besonders vorteilhaft.
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Weiterhin
kann die Hülle einen Fraßlockstoff als Additiv
enthalten. Auch diese Ausführungsform lässt sich
mit allen zuvor genannten bevorzugten Ausführungsformen
kombinieren. Der Fraßlockstoff ist vorzugsweise ein Pheromon,
insbesondere 2(E),4(Z)-Ethyldecadienoat, Glutamat oder Zucker, insbesondere
Saccharose, Glukose oder Fruktose. Viele Pheromone sind stark flüchtig,
so dass ihre biologische Wirkung schon kurze Zeit nach Austragung nicht
mehr besteht. Viele dieser Pheromone sind jedoch lipophil, so dass
die Inkorporation in eine lipophile Matrix das Freisetzungsverhalten
im gewünschten Maße verzögert. Dies gilt
insbesondere für den genannten Lockstoff des Apfelwickler-Granulovirus. Die
genannte Verbindung dient als Pheromon für adulte Weibchen
sowie als Fraßlockstoff für die Apfelwickler-Larven.
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Besonders
bevorzugt sind Baculoviren, insbesondere aus der Gattung Granulovirus.
Ganz besonders vorteilhaft enthalten die Mikropartikel Apfelschalenwickler-Granuloviren
oder Apfelwickler-Granuloviren. Ein besonders bevorzugter Mikropartikel für
die beiden letztgenannten Viren enthält als Triacylglycerid
Tripalmitin und/oder ein tripalmitin-haltiges Gemisch, insbesondere
Palmfett. Weiterhin enthält dieser Mikropartikel 2(E),4(Z)-Ethyldecadienoat als
Fraßlockstoff sowie einen UV-Stabilisator. Die Viren können
in Ringform oder aber auch gebunden an einen Träger Einsatz
finden. Weitere, der Stabilisierung der Viren dienende Zusätze
sind möglich.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung liegt in der Bereitstellung eines
Verfahrens zur Herstellung eines verkapselten Mikropartikels. Das
erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Schritte:
Bereitstellen
eines Kapselmaterials, das zu mindestens 50 Gew.-% aus einem oder
mehreren Triacylglyceriden mit einer Kettenlänge der Fettsäuren
von C10 bis C24 besteht, in einem Druckbehälter einer Hochdruckanlage
zur Partikelerzeugung (PGSS-Anlage);
Zugabe von Viren in freier
oder an einen Träger gebundener Form zum Kapselmaterial;
optional,
Zugabe weiterer Additive zum Kapselmaterial;
Aufschmelzen des
Kapselmaterials zur Herstellung einer die Viren enthaltenden Suspension;
Beaufschlagen
der Schmelze mit einem verdichteten Gas bei einem Druck im Bereich
von 20 bis 500 bar und einer Temperatur im Bereich von 283 bis 373
K für eine vorgebbare Verweilzeit; und
Versprühen
der Schmelze durch eine Düse oder Kapillare.
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Bei
dem sogenannten PGSS-Verfahren (Particles from Gas Saturated Solutions)
handelt es sich um eine Hochdruckmethode zur Partikelerzeugung.
Grundsätzlich können beliebig viele verflüssigbare
Feststoffe vermischt und zu rieselfähigem Pulver verarbeitet
werden. Dabei werden in der Regel überkritische Fluide
als Hilfsstoffe genutzt. Schmelzen werden homogenisiert und pulverisiert,
indem die verflüssigten Einzelkomponenten mit verdichtetem
Kohlendioxid vermischt und anschließend, zum Beispiel über
eine Düse, entspannt werden. Die Schmelze wird hierdurch
in kleinste Tröpfchen zerrissen. Es bildet sich feinstes
Pulver, welches aufgrund seiner gezielt einstellbaren Größe
(Nano- bis Mikrometer), Morphologie und Zusammensetzung neue Anwendungen
eröffnet. Das PGSS-Verfahren kann sowohl kontinuierlich
als auch diskontinuierlich (batchweise) betrieben werden.
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Das
verdichtete Gas ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe
Kohlendioxid, Distickstoffoxid, Alkane mit einem Siedepunkt kleiner
50°C bei 1 bar, Alkene mit einem Siedepunkt kleiner 50°C
bei 1 bar, Fluorkohlenwasserstoffe mit einem Siedepunkt kleiner
50°C bei 1 bar und Mischungen der genannten Gase. Besonders
bevorzugt sind Kohlendioxid, Ethan, Propan oder Butan. Insbesondere
ist das verdichtete Gas Kohlendioxid oder Propan. Propan und Kohlendioxid
weisen einen für die erfindungsgemäßen
Zwecke besonders günstigen Joule-Thompson-Effekt auf und
dampfen aus der Hülle gut aus, so dass allenfalls nur geringe
Kontaminationen verbleiben.
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Anstelle
des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auch eine
Sprühtrocknung erfolgen, ein Ausfällen aus geeigneten
Lösemitteln oder es kann auf alternative Hochdrucksprühverfahren
zurückgegriffen werden. Das erfindungsgemäße
Verfahren hat jedoch den Vorteil, dass kein Lösemittel
verwendet wird, das anschließend abgetrennt werden muss oder
die Partikel verunreinigt. Gegenüber der Sprühtrocknung
ergeben sich niedrigere Arbeitstemperaturen, da zum Beispiel der
Einsatz von Kohlendioxid die Schmelztemperatur der Mischung und
deren Viskosität senkt. Andere Hochdruckprozesse arbeiten
im Regelfall mit höherem Kohlendioxid- und Energiebedarf,
so dass sie in diesem Fall weniger ökonomisch sind.
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Der
Schritt der Beaufschlagung der Schmelze mit Gas erfolgt vorzugsweise
bei einem Druck im Bereich von 100 bis 200 bar. Weiterhin liegt
die Temperatur in diesem Verfahrensschritt vorzugsweise im Bereich
von 25 bis 80°C.
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Die
Düsen oder Kapillaren der PGSS-Anlage haben vorzugsweise
einen Durchmesser im Bereich von 50 μm bis 1500 μm.
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Nachfolgend
wird der allgemeine Verfahrensgang an einem Beispiel näher
beschrieben:
Das Kapselmaterial und die Zusatzstoffe (Fraßlockstoffe,
UV-Stabilisatoren, Emulgatoren etc.) werden aufgeschmolzen und die
Viren in der Schmelze dispergiert. In einem Druckbehälter
wird die Schmelze mit Kohlendioxid beaufschlagt, wobei der Druck
zwischen 20 und 500 bar (bevorzugt 100–200 bar) gewählt
wird und die Temperatur zwischen 10°C und 100°C
(bevorzugt 25°C bis 65°C) eingestellt wird, mindestens
jedoch so hoch, dass das Kapselmaterial schmilzt. Temperatur und
Verweilzeit werden so gewählt wird, dass die Viren nicht
deaktiviert werden.
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Das
Kapselmaterial wird mit dem darin gelösten Kohlendioxid
durch eine Düse oder Kapillare (Durchmesser zwischen 50 μm
und 1500 μm, bevorzugt 200–500 μm) versprüht.
Die dabei entstehenden Partikel werden aufgefangen.
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Ausführungsbeispiel
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150
g Kapselmaterial (80 Gew.-% Tripalmitin, 20 Gew.-% Palmitin) werden
bei 60°C aufgeschmolzen und mit 4 ml einer glycerinhaltigen
Apfelwickler-Granulovirus-Suspension (erhältlich unter dem
Handelsnamen Madex; Virenkonzentration ca. 3 × 1013 Viren pro Liter) versetzt. Die Mischung
wird in einem Druckbehälter mit Rührwerk eingebracht.
Die Temperatur der Schmelze wird auf 60°C gehalten und
es wird über einen Kompressor Kohlendioxid zugegeben, so
dass sich ein Druck von 100 bar einstellt und für 30 min
gerührt. Durch eine an den Behälter angeschlossene
Düse (60°-Hohlkegeldüse, 400 μm) wird
die Mischung gegen Atmosphäre versprüht. Die mittlere
Größe der erhaltenen Kapseln liegt bei 15 μm.
Die berechnete Beladung liegt bei 1,25 Viren pro Kapsel.
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Ergebnisse
aus Tierversuchen zur Temperaturtoleranz der Baculoviren:
Viren,
die für 1 h auf 65°C erhitzt wurden, besitzen
einen Wirkungsgrad von 95% verglichen mit thermisch unbehandelten
Viren. Auf 70°C erhitzte Viren haben noch einen Wirkungsgrad
von ca. 88%, auf 80°C erhitzte Viren töten nur
noch 30% der Larven ab.
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Wirkung
der verkapselten Viren:
Die nach obigem Verfahren hergestellten
Mikropartikel zeigten in Tierversuchen einen Wirkungsgrad von über
88%, bezogen auf unverkapselte Viren.
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In
ersten Freilandversuchen zeigten die verkapselten Viren einen deutlich
gegenüber unbehandelten Viren verbesserten Wirkungsgrad,
was sowohl auf eine verbesserte UV-Stabilisierung als auch erhöhte
Aufnahmerate schließen lässt.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Evaluation
of spray-dried lignin-based formulations and adjuvants as solar
protectants for the granulovirus of the codling moth, Cydia pomonella
(L) – Arthurs, S. P.; Lacey, L. A.; Behle, R. W.; Yakima Agricultural
Research Laborstory, USA; Journal of Invertebrate Pathology (2006),
93(2), 88–95 [0006]