DE102007044296A1 - Strukturmodulator von Proteinen - Google Patents

Strukturmodulator von Proteinen Download PDF

Info

Publication number
DE102007044296A1
DE102007044296A1 DE102007044296A DE102007044296A DE102007044296A1 DE 102007044296 A1 DE102007044296 A1 DE 102007044296A1 DE 102007044296 A DE102007044296 A DE 102007044296A DE 102007044296 A DE102007044296 A DE 102007044296A DE 102007044296 A1 DE102007044296 A1 DE 102007044296A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
transglutaminase
proteins
chemical compound
compound according
transglutaminases
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE102007044296A
Other languages
English (en)
Inventor
Hans-Lothar Prof. Dr. Fuchsbauer
Susan Dipl.-Biol. Schmidt
Felicitas Prof. Dr. Pfeifer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to DE102007044296A priority Critical patent/DE102007044296A1/de
Publication of DE102007044296A1 publication Critical patent/DE102007044296A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/12—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by halogen atoms or by nitro or nitroso groups
    • C07C233/13—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by halogen atoms or by nitro or nitroso groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/34—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups
    • C07C233/35—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/36—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine chemische Verbindung der Formel (I):
R1-CO-X-R3
worin
X NR2 oder O,
R1 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl (an einem gesättigten oder ungesättigten Abstandshalter aus 1-3 Kohelstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatomen), ein Heterozyklus (an einem gesättigten oder ungesättigten Abstandshalter aus 1-3 Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatomen) und PEG,
R2 H und Alkyl,
R3 [(CH2)n-NR4]mR5, (CH2)n-CO2R5, (CH2)n-CR4O, (CH2)n-OR5, (CH2)n-SR5 mit n, m 1-5, R4 H, Alkyl und R5 H, Alkyl, Acyl, Aryl (an einem Abstandshalter von wenigstens einer Methylengruppe) oder ein Heterozyklus (ab einem Abstandshalter von wenigstens einer Methylengruppe)
bedeuten.
Die chemische Verbindung der Formel (I) aktiviert Proteine unter Erhalt der biologischen Funktion, dass sie an Enzyme, Rezeptoren oder andere Biomoleküle binden.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft chemische Verbindungen, die Proteine unter Erhalt der biologischen Funktion so aktivieren, dass sie an Enzyme, Rezeptoren oder andere Biomoleküle binden. Die neuen Wirkstoffe erhöhen beispielsweise die Reaktivität proteingebundener Glutamine und Lysine, dass es in Gegenwart einer Transglutaminase zur Polymerisation des betreffenden Proteins kommt.
  • Die Struktur von wasserlöslichen Proteinen ist dadurch gekennzeichnet, dass hydrophobe Aminosäuren den inneren Kern bilden und so die funktionale Konformation stabilisieren, während polare und geladene Aminosäuren um das Protein eine Hydrathülle aufbauen und es damit in Lösung halten. Die in die wässrige Umgebung hineinragenden Seitenketten der polaren und geladenen Aminosäuren sind notwendige Strukturmuster, dass Proteine an ihre spezifischen Enzyme und Rezeptoren binden können. Umgekehrt suchen Enzyme und Rezeptoren aus der Vielzahl unterschiedlichster Proteine aufgrund dieser Merkmale ihr spezifisches Substrat heraus. Wenn essentielle Aminosäuren mit anderen funktionellen Gruppen über inter- oder intramolekulare Wasserstoffbrücken, Dipol-Dipol-Bindungen oder elektrostatisch Wechselwirken, fehlen die spezifischen Erkennungsmerkmale und damit jegliche Bindekapazität. Beispielsweise ist bekannt, dass proteingebundene Asparagin- und Glutaminresten mit sich selbst oder Peptidbindungen stabile Dipol-Dipol-Wechselwirkungen eingehen. Entgegengesetzt geladene Reste, z. B. Glutamat und Lysin, bilden Salzbrücken. Wahrscheinlich sind deshalb viele Proteine keine Substrate des Vernetzungsenzyms Transglutaminase.
  • Prinzipiell lassen sich Proteine in Enzymsubstrate umwandeln, indem man sie erhitzt und mit Reagenzien wie Harnstoff, Guanidiniumchlorid oder Natriumdodecylsulfat behandelt. Dabei verlieren sie jedoch ihre biologische Funktion, die meist nach der Enzymreaktion nicht mehr hergestellt werden kann. Bisher ist nicht bekannt, wie verborgene Seitenketten für Enzymreaktionen oder andere Bindemoleküle aktiviert werden können, ohne dass die biologische Funktion eines Proteins durch Denaturierung verloren geht.
  • Es ist deshalb Aufgabe der vorliegenden Erfindung, potente Strukturmodulatoren von Proteinen zur Verfügung zu stellen, die unter Erhalt der funktionalen Proteinkonformation Aminosäuren spezifisch aktivieren und damit eine Enzymreaktion oder die Bindung an ein anderes Biomolekül ermöglichen. Insbesondere sind Glutamin- und Lysinseitenketten zu aktivieren, die für die Katalyse von Transglutaminasen notwendig sind.
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch eine chemische Verbindung der Formel (I): R1-CO-X-R3 (I)worin
    X NR2 oder O,
    R1 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl (an einem gesättigten oder ungesättigten Abstandshalter aus 1–3 Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatomen), ein Heterozyklus (an einem gesättigten oder ungesättigten Abstandshalter aus 1–3 Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatomen) und PEG,
    R2 H und Alkyl,
    R3 [(CH2)n-NR4]mR5, (CH2)n-CO2R5, (CH2)n-CR4O, (CH2)n-OR5, (CH2)n-SR5 mit n, m 1–5, R4 H, Alkyl und R5 H, Alkyl, Acyl, Aryl (an einem Abstandshalter von wenigstens einer Methylengruppe) oder ein Heterozyklus (an einem Abstandshalter von wenigstens einer Methylengruppe)
    bedeuten.
  • Im Folgenden werden die verwendeten Begriffe näher definiert.
  • Alkyl bedeutet eine unverzweigte oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1–23 Kohlenstoffatomen, einschließlich Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl (Lauryl), Tridecyl (Myristyl), Pentadecyl (Palmityl), Heptadecyl (Stearyl), wobei für R1 Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl (Lauryl) und für R2, R4 Methyl bevorzugt sind.
  • Alkenyl und Alkinyl bedeuten wie Alkyl unverzweigte oder verzweigte Kohlenwasserstoffketten mit 1–23 Kohlenstoffatomen, wobei Doppel- oder Dreifachbindungen einfach oder mehrfach auftreten können.
  • Aryl bedeutet eine aromatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffen, z. B. Phenyl oder Naphthyl. Bei R5 sind die aromatischen Ringe durch geeignete Substituenten wie Carboxyl-, Sulfonyl- oder Ammoniumgruppen hydrophilisiert.
  • Ein Heterozyklus bedeutet eine 5- oder 6-gliedrige heterozyklische monozyklische Gruppe, z. B. eine Oxazol-2-yl-, Oxazol-4-yl-, Oxazol-5-yl-, Isoxazol-3-yl-, Isoxazol-4-yl-, Isoxazol-5-yl-, Thiazol-2-yl-, Thiazol-4-yl-, Thiazol-5-yl-, Isothiazol-3-yl-, Isothiazol-4-yl-, Isothiazol-5-yl-, 1,2,4-Oxadiazol-3-yl-, 1,2,4-Oxadiazol-5-yl-, 1,2,4-Thiadiazol-3-yl-, 1,2,4-Thiadiazol-5-yl-, 1,2,5-Oxadiazol-3-yl-, 1,2,5-Oxadiazol-4-yl-, 1,2,5-Thiadiazol-3-yl-, 1,2,5-Thiadiazol-4-yl-, 1-Imidazolyl-, 2-Imidazolyl-, 4-Imidazolyl-, 5-Imidazolyl-, 1-Pyrrolyl-, 2-Pyrrolyl-, 3-Pyrrolyl-, 2-Furanyl-, 3-Furanyl-, 2-Thienyl-, 3-Thienyl-, 2-Pyridyl-, 3-Pyridyl-, 4-Pyridyl-, 2-Pyrimidinyl-, 4-Pyrimidinyl-, 5-Pyrimidinyl-, 6-Pyrimidinyl-, 3-Pyridazinyl-, 4-Pyridazinyl-, 2-Pyrazinyl-, 1-Pyrazolyl-, 3-Pyrazolyl- und eine 4-Pyrazolyl-Gruppe.
  • PEG bedeutet Polyethylenglycol (CH3O(CH2CH2O)OCH2-), wobei o 0–6 bedeutet.
  • Die Herstellung einiger Abkömmlinge der erfindungsgemäßen chemischen Verbindung R1–CO–X–R3 ist bereits bekannt (z. B. Balakrishna et al., 2006, Antimicrob. Agents Chemother., 852–861). Die in vielen Experimenten verwendeten N-Lauroylsarcosin oder N-Lauroyl-3-N'-dimethylpropandiamin sind käufliche Detergenzien.
  • Weiterhin ist bekannt, dass acylierte Polyamine, die der chemischen Verbindung R1-CO-X-R3 zuzurechnen sind, ubiquitär in der Natur vorkommen (Seiler et al., 1996, Int. J. Biochem. Cell Biol, 28, 843–861; Bachrach, 1970, Ann. Rev. Microbiol., 24, 109–134; Tabor und Tabor, 1964, Ann. Rev. Pharmacol., 16, 247–294). Bei marinen Organismen wurden jüngst strukturanaloge Verbindungen von N-Lauroyl-3-N'-dimethylpropandiamin mit antibiotischen Eigenschaften (Ojika et al., 2003, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 1410–1412) gefunden. Streptomyceten bilden Acylaminosäuren, wenn essentielles Phosphat erschöpft ist (Grafe et al., 1982, Z. Allg. Mikrobiol., 22, 97–106). Strukturmodulatoren von Proteinen können entsprechend auch aus biologischem Material durch Extraktion (Ojika et al., 2003, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 1410–1412) oder durch Kultivierung von Mikroorganismen gewonnen werden.
  • Andere erfindungsgemäße chemische Verbindungen mit der Struktur R1-CO-X-R3 sind auf verschiedene Art und Weise über Standardverfahren der organischen Synthese zugänglich. Acylpolyamine, Acylaminosäuren, Acylaminoaldehyde, Acylaminoketone, Acylaminoalkohole, Acylaminomerkaptane sowie die entsprechenden Ester von Hydroxycarbonsäuren, Hydroxyaldehyden, Hydroxyketonen, Aminoalkoholen, Alkandiolen, Hydroxymerkaptanen werden beispielsweise aus Carbonsäurechloriden oder -anhydriden und geschützten Polyaminen, Aminosäuren, Aminoaldehyden, Aminoketonen, Aminoalkoholen, Aminomerkaptanen, Hydroxycarbonsäuren, Hydroxyaldehyden, Hydroxyketonen, Alkandiolen oder Hydroxymerkaptanen hergestellt. Aminosäuren und Hydroxycarbonsäuren sind typischerweise mit einfach abspaltbaren Schutzgruppe an der Carboxylfunktion verestert, z. B. mit einer tert-Butylgruppe, Aminoaldehyde, Aminoketone, Hydroxyaldehyde und Hydroxyketone acetalisiert, z. B. mit Ethylenglycol, und Aminoalkohole, Aminomerkaptane, Alkandiole und Hydroxymerkaptane monoacyliert, z. B. mit Essigsäure.
  • Geschützte Ausgangsverbindungen wie beispielsweise Aminoacyl-tert-butylester, Hydroxyacyl-tert-butylester, monoacylierte Aminoalkohole, Aminomerkaptane, Alkandiole und Hydroxymerkaptane können nach Standardverfahren direkt aus den Aminosäuren (vgl. Wünsch (1974) Synthese von Peptiden in: Houben-Weyl-Müller, Methoden der Organischen Chemie XV/1 und XV/2, Thieme, Stuttgart) oder Aminoalkoholen, Aminomerkaptanen, Alkandiolen und Hydroxymerkaptanen hergestellt werden. Bei anderen geschützten Vorstufen empfiehlt sich die Synthese über ein Zwei-Stufenverfahren aus den entsprechenden Halogenverbindungen, z. B. 3-Brompopanal, 4-Iod-2-butanon. Nach Herstellung des Acetals oder Ketals mit Ethylenglycol erfolgt der einfache Austausch des Halogens gegen eine Amino- oder Hydroxylgruppe.
  • Die chemische Verbindung R1-CO-X-R3 wurde auf ihre Wirkung als Strukturmodulator für Proteine untersucht. Für die Untersuchungen wurde das Enzym Transglutaminase (EC 2.3.2.13) verwendet, das zwei verschiedene Bindestellen besitzt, eine für dipolare, ungeladene Glutamine und eine weitere für basische, positiv geladene Lysine. Transglutaminasen katalysieren die Vernetzung von Proteinen durch Bildung von γ-Glutamyl-ε-Lysin-Isopeptidbindungen (Mehta und Eckert (Hrsg.), 2005, in: Prog. Exp. Tumor Res. (Bertino, Hrsg.) Vol. 38, Karger, Basel).
  • Damit im ersten Schritt ein Acylenzymkomplex zwischen einem Protein und Transglutaminase entstehen kann, müssen reaktive Glutaminseitenketten vorhanden sein. Die Reaktivität wurde durch Markierung mit einem Transglutaminase-spezifischen Biotinreagenz (Monobiotinylcadaverin) in Gegenwart eines Strukturmodulators bestimmt (siehe 1). Dabei zeigte sich erfindungsgemäß, dass die Acylaminosäure N-Lauroylsarcosin und das Acylpolyamine N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin reaktive Glutamine erzeugen oder die Reaktivität von Glutaminen erhöhen (siehe 2).
  • Die Bestimmung der Bindefähigkeit von proteingebundenen Lysinen an Transglutaminase ist erst nach Ausbildung des Acylenzymkomplexes möglich. Entsprechend wurde die Reaktivität der Lysine in Gegenwart eines Strukturmodulators mit einem biotinylierten Glutaminpeptid (N-Biotinyl-6-N'-[carbobenzoxy-L-glutaminylglycyl]hexandiamin) untersucht, das zunächst das notwendige Intermediat mit Transglutaminase bildet (siehe 3). Dabei zeigte sich erfindungsgemäß, dass positiv geladene Acylpolyamine wie N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin die Reaktivität von proteingebundenen Lysinen erhöhen, während negativ geladene Acylaminosäuren wie N-Lauroylsarcosin die Reaktivität bei einigen Proteinen herabsetzen, offensichtlich durch Ausbildung neuer Salzbrücken (siehe 4).
  • Entsprechend wurde erfindungsgemäß die Strukturmodulator-vermittelte Polymerisation von Proteinen durch Transglutaminase beobachtet (siehe 5). Negativ geladene Strukturmodulatoren können bei bestimmten Proteinen die Vernetzungsreaktion unterdrücken. Sie eignen sich in technischen Verfahren deshalb besonders für den Einbau von beliebigen Molekülen mit primärer Aminofunktion in bestimmte Glutamindonorproteine, weil die konkurrierende Proteinpolymerisation verhindert wird.
  • Die Wirkung der Strukturmodulatoren auf die biologische Funktion der Proteine wurde weiterhin untersucht. Dabei wurde erfindungsgemäß beobachtet, dass die Menge an Strukturmodulator, die zur Erhöhung der Reaktivität von proteingebundenen Glutaminen und Lysinen notwendig ist, nicht die biologische Aktivität des Proteins beeinträchtigt. Zum Beispiel wird die Glutamin- und Lysinreaktivität des Subtilisin- und TAMEP-Inhibitors von Streptomyces mobaraensis, der ohne Wirkstoff kein oder bestenfalls ein extrem schwaches Lysinsubstrat von Transglutaminase ist (Taguchi et al., 2000, J. Biochem. 128, S. 415–425), mit 2,4 mM (0,07%) N-Lauroylsarcosin erst erzeugt. Diese Menge ist erfindungsgemäß nicht geeignet, die inhibitorische Aktivität des Proteins gegenüber Subtilisin herabzusetzen (siehe 6). Entsprechend hat auch die zur Polymerisation des Inaktivierungsproteins DAIP (unveröffentlicht) notwendige Menge an N-Lauroyl-3-N'-dimethylpropandiamin keinen negativen Einfluss auf die Aktivität gegenüber Dispase (siehe 7). Auch die Transglutaminase- und Subtilisinaktivität von Kontrollproben wurde nicht beeinträchtigt. Im Gegenteil. Bakterielle Transglutaminase wird in Gegenwart eines Strukturmodulators zu einer Autokatalyse veranlasst.
  • Beschreibung der Abbildungen
  • 1 Schematische Darstellung des Einbaus von Monobiotinylcadaverin in reaktive Glutaminseitenketten zum Nachweis der primären Bindefähigkeit eines Proteins an Transglutaminase
  • 2 Einbau von Monobiotinylcadaverin in den Subtilisin-/TAMEP-Inhibitor (A, B) sowie den Dispase-Inhibitor (C, D) von Streptomyces mobaraensis in Anwesenheit von 2,4 mM (0,07%) N-Lauroylsarcosin (A, B) und N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin (C, D). A, B: Spuren 1: Reaktionsmischung; Spuren 2, Reaktionsmischung ohne Transglutaminase; Spuren 3, Reaktionsmischung ohne Inhibitor. C, D: Spuren 1–3, Reaktionsmischungen mit 0, 1,7 und 3,5 mM (0, 0,05 und 0,1%) N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin.
    A, C: Auf Nitrocellulose transferiert Proteine einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese angefärbt mit einem Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat
    B, D: Silbergefärbtes Polyacrylamidgel
  • 3 Schematische Darstellung des Einbaus von (N-Biotinyl-(6-N'-carbobenzoxy-L-glutaminylglycyl)pentandiamin) in reaktive Lysinseitenketten zum Nachweis der sekundären Bindefähigkeit eines Proteins an Transglutaminase
  • 4 Einbau von N-Biotinyl-6-N'-[carbobenzoxy-L-glutaminylglycyl]hexandiamin in den Subtilisin-/TAMEP-Inhibitor (A, B) sowie den Dispase-Inhibitor (C–F) von Streptomyces mobaraensis in Anwesenheit von 2,4 mM (0,07%) N-Lauroylsarcosin (A, B), 1,7 mM (0,05%) N-Lauroylsarcosin (C, D) oder 1,7 mM (0,05%) N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin (E, F). A, B: Spuren 1: Reaktionsmischung; Spuren 2, Reaktionsmischung ohne Transglutaminase; Spuren 3, Reaktionsmischung ohne Inhibitor. C–F: Spuren 1–3, Reaktionsmischungen mit 0, 1,7 und 3,5 mM (0, 0,05 und 0,1%) N-Lauroylsarcosin (C, D) oder N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin (E, F).
    A, C, E: Auf Nitrocellulose transferiert Proteine einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese angefärbt mit einem Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat
    B, D, F: Silbergefärbtes Polyacrylamidgel
  • 5 Polymerisation des Subtilisin/TAMEP- (A, B) und Dispase-Inhibitors (C, D) von Streptomyces mobaraensis durch Transglutaminase in Gegenwart von 2,4 mM (0,07%) N-Lauroylsarcosin (A, B) und 1,7 mM (0,05%) N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin oder 1,7 mM (0,05%) N-Lauroylsarcosin (C, D). A, B: Spuren 1: Reaktionsmischung; Spuren 2, Reaktionsmischung ohne Transglutaminase; Spuren 3, Reaktionsmischung ohne Inhibitor; Spuren 4, Reaktionsmischung ohne N-Lauroylsarcosin. C, D: Spuren 1, Reaktionsmischung mit N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin; Spuren 2, Reaktionsmischung mit N-Lauroylsarcosin.
    A, C: Silbergefärbtes SDS-Polyacrylamidgel
    B, D: Auf Nitrocellulose transferiert Proteine einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese angefärbt mit Inhibitor-spezifischem Antiserum und einem Zweitantikörperenzymkonjugat
  • 6 Einfluss von N-Lauroylsarcosin auf die Aktivität des proteinogenen Subtilisin-Inhibitors von Streptomyces mobaraensis
  • 7 Einfluss von N-Lauroyl-3-N',N'-dimethylpropandiamin auf die Aktivität des proteinogenen Dispase-Inaktivierungsproteins von Streptomyces mobaraensis Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
  • Beispiel I
  • Allgemeine Synthesevorschrift zur Acylierung von Aminen und Alkoholen
  • 1 Mol eines geschützten oder ungeschützten Amins oder Alkohols in trockenem Dioxan, THF oder DMF wird mit 2 Mol Carbonsäurechlorid oder Carbonsäureanhydrid bis zur völligen Umsetzung (in der Regel 10 min bis 2 h) bei Raumtemperatur gerührt. Bei Alkoholen wird bei Bedarf auch unter Rückfluss erhitzt. Man gießt die Mischung auf Eiswasser, säuert an, extrahiert mit Essigester, entsäuert mit ges. NaHCO3 und trocknet über Magnesiumsulfat. Nach Abziehen des Lösungsmittels i. Vak. werden die Rückstände durch Destillation oder Kristallisation gereinigt.
  • Beispiel II
  • Herstellung von N-Hexanoyl-3-N'-methylpropandiamin und N-Dodecanoyl-3-N'-methylpropandiamin
  • 1–2 g N-Hexanoyl-3-brompropanamin oder N-Dodecanoyl-3-brompropanamin werden in 10 ml Ethanol mit 33% Methylamin 2 Stunden unter leichtem Rückfluss erwärmt. Man dampft bis zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Ethanol/Wasser um.
    1H-NMR (CDCl3):
    • a) N-Hexanoyl-3-N'-methylpropandiamin: δ (ppm) = 0,85 (t, CH3), 1,25 (m, 4 CH2), 1,5 (m, CH2), 1,8 (m, CH2), 2,5 (m, CH2), 2,75 (d, CH3), 3,35 (m, NH), 6,45 (s, NH).
    • b) N-Dodecanoyl-3-N'-methylpropandiamin: δ (ppm) = 0,85 (t, CH3), 1,25 (m, 10 CH2), 1,5 (m, CH2), 1,8 (m, CH2), 2,5 (m, CH2), 2,75 (d, CH3), 3,35 (m, NH), 6,45 (s, NH).
  • Beispiel III
  • Allgemeine Vorschrift zur Markierung von Proteinen mit biotinylierten Reagenzien und Transglutaminase
  • Die Markierung von Proteinen zur Bestimmung reaktiver Glutamin- und Lysinseitenketten erfolgte in 0,1 M N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) (HEPES) pH 7,5. 30 μl gepufferte Lösung enthielten 7,5 μl Protein (0.5–0.8 mg/ml), 2 mM Monobiotinylcadaverin (Nachweis reaktiver Glutamine) oder 0.13 mM N-Biotinyl-(6-N'-carbobenzoxy-L-glutaminylglycyl)hexandiamin (Nachweis reaktiver Lysine), 0–0,2% Strukturmodulator und 2,5 μl Transglutaminase (0,2–0,3 mg/ml). Die Inkubation erfolgte bei 37°C für 2 Stunden. Die Reaktionsmischung wurde durch SDS-Polyarylamidgelelektrophorese getrennt, auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit einem Avidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat angefärbt. Dazu wurden zunächst nach dem Proteintransfer unspezifische Bindungsstellen der Nitrocellulosemembran mit fettfreier Milch blockiert. Nach mehrfachem Waschen mit 10 mM Tris-HCl/150 mM NaCl/0,05% Tween pH 8,0, Inkubation mit 50 ng/ml Avidinkonjugat über Nacht bei 4°C, erneutem Waschen und Einstellen der Membran auf pH 9,5 mit 0,1 M Tris-HCl/0,1 M NaCl/5 mM MgCl2 erfolgte die Färbung mit 5-Brom-4-chlorindolylphosphat und 2,2'-Di-p-nitrophenyl-5,5'-diphenyl-(3,3'-dimethoxy-4,4'-diphenylen)-ditetrazoliumchlorid (Nitrotetrazoliumblau).
  • Beispiel IV
  • Allgemeine Vorschrift zur Vernetzung von Proteinen mit Transglutaminase
  • Die Vernetzung von Proteinen durch Transglutaminase erfolgte mit 0–0,2% Strukturmodulator in einem geeigneten Puffer bei pH 5–9 und 37°C für 0,5–24 h. Die Reaktionsmischung wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese getrennt, silbergefärbt oder nach Transfer auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung von Antiseren immunchemisch gefärbt.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Balakrishna et al., 2006, Antimicrob. Agents Chemother., 852–861 [0012]
    • - Seiler et al., 1996, Int. J. Biochem. Cell Biol, 28, 843–861 [0013]
    • - Bachrach, 1970, Ann. Rev. Microbiol., 24, 109–134 [0013]
    • - Tabor und Tabor, 1964, Ann. Rev. Pharmacol., 16, 247–294 [0013]
    • - Ojika et al., 2003, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 1410–1412 [0013]
    • - Grafe et al., 1982, Z. Allg. Mikrobiol., 22, 97–106 [0013]
    • - Ojika et al., 2003, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 1410–1412 [0013]
    • - Mehta und Eckert (Hrsg.), 2005, in: Prog. Exp. Tumor Res. (Bertino, Hrsg.) Vol. 38, Karger, Basel [0016]
    • - Taguchi et al., 2000, J. Biochem. 128, S. 415–425 [0020]

Claims (10)

  1. Chemische Verbindung der Formel (I): R1-CO-X-R3 (I)worin X NR2 oder O, R1 Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl (an einem gesättigten oder ungesättigten Abstandshalter aus 1–3 Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatomen), ein Heterozyklus (an einem gesättigten oder ungesättigten Abstandshalter aus 1–3 Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatomen) und PEG, R2 H und Alkyl, R3 [(CH2)n-NR4]mR5, (CH2)n-CO2R5, (CH2)-CR4O, (CH2)n-OR5, (CH2)n-SR5 mit n, m 1–5, R4 H, Alkyl und R5 H, Alkyl, Acyl, Aryl (an einem Abstandshalter von wenigstens einer Methylengruppe) oder ein Heterozyklus (an einem Abstandshalter von wenigstens einer Methylengruppe) bedeuten.
  2. Chemische Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass unter Erhalt der biologischen Funktion Bindeaktivität von Proteinen gegenüber Enzymen, Rezeptoren oder anderen Biomolekülen erzeugt oder bereits bestehende Bindeaktivität erhöht wird.
  3. Chemische Verbindung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass Bindeaktivität von proteingebundenem Glutamin gegenüber Transglutaminasen erzeugt oder erhöht wird.
  4. Chemische Verbindung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass Bindeaktivität von proteingebundenem Lysin gegenüber Transglutaminasen gezielt erzeugt, erhöht oder erniedrigt wird.
  5. Chemische Verbindung nach den Ansprüchen 1 und 2 zur Polymerisation von Proteinen mit Transglutaminase.
  6. Chemische Verbindung nach den Ansprüchen 1 und 2 zur Modifikation von Proteinen mit Transglutaminase und einem funktionalen Amin bei gleichzeitiger Unterdrückung der Vernetzungsreaktion.
  7. Verwendung der chemischen Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Transglutaminase-katalysierten Verfahren.
  8. Verwendung nach Anspruch 7 in Verfahren mit – Säugertransglutaminasen, – humanen Transglutaminasen, – Blutfaktor XIII/Blutfaktor XIIIa – Gewebetransglutaminasen, – Lebertransglutaminasen, – Gehirntransglutaminasen, – Augenlinsentransglutaminase, – Keratinocyten-Transglutaminase, – epidermaler Transglutaminase, – Prostata-Transglutaminase, – Transglutaminase 5 – Transglutaminase 6 – Transglutaminase 7, – pflanzlicher Transglutaminase, – parasitärer Transglutaminase, – bakterieller Transglutaminase.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die chemische Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 6, sowie mindestens eine weitere Komponente, ausgewählt aus mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Antikoagulanz, weiteren Wirkstoff und/oder Inhibitor.
  10. Chemische Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als Medikament.
DE102007044296A 2007-09-17 2007-09-17 Strukturmodulator von Proteinen Withdrawn DE102007044296A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102007044296A DE102007044296A1 (de) 2007-09-17 2007-09-17 Strukturmodulator von Proteinen

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102007044296A DE102007044296A1 (de) 2007-09-17 2007-09-17 Strukturmodulator von Proteinen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102007044296A1 true DE102007044296A1 (de) 2009-03-19

Family

ID=40348616

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102007044296A Withdrawn DE102007044296A1 (de) 2007-09-17 2007-09-17 Strukturmodulator von Proteinen

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE102007044296A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016526574A (ja) * 2013-07-11 2016-09-05 ノバルティス アーゲー 部位特異的化学酵素的タンパク質修飾

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bachrach, 1970, Ann. Rev. Microbiol., 24, 109-134
Balakrishna et al., 2006, Antimicrob. Agents Chemother., 852-861
Grafe et al., 1982, Z. Allg. Mikrobiol., 22, 97-106
Mehta und Eckert (Hrsg.), 2005, in: Prog. Exp. Tumor Res. (Bertino, Hrsg.) Vol. 38, Karger, Basel
Ojika et al., 2003, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 1410-1412
Seiler et al., 1996, Int. J. Biochem. Cell Biol, 28, 843-861
Tabor und Tabor, 1964, Ann. Rev. Pharmacol., 16, 247-294
Taguchi et al., 2000, J. Biochem. 128, S. 415-425

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016526574A (ja) * 2013-07-11 2016-09-05 ノバルティス アーゲー 部位特異的化学酵素的タンパク質修飾
US10975120B2 (en) 2013-07-11 2021-04-13 Novartis Ag Site-specific chemoenzymatic protein modifications

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nick et al. Unilateral reorientation of microtubules at the outer epidermal wall during photo-and gravitropic curvature of maize coleoptiles and sunflower hypocotyls
EP2071029B1 (de) Verfahren zur Behandlung einer Biomoleküle enthaltenden Probe
DE4499550C1 (de) Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen und Affinitätsliganden an polymere Träger
EP0071704B1 (de) Oberflächenreiche Systeme zur Fixierung von nucleophile Gruppen enthaltenden Substraten
WO2014144174A1 (en) Compositions and methods for nucleic acid extraction
US6503745B1 (en) Cyclopentane and cyclopentene compounds and use for detecting influenza virus
Pradère et al. Chemical Synthesis of Mono‐and Bis‐Labeled Pre‐MicroRNAs
DE10118774A1 (de) Verfahren zur Bestimmung der Substratspezifität einer enzymatischen Aktivität und Vorrichtung hierzu
DE102007044296A1 (de) Strukturmodulator von Proteinen
Stepek et al. Synthetic fermentation of bioactive molecules
US20200399660A1 (en) Modified polyamine polymers for delivery of biomolecules into cells
CN105592860B (zh) 抗体组合物和用于其的缓冲体系
Behrendt et al. Dimethylsulfoniopropionate decorated cryogels as synthetic spatially structured habitats of marine bacterial communities
CN105754026B (zh) 实现细胞膜修饰的糖胺聚糖类似物及其合成方法及其体外诱导干细胞定向分化的应用方法
CN105906581B (zh) 一种具有抗菌活性的手性螺1,2,3-噻二唑衍生物及其合成方法和应用
DE102020103957B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen und ein fluidisches Kanalsystem
US20230382875A1 (en) Compounds, compositions, and methods for isolation of nucleic acids
CN108660146B (zh) 一种提高PCR片段兼容性与效率的Topo1连接方法
AT412157B (de) Screeningmethode zum nachweis von amidase- und nitrilhydrataseaktivitäten und deren verwendung
Takeda et al. A spatial relationship between sheath elongation and cell proliferation in Sphaerotilus natans
CN101517092A (zh) 光学活性琥珀酰亚胺化合物的制造方法
Eslami et al. Effect of new methionine-based ionic liquid on the CDR1 and CDR2 gene expression on sensitive and resistant strains of Candida albicans
Mikhaylova et al. An alternative method for preparation of Schiff-like reagent from osmium-ammine complex for selective staining of DNA on thin Lowicryl sections.
CN107973754B (zh) 一种小分子抑制剂及其制备方法与其在多发性骨髓瘤治疗中的应用
WO1980000573A1 (en) Compounds having the empiric summary formula c25h33n3o3s2

Legal Events

Date Code Title Description
8122 Nonbinding interest in granting licences declared
8139 Disposal/non-payment of the annual fee