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Das
Einbringen eines nicht-membrangängigen Fremdmaterials (z.
B. Nukleinsäuremoleküle, Chromosomen, Organellen,
Nanopartikel, Proteine, Farbstoffe, pharmazeutische Wirkstoffe)
in Zellen stellt ein weit verbreitetes Problem in der Zellbiologie dar.
Besonders schwierig gestaltet sich das gezielte Einbringen der o.
g. Substanzen in ausgewählte Einzelzellen innerhalb einer
Zellpopulation.
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Während
leicht zu handhabende und daher in den Laboren auch weit verbreitete
Methoden zur Überwindung der Zellmembran, wie z. B. die
Elektroporation (d. h. die transiente Permeabilisierung der Zellmembran
durch Spannungspulse) oder der Einsatz von Liposomen (Lipidvesikel,
in deren Inneren sich das einzubringende Fremdmaterial befindet
und die mit der Zellmembran verschmelzen) in der Regel unspezifisch
auf eine Vielzahl von Zellen gleichzei tig wirken, stand bis vor
kurzem für die Manipulation von Einzelzellen im Wesentlichen
nur das sowohl apparativ sehr aufwendige als auch von der Handhabung her
höchst anspruchsvolle Verfahren der Mikroinjektion zur
Verfügung. Hierbei wird das Fremdmaterial mit Hilfe einer
Mikrokapillare direkt in den Zellkern bzw. ins Cytoplasma der Zelle
injiziert. Das Verfahren besitzt eine Effizienz von nahezu 100%.
Allerdings können nur relativ wenige Zellen in einem praktikablen
Zeitraum manipuliert werden.
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Der
Fortschritt in der Laser-Nanochirurgie führte in den letzten
Jahren zu der Entwicklung der Laser-vermittelten Permeabilisierung
der Zellmembran (Optoperforation, auch als Laser- oder Photoperforation
bezeichnet), um auf diesem Wege das Einbringen von Fremdmaterial
in ausgewählte Einzelzellen zu ermöglichen. Mittels
einer entsprechenden Mikroskopanordnung, wie z. B. in Stevenson
et al. (2006, Optics Express, Vol. 14, No. 16, pp. 7125–33) dargestellt,
kann die Zellmembran von Einzelzellen mit gepulstem Laserlicht bestrahlt
werden. Am Ort des Auftreffens des Laserlichts auf die Zellmembran kommt
es bei ausreichender Strahlungsintensität zur Bildung von
Kavitationsblasen. Es wird inzwischen davon ausgegangen, dass bei
Verwendung von einzelnen Laserpulsen oder von Pulsserien mit Repetitionsraten ≤ 1
MHz das einzubringende Fremdmaterial nur dann effektiv von der Zielzelle
aufgenommen werden kann, wenn es während der Bestrahlung
zur Bildung dieser Kavitationsblasen kommt (Vogel et al., 2005,
Applied Physics B 81, pp. 1015–47). Andererseits
wirken sich zu hohe Strahlungsdosen und somit zu große
Kavitationsblasen negativ auf die Viabilität der Zielzelle
aus, es kommt dann in der Folge zu einer erhöhten Sterblichkeit
der behandelten Zellen, wodurch wiederum die Effektivität
der Methode beeinträchtigt wird.
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Die
Applikation der optimalen Strahlungsdosis, bei der eine effektive
Permeabilisierung der Zellmembran bei einer möglichst hohen Überlebensrate der
bestrahlten Zellen gewährleistet ist, stellt somit die
entscheidende Voraussetzung für den Erfolg der Methode
dar. Die optimale Strahlungsdosis ist dabei in hohem Maße
abhängig von der jeweils zu bestrahlenden Probe. Je nach
Zell- oder Gewebetyp, physiologischen Zustand der Zellen und dem
die Zellen umgebenden Medium bzw. Umfeld müssen die Laserparameter
jeweils individuell angepasst werden.
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Als
Indikator für die jeweiligen durch das applizierte Laserlicht
erzielten Effekte könnte hier die Größe
der entstehenden Kavitationsblasen dienen, wobei, wie von Vogel
et al. (2005, Applied Physics B, 81, pp. 1015–47)
vorgeschlagen, die Bestimmung der Blasengröße über
die Messung der jeweiligen Blasenoszillationzeit (d. h. der Blasenlebensdauer) erfolgen
kann; wie dieses Ziel konkret erreicht werden soll wird jedoch nicht
beschrieben.
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In
der
DE 103 31 792
A1 wird ein Laser mit Dosimetriesteuerung offenbart, bei
dem das erste Auftreten von Blasen innerhalb eines Gewebes u. a. interferometrisch über
die Änderung des Brechungsindex erfasst werden kann. Dies
dient dazu, die Leistung des Lasers derart zu modulieren, dass größtenteils
dicht oberhalb der Blasenbildungsschwelle bestrahlt werden kann.
Hierbei wird jedoch lediglich das Auftreten der Blasen detektiert,
eine Bestimmung der Lebensdauer der Blasen und Rückschlüsse
hieraus auf die Blasengröße werden nicht beschrieben.
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Es
ist nun die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Optoperforation
einzelner Zellen mittels gepulster Laserstrahlung anzugeben, bei
dem der Grad der Zellmembran-Permeabilisierung derart kontrolliert
werden kann, dass die Effizienz der Fremdkörperaufnahme
in die bestrahlte Zelle möglichst maximal ist und zugleich
die Viabilität der Zellen nicht unnötig beeinträchtigt
wird.
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Die
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren
zur Optoperforation der Zellmembran einer Zelle durch Applikation
von Laserlichtpulsen mit den in Anspruch 1 dargestellten Schritten
gelöst. Die Unteransprüche geben vorteilhafte
Weiterbildungen des Verfahrens nach Anspruch 1 an.
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Wie
bereits erwähnt, kann die Aufnahme von Fremdkörpern
in die Zelle durch die Beobachtung der Blasenoszillation während
der Pulslaserapplikation realisiert werden. Blasenbildung findet
nicht immer unter der Laserapplikation statt, sondern es ist ebenso
möglich, dass das durch nichtlineare Absorption von Laserpulsen
erzeugte Plasma (insbes. Freie Elektronen) im Applikationsbereich
nicht ausreicht, um eine Blase aufschwingen zu lassen. Ein derartiges
Plasma zerstört jedoch u. a. chemische Bindungen in der
Zellmembran und kann durch Akkumulation der Effekte vieler Laserpulse
die Zelle sozusagen auf chemischem Wege öffnen. Bei Blasenbildung
erfolgt die lokale Öffnung der Zellmembran hingegen eher
auf thermomechanischem Wege wofür eine weitaus geringere
Anzahl von Laserpulsen ausreicht.
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Darüber
hinaus ist es durch Perforation der Zellmembran mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren ebenso gut möglich, Stoffe aus der Zelle auszuschleusen
oder über die Zellmembran aufgebaute (chemische) Potenziale
kollabieren zu lassen. Die folgenden Ausführungen beziehen
sich deshalb lediglich beispielhaft auf die erfindungsgemäße
Anwendung zur Aufnahme von Stoffen in die Zelle.
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Grundlage
der Erfindung ist die Erkenntnis, dass die Zellmembraneröffnung
mittels einzelner Laserpulse oder Pulsserien mit Repetitionsraten < 1 MHz immer mit
transienter Blasenbildung im Laserfokus einhergeht. Die Blasen haben
dann Lebensdauern im Bereich von Nanosekunden bis Mikrosekunden – im
Unterschied zu den langlebigen Blasen, die bei Photoperforation
mit Femtosekunden-Oszillatorpulsen (> 1 MHz Repetitionsrate) entstehen, wenn man
die Laserleistung überdosiert.
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Im
Folgenden soll stets darauf abgezielt werden, dass Blasenbildung
möglich ist. Typische Laserparameter, die dies erlauben,
sind insbesondere Pulsdauern im Piko- bis Femtosekundenbereich (ps oder
fs), Repetitionsraten unter 1 MHz, bevorzugt um 1 kHz, und Pulsenergien
in den Größenordnungen 1 bis 10.000 nJ. Die Blasenbildung
bei Fokussierung des Pulslasers auf die Zellmembran tritt in Erscheinung,
sobald eine dafür ausreichenden Pulsenergie eingestellt
wird. Dies lässt sich allerdings nicht durch eine feste,
vorgewählte Energieeinstellung erreichen, weil sich Fokusqualität
(Fleckgröße), Energieverluste auf dem Weg zum
Laserfokus und die Absorptionseigenschaften der Zielstruktur von
Fall zu Fall ändern. Das reproduzierbare Erzeugen von Blasen,
die idealerweise stets dieselbe Größe aufweisen
sollen – und damit dasselbe Beschädigungspotenzial
für die Zellmembran – erfordert deshalb eine adaptive
Pulslasersteuerung, die sich auf die Beobachtung der Blasengröße
stützt. Welche Größe optimal ist, hängt
von den jeweiligen Zelleigenschaften ab.
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Erfindungsgemäß wird
daher die Blasenbildung kontinuierlich überwacht und im
Zeitregime aufgezeichnet. Dabei wird die Zeitspanne zwischen dem ersten
Aufschwingen der Blase bis zu ihrem ersten Kollaps (i. F. bezeichnet
als Oszillationszeit), möglichst genau gemessen. Dies wird
möglich durch das Detektieren der Streuung eines Probelichtstrahls, vorzugsweise
eines Probelaserstrahls. Der Probelichtstrahl soll selbst keine
Wirkung auf Zellen oder umgebendes Medium entfalten, sondern dient
allein zur Überwachung der optischen Eigenschaften des Materials
im Pulslaserfokus. Vorzugsweise wird ein leistungsschwacher cw-Laser
verwendet mit einer Hauptemissionswellenlänge, die sich
wesentlich von der des Pulslasers unterscheidet. Es hat sich erwiesen,
dass Wellenlängen aus dem Nahinfrarot-Spektrum, z. B. 780
nm, besonders geeignet sind, weil sie die mikroskopische Beobachtung
der Zellen nicht stören.
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Der
Probelaserstrahl muss dazu den Bereich des Pulslaserfokus durchqueren,
in dem das Pulslaserlicht – bevorzugt unmittelbar an der
Zellmembran – für die Blasenbildung sorgt. Es
ist dafür praktisch, den Probelaserstrahl in den Strahlengang
des Pulslaserlichts einzuspiegeln. Dies ist mit einem dichroitischen
Spiegel möglich, ebenso wie das Auskoppeln des Probela serstrahls
nach dem Durchqueren des Fokus. Der ausgekoppelte Probelaserstrahl
wird auf einen Detektor geführt, der die Lichtintensität
fortlaufend registriert.
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Schwankungen
in der Lichtintensität des Probelasers sind auf Streuprozesse
im Pulslaserfokus zurückzuführen, wenn eine Blase
oszilliert. Bei sehr kleinen Blasen sind diese Schwankungen äußerst
schwach und sehr kurzzeitig. Um sie überhaupt messbar zu
machen, wird das Streulichtsignal des Probelasers mit einem empfindlichen
AC-gekoppelten High-Speed-Photoreceiver (Diode mit Verstärker für
den Fotostrom) vorzugsweise mit einer Signalbandbreite von 25 kHz
bis 200 MHz detektiert. Durch die AC-Kopplung werden alle „langsamen"
(hier bis 25 kHz) Schwankungen aus dem Signal gefiltert. Solche
langsamen Schwankungen können leicht aufgrund von Leistungsschwankungen
des Probelasers oder durch sonstige externe Einflüsse entstehen.
Zudem ist die zu detektierende Blase häufig deutlich kleiner
als das Fokusvolumen, wodurch der Streulichtanteil erheblich geringer
ist als die Gesamtintensität des durch den Fokus transmittierten
Lichtes. Durch die AC-Kopplung werden Gleichanteile aus der Messung
entfernt.
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Trotzdem
bietet der Photoreceiver die Möglichkeit, sich auch das
DC-Signal anzusehen. Dies ist wichtig für die Grundjustage
des Systems, denn der Probelaser muss optimal in den Strahlengang
des Pulslasers einjustiert werden, was einem maximalen DC-Signal
entspricht. Die hohe Bandbreite und die Empfindlichkeit des AC-Photoreceivers
ermöglichen die Detektion kleinster Änderungen
im Streulichtsignal des Probelasers. Die Dauer des Streulichtsignals entspricht
der Blasenoszillationszeit. Da der Photoreceiver eine Anstiegs-
und Abfallzeit von 1.8 ns besitzt, eignet er sich zur Bestimmung
von Blasenoszillationszeiten bis unter 5 ns. Die kürzeste
bisher gemessene Blasenoszillationszeit betrug 15 ns (an der Schwelle
zur Blasenbildung mit Femtosekundenpulsen und Fokussierung mit NA
= 0.9), was einem Blasenradius von nur 150 nm entspricht. Da noch
Reserven im Messbereich vorhanden sind, ist das System für
alle auftretenden Eventualitäten (d. h. noch kleinere Blasen
bei maximaler numerischer Apertur des Mikroskopobjektivs von NA
= 1.3) gerüstet.
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1 zeigt
eine Auswahl von Messungen der Blasenoszillation mit dem erfindungsgemäßen Messverfahren
wie zuvor beschrieben. Alle Grafiken stellen die gemessene Lichtintensität
gegenüber der Zeitachse dar und sind mit Angaben zu verwendeten Pulsenergien
E und daraus resultierenden Oszillationszeiten τ versehen.
Die Blasenoszillationen sind gekennzeichnet durch signifikante Abweichungen vom
ansonsten konstanten Signalverlauf.
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Die
erfindungsgemäß ermittelte Oszillationszeit der
lasererzeugten Blasen kann über die Rayleigh-Beziehung
in die Maximalausdehnung
der Blasen umgerechnet werden. Dabei sind p
0 der
hydrostatische Druck in der Umgebung der Blase, p
v der
Blaseninnendruck und ρ
0 die Dichte
des Mediums.
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Die
Rayleigh-Beziehung ist aus anderen technischen Feldern wohlbekannt,
wird aber hier wohl erstmals für nanoskalige Blasen, die
bei Laserapplikation entstehen, verwendet. Es zeigt sich denn auch,
dass sie zu falschen Ergebnissen führt, da die Oberflächenspannung
nicht berücksichtigt wird. Die Oberflächenspannung σ wirkt
wie ein Zusatzdruck p = 2σ/R auf die Blase, dessen Amplitude
umgekehrt proportional zum Blasenradius R ist. Dieser Zusatzdruck
verändert den Zusammenhang zwischen Oszillationszeit und
Maximalausdehnung der Blase. Mit Hilfe des Gilmore-Modells, das
die Oberflächenspannung mit ihrer Temperaturabhängigkeit
berücksichtigt, lassen sich aber Korrekturfaktoren zur
Rayleigh-Beziehung errechnen (siehe dazu 2). Aus 3 ist
zu entnehmen, dass die Rayleigh-Beziehung gerade für sehr
kleine Blasen die Durchmesser stark unterschätzt, während
das Gilmore-Modell sehr viel bessere Übereinstimmung mit
fotografischen Messungen zeigt.
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Damit
sind nun in guter Näherung die erzeugten Blasengrößen
aus den Blasenoszillationszeiten ermittelbar. Dabei ist bemerkenswert,
dass bereits Blasenradien bis hinab zu 150 nm optisch nachgewiesen
wurden, obwohl der Probelaser eine deutlich größere
Wellenlänge aufweist. Die Nachweisgrenze des gegenwärtig
verwendeten Fotodetektors mit 200 MHz Bandbreite liegt bei R ≈ 50
nm.
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Es
wurde bereits erwähnt, dass andere Arbeiten die Blasengröße
als einen kritischen Faktor für die Effizienz der zellulären
Fremdkörperaufnahme identifiziert haben. Sind die Blasen
zu klein, perforieren sie die Zellmembran nicht in ausreichendem
Maße, um den einzubringenden Fremdkörpern (typisch sollen
Nukleinsäuren, Chromosomen, Proteine, Organelle, Farbstoffe,
pharmazeutische Wirkstoffe oder funktionalisierte Nanopartikel in
die Zellen eindringen) Zugang zum Zellinnern zu gewähren.
Sind die Blasen indes zu groß, werden die Zellmembranen
so stark beschädigt, dass sich die Zelle nicht mehr von der
Beschädigung erholt und die Bearbeitung nicht überlebt.
In der Literatur sind Angaben zwischen 5 und 7,5 Mikro metern als
Obergrenze des zur Perforation dienlichen Blasendurchmessers zu
finden. Größere Blasen ziehen dort den Zelltod
nach sich.
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Das
für die optimale Transfektionseffizienz geeignete Intervall,
in dem die erzeugten Blasendurchmesser liegen sollten, um eine möglichst
hohe Zellviabilität zu sichern, kann nicht universell angegeben
werden. Es hängt vom gewählten Zelltyp, dem umgebenden
Medium und auch von der Art der einzubringenden Fremdkörper
ab, da auch diese auf die Laserpulse reagieren können.
Dieses optimale Intervall muss jeweils im Einzelfall der in Betracht
stehenden Aufgabe bestimmt werden. Als Faustregel kann man davon
ausgehen, dass die Blasengröße wenigstens der
Größe der Fremdkörper entsprechen sollte, höchstens
aber einem Bruchteil des Zelldurchmessers.
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Die
erforderlichen Kalibrierversuche, mit denen insbesondere die Erfolgsquote
des Einbringens der Fremdkörper in die Zellen und die Zellviabilität ggf.
auch getrennt untersucht werden, sind Stand der Technik und trotz
eines gewissen Aufwandes heute üblich.
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Die
Erfindung stellt neben der Laserpulsenergie eine zusätzliche
Messgröße, die Blasengröße bzw.
die Blasenoszillationszeit, zur Verfügung, für
die im Zuge der Kalibrierung eines günstiges Intervall aufzufinden
ist. Der besondere Vorteil der Erfindung liegt in der kontinuierlichen
Messbarkeit dieser Größe auch während
des eigentlichen Bearbeitungsvorganges. In der Tat ist es dadurch
nicht nur möglich, die tatsächlich im Pulslaserfokus
entstehende Blase praktisch schritthaltend mit der Pulsapplikation
zu vermessen, sondern durch geeignete Ansteuerung der Pulslaserquelle
kann sogar das Pulslaserlicht modifiziert werden, um ein aktiv kontrolliertes,
die Zelle schonendes Bestrahlen zu realisieren.
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Aus 3 ist
ebenfalls ersichtlich, dass ein monotoner Zusammenhang zwischen
der Pulsenergie der applizierten Strahlung und der beobachtbaren Blasengröße
besteht. Von daher ist es erfindungsgemäß zu bevorzugen,
die Pulsenergie des Bearbeitungslasers zu steuern. Dies kann zwar
prinzipiell über die Kontrolle der Pumpleistung oder über
die Rotation einer zwischen Polarisatoren angebrachten λ/2-Platte
geschehen, deutlich vorteilhafter ist jedoch die Verwendung eines
akustooptischen Modulators, weil dieser ein sehr schnelles Schalten
gestattet.
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Eine
automatisierte Steuerung der Optoperforation könnte folgendermaßen
aussehen:
Der Laser zielt auf die Zellmembran oder auf einen vorgewählten
Ort in der Nähe der Zellmembran. Es wird nun eine Laserpulsfolge
appliziert, bei der die Energie des ersten Pulses unterhalb der
zuvor bestimmten oder aus vorangegangenen Eingriffen bekannten Schwelle
für die Blasenbildung liegt. Die Pulsenergie wird bei den
folgenden Pulsen nach und nach erhöht (ansteigende Pulsenergierampe),
bis eine vorgewählte Blasengröße erreicht
ist. Die Pulsserie wird nun entweder sofort beendet oder mit konstanter
Pulsenergie weitergeführt, bis eine vorgewählte
Zahl zusätzlicher Pulse appliziert ist, welche die jeweils
gewünschte Blasengröße erzeugen.
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Die
vorstehende „Pulslaserapplikations-Strategie" ist vorzugsweise
durch eine geeignete Rechnerimplementation nach dem Stand der Technik
zu realisieren. Sie umfasst insbesondere das wiederholte Auslesen
des AC-Photodetektors, die schritthaltende Interpretation der Messdaten
hinsichtlich der aktuell erzeugten Blasengröße
und eine durch Programmparameter konditionierte Ansteuerung der
die Pulsenergie variierenden Einheit, bevorzugt eines akustooptischen
Modulators.
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Die
obige Strategie und der Ansatz zu ihrer Umsetzung sind im Kern der
Druckschrift
DE 103
31 792 A1 entliehen. Allerdings gibt diese keinerlei Hinweis
auf eine Möglichkeit, wie die Größe einzelner
erzeugter Blasen zu bestimmen wäre. Bei der
DE 103 31 792 A1 geht es
um die Laserbehandlung von Gewebeschichten, mithin um die simultane
Bestrahlung einer großen Zahl sehr unterschiedlicher Zellen,
so dass sich eine solche Frage dort nicht unmittelbar stellt.
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Die
Optoperforation bestimmter einzelner Zellen stellt insofern höhere
Anforderungen an die Dosimetriekontrolle. Die hierfür zweckdienliche
Blasengröße muss und kann sehr viel genauer bestimmt und
reproduzierbar erzeugt werden, als der Stand der Technik dies bislang
zuließ.
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Es
sollte abschließend noch erwähnt werden, dass
die Verwendung der Rayleigh-Beziehung und/oder der Korrekturen des
Gilbert-Modells nicht zwingend erforderlich sind, um eine funktionsfähige Dosimetriekontrolle
zu realisieren. Hierfür reicht allein schon die Messung
der Blasenoszillationszeit völlig aus sofern das Verfahren
auf die Oszillationszeit kalibriert wird. Die Übersetzungen
in Blasengrößen waren und sind jedoch für
das Verständnis der erzielten Effekte sehr nützlich
und können natürlich auch bei der adaptiven Kontrolle
des Pulslasers ohne großen Aufwand errechnet und protokolliert
werden. Es kann von Vorteil sein, diese ermittelten Blasengrößen
im Zusammenhang z. B. mit der Kenntnis des bearbeiteten Zelltyps
zur algorithmischen Optimierung der Lasersteuerung zu verwenden,
etwa zur Beschleunigung des Anstiegs der Pulsenergierampe.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 10331792
A1 [0006, 0028, 0028]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - 2006, Optics
Express, Vol. 14, No. 16, pp. 7125–33 [0003]
- - Vogel et al., 2005, Applied Physics B 81, pp. 1015–47 [0003]
- - 2005, Applied Physics B, 81, pp. 1015–47 [0005]