DE102006046410A1

DE102006046410A1 - Arzneimittel zur Prophylaxe oder Behandlung oder Diagnostik von ischämischen Krankheiten

Info

Publication number: DE102006046410A1
Application number: DE102006046410A
Authority: DE
Inventors: Holger Dr. Eltzschig; Tobias Dr. Eckle; Almut Dr. Grenz; Melanie Hart; Hartmut Prof. Osswald
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 2006-09-20
Filing date: 2006-09-20
Publication date: 2008-03-27
Also published as: WO2008034623A3; WO2008034623A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Prophylaxe oder Behandlung oder Diagnostik von ischämischen Krankheiten, Verfahren, um bei einem Lebewesen eine Veranlagung für eine ischämische Krankheit oder Erkrankung an einer ischämischen Krankheit zu diagnostizieren, sowie eine pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Prophylaxe oder Behandlung oder Diagnostik von ischämischen Krankheiten, Verfahren, um bei einem Lebewesen eine Veranlagung für oder Erkrankung an einer ischämischen Krankheit zu diagnostizieren, sowie eine pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzung.
Unter Ischämie versteht man die Verminderung oder Unterbrechung der Durchblutung eines Organs, Organteils oder Gewebes infolge mangelnder arterieller Blutzufuhr. Der damit verbundene Sauerstoffmangel, der als Hypoxie bezeichnet wird, führt bei längerem Bestehen zum Absterben von Zellen, Geweben oder Organteilen. Die auf eine solche Minderdurchblutung zurückzuführenden Krankheiten werden als ischämische Krankheiten bezeichnet. Sie stellen derzeit die häufigsten, mit dem Gefäßsystem assoziierten Erkrankungen dar.
Die gegenwärtigen therapeutischen Ansätze zur Behandlung von ischämischen Krankheiten basieren u.a. auf der Verabreichung von entzündungshemmenden Substanzen, wie bspw. Glukokortikoiden. Ferner wird eine Verbesserung der Mikrozirkulation durch Gabe von Vasodilatoren, wie bspw. Stickstoffmonoxiddonatoren, und Antikörpern gegen Adhäsionsmoleküle sowie die Erhöhung der Ischämietoleranz durch Verminderung von Sauerstoffradikalen durch Glutathion vergenommen.
Auch eine Konditionierung von Organen, die sog. ischämische Präkonditionierung (IP), wurde als Instrument zur Protektion vor Ischämie beschrieben. So wurde gezeigt, dass kurze, kontrollierte Perioden der Okklusion der arteriellen Blutzufuhr mit nachfolgender Reperfusion vor einer längeren Gewebeischämie schützend wirken können. IP bedeutet, dass eine zusätzliche, kontrollierte Gewebeischämie mit konsekutiver Reperfusionsphase der eigentlichen, im Rahmen einer Operation entstehenden Ischämie vorgeschaltet wird. Daraus resultiert eine Organprotektion durch Erhöhung der Ischämietoleranz.
Trotz einer Vielzahl von Studien ist es bislang nicht gelungen, die molekularen Mechanismen zu erkennen, die der ischämischen Präkonditionierung zugrunde liegen, um diese gezielt therapeutisch nutzen zu können. So untersuchten bspw. Mild T. et al. (1998), "Ecto-5'-nucleotidase is not required for ischemic preconditioning in rabbit myocardium in situ", Am. J. Physiol. 275, H1329-37, die Rolle des Enzyms Ecto-5'-Nucleotidase während der ischämischen Präkonditionierung und kommen zu dem Ergebnis, dass diese hierbei keine Rolle zu spielen scheint.
Van Waarde A. et al. (1989), "Protektion of the kidney against ischemic injury by inhibition of 5'-nucleotidase", Am. J. Physiol. 256 (2 Pt 2):F298-305, hingegen be haupten im Widerspruch zu den Erkenntnissen von Miki T. et al. (a.a.O.), dass die renale Ischämie durch eine Inhibition der 5'-Nucleotidase verbessert werden könne.
Trotz intensiver Forschungsbemühungen stellen ischämische Krankheiten, wie bspw. die Myokardischämie, eines der größten Gesundheitsprobleme der westlichen Industrienationen dar. Auch die renale Ischämie trägt signifikant zur Morbidität und Sterblichkeit von Patienten bei, wie nach Operationen oder invasiver Diagnostik. Bspw. kommt es bei chirurgischen Eingriffen, die ein Abklemmen der Aorta oder von renalen Gefäßen erfordern, bspw. während der operativen Korrektur von Aneurysmen oder der Behandlung von peripheren vaskulären Erkrankungen, in 15 bis 30 % der Fälle zu einem Nierenversagen aufgrund von Ischämie. Auch nach einem chirurgischen Eingriff in das Herz kommt es bei normalem Verlauf immerhin in 1 bis 10 % der Fälle zu einem akuten Nierenversagen aufgrund von Ischämie.
Vor diesem Hintergrund ist es dringend erforderlich, neue therapeutische Strategien zu entwickeln, mit denen ischämischen Krankheiten vorgebeugt werden kann, bzw. mit denen derartige Krankheiten behandelt und diagnostiziert werden können.
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik von ischämischen Krankheiten bereitzustellen, das zielgerichtet an den molekularen Ursachen der ischämischen Krankheiten ansetzt und dadurch die existierenden Therapiekonzepte zur Behandlung dieser Erkrankungen bzw. Diagnostiken unterstützt oder ggf. sogar ersetzt.
Diese Aufgabe wird durch die Verwendung von Nucleotid-Phosphohydrolase zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik von ischämischen Krankheiten gelöst.
Die Erfinder haben im Tierversuch überraschenderweise festgestellt, dass durch die Verabreichung von Nucleotid-Phosphohydrolase die Symptome von ischämischen Krankheiten, die in Mäusen künstlich induziert wurden, stark reduziert werden können und die betroffenen Tiere gegenüber unbehandelten Tieren eine deutlich höhere Überlebensrate zeigen. Dabei wurde auch festgestellt, dass die verabreichte Nucleotid-Phosphohydrolase eine Protektion von Risikogebieten („areas at risk", AARs) bewirkt, so dass nicht nur eine akute Behandlung von ischämischen Krankheiten, sondern auch eine Prophylaxe möglich ist.
Eine Nucleotid-Phosphohydrolase oder auch Nucleotidase bzw. Nucleotidphosphatase ist ein Enzym, das die hydrolytische Spaltung von Phosphatgruppen von Nucleosidmonophosphaten und damit den Abbau von Mononucleotiden zu den entsprechenden Nucleosiden katalysiert. Bei einer Substratspezifität für 5'-Phosphatgruppen spricht man auch von einer 5'-Nucleotidase bzw. 5'-Nucleotid-Phosphohydrolase.
Die Erfindung lässt sich auch diagnostisch einsetzen. So kann bei einen Risikopatienten, bei dem wegen eines entsprechenden familiären Hintergrunds angenommen wird, dass eine Prädisposition für eine ischämische Erkrankung vorliegt, oder der bereits erste Symptome für eine ischämische Erkrankungen zeigt, leicht feststellen, ob dies tatsächlich der Fall ist. So werden sich in einem solchen Fall nach einer Verabreichung der Nucleotid-Phosphohydrolase die Symptome nämlich messbar verbessern, so dass dann eine positive Diagnose erfolgen kann.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst. Die Erfinder machen sich dabei erstmals erkannte molekulare Mechanismen, die zur Entstehung von ischämischen Krankheiten führen bzw. der Protektion durch IP zugrunde liegen, zu Nutze, um ein potentes Arzneimittel bzw. Diagnostikum zu schaffen.
Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn als Nucleotid-Phosphohydrolase 5'-Nucleotidase (CD73) verwendet wird.
Die 5'-Nucleotidase wird gemäß der Nomenklatur der CD-Marker auch als CD73 (EC 3.1.3.5) bezeichnet. Ein weiteres Synonym für die 5'-Nucleotidase ist 5'-NT. CD73 ist in seiner nativen Form ein Ecto-Enzym, d.h. es entfaltet seine Aktivität im Interstitium bzw. im Extrazellulär-Raum. Es hydrolysiert 5'-AMP zu Adenosin, das seinerseits von der extrazellulären Seite auf spezifische Membranrezeptoren der Zellen wirkt.
Die erfindungsgemäße Verwendung von 5'-Nucleotidase, die nicht in die Zellen aufgenommen wird, steigert den Abbau von 5'AMP zu Adenosin im Interstitium und hat den Vorteil, dass eine solche Nucleotid-Phosphohydrolase zum Einsatz kommt, die sich nach Erkenntnissen der Erfinder zur Prophylaxe bzw. Behandlung von ischämischen Krankheiten besonders eignet. So konnte gezeigt werden, dass cd73^-/--Mäuse, denen genetisch CD73 fehlt und die experimentelle Symptome von ischämischen Krankheiten zeigen, erfolgreich durch die Gabe von 5'-Nucleotidase behandelt werden können. Konkret konnte eine Protektion des Risikogebietes erzielt werden, die vergleichbar war mit jener, die bei einer IP-Behandlung beobachtet wird.
Diese Beobachtungen der Erfinder waren insbesondere deshalb so überraschend, da die Ausführungen im Stand der Technik in genau die gegenteilige Richtung weisen. So behaupten nämlich sowohl Miki et al. (a.a.O.) als auch Van Waarde et al. (a.a.O.), dass die 5'-Nucleotidase für eine Protektion von ischämischen Risikogebieten nicht erforderlich sei, bzw. deren Aktivität bzw. Expression zu diesem Zwecke sogar inhibiert werden solle. Die erfindungsgemäße Lösung stellt damit eine Abkehr von den Erkenntnissen aus dem Stand der Technik dar.
Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn als Nucleotid-Phosphohydrolase alternativ oder zusätzlich Apyrase (CD39) verwendet wird.
Die Apyrase ist ein Enzym, das durch Calcium oder Magnesium aktiviert wird, und in biologischen Systemen – als Apyrase – in plasmamembrangebundener Form als Ecto-Enzym vorliegt (EC 3.6.1.5). Apyrase wird gemäß der Nomenklatur der CD-Marker auch als CD39 bezeichnet. Weitere Synonyme für die Apyrase sind NTPDase1, ATP-Diphosphohydrolase, ATPDase und Lymphoid cell activation antigen. Die Apyrase katalysiert als Nucleotid-Phosphohydrolase die Hydrolyse von ATP unter Bildung von AMP und Orthophosphat. Die Ecto-Apyrase kann ferner ADP und weitere Nucleosid-Diphosphate und -Triphosphate umsetzen.
Die Apyrase eignet sich nach Erkenntnissen der Erfinder zur Prophylaxe bzw. Behandlung von ischämischen Krankheiten ebenfalls besonders gut. So konnte bspw. gezeigt werden, dass eine Hemmung der endogenen Apyrase in Versuchstieren zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber ischämischen Krankheiten führt, wohingegen die exogene Verabreichung von Apyrase therapeutische Wirksamkeit gegenüber ischämischen Krankheiten zeigte.
Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Nucleotid-Phosphohydrolase bzw. 5'-Nucleotidase in löslicher Form vorliegt.
Die Erfinder haben festgestellt, dass die Nucleotid-Phosphohydrolase für eine Wirksamkeit gegenüber ischämischen Krankheiten nicht in membrangebundener Form vorliegen muss. Auch die lösliche Form zeigt Wirksamkeit, was insbesondere bei der Formulierung des Arzneimittels Vorteile mit sich bringt.
Erfindungsgemäß ist es ferner bevorzugt, wenn die Nucleotid-Phosphohydrolase in mikronisierter Form vorliegt.
Unter mikronisierter Form wird erfindungsgemäß eine Ausgestaltung einer Nucleotid-Phosphohydrolase verstanden, die in ihrer Größe gegenüber der natürlichen bzw. Wildtypvariante reduziert ist. Vorzugsweise erfolgt die Größenreduzierung bis auf eine solche Größe, bei der das Enzym noch enzymatisch aktiv ist, d.h. noch das aktive Zentrum enthält, anderer bspw. strukturgebende Abschnitte jedoch fehlen. Diese Reduzierung kann auf enzymatische Art und Weise oder aber durch Methoden der DNA-Rekombinationstechnologie erfolgen. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine solche Nucleotid-Phosphohydrolase verwendet wird, die das Gefäßsystem verlassen und ihre Wirkung im Interstitium entfalten kann. Erfahrungsgemäß ist dies bei der natürlichen bzw. Wildtypvariante nur erschwert möglich.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, wenn die ischämische Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Myokardischämie, renale Ischämie, Darmischämie und Leberischämie.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein Arzneimittel zur Behandlung von besonders bedeutsamen ischämischen Krankheiten bereitgestellt wird. So konnten die Erfinder feststellen, dass gerade bei ischämiebedingtem Organversagen, bei dem die Organe Herz, Niere, Darm oder Leber betroffen waren, die Wirkung der Nucleotid-Phosphohydrolase besonders vorteilhaft ist.
Die Nucleotid-Phosphohydrolase kann erfindungsgemäß ferner in Form einer Codierungssequenz in einem Expressionsvektor vorliegen.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass der behandelte Patient „selbst" die benötigte Nucleotid-Phosphohydrolase herstellt und ggf. genetische Defekte, die zu einer Mutation von endogener Nucleotid-Phosphohydrolase geführt haben, ausgeglichen werden können. Die Codierungssequenzen von Nucleotid-Phosphohydrolasen sind der NCBI-Datenbank bzw. der GeneBank zu entnehmen. Die Codierungssequenz von humaner 5'-Nucleotidase ist unter der Zugriffsnummer NM_001776 erhältlich. Die Codierungssequenz von humaner Ecto-Apyrase ist unter der Zugangsnummer NP_001767 erhältlich. Diese Referenzen sowie Sequenzen sind durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Es versteht sich, dass der Expressionsvektor weitere Abschnitte, wie Promotoren, Enhancer etc. aufweisen kann, die die Expression der Nucleotid-Phosphohydrolase in dem Patienten sicherstellen.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, wenn das Arzneimittel einen Wirkungsverstärker aufweist.
Als Wirkungsverstärker kommt jede Verbindung oder Zusammensetzung in Frage, die zur Prophylaxe oder Behandlung von ischämischen Krankheiten geeignet ist und die therapeutische Wirkung von Nucleotid-Phosphohydrolase gegenüber ischämischen Krankheiten nicht negativ beeinflusst bzw. ggf. sogar verstärkt. Dabei kann es sich bspw. um Substanzen handeln, die antiinflammatorische bzw. immunmodulatorische Wirkung haben. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die von den Erfindern erstmals erkannte und therapeutisch genutzte Wirkung von Nucleotid-Phosphohydrolase zusätzlich verstärkt und das Arzneimittel dadurch in seiner Potenz nochmals verbessert wird.
Als Wirkungsverstärker wird erfindungsgemäß bevorzugt ein Adenosin-A_2B-Rezeptor-Agonist, bspw. BR4887, verwendet.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein solcher Wirkungsverstärker zum Einsatz kommt, der nach Erkenntnissen der Erfinder zur Weiterentwicklung des Arzneimittels besonders geeignet ist. Bei BR4887, das auch als BAY 60-6583 bezeichnet wird, handelt es sich um einen spezifischen Adenosin-A_2B-Rezeptor-Agonisten, hergestellt von Bayer HealthCare. So konnten die Erfinder feststellen, dass bereits die isolierte Verabreichung von BR4887 eine hypoxieinduzierte vaskuläre Leckage reduzieren kann. Eine kombinierte Verabreichung mit Nucleotid-Phosphohydrolase führt sogar zu einer deutlichen Verbesserung des erfindungsgemäßen Arzneimittels.
Als Wirkungsverstärker ist erfindungsgemäß ferner ein Inhibitor des Nucleosidtransporters bevorzugt, wobei vorzugsweise ein solcher Inhibitor verwendet wird, der den Nucleosidtransporter ENT-1 bzw. ENT-2 inhibiert.
Durch diese Maßnahme machen sich die Erfinder kürzlich im Stand der Technik gewonnene Erkenntnisse zu Nutze. Vaskuläres Adenosin wird vorwiegend durch die equilibrativen Nucleosid-Transporter (ENT)-1 und -2 aufgenommen. Diese Transporter sind in die Regulation der Adenosin-Signalantworten involviert. Es konnte gezeigt werden, dass die Repression von ENT-1 in Abhängigkeit des hypoxyinduzierbaren Faktors 1 (HIF 1) während der Hypoxie in einer verminderten vaskulären Adenosinaufnahme und in verstärkten Adenosin-Signaleffekten resultiert; vgl. Eltzschig H. K. et al., "HIF-1-dependent repression of equilibrative nucleoside transporter (ENT) in hypoxia", J. Exp. Med. 202, 1493-1505 (2005). Diese Beobachtungen machen inhibitoren von ENT-1 und ENT-2 zu besonders geeigneten erfindungsgemäßen Wirkungsverstärkern.
Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn als Inhibitor von ENT-1 bzw. ENT-2 Dipyridamol verwendet wird.
Auch hierbei machen sich die Erfinder kürzlich gewonnene Erkenntnisse zu Nutze, nach denen bei Mäusen, die mit Dipyridamol (Boehringer Ingelheim) vorbehandelt wurden, nach der Induktion von Hypoxie eine deutlich verminderte Albuminleckage feststellbar und auch die ischämische Kaskade in ihrem Ausmaß deutlich schwacher ausgebildet war; vgl. Eltzschig H. K. et al. (a.a.O.).
Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren, um bei einem Lebewesen eine Veranlagung für oder Erkrankung an einer ischämischen Krankheit zu diagnostizieren, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Bereitstellung einer aus dem Lebewesen stammenden biologischen Probe, (2) Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein einer Nucleotid-Phosphohydrolase, (3) ggf. Bestimmung der Funktionsfähigkeit und/oder Aktivität der Nucleotid-Phosphohydrolase, (4) Korrelation der Abwesenheit von Nucleotid-Phosphohydrolase in der biologischen Probe oder einer in der biologischen Probe gegenüber dem Wildtyp reduzierten Funktionsfähigkeit und/oder Aktivität der Nucleotid-Phosphohydrolase in der biologischen Probe mit einer positiven Diagnose.
Unter einer biologischen Probe wird eine jegliche Probe verstanden, anhand derer festgestellt werden kann, ob das Lebewesen eine funktionsfähige Nucleotid-Phosphohydrolase exprimiert. Beispiele für eine biologische Probe stellen Gewebe der Risikogebiete [„areas at risk” (AAR)] dar, bspw. Myokard-, Nieren-, Darm- oder Lebergewebe, eine Speichel- oder Blut-, Haarprobe etc. Geeignete biologische Proben können aber auch aus anderen Regionen des Lebewesens stammen. Vorzugsweise enthalten diese Proben repräsentatives genetisches Material, wie Gesamt-DNA. Geeignet sind deshalb allgemein kernhaltige Zellen.
Die Untersuchung auf das Vorhandensein einer Nucleotid-Phosphohydrolase gemäß Schritt (2) erfolgt mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren, bspw. unter Verwendung von spezifischen Antikörpern. Bevorzugt ist es auch, wenn in Schritt (2) ein Mutations-Screening durchgeführt wird, bei dem festgestellt wird, ob in der Codierungssequenz für die Nucleotid-Phosphohydrolase eine Mutation vorliegt, die zu einem vollständigen Ausfall des Proteins oder aber zu einem Aktivitätsverlust gegenüber dem Wildtyp führt.
Die Funktionsfähigkeit oder Aktivität der Nucleotid-Phosphohydrolase wird in Schritt (3) gemäß im Stand der Technik allgemein bekannter Methoden bestimmt. Dabei ist es bevorzugt, wenn die Adenosin-Bildungsrate der Nucleotid-Phosphohydrolase in der biologischen Probe im Vergleich zur Adenosin-Bildungsrate von Wildtyp-Nucleotid-Phosphohydrolase bzw. vollaktiver bzw. funktionsfähiger Nucleotid-Phosphohydrolase bestimmt wird.
Bei einer Feststellung, dass die biologische Probe keine aktive bzw. funktionsfähige Nucleotid-Phosphohydrolase enthält, bspw. aufgrund eines Polymorphismus, kann diagnostiziert werden, dass das betroffene Lebewesen eine verminderte Ischämietoleranz und deshalb eine Veranlagung für die Entwicklung einer ischämischen Erkrankung hat oder sich bereits eine ischämische Erkrankung manifestiert hat.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat den Vorteil, dass erstmals die molekularen Ursachen einer ischämischen Krankheit diagnostisch genutzt werden. Bislang basiert die Diagnostik von ischämischen Krankheiten weitgehend auf empirisch bestimmten Parametern, wie des Sauerstoffpartialdrucks im arteriellen Blut sowie der Verwendung von bildgebenden Verfahren, wie der Echokardiographie, MRT, SPECT etc. Diese Messmethoden sind allerdings mit einem hohen Fehlerrisiko behaftet, so dass das erfindungsgemäße Verfahren zu einer sicheren Diagnose beiträgt und eine zielgerichtete Behandlung von ischämischen Krankheiten ermöglicht.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische und/oder diagnostische Zusammensetzung, die Nucleotid-Phosphohydrolase in einer therapeutisch wirksamen Menge sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ggf. einen Wirkungsverstärker aufweist.
In Bezug auf die Nucleotid-Phosphohydrolase sowie den Wirkungsverstärker wird auf die obigen Ausführungen im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Verwendung verwiesen, die hier gleichermaßen gelten. Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik allgemein bekannt, vgl. Kibbe A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients. American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press, 3rd Edition (2000). Es versteht sich, dass die pharmazeutische bzw. diagnostische Zusammensetzung weitere Inhalts- oder Hilfsstoffe aufweisen kann, wie Binde-, Spreng-, Gleitmittel und Salze etc., um eine galenisch geeignete Form bereitzustellen, und um eine ausreichende Konzentration des Wirkstoffes am Wirkort zu gewährleisten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren, um bei einem Lebewesen eine Veranlagung für oder Erkrankung an einer ischämischen Krankheit zu diagnostizieren, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Verabreichung der vorstehenden diagnostischen Zusammensetzung an ein Lebewesen, das Symptome einer ischämischen Krankheit zeigt; (2) Feststellung, ob sich die Symptome verbessern, und (3) Korrelation einer Verbesserung der Symptome mit einer positiven Diagnose.
Mit diesem Test können bspw. Patienten untersucht werden, in deren Familie relativ häufig Herzerkrankungen oder andere mit ischämischen Konditionen in Verbindung stehende Krankheiten aufgetreten sind, und festgestellt werden soll, ob eine Prädisposition für eine Ischämieintoleranz bzw. eine reduzierte Ischämietoleranz gegeben ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Adenosin-A_2B-Rezeptor-Agonisten, vorzugsweise von BR4887 (BAY 60-6583), zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik von ischämischen Krankheiten, vorzugsweise von Myokardischämie.
Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass die Verabreichung eines spezifischen Adenosin-A_2B-Rezeptor-Agonisten nach der Induktion von Hypoxie zu einem Infarkt mit deutlich verringertem Ausmaß führt, als bei unbehandelten Kontrolltieren. Dadurch wurde ein kardioprotektiver Effekt von Adenosin-A_2B-Rezeptor-Agonisten, wie BR4887 (BAY 60-6583), demonstriert. Entsprechende Ergebnisse wurden für die anderen Organe (Niere, Leber, Darm) gefunden.
Die Erfinder haben ferner ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung von ischämischen Krankheiten bei einem Patienten entwickelt, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Verabreichung der zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in einen Patienten, und (2) ggf. wiederholen der Verabreichung gemäß Schritt (1).
Die Erfinder haben ferner ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung von ischämischen Krankheiten bei einem Patienten entwickelt, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Aktivierung der endogenen Nucleotid-Phosphohydrolase, wie bspw. der Ecto-5'-Nucleotidase (CD73) und/oder Ecto-Apyrase (CD39) in einen Patienten, und (2) ggf. wiederholen der Aktivierung gemäß Schritt (1).
Dieses Verfahren beruht darauf, dass die Aktivität der endogenen Nucleotid-Phosphohydrolase erhöht wird. Dies könnte bspw. durch die Steigerung des extrazellulär bereitgestellten 5'-AMP erfolgen, was wiederum bspw. durch CD39 möglich ist.
Insofern stellen die Erfinder auch Aktivatoren bereit, die die Aktivität der endogenen Nucleotid-Phosphohydrolase erhöhen. Diese Aktivatoren sind geeignet zur Herstel lung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik von ischämischen Krankheiten.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Im Anschluss wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die rein illustrativen Charakter haben und die Reichweite der Erfindung nicht einschränken. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist.
1 CD73 wird durch kardiale ischämische Präkonditionierung (IP) induziert. (a) Mausmodell zur kardialen IP. Alters-, geschlechts- und gewichtsabgestimmte Mäuse wurden mit Pentobarbital anästhesiert und mechanisch ventiliert. Die ischämische Präkonditionierung wurde in situ unter Verwendung eines Systems mit hängendem Gewicht zur atraumatischen Okklusion der linken Koronararterie durchgeführt. Das IP-Protokoll bestand aus vier Zyklen von Ischämie/Reperfusion (jeweils 5 Minuten). Die Tiere wurden zu den angegebenen Zeitpunkten getötet und das Risikogebiet wurde herausgeschnitten. Die Transkriptionsantworten auf die IP wurden nach der Isolierung von RNA aus dem Risikogebiet, einem DNase-Verdau und einer Echtzeit-reversen Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (Echtzeit-RT-PCR), ausgehend von cDNA, untersucht. (b) Die CD73-mRNA wird durch die IP induziert. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurden die Risikogebiete herausgeschnitten, die Gesamt-RNA isoliert und die CD73-mRNA-Spiegel wurden durch Echtzeit-RT-PCR bestimmt. Die Daten wurden in Relation zu einem internen Haushaltsgen (β-Actin) berechnet und ausgedrückt als x-fache Veränderung im Vergleich zur Kontrolle (keine IP) ± SD zu den jeweils angegebenen Zeiten. Die Ergebnisse stammen aus 6 Experimenten zu jeder Bedingung. (c) Das CD73-Protein wird durch die IP induziert. Das Risikogebiet wurde zu den angegebenen Zeitpunkten herausgeschnitten, schockgefroren, lysiert, und die Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die Membranen wurden mit einem anti-CD73-Antikörper inkubiert. Ein repräsentatives Experiment aus insgesamt 3 Experimenten ist dargestellt. (d) Um den Einfluss der IP auf die kardiale CD73-Expression zu untersuchen, wurden Mäuse einer IP unterzogen. Das kardiale Gewebe aus dem Risikogebiet wurde 90 Minuten nach der IP gewonnen, zerschnitten, mit polyklonalem anti-CD73-Antikörper gefärbt, mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop (90 min, WT) visualisiert und mit dem nicht-präkonditionierten Gewebe (Kontrolle) verglichen. In weiteren Experimenten wurde der sekundäre Antikörper allein verwendet („negativ") oder die primären und sekundären Antikörper wurden an zuvor charakterisierten Mäusen mit zielgerichteter Gendeletion von cd73 verwendet (90 min, KO). WT: Wildtyp-Mäuse, KO: cd73^-/--Mäuse. (e) CD73-Aktivität nach IP. Nach der IP in situ wurde das Risikogebiet zu den angegebenen Zeitpunkten herausgeschnitten, schockgefroren und die Enzymaktivität wurde durch die Messung der Umwandlung von [¹⁴C]IMP in [¹⁴C]Inosin evaluiert. Für besondere Zwecke wurde APCP als ein CD73-Inhibitor verwendet. Die CD73-Aktivität ist als APCP-inhibierte IMP-hydrolysierende Aktivität dargestellt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in nmol IMP hydrolisiert/h/mg Protein und werden verglichen mit nicht-präkonditioniertem Myokard (C).
2 CD73 wird durch renale ischämische Präkonditionierung (IP) induziert. (a) Mausmodell zur renalen IP. Alters-, geschlechts- und gewichtsabgestimmte Mäuse wurden mit Pentobarbital anästhesiert, einer rechten Nephrektomie unterzogen, gefolgt von einer ischämischen Präkonditionierung in situ mit einem System mit einem hängenden Gewicht zur atraumatischen Okklusion der linken renalen Arterie. Das IP-Protokoll bestand aus vier Zyklen von Ischämie/Reperfusion (jeweils 4 Minuten), gefolgt von den angegebenen Zeiten der Reperfusion. (b) Die CD73-mRNA wird durch die IP induziert. Nach den angegebenen Zeiträumen wurden die Nieren ausgeschnitten, die Gesamt-RNA isoliert und die CD73-mRNA-Spiegel wurden durch Echtzeit-RT-PCR bestimmt. Die Daten wurden relativ zu einem internen Haushaltsgen (β-Actin) berechnet und werden ausgedrückt als x-fache Veränderung im Vergleich zur Kontrolle (keine IP) ± SD zu den jeweils angegebenen Zeiten. Die Ergebnisse stammen aus 6 Experimenten zu jeder Bedingung. (c) Das CD73-Protein wird durch IP induziert. Die Nieren wurden zu den angegebenen Zeitpunkten herausgeschnitten, schockgefroren, lysiert, und die Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose transferiert. Die Membranen wurden mit anti-CD73-Antikörper inkubiert. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment von 3 Experimenten. Der gleiche Blot wurde auf die β-Actin-Expression als Kontrolle für die Proteinbeladung untersucht. (d) Das CD73-Protein wird durch IP induziert – Immunhistochemie. Wildtyp- und cd73^-/--Mäuse wurden einer IP unterzogen. Die Nieren wurden nach den angegebenen Zeiträumen nach der IP gewonnen, zerschnitten, mit einem anti-CD73-Antikörper gefärbt und auf einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop visualisiert. Gewebe aus einer perfundierten, jedoch unpräkonditionierten Wildtyp-Maus diente als Kontrolle. Die Färbung von Wildtypgewebe mit einem sekundären Antikörper allein ist in der oberen linken Teilabbildung gezeigt und als „negativ" gekennzeichnet. (e) Die CD73-Enzymaktivität wird durch IP induziert. Die Nieren wurden nach der IP-Behandlung herausgeschnitten, schockgefroren und die Extrakte wurden, wie in dem Material- und Methoden-Teil beschrieben, präpariert. Die 5'-Nucleotidase-Enzymaktivität wurde durch die Messung der Umwandlung von [¹⁴C]IMP in [¹⁴C]Inosin in Gegenwart und Abwesenheit von APCP evaluiert. Die Enzymaktivität wird dargestellt als nmol/h/mg-Protein von APCP-inhibierbarer IMP-Hydrolyseaktivität und wird verglichen mit nicht-präkonditionierten Nieren (-IP).
3 Die Inhibition von CD73 durch APCP-Behandlung hebt die Kardioprotektion durch ischämische Präkonditionierung (IP) auf (a) Messung von CD73-Aktivität in Herzen, die mit APCP behandelt wurden. Alters-, geschlechts- und gewichtsabgestimmte Wurfgeschwisterkontrollen wurden anästhesiert und erhielten eine Infusion des spezifischen CD73-Inhibitors Alpha-Beta-Methylen-ADP (APCP) über einen Carotis-Arterienkatheter (40 mg/kg/h). Um die effektive Inhibition der CD73-Aktivität zu bestätigen, wurden die Herzen nach 30-minütiger Infusion herausgeschnitten und die Enzymaktivität wurde durch die Messung der APCP-inhibierten Umwandlung von [¹⁴C]IMP in [¹⁴C]Inosin evaluiert. Die Ergebnisse werden ausgedrückt in nmol IMP hydolysiert/h/mg-Protein. (b) AMP-induzierte Bradykardie wird durch APCP-Infusion blockiert. Um die funktionelle Inhibition von CD73 durch APC-Behandlung zu bestätigen, wurde ein Bolus von 5'-Adenosinmonophosphat (AMP) verabreicht (50 μl einer Lösung mit 8 mg/ml von AMP) und die AMP-induzierte Bradykardie wurde bestimmt. Festzuhalten ist: Die Behandlung mit APCP blockiert die AMP-induzierbare Bradykardie. (c) Die APCP-Behandlung schwächt die Kardioprotektion durch IP ab. Um den Einfluss der APCP-Infusion auf die Kardioprotektion durch IP zu untersuchen, wurde als Nächstes die Präkonditionierung in situ mit 4 Zyklen von IP durchgeführt (5 min Ischämie, 5 min Reperfusion, mit oder ohne APCP-Infusion). Die Mäuse wurden nach 2-stündiger Reperfusion getötet und die Plasmaspiegel von Troponin I (cTnI) wurden durch ELISA gemessen. Festzuhalten ist: Die kardioprotektiven Effekte der IP werden durch die APCP-Behandlung abgeschwächt. (d) In weiteren Experimenten wurden die Infarktgrößen durch Doppelfärbung mit Evan's Blue und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid in APCP-behandelten oder -unbehandelten Mäusen (+/- APCP) gemessen. Die Infarktgrößen von Mäusen, die mit oder ohne IP (-/+ IP) behandelt wurden, werden ausgedrückt als Prozent des Infarktes in dem Risikogebiet. Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwerte ± SD aus 6 Tieren pro Bedingung. (e) Es werden repräsentative Aufnahmen der Infarkte dargestellt.
4 Die Inhibition von CD73 durch die APCP-Behandlung hebt die renale Protektion durch ischämische Präkonditionierung (IP) auf (a) Die renale CD73-Enzymaktivität wird durch APCP-Infusion inhibiert. Alters-, gewichts- und geschlechtsabgestimmte C57BL/6J-Mäuse wurden anästhesiert und es wurde der spezifische CD73-Inhibitor APCP (2 mg pro kg) i.p. oder sterile Kochsalzlösung verabreicht. Die Nieren wurden 30 min nach der Verabreichung herausgeschnitten und die Enzymaktivität wurde durch Messung der Umwandlung von [¹⁴C]IMP in [¹⁴C]Inosin evaluiert. Die Ergebnisse werden ausgedrückt als nmol/h/mg-Protein der APCP-inhibierbaren IMP-Hydrolyseaktivität. Die APCP-Behandlung verhindert die renale Protektion durch die IP. Es wurden Experimente in APCP-behandelten oder -unbehandelten Mäusen mit oder ohne Präkonditionierung in situ (4 Zyklen von IP, 4 min Ischämie, 4 min Reperfusion) 30 min vor der Ischämie durchgeführt. Die Nierenfunktionstests wurden nach 24-stündiger Reperfusion durchgeführt. (b) Messung der Plasmacreatininkonzentration. (c) Messung des Plasmakaliums (Plasma-K⁺). (d) Messung der Creatinin-Clearance. (e) Messung der Urinflussrate. (f) Messung der Urinnatriumausscheidung (Urin-Na⁺-Ausscheidung). (g) Messung der Urinkaliumausscheidung (Urin-K⁺-Ausscheidung). (h) Quantitative Bestimmung der PMN-Gewebeakkumulierung durch Messung der Myeloperoxidase (MPO)-Gewebespiegel. Die Daten stammen aus 5 bis 8 Mäusen pro Bedingung und die Ergebnisse werden ausgedrückt als Mittelwerte ± SD.
5 Die Kardioprotektion durch ischämische Präkonditionierung (IP) wird in cd73^-/--Mäusen aufgehoben. (a) Messung der CD73-Aktivität in Herzen aus cd73^-/-Mäusen. Cd73^-/--Mäuse (schwarze Balken) und alters-, gewichts- und geschlechtsabgestimmte Wurfgeschwisterkontrollen (weiße Balken) wurden anästhesiert, intubiert und über einen in der Carotis-Arterie platzierten Katheter ausbluten gelassen. Die Herzen wurden isoliert, schockgefroren und die CD73-Enzymaktivität wurde als Teil der APCP-inhibierten IMP-Hydrolyseaktivität gemessen. Die Ergebnisse werden ausgedrückt in nmol IMP hydrolysiert/h/mg Protein. (b) Die AMP-induzierte Bradykardie ist in cd73^-/--Mäusen abgeschwächt. Wildtyp-cd73^+/+- oder Mäuse, die für cd73 mutiert waren (cd73^-/-) wurden mit einem Bolus von Adenosinmonophosphat (AMP, 50 μl einer Lösung mit 3 mg/ml von AMP) über einen Carotis-Arterienkatheter behandelt. Die Ergebnisse werden ausgedrückt als prozentuale Veränderung in der Herzrate nach AMP-Injektion. (c) Die Kardioprotektion durch IP wird in cd73^-/--Mäusen aufgehoben. Um die kardiale IP in Mäusen zu untersuchen, die für cd73 mutiert waren, wurde eine Präkonditionierung in situ mit 4 Zyklen von IP (5 min Ischämie, 5 min Reperfusion) in Wildtyp-(cd73^+/+) oder in solchen Mäusen mit zielgerichteter Deletion von cd73 (cd73^-/-) durchgeführt. Die Mäuse wurden nach 2- stündiger Reperfusion getötet und die Infarktgrößen wurden durch Doppelfärbung mit Evan's Blue und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid gemessen. Die Infarktgrößen werden ausgedrückt als Prozent des Infarktes in dem Risikogebiet. Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwerte ± SD aus 6 Tieren pro Bedingung. (d) Troponin I (cTnI)-Plasmaspiegel wurden in Wildtyp-Mäusen (cd73^+/+) oder cd73-mutierten Mäusen (cd73^-/-) gemessen, die mit oder ohne IP (+/- IP) behandelt wurden. Festzuhalten ist: Die kardioprotektiven Effekte der IP werden in cd73^-/--Mäusen abgeschwächt. (e, f) Rekonstitution von cd73^-/--Mäusen mit Adenosin. Cd73^-/--Mäuse (e) und alters-, gewichts- und geschlechtsabgestimmte Wurfgeschwisterkontrollen (f) erhielten eine intraarterielle Infusion mit Adenosin (200 μl/h, Adenosin 8 mg/ml), d.h. eine Dosis, die zuvor als eine solche bestimmt wurde, die keine Hypotension oder Bradykardie induziert. 16 min nach Beginn der Infusion wurde die ischämische Präkonditionierung wie oben beschrieben durchgeführt, die Infarktgröße wurde durch Doppelfärbung mit Evan's Blue und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid bestimmt. Die Ischämie mit IP wurde mit 1 U von löslicher 5'-Nucleotidase durch Infusion über einen Carotis-Arterienkatheter nahezu auf einen WT-Spiegel rekonstituiert. (g, h) Rekonstitution von cd73^-/--Mäusen mit löslicher 5'-Nucleotidase. Cd73^-/--Mäuse (f) und alters-, gewichts- und geschlechtsabgestimmte Wurfgeschwisterkontrollen (g) erhielten eine Behandlung i.p. mit 1 U von löslicher 5'-Nucleotidase, die aus dem Gift von C. atrox 60 min vor der IP erfolgte. Die Infarktgröße wurde durch Doppelfärbung mit Evan's Blue und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid bestimmt. Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwerte ± SD aus 6 Tieren pro Bedingung.
6 Die renale Protektion durch ischämische Präkonditionierung (IP) wird in cd73^-/--Mäusen aufgehoben. (a) Messung der CD73-Aktivität in Nieren aus cd73^-/--Mäusen. Cd73^-/--Mäuse und alters-, gewichts- und geschlechtsabgestimmte Wurfgeschwisterkontrollen wurden anästhesiert und die Nieren herausgeschnitten. Die Nieren wurden schockgefroren und die CD73-Enzymaktivität wurde als Anteil der APCP-inhibierten Hydrolyseaktivität gemessen. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in nmol IMP hydrolysiert/h/mg Protein. Die renale Protektion durch IP wird in cd73^-/--Mäusen aufgehoben. Es wurde eine Präkonditionierung in situ mit 4 Zyklen von IP (4 min Ischämie, 4 min Reperfusion) durchgeführt, gefolgt von 30 min der Ischämie. Renale Funktionstests wurden nach 24-stündiger Erholung durchgeführt. (b) Messung der Plasmacreatininkonzentration. (c) Messung des Kaliumgehaltes im Plasma (Plasma-K⁺). (d) Messung der Creatinin-Clearance. (e) Messung der Urinflussrate. (f) Messung der Urinnatriumausscheidung (Urin-Na⁺-Ausscheidung). (g) Messung der Urinkaliumausscheidung (Urin-K⁺-Ausscheidung). (h) Quantitative Bestimmung der PMN-Gewebeakkumulierung durch Messung der Myeloperoxidase (MPO)-Gewebespiegel. Die Daten stammen aus 6 bis 8 Mäusen pro Bedingung und die Ergebnisse werden ausgedrückt als Mittelwerte ± SD.
7 Der Adenosin-A_2B-Rezeptor wird selektiv durch ischämische Präkonditionierung (IP) induziert. (a) Modulierung des Spiegels von Adenosin-Rezeptortranskript durch IP. Alters-, gewichts- und geschlechtsabgestimmte Wurfgeschwistermäuse wurden mit Pentobarbital anästhesiert und mechanisch ventiliert. Es erfolgte eine ischämische Präkonditionierung in situ unter Verwendung eines Systems mit hängendem Gewicht zur atraumatischen Okklusion der linken Koronararterie. Das IP-Protokoll bestand aus 4 Zyklen der Ischämie/Reperfusion (jeweils 5 min). Die Tiere wurden zu den angegebenen Zeitpunkten getötet und die Risikogebiete wurden herausgeschnitten. Die Transkriptionsantworten von allen 4 Adenosinrezeptoren (A₁, A_2A, A_2B und A₃) auf die IP wurden nach der Isolierung von RNA aus dem Risikogebiet, einem DNase-Verdau und einer Echtzeitreverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (Echtzeit-RT-PCR) von der cDNA untersucht. Die Daten wurden relativ zu einem internen Haushaltsgen (β-Actin) berechnet und werden ausgedrückt als x-fache Veränderung im Vergleich mit simulationsoperierten Tieren ohne IP-Behandlung (Kontrollen, C ± SD). Die Ergebnisse stammen aus 6 Experimenten pro Bedingung. (b) Um die relativen Spiegel von Transkript der verschiedenen Adenosinrezeptoren in präkonditioniertem (schwarze Balken, 90 min nach IP) oder nicht-präkonditioniertem Gewebe (weiße Balken, Kontrolle) aus dem Risikogebiet miteinander zu vergleichen, wurden die Transkriptionsspiegel relativ zu dem Adenosinrezeptor mit den niedrigsten Transkriptionsspiegeln (A_2A) normalisiert. (c) Das Adenosin-A_2B-Rezeptorprotein wird durch IP induziert. Alters-, gewichts- und geschlechtsabgestimmte Wurfgeschwistermäuse wurden mit Pentobarbital anästhesiert und mechanisch ventiliert. Es erfolgte eine ischämische Präkonditionierung in situ, wie oben beschrieben. Die Tiere wurden 90 min nach der IP getötet und das Gewebe aus dem Risikogebiet wurde herausgeschnitten, mit Antikörpern gegen den Adenosin-A_2B-Rezeptor gefärbt, auf einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop visualisiert und mit Kardialgewebe aus nicht-präkonditionierten Tieren (Kontrolle) verglichen. Zusätzlich wurde der sekundäre Antikörper allein verwendet („negativ"). Ferner wurden die primären und sekundären Antikörper in Mäusen mit zielgerichteter Deletion des Adenosin-A_2B-Rezeptors verwendet (90 min KO). WT: Wildtyp-Mäuse, KO: A_2BAR^-/--Mäuse. (d) Präkonditionierung in sämtlichen Adenosinrezeptor-Knockoutmäusen – außer in Adenosin-A_2B-Rezeptor-Knockoutmäusen. Um die kardiale IP in Mäusen zu untersuchen, die für jeden einzelnen Adenosinrezeptor mutiert waren, erfolgte 60 min vor der Ischämie in sämtlichen Adenosinrezeptor-mutierten Mäusen (A₁, A_2A, A_2B, A₃) oder in alters-, gewichts- oder geschlechtsabgestimmten Wurfgeschwisterkontrollen eine Präkonditionierung in situ (4 Zyklen von IP, 5 min Ischämie, 5 min Reperfusion) oder Simulationsoperationen. Die Mäuse wurden 2 Stunden nach der Reperfusion getötet und die Infarktgrößen wurden durch Doppelfärbung mit Evan's Blue und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid gemessen. Die Infarktgrößen werden ausgedrückt als prozentuale Veränderung gegenüber den Wurfgeschwisterkontrollen mit IP. Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte ± SD aus 6 Tieren pro Bedingung.
8 Die IP wird in Adenosin-A_2B-Rezeptor-Knockoutmäusen aufgehoben. (a) Charakterisierung von Adenosin-A_2B-Rezeptor-mutierten Mäusen. Die Messungen der Spiegel der Transkripte der Adenosinrezeptoren durch Reverse-Transkriptase-Echtzeit-Polymerasekettenreaktion in kardialem Gewebe aus Mäusen, die für den Adenosin-A_2B-Rezeptor mutiert waren, wurden von Deltagene durchgeführt (WT: Wildtyp; HZ: heterozygote Deletion des Adenosin-A_2B-Rezeptors, KO: homozy gote Deletion des Adenosin-A_2B-Rezeptors). (b) PCR zur Genotypisierung gemäß den Angaben des Herstellers in Mäusen, die für den Adenosin-A_2B-Rezeptor mutiert waren (WT: Wildtyp; HZ: heterozygote Deletion des Adenosin-A_2B-Rezeptors, KO: homozygote Deletion des Adenosin-A_2B-Rezeptors). (d) Die Hypoxie-induzierte vaskuläre Leckage nimmt in Kardialgewebe aus Mäusen, die für den Adenosin-A_2B-Rezeptor mutiert sind, zu. A_2B ^-/--Mäusen und alters-, gewichts- und geschlechtsabgestimmten Kontrollen wurde intravenös Evan's Blue-Lösung (0,2 ml von 0,5 % in PBS) verabreicht und diese einer normobaren Hypoxie (H, 8 % O₂, 92 % N₂) oder Raumluft (N) für 4 h ausgesetzt. Die Tiere wurden getötet und die Herzen isoliert. Die Konzentrationen von Evan's Blue in dem Organ wurden nach der Formamidextraktion (55 C für 2 h) durch Messung der Absorptionen bei 610 nm nach Abzug der Referenzabsorption bei 450 nm quantifiziert. Festzuhalten ist eine kardiale Retention von Evan's Blue in A_2B ^-/--Mäusen nach der Hypoxieexposition. Die Daten werden ausgedrückt als Mittelwerte ± SD von Evan's Blue OD/mg Feuchtgewebe und gepoolt aus 4 bis 6 Tieren pro Bedingung. (e) Die IP wird in A_2B ^-/--Mäusen aufgehoben. Um die kardiale IP in Mäusen zu untersuchen, die für den Adenosin-A_2B-Rezeptor mutiert waren, wurde in situ eine Präkonditionierung mit 4 Zyklen von IP (5 min Ischämie, 5 min Reperfusion) in Wildtyp-Mäusen (A_2B ^+/+, weiße Balken) oder in Mäusen mit zielgerichteter Deletion des Adenosin-A_2B-Rezeptors (A_2B ^-/-, schwarze Balken) durchgeführt. Die Mäuse wurden nach 2-stündiger Reperfusion getötet und die Troponin I (cTnI)-Plasmaspiegel wurden mit oder ohne IP (+/-IP) gemessen. Zusätzlich wurden die Infarktgrößen durch Doppelfärbung mit Evan's Blue und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid gemessen. Die Infarktgrößen werden ausgedrückt als Infarktprozent in dem Risikogebiet. Die Ergebnisse werden dargestellt als Mittelwerte ± SD aus 6 Tieren pro Bedingung. Festzuhalten ist: Die kardioprotektiven Effekte der IP werden in A_2B ^-/--Mäusen abgeschwächt. (f) Repräsentative Aufnahmen aus Mäusen, die für den Adenosin-A_2B-Rezeptor deletiert waren (A_2B ^-/-) mit oder ohne IP 60 min vor der Ischämie und 2 h vor der Reperfusion mit Evan's Blue/2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Doppelfärbung. (g) Um den Einfluss von PSB1115, einem wasserlöslichen hochspezifischen Adenosin-A_2A-Rezeptor-Antagonisten auf die Kardioprotekti on durch IP zu untersuchen, wurde in situ eine Präkonditionierung in alters-, gewichts- und geschlechtsabgestimmten Wurfgeschwisterkontrollen und in Mäusen durchgeführt, die für den Adenosin-A₁-Rezeptor mutiert waren, wozu 4 Zyklen von IP (5 min Ischämie, 5 min Reperfusion) 60 min vor der Ischämie verwendet wurden. Während des experimentellen Verfahrens erhielten die Mäuse eine Infusion mit PSB1115 (5 mg/kg/h über einen Carotis-Arterienkatheter, schwarze Balken) oder Vehikelkontrolle (weiße Balken). Die Mäuse wurden nach 2-stündiger Reperfusion getötet und die Infarktgrößen wurden durch Doppelfärbung mit Evan's Blue und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid gemessen. Die Infarktgrößen, die mit oder ohne IP (-/+ IP) behandelt wurden, werden ausgedrückt als Infarktprozent in dem Risikogebiet. Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwerte ± SD aus 6 Tieren pro Bedingung. Festzuhalten ist: Die Abschwächung der Limitierung der Infarktgröße durch IP auf Grund von PSB1115 in Wildtyp-Mäusen und A₁ ^-/--Mäusen.
9 Histologische Anzeichen von renaler Protektion durch IP fehlen in cd73^-/--Mäusen. Um die histologischen Aspekte als auch die renale Infiltration mit polymorphkernigen neutrophilen (PNM) zu untersuchen, wurden die Nieren 24 h nach der Ischämie mit oder ohne IP (4 IP-Zyklen mit 4 min Ischämie und 4 min der Reperfusion 30 min vor der Ischämie) isoliert. (a) Dargestellt sind repräsentative Schnitte (x400, nach H&E-Färbung) (b) Quantifizierung der ischämischen Schädigung mit der Jablonski-Skala (siehe Material- und Methoden-Teil). Die reduzierte renale Infiltration mit polymorphkernigen Neutrophilen (PMN) wird in cd73^-/--Mäusen aufgehoben. (c) Dargestellt sind repräsentative Schnitte (Chloracetatesterase-Färbung, x400) nach der Ischämie (+ IP) und ohne IP (- IP) in cd73^-/--Mäusen und Wurfgeschwistern. (d) Quantifizierung der Granulocyteninfiltration. Die Daten stammen aus 6 bis 7 Mäusen pro Bedingung, und die Ergebnisse werden ausgedrückt als Mittelwerte ± SD.
10 Eine Behandlung mit Adenosin-A_2B-Rezeptor-Agonist schützt vor Ischämie. (a) Funktion der Gefäßbarriere nach Behandlung mit BR4887. Alters-, gewichts- und geschlechtsabgestimmte Wurfgeschwister erhielten eine Behandlung i.p. mit BR4887 (10 μg/kg, 30 min vor Hypoxie, Normoxie) oder mit Vehikelkontrolle. Den Mäusen wurde intravenös Evan's Blue (0,2 ml von 0,5 % in PBS) intravenös verabreicht und die Mäuse wurden gegenüber normobarer Hypoxie (H, 8 % O₂, 92 % N₂) oder Raumluft (N) für 4 h exponiert. Die Tiere wurden getötet und die Herzen wurden isoliert. Die Konzentration von Evan's Blue im Organ wurde nach Formamidextraktion (55 C für 2 h) durch Messung der Absorptionen bei 610 nm nach Abzug der Referenzabsorption bei 450 nm quantifiziert. Die Daten werden ausgedrückt als Mittelwerte ± SD Evan's Blue OD/mg Feuchtgewebe und werden aus 6 Tieren pro Bedingung gepoolt. Festzuhalten ist: Niedrigere kardiale Evan's Blue-Retention in Mäusen die mit BR4887 behandelt wurden. Repräsentative Aufnahmen (b) oder quantitative Analyse (c) einer Myokardinfarktgröße (60 min der Ischämie, 2 h der Reperfusion, Doppelfärbung mit Evan's Blue und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid) nach IP-Behandlung mit BR4887 (10 μg/kg i.p., 30 min vor der Induktion von myokardialer Ischämie) oder Vehikelkontrolle in alters-, gewichts- und geschlechtsabgestimmten Wurfgeschwistern. Die Ergebnisse werden dargestellt als Mittelwerte ± s.d. aus 6 Tieren pro Bedingung. (d) Quantitative Analyse der Myokardinfarktgröße (60 min der Ischämie, 2 h der Reperfusion, Doppelfärbung mit Evan's Blue und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid) nach IP-Behandlung mit BR4887 (10 μg/kg i.p., 30 min vor der Induktion der myokardialen Ischämie) oder Vehikelkontrolle in Mäusen, die für den Adenosin-A_2B-Rezeptor mutiert waren. Festzuhalten ist, dass eine Kardioprotektion mit BR4887-Behandlung in Wildtyp-Mäusen erfolgt, nicht aber in A_2B ^-/--Mäusen.
11 Rekonstitution von cd73^-/--Mäusen mit löslicher 5'-Nucleotidase. Nach der Induktion der Anästhesie wurden cd73^-/--Mäuse mit 1 U von löslicher 5'-Nucleotidase aus Crotalus atrox-Gift i.p. (+ 5'-NT) oder mit Vehikelkontrolle (- 5'-NT) behandelt. Es wurden Experimente mit oder ohne Präkonditionierung in situ mit 4 Zyklen von IP (4 min Ischämie, 4 min Reperfusion), mit oder ohne Behandlung mit löslicher 5'-Nucleotidase durchgeführt. Renale Funktionstests wurden nach 24-stündiger Reperfusion durchgeführt. Die Behandlung mit löslicher 5'-Nucleotidase verbessert die renale Hämodynamik in cd73^-/--Mäusen. (a) Messung der Plasmacreatininkonzentration. (b) Messung des Kaliums im Plasma (Plasma-K⁺). (c) Messung der Creatinin-Clearance. (d) Messung der Urinflussrate. (e) Messung der Urinnatriumausscheidung (Urin-Na⁺-Ausscheidung). (f) Messung der Urinkaliumausscheidung (Urin-K⁺-Ausscheidung). Die Daten stammen aus 5 bis 7 Mäusen pro Bedingung, die Ergebnisse werden ausgedrückt als Mittelwerte ± SD.
12 Die Behandlung mit löslicher 5'-Nucleotidase ahmt den protektiven Effekt der IP in WT-Mäusen nach. Cd73^+/+-Mäuse erhielten 30 min vor der renalen Ischämie 1 U von löslicher 5'-Nucleotidase, die aus C. atrox-Gift gereinigt wurden. Die Mäuse wurden mit oder ohne ischämische Präkonditionierung (4 min Ischämie, 4 min Reperfusion, 4 Zyklen) gefolgt von 30 min der renalen Ischämie, mit oder ohne lösliche 5'-Nucleotidase, behandelt. Die renalen Funktionstests wurden nach 24-stündiger Reperfusion durchgeführt. (a) Messung der Plasmacreatininkonzentration. (b) Messung des Kaliums im Plasma (Plasma-K⁺). (c) Messung der Creatinin-Clearance. (d) Messung der Urinflussrate. (e) Messung der Urinnatriumausscheidung (Urin-Na⁺-Ausscheidung). (f) Messung der Urinkaliumausscheidung (Urin-K⁺-Ausscheidung). Die Daten stammen aus 5 bis 7 Mäusen pro Bedingung, die Ergebnisse werden ausgedrückt als Mittelwerte ± SD.
13 Histologische Anzeichen der renalen Protektion durch Behandlung von Wildtyp-Mäusen mit löslicher 5'-Nucleotidase. Um die histologischen Aspekte als auch die renale Infiltration mit polymorphkernigen Neutrophilen (PMN) zu untersuchen, wurden die Nieren 24 h nach 30-minütiger Ischämie mit oder ohne 5'-Nucleotidase-Behandlung i.p. isoliert. (a) Dargestellt sind repräsentative Schnitte (x400, nach H&E-Färbung). (b) Quantifizierung der ischämischen Schädigung mit der Jablonski-Skala (siehe Material- und Methoden-Teil). (c) Repräsentative Schnitte mit Chloracetatesterase-Färbung (x400). (d) Quantifizierung der Granulocyteninfiltration. Die Daten stammen aus 6 bis 7 Mäusen pro Bedingung, und die Ergebnisse werden ausgedrückt als Mittelwerte ± SD.
Ausführungsbeispiele
1. Material und Methoden
1.1 Mäuse
Sämtliche Tierversuchsprotokolle standen in Übereinstimmung mit den deutschen Richtlinien über die Verwendung von lebenden Tieren und wurden von dem Tierschutzkomitee des Universitätsklinikums Tübingen und des Regierungspräsidiums Tübingen genehmigt. Mäuse, die eine Mutation in cd73, in den Adenosin-A₁- oder -A₃-Rezeptoren auf dem BL6-Stamm trugen, Mäuse, die eine Mutation in dem Adenosin-A_2A-Rezeptor auf der CD1-Linie trugen, wurden hergestellt, validiert und charakterisiert, wie zuvor beschrieben; vgl. Thompson L. F. et al. (2004), "Crucial Role for Ecto-5'-Nucleotidase (CD73) in Vascular Leckage during Hypoxia", J. Exp. Med. 200, 1395-1405. Adenosin-A_2B-Rezeptor-Mutanten wurden von Deltagen Inc., (San Carlos, CA) hergestellt. Ein 112 bp-Fragment (von Base 156 bis Base 267) aus der 1076 bp umfassenden proteincodierenden Region von Als wurde ersetzt durch eine 9,6 kb umfassende IRES-lacZ-Reporter- und Neomycineresistenz-Kassette. Die Charakterisierung und Validierung wurde von Deltagen und in den Laboren der Erfinder in Tübingen durchgeführt. Danach bestätigte eine PCT-Genotypisierung gemäß den Anweisungen des Herstellers, eine Echtzeit-RT-PCR zur Bestimmung der Expressionsmuster der Adenosinrezeptoren und Western-Blotting das erfolgreiche Ausschalten der Adenosin-A_2B-Rezeptor-Transkript- und -Proteinspiegel in den untersuchten Geweben. In Übereinstimmung mit früheren Berichten scheinen die A_2B ^-/--Mäuse ein normales Immunsystem zu haben und gesund zu sein, wenn diese in einer speziellen pathogenfreien Anlage gehalten werden. Als Kontrolle wurden Wurfgeschwistermäuse verwendet, die hinsichtlich Alter, Geschlecht und Gewicht abgestimmt waren.
1.2 Mausmodelle
(a) Kardiale IP
Die Anästhesie wurde mit Pentobarbital induziert (70 mg/kg Körpergewicht i.p.) und aufrechterhalten (10 mg/kg/h). Die Mäuse wurden auf einer temperaturkontrollierten Wärmeplatte (RT, Effenberg, München, Deutschland) mit einer rektalen Thermometersonde platziert, die mit einem thermalen Feedback-Controller verbunden war, um eine Körpertemperatur von 37°C aufrechtzuerhalten. Der Trachealtubus wurde mit einem mechanischen Ventilator (Servo 900C, Siemens, Deutschland, mit einem pädiatrischen Röhrensystem) verbunden und die Tiere wurden mit einem druckkontrollierten Ventilationsmodus ventiliert (Peak des Einatmungsdrucks 10 mbar, Frequenz 110 Atmungen/min, positiver Endausatmungsdruck von 3 mbar FiO₂ = 0,3). Die Blutgasanalyse ergab einen regulären paO₂- (115±15 mmHg) und paCO₂-Spiegel (38±6 mmHg) mit der verwendeten Ventilatoreinrichtung. Nach der Induktion der Anästhesie wurden die Tiere mit einem ECG (Hewlett Packard, Böblingen, Deutschland) überwacht. Der Flüssigkeitsersatz erfolgte mit normaler Kochsalzlösung, 0,1 ml/h i.p. Die Carotis-Arterie wurde für die kontinuierliche Aufnahme des Blutdruckes mit einem Statham-Element (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Schweiz) katheterisiert. Die Operationen erfolgten unter einem aufrechten Seziermikroskop (Olympus SZX12). Nach der linksschrägen Thorakotomie, Exposition des Herzens und der Präparierung des Pericards wurde die linke Koronararterie (LCA) visuell identifiziert. Anschließend wurde ein 8,0 Nylonfaden (Prolele, Ethicon, Norderstedt, Deutschland) um das Gefäß platziert. Die LCA-Okklusion für die Ischämie- und IP-Untersuchungen erfolgte unter Verwendung eines Systems mit hängendem Gewicht; vgl. Eckle T. et al. (2006), "Systematic evaluation of a novel model for cardiac ischemic preconditioning in mice", Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. Die erfolgreiche LCA-Okklusion wurde durch eine unmittelbare Farbveränderung des Gefäßes von Hellrot nach Dunkelviolett, der Farbveränderung des durch das Gefäß versorgten Myokards (von Hellrot in Weiß) und die Gegenwart von ST-Erhöhungen in dem ECG bestätigt. Während der Reperfusion verschwanden die Farbveränderungen sofort, wenn die hängenden Gewichte angehoben und die LCA erneut perfundiert wurde.
Die Infarkte wurden durch Berechnung des prozentualen Anteils des myokardialen Infarkts im Vergleich zu dem Risikogebiet bestimmt, wozu die zuvor beschriebene Doppelfärbungstechnik mit Evan's Blue und Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) verwendet wurde; vgl. Eckle, T. et al. (a.a.O.). Das Risikogebiet und die Infarktgröße wurden über Planimetrie unter Verwendung der NIH-Software Image 1.0 bestimmt und das Ausmaß der Myokardschädigung wurde als Prozent des von dem Infarkt betroffenen Myokards in Bezug auf das Risikogebiet berechnet.
(b) Renale IP
Die Mäuse wurden mit Natriumpentobarbital anästhesiert (70 mg/kg) und auf einer temperaturkontrollierten Wärmeplatte (RT, Effenberg, München, Deutschland) in einer linken Seitenlage platziert. Die Operationen erfolgten unter einem aufrechten Seziermikroskop (Leica, MZ95, Bensheim, Deutschland). In Kürze, ein Einschnitt erfolgte auf der rechten Körperseite und die rechte Niere wurde entfernt. Nach Verschluss der chirurgischen Wunde mit einem durchgehend verlaufenden Nahtmaterial (Muskelwand und Haut), wurden die Tiere in einer rechten Seitenlage platziert und ein Schnitt in die linke Seite erfolgte für einen Zugriff auf die linke Niere. Die linke Niere wurde sorgfältig von angrenzendem Bindegewebe entfernt und mit ihrer ventralen Seite nach unten in eine Acrylglasschale gelegt. Die renale Arterie wurde präpariert und ein 8.0 Nylonnähmaterial (Ethicon, Norderstedt, Deutschland) wurde um die Arterie herumgelegt. Die Okklusion der renalen Arterie für Ischämie (30 min) und IP (4 Zyklen von 5 min Ischämie und 4 min Reperfusion 30 min vor der Ischämie) erfolgte unter Verwendung eines Systems mit hängendem Gewicht, wie zuvor beschrieben; vgl. Eckle, T. et al. (a.a.O.). Eine erfolgreiche Okklusion der renalen Arterie war mit einer unmittelbaren Farb veränderung von Rot nach Weiß verbunden. Gemäß der experimentellen Vorgehensweise (Ischämie mit oder ohne vorherige IP) wurde die linke Niere in ihre anatomische Position in der retroperitonealen Höhle zurückgegeben und die Wunde verschlossen. Am Ende des chirurgischen Eingriffs erhielten die Mäuse 0,3 ml normale Kochsalzlösung i.p. und erholten sich für 2 h unter einer Wärmelampe. Anschließend wurden diese in Stoffwechselkäfige (Tecniplast, Hohenpeissenberg, Deutschland) zur Bestimmung der renalen Funktionsparameter gebracht.
1.3 Herzenzymmessung
Kardialtroponine ersetzten die Creatinkinase und die Lactatdehydrogenaseisoenzyme als Standardkriterien für die Diagnose von myokardialer Schädigung. Da eine Korrelation von Kardialtroponin mit den Infarktgrößen existiert, wurde über eine zentralvenöse Punktur Blut für die cTnI-Messung abgenommen. Die cTnI-Plasmakonzentrationen wurden unter Verwendung eines quantitativen cTnI-Schnellassays (Life Diagnostics, Inc., West Chester, PA, USA) gemessen.
1.4 Messung der Nierenfunktion
Die Mäuse wurden zwei Stunden nach dem experimentellen Vorgehen in Stoffwechselkäfigen gehalten (Tecniplast, Hohenpeissenberg, Deutschland). Die renale Funktion wurde durch Messung des Plasma- und Urincreatinins 24 Stunden nach der renalen Ischämie unter Verwendung einer kommerziell verfügbaren colorimetrischen Methode gemäß dem Protokoll des Herstellers (LT-SYS, Labor + Technik, Berlin, Deutschland) bestimmt. Plasma- und Urinkonzentrationen von Na⁺, K⁺ wurden mit einem Flammenemissionsphotometer (ELEX 6361, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) bestimmt. Renale Ausscheidungs- und hämodynamische Werte wurden unter Verwendung von Standardformeln berechnet. Die Mäuse wurden nach 24-stündiger Beobach tung in dem Stoffwechselkäfig getötet und die Plasmaproben gewonnen. Ferner wurden die Nieren isoliert und bei -80°C zur weiteren Analyse gelagert.
1.5 Histologische Untersuchung
Die histologische Untersuchung der Nieren erfolgte 24 Stunden nach der renalen Ischämie. Die renalen Gewebe wurden in 4,5%igem gepuffertem Formalin fixiert, dehydriert und in Paraffin eingebettet. Die Schnitte (3 μm) wurden mit Hämatoxilin, Eosin und Periodsäure (PAS) gefärbt. Die Untersuchung und Einstufung des gesamten Schnittes von jeder Niere erfolgte durch einen erfahrenen Nierenpathologen, der keine Kenntnisse über die experimentelle Gruppe hatte. Verwendet wurde eine Einstufungsskala von 0 bis 4, wie von Jablonski et al. beschrieben, um die histopathologische Bewertung der proximalen tubulären Schädigung durch Ischämie und Reperfusion in Nieren mit oder ohne IP vorzunehmen. Bewertet wurden vier Tiere unter jeder Bedingung und drei repräsentative Schnitte von jeder Niere.
1.6 Immuno-Blotting-Experimente
In einigen Experimenten wurde der Gehalt von CD73- und Adenosin-A_2B-Rezeptor-Protein aus dem Risikogebiet bestimmt. Zu diesen Zwecken wurden C57BL/6J-Mäuse (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) nach kardialer IP, wie oben beschrieben, getötet. Das verbleibende Blut wurde entfernt, das Risikogebiet wurde zu den angegebenen Zeitpunkten (30, 60, 90 und 120 min nach IP) herausgeschnitten und unmittelbar bei -80°C eingefroren. Die Gewebe wurden homogenisiert und für 10 min in eiskaltem Lysepuffer (10⁷ PMN/500 μl; 150 mM NaCl, 25 mM Tris pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 % Triton X-100 und 10 % Säugetiergewebe-Proteaseinhibitorcocktail, Sigma-Aldrich) lysiert und in Mikrofugenröhrchen gesammelt. Nach einer Zentrifugation bei 14.000 g, um die Zelltrümmer zu entfernen, wurde das Pellet verworfen. Die Proteine wurden in reduzierendem Lämmli-Probenpuffer und für 5 min auf 90°C erhitzt. Die Proben wurden über ein 12%iges Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembranen transferiert. Die Membranen wurden für 1 h bei Raumtemperatur in PBS, versetzt mit 0,2 % Tween 20 (PBS-T) und 4 % BSA blockiert. Die Membranen wurden in 10 μg/ml CD73-Kaninchen-Polyklonaler-Antikörper gegen die Aminosäuren 275-574 (Santa Cruz, Danvers, USA) oder A_2B-Ziegen-Polyklonaler-Antikörper gegen den C-Terminus (Santa Cruz, Danvers, USA) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von 10-minütigen Waschvorgängen in PBS. Die Membranen wurden dann in 1:3000 Ziege-Anti-Kaninchen-HRP im Falle von CD73 (Perbio Science, Bonn, Deutschland) oder Esel-Anti-Ziege-HRP im Falle von A_2BAR (Santa Cruz, Danvers, USA) inkubiert. Die Waschvorgänge wurden wiederholt und die Proteine wurden durch verstärkte Chemilumineszenz detektiert.
1.7 Immunhistochemie
(a) Myokard
Um den Einfluss der IP auf kardiales CD73 und den A_2BAR zu untersuchen, wurde eine IP in C57BL/6J-Mäusen (Charles River, Sulzfeld, Deutschland), wie im Detail oben beschrieben, durchgeführt. Die Mäuse wurden getötet und die Herzen wurden anschließend zu den angegebenen Zeitpunkten (30, 60, 90 min nach IP) entfernt und für 24 Stunden in Tissue-Tek (Sakura) fixiert. Kryostatschnitte wurden auf Glasdeckgläsern eingebettet, luftgetrocknet und anschließend in Aceton/Methanol (1:1) für 3 min bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Die Schnitte wurden durch Inkubation in 5 % [w/v (Gewicht pro Volumen)] Magermilch und 0,1 % (w/v) Triton X-100 (Sigma, München, Deutschland) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) für 30 min blockiert. CD73-Kaninchen-Polyklonaler-Antikörper gegen die Aminosäuren 275-574 (Santa Cruz, Danvers, USA) oder A_2B-Ziege-Polyklonaler-Antikörper gegen den C-Terminus (Santa Cruz, Danvers, USA) wurden 1:200 in der gleichen Lösung verdünnt und die Schnitte wurden für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach drei Waschvorgängen mit TBS wurden die Schnitte für 45 Minuten mit dem sekundären Antikörper (CD73: Ziege-Anti-Kaninchen-Cy3, Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland; A2B: Kaninchen-Anti-Ziege-Cy3, Dianova Hamburg, Deutschland) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fluoreszenz wurde mit einem konfokalen Laserscanner-Mikroskop (Leica, Deutschland) visualisiert.
(b) Niere
Die Granulocyteninfiltrate wurden durch Histochemie unter Verwendung von Chloracetatesterase (CAE) gefärbt. Die Untersuchung und Einstufung hinsichtlich der Neutrophilen-Infiltration der Schnitte aus jeder Niere erfolgte durch einen erfahrenen Nierenpathologen, dem die Behandlungsgruppe unbekannt war. In Kürze, in Abhängigkeit von dem Grad der Infiltration wurden 0 bis 4 Punkte vergeben: Grad 0, normales renales Gewebe; Grad 1, leichte lokale Infiltration; Grad 2, moderate Infiltration in verschiedenen Bereichen; Grad 3, starke Infiltration <50 %; Grad 4, starke diffuse Infiltration von mehr als 50 % des renalen Gewebes. Unter jeder Bedingung wurden sechs Tiere verwendet und eingestuft wurden drei repräsentative Schnitte von jeder Niere.
1.8. Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität
Um die Gewebe-Infiltration mit Neutrophilen zu quantifizieren, wurden die bekannten Verfahren der MPO-Messungen modifiziert. Proben von renalem Gewebe wurden 24 Stunden nach dem experimentellen Vorgehen (renale Ischämie mit oder ohne IP) schockgefroren, in eiskaltem 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 homogenisiert und anschließend bei 20.000 g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,4, enthaltend 0,5 % Hexadecyltrimethylammoniumbromid, für 30 Sekunden sonifiziert. Die Homogenate wurden bei 20.000 g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Fünf μl des Überstandes wurden zu 195 μl Reaktionspuffer (50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 6,0, 0,68 mM O-Dianisidin, 0,0005 % Wasserstoffperoxid) hinzugegeben. Die Veränderung in der Absorption wurde spektrophotometrisch (Victor 3V, Perkin Elmer) bei 450 nm über 2 Minuten gemessen. Die MPO-Aktivität wurde als Veränderung in der optischen Dichte (OD) pro Minute und pro Milligramm Protein, das durch den Lowry-Proteinassay detektiert wurde, ausgedrückt.
1.9 Ecto-5'-Nucleotidase-Enzymassays
die Ecto-5'-Nucleotidase-Enzymaktivität wurde durch Messung der Umwandlung von [¹⁴C]IMP in [¹⁴C]Inosin bewertet, wie im Stand der Technik beschrieben; vgl. Thompson L. F. et al. (1979), "Ecto-5'-nucleotidase activity in T and B lymphocytes from normal subjects and patients with congenital X-linked agammaglobulinemia", J. Immunol. 123, 2475-8. APCP (Sigma-Aldrich) wurde als unspezifischer Inhibitor von CD73 verwendet. Die Ecto-5'-Nucleotidase-Enzymaktivität wurde als prozentualer Anteil der gesamten IMP-hydrolysierenden Aktivität, die durch APCP inhibiert wird, berechnet. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in nmol IMP hydrolysiert/h/mg Protein.
1.10 In vivo-Hypoxie-Modell
Mäuse, die auf der F1-Linie für A_2BAR mutiert waren, wurden hergestellt, validiert und, wie oben beschrieben, charakterisiert. Kontrollmäuse wurden hinsichtlich des Geschlechtes, Alters und Gewichts abgestimmt. Die vaskuläre Permeabilität des gesamten Organs wurde durch intravaskuläre Verabreichung von Evan's Blue quantifiziert, wie im Stand der Technik beschrieben; vgl. Thompson L.F. et al. (a.a.O.). Zum Zwecke der Quantifizierung der vakulären Permeabilität wurden 0,2 c.c. von Evan's Blue 0,5 % in PBS intravenös injiziert. Die Tiere wurden dann gegenüber normobarer Hypoxie (8 % O₂, 92 % N₂) oder Raumtemperatur für 4 Stunden exponiert (n=4 Tiere pro Bedingung). Nach der Exposition gegenüber Hypoxie/Normoxie wurden die Tiere getötet und die Herzen isoliert. Die Konzentrationen von kardialem Evan's Blue wur den nach Formamidextraktion (55 C für 2 h) durch Messung der Absorptionen bei 610 nm nach Abzug der Referenzabsorption bei 450 nm quantifiziert.
1.11 Transkriptionsanalyse
Um den Einfluss von IP auf die Transkriptionsspiegel von cd73-, Adenosin-A₁-, -A_2A-, -A_2B- und -A₃-Rezeptor zu bestimmen, erfolgten 4 Zyklen von IP (5 bzw. 4 min Ischämie, 5 bzw. 4 min Reperfusion), das AAR wurde durch Evan's Blue-Färbung dargestellt und zu den angegebenen Zeiten herausgeschnitten, gefolgt von der Isolierung von RNA und der Quantifizierung der Transkriptionsspiegel durch Echtzeit-RT-PCR (iCycler; Bio-Rad Laboratories Inc.). In Kürze, Gesamt-RNA wurde aus dem Herz- oder Nierengewebe unter Verwendung des Gesamt-RNA-Isolierung-NucleoSpin-RNA-II-Kits gemäß den Angaben des Herstellers (Macherey & Nagel, Düren, Deutschland) isoliert. Zu diesen Zwecken wurde Gewebe, das in flüssigem Stickstoff eingefroren wurde, in Gegenwart von RA1-Lysepuffer homogenisiert (Micra D8-Homogenizer, ART-Labortechnik, Müllheim, Deutschland) und nach der Filtration wurden die Lysate auf Nucleo-Spin-RNA-II-Säulen geladen, gefolgt von einer Entsalzung und DNaseI-Verdau (Macherey & Nagel, Düren, Deutschland). Die RNA wurde gewaschen und die Konzentration wurde quantifiziert. Die Primer-Sets für die PCR-Reaktion enthielten 1 μM Sinnstrang und 1 μM Gegensinnstrang mit SYBR Green I (Molecular Probes Inc.). Es wurden Primersätze (Sinnprimersequenz, Gegensinnprimersequenz und Transkriptgröße) für die folgenden Gene verwendet: CD73 [5'-CAA ATC CCA CAC AAC CAC TG-3' (SEQ ID-Nr. 1), 5' TGC TCA CTT GGT CAC AGG AC-3' (SEQ ID-Nr. 2), 123 bp]; A₁ [5'-AGG GAG GGG TCA AGA ACT GT-3' (SEQ ID-Nr. 3), 5'-TCC CAG TCT CTG CCT CTG TT-3' (SEQ ID-Nr. 4), 109 bp]; A_2A [5'-GAA GAC CAT GAG GCT GTT CC-3' (SEQ ID-Nr. 5), 5'-GAG TAT GGG CCA ATG GGA GT-3' (SEQ ID-Nr. 6), 253 bp]; A_2B [5'-GGA AGG ACT TCG TCT CTC CA-3' (SEQ ID-Nr. 7), 5'-GGG CAG CAA CTC AGA AAA CT-3' (SEQ ID-Nr. 8), 322 bp]; A₃ [5'-CAA TTC GCT CCT TCT GTT CC-3' (SEQ ID-Nr. 9), 5'-TCC CTG ATT ACC ACG GAC TC-3' (SEQ ID-Nr. 10), 334 bp]. Der Primersatz wurde unter Verwendung von zunehmenden Zyklenzahlen von 94°C für 1 min, 58°C für 0,5 min, 72°C für 1 min, amplifiziert. Maus-β-Actin [Sinnprimersequenz, 5'-ACA TTG GCA TGG CTT TGT TT-3' (SEQ ID-Nr. 11) und Gegensinnprimersequenz, 5'-GTT TGC TCC AAC CAA CTG CT-3' (SEQ ID-Nr. 12)] wurde in identischen Reaktionen als Kontrolle für das Ausgangstemplate verwendet.
1.12 Datenanalyse
Die Daten betreffend die Einstufung der Nierenschädigung werden als Median (Bereich) angegeben, sämtliche anderen Daten werden angegeben als Mittelwert ± SD aus 5 bis 10 Tieren pro Bedingung. Es wurde eine statistische Analyse unter Verwendung des Student's t-Tests (zweiseitig, α<0,05) oder eine Varianzanalyse durchgeführt, um gruppenspezifische Unterschiede festzustellen. Die renale Schädigung wurde mit dem Kruskal-Wallis-Einstufungstest analysiert.
2. Ergebnisse
2.1 CD73 wird durch IP induziert
Die Erfinder stellten die Hypothese auf, dass die CD73-abhängige Adenosinbildung auch eine entscheidende Rolle für die Kardioprotektion bzw. renale Protektion während der IP spielen könnte. Deshalb wurden zunächst die transkriptionellen Veränderungen der renalen und kardialen IP auf die CD73-Expression und -Funktion untersucht.
(a) Myokard
Es wurde ein aus dem Stand der Technik bekanntes Modell der kardialen IP (1a) verwendet und das Risikogebiet (AAR) wurde zu den angegebenen Zeitpunkten isoliert. Unter Verwendung einer Echtzeit-reversen-Transkriptase- Polymerasekettenreaktion (Echtzeit-RT-PCR) wurde 90 min nach der kardialen IP eine deutliche Induktion der cd73-mRNA festgestellt (14,5±2,7fach, p<0.0001; 1b).
Gleichermaßen bestätigte eine Western-Blot-Analyse des Risikogebietes die Induktion des CD73-Proteins 90 und 120 min nach der IP (1c).
Die immunhistologische Färbung des Risikogebietes und die bildgebende Darstellung über die konfokale Laserscanning-Mikroskopie bestätigte eine starke Induktion des CD73-Proteins nach kardialer IP. Kontrollexperimente, bei denen zuvor beschriebene, für cd73 mutierte Mäuse verwendet wurden, bestätigten die Spezifität der Experimente (1d).
Nachdem gezeigt wurde, dass die cd73-mRNA und das CD73-Protein durch kardiale IP induziert werden, wurde als Nächstes die funktionelle Induktion von CD73 durch IP untersucht, wozu eine zuvor beschriebene Technik zur Messung der Ecto-5'-Nucleotidase-Aktivität verwendet wurde. Wie in 1e gezeigt ist, wird die Ecto-5'-Nucleotidase-Aktivität bereits 30 min nach der IP induziert.
Zusammengefasst liefern diese Daten starke Belege dafür, dass CD73 in dem AAR durch kardiale IP induziert wird.
(b) Niere
In einem in situ-Modell wurden zur IP vier Zyklen von intermittierender, renaler, arterieller Okklusion und Reperfusion (4 min Ischämie, 4 min Reperfusion) durchgeführt (2a). Die intermittierende, renale, arterielle Okklusion wurde durch Verwendung eines Systems mit hängendem Gewicht erreicht, welches während der Präkonditionierung keinerlei sichtbares, chirurgisches Gewebetrauma verursachte.
Nach der IP wurden die Nieren mit renalem Gewebe aus nicht-präkonditionierten alters-, gewichts- und geschlechtsabgestimmten Wurfgeschwistern verglichen. Um transkriptionelle Effekte der IP zu definieren, wurde präkonditioniertes Nierengewebe zu den angegebenen Zeitpunkten nach der IP-Behandlung isoliert und für Echtzeit-RT-PCR verwendet. Hierbei wurde eine deutliche Induktion der cd73-mRNA beobachtet (z.B. 90 min nach renaler IP, 3,9±1,7fach, p<0,01; 2b).
Gleichermaßen bestätigte eine renale Western-Blot-Analyse die CD73-Proteininduktion nach IP (2c).
Die renale immunhistologische Färbung und bildgebende Darstellung mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie bestätigte die starke Induktion des CD73-Proteins nach renaler IP (2d). Kontrollexperimente, in denen die zuvor beschriebenen Mäuse verwendet wurden, die für das cd73-Gen mutiert waren, bestätigten die Spezifität des Anti-CD73-Antikörpers.
Nachdem gezeigt wurde, dass die cd73-mRNA und das CD73-Protein durch renale IP induziert werden, wurde als Nächstes die funktionelle Induktion von CD73 durch IP untersucht, indem eine zuvor beschriebene Technik zur Messung der Ecto-5'-Nucleotidase-Enzymaktivität verwendet wurde. Wie in 2e gezeigt ist, wurde die Ecto-5'-Nucleotidase-Aktivität bereits 30 min nach der IP-Behandlung mehr als zweifach induziert.
Zusammengefasst liefern diese Daten einen starken Beleg dafür, dass CD73 durch renale IP induziert wird.
2.2 Die Inhibition von CD73 schwächt die Protektion durch IP ab
Nachdem gezeigt wurde, dass CD73 durch IP induziert wurde, wurde als Nächstes dessen funktioneller Beitrag zur Protektion durch IP untersucht. Zu diesem Zwecke wurden Mäuse über eine intraarteriellen Infusion des spezifischen CD73-Inhibitors Alpha-Beta-Methylen-ADP [APCP, 40 mg/kg/h (Myokard) bzw. 2 mg/kg i.p. (Niere)] oder Vehikelkontrolle vor der kardialen bzw. renalen IP und/oder Ischämie behandelt.
(a) Myokard
Wie in 3a gezeigt, resultiert der vorstehende pharmakologische Ansatz in einer dreifachen Reduktion der kardialen CD73-Aktivität bei APCP-Behandlung.
Gleichermaßen war die AMP-induzierte Bradykardie in APCP-behandelten Tieren deutlich abgeschwächt (3b). Tatsächlich resultierte die intravaskuläre AMP-Behandlung (50 μl, 8 mg/ml von AMP) in einer Reduzierung der Herzschlagrate von 480/min auf 120/min. Nach APCP-Behandlung wurde diese Antwort nahezu vollständig aufgehoben (480/min auf 360/min, p<0,0001).
Nachdem eine effektive Inhibition der kardialen CD73-Aktivität gezeigt wurde, wurden diese Bedingungen dazu verwendet, um die Kardioprotektion durch IP zu untersuchen. Zu diesen Zwecken wurden Mäuse für 60 min einer Ligation der linken Koronararterie (LCA) unterzogen, gefolgt von 2 h der Reperfusion mit oder ohne vorherige IP, bestehend aus 4 Zyklen mit 5 min Ischämie/5 min Reperfusion. Sämtliche Mäuse überlebten dieses Experiment. Das Körpergewicht und der Blutdruck unterschied sich nicht zwischen den APCP-behandelten und unbehandelten Mäusen.
Um die myokardiale Gewebeschädigung zu bestimmen, wurden die Plasmaspiegel eines zuvor beschriebenen Markers für murine myokardiale Ischämie [Troponin I (cTnI)] gemessen. Übereinstimmend mit früheren Untersuchungen zeigte sich dabei eine Abschwächung der Plasma-cTnI-Werte durch IP (3c).
Allerdings hob die APCP-Behandlung die kardioprotektiven Effekte der IP auf. Gleichermaßen bestätigte die Messung der Infarktgröße mittels einer 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TCC)-Färbung die Inhibition der Kardioprotektion durch IP nach APCP-Behandlung (3d, e).
Zusammengefasst liefern diese pharmakologischen Untersuchungen Belege für eine entscheidende Rolle von CD73 in der Kardioprotektion durch IP.
(b) Niere
Wie in 4a gezeigt, resultiert die APCP-Behandlung in einer zweifachen Reduktion der renalen CD73-Enzymaktivität.
Nachdem eine wirksame Inhibition der renalen CD73-Enzymaktivität durch APCP gezeigt wurde, wurden diese Bedingungen dazu verwendet, um die Rolle von CD73 in der renalen Protektion durch IP zu untersuchen. Folglich wurden Mäuse (C57BL/6J) einer 30-minütigen renalen arteriellen Okklusion mit oder ohne vorherige IP-Behandlung (4 Zyklen, 4 min Ischämie, 4 min Reperfusion), gefolgt von 24 h der Reperfusion unterzogen, während die Tiere in Stoffwechselkäfigen zur Bestimmung der renalen Hämodynamik untersucht wurden. Sämtliche Mäuse überlebten dieses Experiment.
Wie in 4 gezeigt, erhöhte sich durch IP das Plasmacreatinin (4b), Plasmakalium (4c), die Creatinin-Clearance (4d), die Urinflussrate (4e) und die Ausscheidung von Natrium (4f) und Kalium (4g) über den Urin.
Hierzu im Gegensatz hob die APCP-Behandlung die renalen protektiven Effekte von IP auf (4b-g). Ferner zeigten Mäuse, die mit APCP vor der Ischämie mit IP behandelt wurden, einen Anstieg der Myeloperoxidaseaktivität im renalen Gewebe (4h).
Zusammengenommen liefern diese Untersuchungen pharmakologische Belege für eine kritische Rolle von CD73 in der renalen Protektion durch IP.
2.3 Die Protektion durch IP wird in cd73^-/--Mäusen aufgehoben
Basierend auf diesen pharmakologischen Erkenntnissen, die belegen, dass die CD73-Inhibition die protektiven Effekte der IP abschwächen, wurden als Nächstes Untersuchungen in den zuvor beschriebenen Mäusen mit zielgerichteter Deletion des cd73-Genes durchgeführt.
(a) Myokard
Als Nächstes wurde die Abwesenheit von kardialer CD73-Aktivität in diesen Mäusen bestätigt. Wie in 5a gezeigt, konnte in den cd73^-/--Mäusen im Vergleich zu Wurfgeschwisterkontrollen nahezu keine kardiale CD73-Aktivität gemessen werden. Gleichermaßen war die AMP-induzierte Bradykardie in cd73^-/--Mäusen im Vergleich zu Wurfgeschwistern deutlich abgeschwächt.
Als Nächstes wurde eine IP in den cd73^-/--Mäusen und Wurfgeschwisterkontrollen durchgeführt. Tatsächlich war die Infarktgröße 60 min nach der Ischämie durch IP in cd73^-/--Mäusen nicht abgeschwächt (5c).
Des Weiteren zeigten cd73^-/--Mäuse im Vergleich zu den Kontrollen deutlich größere Infarkte nach 60 min alleiniger Ischämie.
Um zu bestätigen, dass die IP in cd73^-/--Mäusen abgeschwächt war, wurden die cTnI-Spiegel in Plasmaproben erneut gemessen. Wie in 5d gezeigt, gab es keinen Unterschied in den cTnI-Plasmaspiegeln in cd73^-/--Mäusen nach 60 min der Ischämie mit oder ohne kardiale IP.
Als „proof of principle" und um zu demonstrieren, dass das Ausbleiben der Kardioprotektion durch IP in cd73^-/--Mäusen das Fehlen von extrazellulärem Adenosin reflektiert, wurden über eine intraarterielle Infusion extrazelluläre Adenosinspiegel rekonstituiert (200 μl/h, Adenosin 8 mg/ml), und zwar mit einer Dosis, für die zuvor gezeigt wurde, dass diese keine Hypotension oder Bradykardie induziert (Daten nicht gezeigt). In der Tat resultierte diese Behandlung in einer teilweisen Rekonstitution der Kardioprotektion durch IP in cd73^-/--Mäusen (5e). Die gleiche Behandlung von Wildtyp-Mäusen resultierte in der Abschwächung von Infarktgrößen nach alleiniger IP-Behandlung, was auf einen zusätzlichen Mechhanismus hindeutet. (z.B. Anstieg in der Adenosinrezeptor-vermittelten Signalgebung durch IP) (5e).
In weiteren Experimenten wurden cd73^-/--Mäuse über intraarterielle Applikation von löslicher Ecto-5'-Nucleotidase (1 U 5'-Nucleotidase aus dem Gift von Crotalus atrox) rekonstituiert. Wie in 5f gezeigt ist, war die 5'-Nucleotidase-Behandlung mit einer nahezu vollständigen Rekonstitution eines Wildtyp-Phänotyps in cd73^-/--Mäusen assoziiert. Ferner war die 5'-Nucleotidase-Behandlung von WT-Mäusen mit einer signifikanten Reduktion der Infarktgröße assoziiert (5f).
Zusammengefasst liefern diese Daten zum ersten Mal den genetischen Beleg für eine CD-abhängige Kardioprotektion durch IP. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit löslicher Nucleotid-Phosphohydrolase bzw. 5'-Nucleotidase eine neue Therapiemöglichkeit während der akuten myokardialen Ischämie darstellt.
(b) Niere
Zunächst wurde die Abwesenheit von CD73-Enzymaktivität in renalem Gewebe dieser Mäuse bestätigt (6a).
Als Nächstes wurde eine IP in cd73^-/--Mäusen und Wurfgeschwisterkontrollen durchgeführt. In deutlichem Gegensatz zu den Ergebnissen mit den Wildtyp-Mäusen war in cd73^-/--Mäusen die renale Hämodynamik durch IP, einschließlich des Plasmacreatinins (6b), Plasmakaliums (6c), der Creatinin-Clearance (6d), der Urinflussrate (6e), Ausscheidung von Natrium (6f) und von Kalium (6g) über den Urin, nicht verbessert. D.h., die Anwesenheit einer funktionierenden CD73-Aktivität ist für die gewebeprotektive Wirkung der IP mitentscheidend.
Ferner zeigten cd73^-/--Mäuse keinen Abfall in der Myeloperoxidaseaktivität in renalem Gewebe nach IP-Behandlung (6h).
Zusammengefasst liefern diese Daten das erste Mal genetische Hinweise für die CD73-abhängige renale Protektion durch IP.
2.4 Die kardiale IP ist mit einer selektiven Induktion des Adenosin-A_2B-Rezeptors assoziiert
Nachdem demonstriert wurde, dass die extrazelluläre Adenosinbildung über CD73 für die IP entscheidend ist, wurden als Nächstes die transkriptionellen Konsequenzen der kardialen IP auf die Expressionsspiegel von allen vier Adenosinrezeptoren untersucht (7a-d).
In der Tat ergab sich aus diesen Untersuchungen eine selektive Induktion des Adenosin-A_2B-Rezeptor-Transkriptes mit einem Maximum bei 90 min nach der IP (14fache Induktion, p<0,0001).
Im Gegensatz hierzu verblieben die mRNA-Spiegel der Adenosin-A₁- und -A₃-Rezeptoren durch die IP unverändert, während der Adenosin-A_2A-Rezeptor signifikant unterdrückt wurde. Gleichermaßen bestätigte die Immunhistochemie unter Verwendung konfokaler Laserscanning-Mikroskopie die Induktion des A_2B-Proteins 90 min nach IP (7c).
Nachdem gezeigt wurde, dass die A_2B-mRNA und das A_2B-Protein durch kardiale IP induziert werden, wurde als Nächstes der Beitrag der einzelnen Adenosinrezeptoren auf die Kardioprotektion durch die IP untersucht. Zu diesem Zweck wurden die zuvor beschriebene A₁ ^-/-, A_2A ^-/-- oder A₃ ^-/--Mäuse sowie kommerziell verfügbare A_2B ^-/-Mäuse [Deltagen Inc. (San Carlos, CA, USA)] einer kardialen IP unterzogen. Wie in 7d gezeigt, zeigten sämtliche Adenosinrezeptor-Knockoutmäuse eine Kardioprotektion durch IP, außer die Adenosin-A_2B-Rezeptor-Knockoutmaus.
Zusammengefasst werden hiermit erstmals genetische Belege für eine zentrale Rolle des Adenosin-A_2B-Rezeptors bei der Kardioprotektion durch IP geliefert.
2.5 Die IP wird in A_2B ^-/-Mäusen aufgehoben
Nachdem ein funktioneller Beitrag zur Kardioprotektion durch die IP demonstriert wurde, wurden die Untersuchungen in A_2B ^-/-Mäusen weitergeführt. Zu diesem Zwecke wurde in diesen Mäusen zuerst das Ausbleiben von Adenosin-A_2B-Rezeptor-vermittelten Antworten bestätigt. Tatsächlich bestätigte die PCR-Genotypisierung, die Messung der Adenosin-A_2B-Rezeptor-mRNA-Expression und der A_2B-Rezeptor-Protein-Expression intermediäre Spiegel von Adenosin-A_2B-Rezeptoren in heterozygoten Mäusen und Abwesenheit von Adenosin-A_2B-Rezeptoren in homozygoten Mäusen (8a-c). Ferner waren die Transkriptspiegel der anderen Adenosinrezeptoren (A₁/A_2A/A₃) im Vergleich zu den Kontrollen in den A_2B ^-/-Mäusen unverändert (Daten nicht gezeigt).
Um funktionelle Konsequenzen der Mutation in dem Adenosin-A_2B-Rezeptor zu demonstrieren, wurde die Hypoxie-induzierte vaskuläre Leckage gemessen. Tatsächlich zeigten frühere Untersuchungen eine Zunahme der Evan's Blue- Konzentration nach Hypoxieexposition bei pharmakologischer Inhibition des Adenosin-A_2B-Rezeptors (MRS1754); vgl. Thompson L. F. et al. (a.a.O.). In Übereinstimmung mit diesen Arbeiten zeigten die A_2B ^-/-Mäuse eine Zunahme der Evan's Blue-Leckage in die kardialen Gewebe nach Hypoxieexposition (4 h, 8 % Sauerstoff, 8d), was auf einen funktionellen Beitrag der Adenosin-A_2B-Signalgebung in der vaskulären Barrierefunktion während der Hypoxie hinweist.
Nachdem funktionelle Konsequenzen der Gendeletion des Adenosin-A_2B-Rezeptors im Herzen demonstriert wurden, wurde die Kardioprotektion durch IP untersucht. In der Tat waren die kardioprotektiven Effekte der IP, wie diese durch cTnI oder durch die Messung der Infarktgröße bewertet wurden, in A_2B ^-/-Mäusen aufgehoben (8e-g).
Um diese Befunde zu bestätigen, wurde ein pharmakologischer Ansatz gewählt. Dazu wurde der hochspezifische, wasserlösliche Adenosin-A_2B-Rezeptor-Antagonist PSB1115 verwendet (5 mg/kg/h). Wie in 8 gezeigt, hob die intraarterielle Behandlung mit PSB1115 die Abschwächung der Infarktgröße durch IP auf, was unsere Befunde in den A_2B ^-/-Mäusen bestätigte.
Um die Spezifität von PSB1115 für den Adenosin-A_2B-Rezeptor zu demonstrieren, wurden ebenfalls Adenosin-A₁-Rezeptor-Knockoutmäuse mit PSB1115 behandelt. Diese Untersuchungen ergaben eine Kardioprotektion durch IP in A₁ ^-/-Mäusen, die abgeschwächt wird durch die spezifische Blockade des Adenosin-A_2B-Rezeptors (8g).
Zusammengefasst liefern diese Untersuchungen genetische und pharmakologische Belege für eine Rolle des Adenosin-A_2B-Rezeptors in der Kardioprotektion durch IP.
(b) Niere
Wie in 9a gezeigt, resultierten 30 min der Ischämie in Wildtyp- oder cd73^-/--Mäusen in schwerer akuter Tubulusnekrose, wie sich dies durch den Verlust der Tubuluszellkerne in dem Cortex und dem äußeren medulären Streifen mit nahezu vollständiger Zerstörung des proximalen tubulären Bürstensaums zeigte. In der äußeren Medulla wurde eine große Anzahl von abgestoßenen Bürstensaum-tragenden Ausstülpungen beobachtet. Sowohl im Cortex als auch in der äußeren Medulla konnte die Bildung von Hyalinabstoßungen und intraluminalen nekrotischen Zelltrümmern beobachtet werden. Hierzu im Gegensatz zeigten Wildtyp-Mäuse mit IP-Behandlung vor der Ischämie lediglich leichte histologische Anzeichen von akuter tubulärer Nekrose, wie dies durch eine intakte tubuläre Zellmorphologie festgestellt werden konnte. Die proximale Schädigung des Bürstensaumes war sporadisch und relativ gering. Ferner zeigte sich lediglich eine geringe Anzahl von Hyalinabstoßungen in der IP-behandelten Gruppe. Die renale Gewebeprotektion durch IP blieb in cd73^-/--Mäusen aus. Tatsächlich zeigte die semiquantitative histologische Analyse in der Wildtyp-Gruppe mit IP eine Reduktion des Jablonski-Index von 3 (Bereich 3 bis 4) und ohne IP auf 2 (Bereich 1 bis 3), 9b, p<0,01), während in cd73^-/--Mäusen keine Reduktion der histologischen Einstufung beobachtet werden konnte.
Gleichermaßen waren die Anzeichen von akuter renaler Inflammation nach IP abgeschwächt, was durch cytochemische Färbung der Granulocyten mit Chloracetatesterase (CAE) demonstriert werden konnte (9c).
Das renale Gewebe zeigte nach 30 min der Ischämie in Wildtyp- und cd73^-/--Mäusen ohne IP einen signifikanten Anstieg in der Granulocyteninfiltration, vorzugsweise lokalisiert in peritubulären Bereichen. Diese Granulocyteninfiltration blieb lediglich in der Wildtyp-Gruppe mit IP-Behandlung vor der Ischämie aus. Folglich zeigte die quantitative Analyse eine Reduktion in der Granulocyteninfiltration ohne IP von 3,5 (Bereich 3 bis 4) auf 2 (Bereich 1 bis 3, 9d, p=0,001).
Zusammengefasst demonstrieren diese Daten auf histologischer Ebene die Abwesenheit einer renalen Protektion durch IP in cd73^-/--Mäusen.
2.6 Eine Adenosin-A_2B-Rezeptor-Agonist-Behandlung resultiert in geringeren Infarktgrößen während der akuten myokardialen Ischämie
Nachdem gezeigt wurde, dass Mäuse, die für den Adenosin-A_2B-Rezeptor mutiert waren, größere Infarktgrößen im Vergleich zum Wildtyp aufweisen und dort durch IP keine Kardioprotektion erzielt werden kann, wurde als Nächstes eine potenzielle therapeutische Rolle eines spezifischen A_2B-Agonisten (BR4887) untersucht.
Um die Adenosin-A_2B-Rezeptor-spezifischen Effekte von BR4887 zu demonstrieren, wurden zunächst die Mäuse an Normoxie oder Hypoxie (8 % Sauerstoff, 4 h) nach einer Behandlung mit BR4887 (BAY 60-6583) (10 μg/kg i.p., 30 min vor Hypoxie/Normoxie) oder Vehikelkontrolle exponiert. In Übereinstimmung mit Untersuchungen, die eine zunehmende vaskuläre Leckage mit Adenosin-A_2B-Antagonist-Behandlung zeigten, resultierte die Verabreichung von BR4887 (BAY 60-6583) in einer signifikanten Abschwächung der Hypoxieinduzierten vaskulären Leckage, wie dies durch Evan's Blue-Geweberetention gemessen wurde (10a).
Im nächsten Schritt wurden BL6-Mäuse mit einem einzigen Bolus von intraarteriellem BR4887 (BAY 60-6583) (10 μg/kg/Körpergewicht über 30 min vor Ischämie) behandelt und diese 60 min gegenüber myokardialer Ischämie exponiert. Tatsächlich resultierte die BR4887-Behandlung in einer signifikanten Abschwächung der Infarktgröße (10b, c).
Um die Spezifität von BR4887 zu bestätigen, wurde dieses Experiment in Adenosin-A_2B ^-/-Mäusen wiederholt. Wie in 10d gezeigt, konnte keine signifikante Abschwächung der Infarktgröße in A_2B ^-/-Mäusen festgestellt werden, was die Spezifität der kardioprotektiven Effekte von BR4887 durch Adenosin-A_2B-Rezeptor-Signalgebung bestätigte.
Zusammengefasst liefern diese Untersuchungen einen starken Beleg für die Möglichkeit einer therapeutischen Behandlung des Adenosin-A_2B-Rezeptors während der myokardialen Ischämie.
2.7 Rekonstitution von cd73^-/--Mäusen mit löslicher 5'-Nucleotidase
Als „proof of principle" und um zu demonstrieren, dass die Abnahme der renalen funktionellen Parameter in cd73^-/--Mäusen das Fehlen der extrazellulären 5'-Nucleotidase-Aktivität reflektiert, wurden als Nächstes cd73^-/--Mäuse über i.p. Injektion mit löslicher 5'-Nucleotidase (Sigma 5'-Nucleotidase aus dem Gift von Crotalus atrox) rekonstituiert und mit oder ohne IP 30 min vor der renalen Ischämie behandelt.
Wie in 11a und 11b gezeigt, sind die Anstiege im Serumcreatinin und Serumkalium nach i.p.-Nucleotidase-Behandlung reduziert.
Gleichermaßen nahm die Creatinin-Clearance (11c), Urinflussrate (11d), Ausscheidung von Natrium (11e) und Kalium (11f) über den Urin in cd73^-/--Mäusen mit und ohne IP-Behandlung zu.
Zusammengefasst bestätigen diese Untersuchungen die genetischen Untersuchungen, nach denen CD73 eine entscheidende Rolle in der Zunahme der renalen Resistenz gegenüber Ischämie nach IP-Behandlung zu spielen scheint.
2.8 Behandlung von renaler Ischämie mit löslicher 5'-Nucleotidase in Wildtyp-Mäusen
Nachdem gezeigt wurde, dass die renale Protektion durch IP erfolgreich durch die Behandlung von cd73^-/--Mäusen mit löslicher 5'-Nucleotidase wiederhergestellt werden kann, wurde als Nächstes eine Nucleotidase-Behandlung von renaler Ischämie in Wildtyp-Mäusen untersucht.
Zu diesen Zwecken wurden BL6-Mäuse mit löslicher 5'-Nucleotidase aus C. atrox behandelt und diese 30 min gegenüber renaler Ischämie mit oder ohne vorherige IP-Behandlung exponiert. Nach 24-stündiger Reperfusion wurden Untersuchungen der renalen Funktion durchgeführt. Wie in 12a-f gezeigt, war die 5'-Nucleotidase-Behandlung mit nahezu einer gleichen Protektion der renalen Funktion assoziiert, wie bei der IP-Behandlung.
Zusammengefasst zeigen diese Daten zum ersten Mal einen therapeutischen Effekt der Behandlung mit löslicher 5'-Nucleotidase in der renalen Ischämie.
2.9 Histologische Anzeichen der renalen Protektion durch 5'-Nucleotidase in cd73^-/--Mäusen und Wurfgeschwistern
Um die Erkenntnisse der renalen Protektion durch 5'-Nucleotidase-Behandlung auf einer histologischen Ebene zu bestätigen, wurde auch die renale Histologie und Inflammation nach Behandlung der renalen Ischämie mit löslicher 5'-Nucleotidase untersucht. Zu diesen Zwecken erhielten Mäuse lösliche 5'-Nucleotidase i.p. oder Vehikel 30 min vor der renalen Ischämie mit oder ohne IP-Behandlung. Nach 24 h der Reperfusion wurden histologische Schnitte angefertigt.
In Übereinstimmung mit den Untersuchungen der renalen Funktion bestätigte die renale Histologie eine renale Protektion gegenüber Ischämie durch i.p. 5'- Nucleotidase-Behandlung, wie diese zuvor mit der IP-Behandlung beobachtet wurde (13).
Zusammengefasst liefern diese Daten zum ersten Mal den genetischen Beleg für eine CD73-abhängige renale Protektion durch IP. Ferner konnte die Behandlung mit löslicher 5'-Nucleotidase als potenzielle neue Therapie während der akuten renalen Ischämie demonstriert werden.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verwendung von Nucleotid-Phosphohydrolase zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik von ischämischen Krankheiten.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Nucleotid-Phosphohydrolase 5'-Nucleotidase (CD73) verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Nucleotid-Phosphohydrolase Apyrase (CD39) verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotid-Phosphohydrolase in löslicher Form vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotid-Phosphohydrolase in mikronisierter Form vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die ischämische Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Myokardischämie, renale Ischämie, Darmischämie und Leberischämie.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotid-Phosphohydrolase in Form einer Codierungssequenz in einem Expressionsvektor vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel einen Wirkungsverstärker aufweist.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirkungsverstärker ein Adenosin-A_2B-Rezeptor-Agonist verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Adenosin-A_2B-Rezeptor-Agonist BR4887 verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirkungsverstärker ein Inhibitor des Nucleosid-Transporters verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Nucleosid-Transporter ENT-1 und/oder ENT-2 ist.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Inhibitor von ENT-1 und/oder ENT-2 Dipyridamol verwendet wird.
Verfahren, um bei einem Lebewesen eine Veranlagung für oder Erkrankung an einer ischämischen Krankheit zu diagnostizieren, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Bereitstellung einer aus dem Lebewesen stammenden biologischen Probe, (2) Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein einer Nucleotid-Phosphohydrolase, (3) Ggf. Bestimmung der Funktionsfähigkeit und/oder Aktivität der Nucleotid-Phosphohydrolase, (4) Korrelation der Abwesenheit von Nucleotid-Phosphohydrolase in der biologischen Probe oder einer in der biologischen Probe gegenüber dem Wildtyp reduzierten Funktionsfähigkeit und/oder Aktivität der Nucleotid-Phosphohydrolase in der biologischen Probe mit einer positiven Diagnose.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (2) ein Mutationsscreening durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (3) die Adenosinbildungsrate der in der biologischen Probe vorhandenen Nucleotid-Phosphohydrolase im Vergleich zu Wildtyp-Nucleotid-Phosphohydrolase bestimmt wird.
Pharmazeutische und/oder diagnostische Zusammensetzung, die eine Nucleotid-Phosphohydrolase in einer therapeutisch wirksamen Menge sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ggf. einen Wirkungsverstärker aufweist.
Verfahren, um bei einem Lebewesen eine Veranlagung für eine ischämische Krankheit oder Erkrankung an einer ischämischen Krankheit zu diagnostizieren, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Verabreichung der diagnostischen Zusammensetzung nach Anspruch 17 an ein Lebewesen, das Symptome einer ischämischen Krankheit zeigt; (2) Feststellung, ob sich die Symptome verbessern, und (3) Korrelation einer Verbesserung der Symptome mit einer positiven Diagnose.
Verwendung eines Adenosin-A_2B-Rezeptor-Agonisten, vorzugsweise von BR4887, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik von ischämischen Krankheiten.