DE102006039492A1

DE102006039492A1 - Resonance Raman microscopy device for protein sequencing and structure determination of e.g. virus, has gold wire with fluctuation during radiation of light to wavelength and polarization that are suitable to stimulate Raman-dispersion

Info

Publication number: DE102006039492A1
Application number: DE102006039492A
Authority: DE
Inventors: Bengt Noelting
Original assignee: Nolting Bengt Dr
Current assignee: Nolting Bengt Dr
Priority date: 2006-08-21
Filing date: 2006-08-21
Publication date: 2008-03-06

Abstract

The device has an antenna (101) with resonance characteristics for lights radiated for stimulation of Raman-dispersion, where the antenna has a small transmission head or edge with a radius of below 10 nanometers. The head or edge transmits energy to molecules that are to be examined. The head or edge is connected with an even-fleeced gold wire (102), where the wire has a superior strong light-induced fluctuation of electrical field strength during radiation of the light to the wavelength and polarization, which are suitable for stimulation of Raman-dispersion. An independent claim is also included for a method for top-reinforced resonance Raman microscopy.

Description

Ziel der ErfindungObject of the invention

Das Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer verbesserten Methode zur Aufklärung von biologischen und auch nichtbiologischen Strukturen mit Auflösungen von ca. 0,1-100 nm, wo herkömmliche optische Mikroskopie kaum anwendbar ist. Insbesondere ist die Methode vorgesehen für das Sequenzieren großer Proteine in der Proteomikforschung und zur Strukturaufklärung von Bakterien, Viren, menschlichen, tierischen und pflanzlichen Zellen.The The aim of the invention is to provide an improved method to the enlightenment of biological and non-biological structures with resolutions of about 0.1-100 nm, where conventional optical microscopy is hardly applicable. In particular, the method reserved for sequencing big Proteins in proteomics research and structure elucidation of Bacteria, viruses, human, animal and plant cells.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of technology

Resonanz-Ramanstreuung hat eine hohe Bedeutung bei der Strukturaufklärung von biologischen Molekülen (siehe z.B. Ahmed Z, Asher SA, UV resonance Raman investigation of a 3₁₀-helical peptide reveals a rough energy landscape, Biochemistry 45 (2006) 9068-9073). Metallische Nanopartikel (z.B. aus Gold oder Silber) können im Kontakt mit Molekülen aufgrund des Kneipp-Verstärker-Mechanismus (siehe z.B. Kneipp K, Kneipp H, Itzkan I, Dasari RR, Feld MS; Surface-Enhanced Non-Linear Raman Scattering at the Single Molecule Level, Chem. Phys. 247 (1999) 155-162) zu einer dramatischen Verstärkung der Ramanstreuung führen bis hin zur für die Einzelmoleküldetektion notwendigen Intensität. Ein ähnlicher Verstärkermechanismus wird in der spitzenverstärkten Resonanzramanmikroskopie genutzt (siehe z.B. das AFM/NSOM mit Nahfeld-Raman von Renishaw Plc und Nanonics Imaging Ltd). Leider wird dabei typischerweise nur eine Auflösung von ca. 10-100 nm erreicht (siehe z.B. Gerton JM, Wade LA, Lessard GA, Ma Z, Quake SR, Tip-Enhanced Fluorescence Microscopy at 10 Nanometer Resolution, Phys. Rev. Lett. 93 (2004) 180801-1-4) . Der Mechanismus der Verstärkung der Ramanstreuung wird noch nicht vollständig verstanden, beruht jedoch v.a. auf der Bildung von Plasmonen im metallischen Nanopartikel, welche angeregt werden, wenn die Partikel eine Größe von etwa 100 nm haben. Bei diesen Größenverhältnissen kommt es zur Resonanz der Elektronenbewegungen im Nanopartikel mit der sich periodisch ändernden Feldstärke des einfallenden kohärenten Laserlichtes. Die Nanopartikel wirken also als Antennen (siehe z.B. Sukmanowski J, Viguié JR, Nölting B, Royer FX, Light absorption enhancement by nanoparticles, J. Appl. Phys. 97 (2005) 104332-104338) , die die Lichtenergie einsammeln und auf die Moleküle im Kontakt mit den Nanopartikeln übertragen können. Die Effizienz der Verstärkung der Ramanstreuung eines Moleküls hängt neben der Größe der Nanopartikel auch von deren Form, der Polarisierung des Lichtes, der relativen Orientierung der betroffenen Bindung der Moleküls zum Feldstärkevektor des Lichtes und dem Abstand zwischen Nanopartikel und Molekül ab. Die Vielzahl der wichtigen Parameter bewirkt, daß in einer Suspension von Nanopartikeln mit zu untersuchenden Molekülen nur bei wenigen Nanopartikel-Molekül-Wechselwirkungen die Verstärkung der Ramanstreuung für den Einzelmolekülnachweis ausreicht. Außerdem ist die optimale Größe von mehreren 10 nm der Nanopartikel unvorteilhaft, um strukturell spitzenverstärkte Mikroskopie mit Auflösung im Bereich von wenigen Nanometern oder gar Subnanometerauflösung zu ermöglichen.Resonance Raman scattering is of great importance in the structural analysis of biological molecules (see, for example, Ahmed Z, Asher SA, UV Resonance Analysis of a 3 ₁₀ -helical peptide reveals a rough energy landscape, Biochemistry 45 (2006) 9068-9073). Metallic nanoparticles (eg of gold or silver) may be in contact with molecules due to the Kneipp amplifier mechanism (see eg Kneipp K, Kneipp H, Itzkan I, Dasari RR, field MS; Surface-Enhanced Non-Linear Raman Scattering at the Single Molecule Level, Chem. Phys. 247 (1999) 155-162) lead to a dramatic amplification of Raman scattering up to the intensity required for single molecule detection. A similar amplification mechanism is used in tip-enhanced resonant Raman microscopy (see, eg, the near field Raman AFM / NSOM by Renishaw Plc and Nanonics Imaging Ltd). Unfortunately, typically only a resolution of about 10-100 nm is achieved (see, eg Gerton JM, Wade LA, Lessard GA, Ma Z, Quake SR, Tip-Enhanced Fluorescence Microscopy at 10nm Resolution, Phys. Rev. Lett. 93 (2004) 180801-1-4) , The mechanism of enhancement of Raman scattering is not yet completely understood, but is based primarily on the formation of plasmon in the metallic nanoparticle, which are excited when the particles have a size of about 100 nm. With these size ratios, the electron movements in the nanoparticle resonate with the periodically changing field strength of the incident coherent laser light. The nanoparticles thus act as antennas (see, eg Sukmanowski J, Viguié JR, Nölting B, Royer FX, Light absorption enhancement by nanoparticles, J. Appl. Phys. 97 (2005) 104332-104338) that collect the light energy and transfer it to the molecules in contact with the nanoparticles. The efficiency of amplifying the Raman scattering of a molecule depends not only on the size of the nanoparticles but also on their shape, the polarization of the light, the relative orientation of the affected bond of the molecule to the field strength vector of the light and the distance between the nanoparticle and the molecule. The large number of important parameters has the effect that, in a suspension of nanoparticles with molecules to be investigated, amplification of the Raman scattering is sufficient for single-molecule detection only in the case of a few nanoparticle-molecule interactions. In addition, the optimal size of several 10 nm of nanoparticles is unfavorable to allow structurally tip-enhanced microscopy with resolution in the range of a few nanometers or even subnanometer resolution.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Erfindungsgemäß ist eine Spitze für spitzenverstärkte Ramanmikroskopie so konstruiert, daß sie (a) eine Antenne für die Aufnahme von Lichtenergie enthält, welche eine erheblich bessere Energieaufnahme als ein einfaches Nanopartikel am Ende eines Glasfaserkabels aufweist, wobei (b) die Antenne eine nicht- oder wenigresonante Übertragungsspitze mit einem Radius von unter 10 nm enthält, auf die ein erheblicher Teil der Antennenenergie übertragen wird und welche die Energie weiter zu den zu untersuchenden Molekülen leitet. Da die Herstellung einer solchen Antenne mittels herkömmlicher Verfahren, wie z.B. Elektronenstrahl- oder Röntgenlithographie sehr teuer ist, erfolgt die Herstellung mit einem einfachen mechanischen Verfahren (siehe Ausführungsbeispiel 1 und 1-3): (a) eine verlängerte vergrößerte Vorform der Antenne wird hergestellt, (b) durch Ziehen wird der Querschnitt der Vorform verringert, (c) ein Teil der Vorform wird abgetrennt und mit einer vorzugsweise stabförmigen Auflage zu einer neuen Vorform verbunden, (d) weiter mit Schritt b sofern die gewünschte Größe des Antennenquerschnitts noch nicht erreicht ist, (e) von der Vorform wird eine Scheibe abgetrennt und mit einer transparenten Halterung verbunden. Die Übertragungsspitze der Antenne muß nicht nadelförmig sein, sondern kann auch eine Kantenform – wie in 3 angedeutet – aufweisen, wobei dann die strukturelle Auflösung in Kantenrichtung geringer als quer zur Kantenrichtung ist.In accordance with the present invention, a peak-enhanced Raman microscopy tip is designed to include (a) a light energy receiving antenna which has a significantly better energy input than a simple nanoparticle at the end of a fiber optic cable, where (b) the antenna is non-resonant or non-resonant Transmitter tip with a radius of less than 10 nm, to which a considerable part of the antenna energy is transferred and which passes the energy further to the molecules to be investigated. Since the production of such an antenna by conventional methods, such as electron beam or X-ray lithography is very expensive, the production is carried out with a simple mechanical method (see Example 1 and 1 - 3 (b) drawing reduces the cross-section of the preform; (c) part of the preform is separated and bonded to a new preform with a preferably rod-shaped overlay; (d) continue with step b if the desired size of the antenna cross section has not yet been reached, (e) from the preform a slice is separated and connected to a transparent holder. The transmission tip of the antenna need not be needle-shaped, but can also be an edge shape - as in 3 indicated - have, in which case the structural resolution in the edge direction is less than transverse to the edge direction.

Diese Einschränkung kann jedoch partiell überwunden werden durch Scannen in mehreren Orientierungen der Probe auf einem Drehtisch.These restriction but can be partially overcome by scanning in multiple orientations of the sample on one Turntable.

Die Erfindung kann Anwendung finden zur Aufklärung biologischer Strukturen im Subnanometer- bis Mikrometerbereich, z.B. zur Proteinsequenzierung in der Proteomikforschung (siehe z.B. Schmidt F, Dahlmann B, Janek K, Kloss A, Wacker M, Ackermann R, Thiede B, Jungblut PR, Comprehensive quantitative proteome analysis of 20S proteasome subtypes from rat liver by isotope coded affinity tag and 2-D gel-based approaches, Proteomics 6 (2006) Jul 21 , im Druck) oder der Untersuchung des Wirkungsmechanismus einer Tuberkulosevaccine mittels Strukturanalyse von Zellen des Immunsystems und vom Immunsystem attackierten Tuberkulosebakterien (z.B. deren Schnitte mittels Ultramikrotom).The invention may find application for the elucidation of biological structures in the subnanometer to micrometer range, for example for protein sequencing in proteomics research (see, eg Schmidt F, Dahlmann B, Janek K, Kloss A, Wacker M, Ackermann R, Thiede B, Jungblood PR, Comprehensive quantitative proteome analysis of 20S proteasome subtypes from rat liver by isotope coded affinity tag and 2-D gel-based approaches, proteomics 6 (2006) Jul 21 , in press) or the study of the mechanism of action of a tuberculosis vaccine by structural analysis of cells of the immune system and tuberculosis bacteria attacked by the immune system (eg, their cuts using ultramicrotoma).

Ausführungsbeispiel 1embodiment 1

Herstellung und Design einer Spitze für spitzenverstärkte Ramanmikroskopie gemäß 1-3: (a) eine quer zur Einstrahlrichtung verlängerte vergrößerte Vorform der Antenne wird hergestellt aus in Glas eingegossenen Golddrähten von ca. 0,05-0,5 mm Durchmesser, (b) der Querschnitt der Vorform a wird durch Ziehen verringert während eines Erhitzens des Glases, (c) ein Teil der Vorform b wird ausgeschnitten und mit einem Stab verbunden, wodurch eine neue Vorform gebildet wird, (d) die Schritte b und c werden mehrfach ausgeführt, bis die gewünschte Größe des Querschnitts der Golddrähte in der Vorform erreicht ist, (e) eine Scheibe wird von der in den vorherigen Schritten entstandenen Vorform abgeschnitten und mit einer optisch transparente Halterung verbunden, (f) Scheibe mit Halterung werden zur endgültigen Spitzenform weiter abgeschliffen, abgeschnitten oder abgeschabt.Production and design of a tip for tip-enhanced Raman microscopy according to 1 - 3 : (a) a transversely elongated enlarged preform of the antenna is made of glass cast gold wires of about 0.05-0.5 mm in diameter, (b) the cross section of the preform a is reduced by drawing while heating the glass (c) a portion of the preform b is cut out and bonded to a rod to form a new preform; (d) steps b and c are performed several times until the desired size of the cross section of the gold wires in the preform is achieved; (e) a disc is cut from the preform created in the previous steps and connected to an optically transparent support; (f) disc with support is further ground, cut or scraped to the final tip shape.

1: Eine Designvariante der Vorform der Antenne. 101: flachgeprellte Golddrähte, die später den resonanten Teil der Antenne darstellen; 102: Golddraht, der später die Übertragungsspitze zur Weiterleitung der Energie der Antenne auf das zu untersuchende Molekül darstellt; 103: einfallendes linear polarisiertes kohärentes Laserlicht; 104: Glas; 105: zur Resonanz-Ramanstreuung angeregtes Molekül. Die sich später aus dieser Vorform bildende Übertragungsspitze ist vorzugsweise mit einem Teil der Antenne mit sehr hohen licht-induzierten Feldstärkefluktuationen gekoppelt. 1 : A design variant of the preform of the antenna. 101 : flattened gold wires, which later represent the resonant part of the antenna; 102 : Gold wire, which later represents the transmission tip for transmitting the energy of the antenna to the molecule to be examined; 103 : incident linearly polarized coherent laser light; 104 : Glass; 105 : molecule excited to resonance Raman scattering. The transmission tip, which later forms from this preform, is preferably coupled to a portion of the antenna having very high light-induced field strength fluctuations.

2: Eine Designvariante der Verkleinerung des Querschnitts der Antenne: Die Vorform (201) besteht aus Glas (202) und Golddrähten (203) von ca. 0,05-0,5 mm Durchmesser, wobei alle Golddrähte bis auf einer, aus dem später die Übertragungsspitze zur Weiterleitung der Antennenenergie hergestellt wird, im Glas quer zur Achse vollständig eingeschlossen sind. Die Vorform (201) wird unter Erhitzen zur Vorform (204) gezogen. Dabei ist die Temperatur so eingestellt, daß das Glas erweicht, aber die Golddrähte im Wesentlichen noch fest sind, also im Wesentlichen kaltverformt werden. Aufgrund der höheren Temperatur und des weitestgehenden Einschlusses im Glas kommt es nur geringfügig zur Bildung von Rissen in den Drähten. Von der Vorform (204) wird das Teil (206) abgeschnitten und mit der transparenten Halterung (207) verbunden. Die daraus entstehende Vorform (205) wird zur Vorform (208) gezogen, in der sich nun der Durchmesser der Golddrähte auf wenige Mikrometer verringert hat. Die Prozedur – Abschneiden eines Teils, Ziehen, Verbinden mit einer stabförmigen Auflage zu einer neuen Vorform – wird nun noch einige Male wiederholt, bis der Durchmesser der Golddrähte auf das gewünschte Endmaß von ca. 100 nm verringert ist. Nach dem letzten Ziehen wird eine dünne Scheibe (ca. 1 mm; z.B. (301) in 3) von der Vorform abgeschnitten und mit einer Halterung (z.B. (302 in 3) von einigen mm Dicke befestigt und z.B. gemäß 3 weiter verarbeitet. 3: Eine Designvariante der Spitze des Ramanmikroskops. Eine Scheibe (301) von ca. 1 mm Dicke, die von einer Vorform (z.B. gemäß 2) abgeschnitten wurde, wird mit einer optisch transparenten Halterung (302) verbunden. Der Verbund wird an der Unterseite (304) so angeschliffen, daß die Antenne (303) eine kleine Übertragungsspitze oder Kante an der Unterseite enthält. Der Lichteinfall (305) erfolgt von oben. 2 : A design variant of the reduction of the cross-section of the antenna: The preform ( 201 ) is made of glass ( 202 ) and gold wires ( 203 ) of about 0.05-0.5 mm in diameter, all gold wires except for one, from which later the transmission tip for the transmission of the antenna energy is made, are completely enclosed in the glass transverse to the axis. The preform ( 201 ) is heated to preform ( 204 ) drawn. The temperature is adjusted so that the glass softens, but the gold wires are still essentially solid, so are essentially cold-formed. Due to the higher temperature and the most extensive inclusion in the glass, there is only a slight formation of cracks in the wires. From the preform ( 204 ) the part ( 206 ) and with the transparent holder ( 207 ) connected. The resulting preform ( 205 ) becomes the preform ( 208 ), in which the diameter of the gold wires has now reduced to a few micrometers. The procedure - cutting off a part, pulling it, connecting it with a rod-shaped support to a new preform - is then repeated a few more times until the diameter of the gold wires is reduced to the desired final dimension of about 100 nm. After the last drawing, a thin disc (about 1 mm, eg 301 ) in 3 ) cut from the preform and with a holder (eg ( 302 in 3 ) of a few mm thickness and, for example, according to 3 further processed. 3 : A design variant of the top of the Raman microscope. A disk ( 301 ) of about 1 mm in thickness, that of a preform (eg according to 2 ) is cut with an optically transparent holder ( 302 ) connected. The composite is at the bottom ( 304 ) ground so that the antenna ( 303 ) contains a small transfer tip or edge at the bottom. The incidence of light ( 305 ) takes place from above.

Ausführungsbeispiel 2embodiment 2

Proteinsequenzierung mittels der verbesserten spitzenverstärkten Resonanzramanmikroskopie gemäß 4: Die Proteinmoleküle werden denaturiert, am C- oder N-Terminus mit einer Unterlage chemisch verbunden und dann mittels eines elektrischen Feldes gestreckt und in diesem Zustand getrocknet. Die Sequenzierung erfolgt dann mittels Feststellung unterschiedlicher Ramansignale der verschiedenen Aminosäuren mittels Abscannen der Moleküle mit einem modifizierten Atomkraftmikroskop (AFM), dessen Spitze durch ein Design ähnlich zu 3 ausgetauscht wurde.Protein sequencing by means of the improved tip-enhanced resonance Raman microscopy according to 4 The protein molecules are denatured, chemically linked at the C- or N-terminus to a support and then stretched by means of an electric field and dried in this state. The sequencing is then carried out by detecting different Raman signals of the different amino acids by scanning the molecules with a modified atomic force microscope (AFM), the tip of which by a design similar to 3 was exchanged.

4: Anwendung der Spitze mit mechanisch hergestellter Antenne im Nanometer-Größenbereich in einem modifizierten AFM zur Proteinsequenzierung. 401: denaturiertes, gestrecktes Proteinmolekül; 402: Unterlage; 403: chemischer Linker zwischen Proteinmolekül und Unterlage; 404: xyz-Translationselemente für die Unterlage; 405: optisch überwiegend intransparenter Ausleger des modifizierten AFM; 406: Lichteinlaß in die optisch im Inneren transparente Spitze (407) des AFM; 408: Laserlicht, das aus dem Lichtleiterkabel (409) in die Spitze des AFM übertragen wird. Der kleine Abstand zwischen Lichtleiterkabel (409) und Lichteinlaß (406) in die AFM-Spitze (407) erlaubt eine weitgehend ungehinderte Bewegung von Ausleger (405) und Spitze (407). 4 : Using nanometer-sized mechanically-styled tip in a modified AFM for protein sequencing. 401 : denatured, stretched protein molecule; 402 : Document; 403 : chemical linker between protein molecule and substrate; 404 : xyz translational elements for the pad; 405 : optically predominantly non-transparent cantilever of the modified AFM; 406 : Light inlet into the optical inside transparent tip ( 407 ) of the AFM; 408 : Laser light coming out of the fiber optic cable ( 409 ) is transferred to the top of the AFM. The small distance between fiber optic cables ( 409 ) and light inlet ( 406 ) into the AFM tip ( 407 ) allows a largely unhindered movement of boom ( 405 ) and tip ( 407 ).

Claims

Apparatus and method for point-enhanced resonance scanning microscopy, characterized in that - the tip of the resonance scanning microscope contains an antenna with good resonance properties for the light irradiated to excite the resonance Raman scattering, - the antenna has a small transmission tip or edge with a radius of less than 10 nm, the comparatively worse resonances the incident light for the incident light as the remainder of the antenna and for transmitting energy trapped by the antenna to the molecules to be examined, the small transmission tip or edge is connected or coupled to a part of the antenna which is incident upon irradiation of light Excitation of the resonant Raman scattering suitable wavelength and polarization has an above-average strong light-induced fluctuation of the electric field strength.

equipment and method of peak-enhanced resonant Raman microscopy, according to claim 1, characterized in that - the antenna with transmission tip or edge is made from an enlarged and lengthened Preform of the antenna with multiple cyclic application following Steps: (a) pulling the preform to a smaller cross section, (b) bonding a portion of the drawn preform to a platen and thus the formation of a new preform.