DE102006023887B3 - Transmitted-light microscopy method involves sequentially separating the pictures in light dispersion direction with poly-chromatic source of light to time point or with wavelength-variable source of light - Google Patents

Transmitted-light microscopy method involves sequentially separating the pictures in light dispersion direction with poly-chromatic source of light to time point or with wavelength-variable source of light

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DE102006023887B3
DE102006023887B3 DE200610023887 DE102006023887A DE102006023887B3 DE 102006023887 B3 DE102006023887 B3 DE 102006023887B3 DE 200610023887 DE200610023887 DE 200610023887 DE 102006023887 A DE102006023887 A DE 102006023887A DE 102006023887 B3 DE102006023887 B3 DE 102006023887B3
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chromatic
beam path
light
light microscopy
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Klaus Dr. Körner
Wolfgang Prof.Dr. Osten
Evangelos Dr. Papastathopoulos
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Stuttgart Universitaet
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Stuttgart Universitaet
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Abstract

The method involves accomplishing a chromatic depth resolution by partially chromatic refraction power in the detection rays path, during the object representation. The pictures of the centers of the micro screen (B) or pictures of the center of the multi-illustrated screen during re-illustration into the object area experience a chromatically caused depth resolution. These pictures are separated sequentially in the light dispersion direction with a poly-chromatic source of light to a time point or with a wavelength-variable source of light. An independent claim is also included for the transmitted-light microscopy arrangement.

Description

  • Stand der Technik State of the art
  • Die Durchfokussierung spielt bei der konfokalen Mikroskopie seit Marvin Minski, [Patentschrift The through focus plays in confocal microscopy since Marvin Minski, [Patent US 3,013,467 US 3,013,467 vom 19. Dezember 1961] eine funktionstragende Rolle. from 19 December 1961] a functional role. Es wurden bereits viele Anstrengungen unternommen, die Durchfokussierung ohne mechanisch bewegte Teile zu realisieren. There have been many efforts to realize the By focusing without mechanically moving parts.
  • Im Fachaufsatz von Christopher J. Mann, Lingfeng Yu, Chun-Min Lo, and Myung K. Kim: „High-resolution quantitative phase-contrast microscopy by digital holography" in OPTICS EXPRESS Vol. 13, No. 22, S. 8693–8698, 2005 wird ein holografisches, quantitatives Phasenkontrast-Mikroskopie-Verfahren beschrieben, bei dem die Objektinformationen außerhalb der Fokustiefe numerisch rekonstruiert werden. Deshalb ist für die dreidimensionale Erfassung eines Objekts vorteilhafterweise kein mechanisches Tiefen-Scannen erforderlich. Das Problem stellt hierbei jedoch das bei streuenden Proben nicht ganz vermeidbare Reststreulicht dar, dessen Einfluss hier durch die Nutzung der Informationen des Winkelspektrums zwar schon reduziert ist, bei sehr hohen Anforderungen aber dennoch etwas störend wirken kann. Außerdem ist die erreichbare Tiefenauflösung nicht in jedem Fall zufrieden stellend, beispielsweise, wenn eine Tiefenauflösung bzw. eine Auflösung der optischen Dicke von 10 nm und weniger gef In the technical article by Christopher J. Mann, Lingfeng Yu, Chun-Min Lo, and Myung K. Kim: "High-resolution quantitative phase-contrast microscopy by digital holography" in OPTICS EXPRESS Vol 13, No. 22, pp 8693-. 8698, 2005, holographic, quantitative phase contrast microscopy method is described in which the object information is reconstructed numerically outside the depth of focus. Therefore, advantageously, no mechanical depth scanning is required for three-dimensional detection of an object. However, the problem is here that in scattering samples not completely avoidable residual scattered light is, its influence is here indeed been reduced by the use of the information of the angular spectrum, with very high standards but can be a bit annoying. Also, the achievable depth resolution is not satisfactory in every case, for example, when a low-resolution or a resolution of the optical thickness of 10 nm and less Found ordert ist. is orders.
  • Im Fachaufsatz von Christopher G. Rylander, Digant P. Dave, Taner Akkin, Thomas E. Milner, Kenneth R. Diller, and Ashley J. Welch: „Quantitative phase-contrast imaging of cells with phase-sensitive optical coherence microscopy", OPTICS LETTERS Vol. 29, No. 13, S. 1509–1511, 2004 wird ein faserbasiertes optisches Kohärenz-tomografisches System auf der Basis des differentiellen Interferenzkontrastes (OCT-DIC) beschrieben. Dieses System wird zur quantitativen Vermessung von Zellbestandteilen eingesetzt, indem Änderungen des optischen Gangunterschiedes hochaufgelöst bestimmt werden. Jedoch ist es nicht möglich, Objekte in deutlich unterschiedlicher Tiefe gleichzeitig mit hoher Lateralauflösung zu erfassen, da dies die Begrenzung durch die wellenoptische Schärfentiefe verhindert. In the technical article by Christopher G. Rylander, Digant P. Dave, Taner Akkin, Thomas E. Milner, Kenneth R. Diller, and Ashley J. Welch: "Quantitative phase-contrast imaging of cells with phase-sensitive optical coherence microscopy", OPTICS LETTERS Vol. 29, No. 13, pp 1509-1511, a fiber-based optical coherence tomographic system is described on the basis of the differential interference contrast (OCT DIC) of 2004. This system is used for the quantitative measurement of cell components, by changes in the optical path difference can be determined with high resolution. However, it is not possible to detect objects in significantly different depths simultaneously with high lateral resolution, as this prevents the limitation by the wave-optical depth of field.
  • In der Schrift In Scripture US 6,091,496 US 6,091,496 wird kein Ansatz für die spektral-interferometrische Durchlicht-Mikroskopie dargestellt, jedoch findet sich ein erster Hinweis zu derselben in WO2006/042696, Seite 118 unter Verwendung eines Mach-Zehnder-Interferometers mit chromatischer Längsaberration und Kompensation derselben. no approach to spectrally-interferometric transmitted light microscopy is presented, however, the first indication to the same place in WO2006 / 042696, page 118, using a Mach-Zehnder interferometer with longitudinal chromatic aberration and compensation thereof. Hier ist jedoch keine Lehre gegeben, die Durchlicht-Mikroskopie für Phasenobjekte anzuwenden. Here, however, no teaching is given to apply the transmitted light microscopy for phase objects. In der Veröffentlichung von E. Papastathopoulos, K. Körner und W. Osten „Chromatically dispersed interferometry with wavelet analysis", in OPTICS LETTERS, Vol. 31, No. 5, S. 589–591, 2006, ist das Verfahren der Spektral-Interferometrie mit chromatischer Tiefenaufspaltung des Detektionsfeldes im Objektraum mit der Analyse der entstehenden Wavelet dargestellt. Dieser Ansatz wurde jedoch nicht für die Durchlicht-Mikroskopie beschrieben. In the publication by E. Papastathopoulos, K. grains and W. East "chromatically dispersed interferometry with wavelet analysis", in OPTICS LETTERS, Vol. 31, No. 5, pp 589-591, 2006, is the method of spectral interferometry shown chromatic depth splitting of the detection field in the object space with the analysis of the resulting wavelet. This approach has not been described for the transmitted-light microscopy.
  • Anwendungsgebiet der Erfindung Field of the Invention
  • Die Erfindung zur Durchlicht-Mikroskopie kann für vielfältige Aufgaben in der Medizin und der Biologie, insbesondere zur Analyse von einzelnen, ungefärbten, unbehandelten, lebenden tierischen oder humanen Zellen sowie Kulturzellen eingesetzt werden, indem deren optische Dicke und Tiefenposition bestimmt wird. The invention for transmitted light microscopy can be used by the optical thickness and depth position is determined for various tasks in medicine and biology, in particular for the analysis of individual, undyed, untreated, living animal or human cells as well as culture cells. Insbesondere kann die Erfindung auch zur Analyse von Chromosomen in der Human- und Zytogenetik Anwendung finden. In particular, the invention also provides for the analysis of chromosomes in the human and cytogenetics can be applied. Beispielsweise sollen auch Bestandteile von Krebszellen hinsichtlich der optischen Dicken mit hoher Genauigkeit vermessen werden können. For example, constituents of cancer cells in terms of optical thicknesses with high accuracy are able to be measured.
  • Weiterhin kann die quantitative Bestimmung der Verteilung, der Position im Raum und der lateralen Abmessungen von opaken Mikropartikeln, beispielsweise auch von interstellarem Mikrostaub (star dust) in einem transparenten Medium erfolgen. Further, the quantitative determination of the distribution, the position in space and the lateral dimensions of opaque micro-particles, for example, be also micro-dust of interstellar (star dust) in a transparent medium. Dieses muss zwischen Kondensor und Objektiv „eingebracht" werden. Es ist möglich, mit der Erfindung die Verteilung und die lateralen Abmessungen von Mikrofasern in einem transparenten oder auch partiell trüben Medium, wie spezielle Kunststoffe, zu bestimmen, also die Erfindung für technische Applikationen einzusetzen. Im NIR-Bereich ist die Analyse von Si-Strukturen in Transmission durchführbar, wobei wegen der sphärischen Aberration die Strukturen eine näherungsweise konstante Dicke aufweisen sollten. Es ist mit der erfinderischen Lösung auch eine Kristall-Analyse durchführbar. Erfindungsgemäß kann auch die Bestimmung von Brechzahlveränderungen in transparenten Medien in der mikroskopischen Skale lateral hochgenau und tiefenaufgelöst erfolgen. Die genannten Anwendungen können im DUV-, UV-, VIS- oder auch im NIR-Bereich erfolgen. Dabei kann auch mit Immersionstechniken in Öl, Wasser oder Glyzerin gearbeitet werden, wobei jeweils speziell abgestimmte Objektive eingesetzt This must be "introduced" between condenser and objective. It is possible to determine with the invention, the distribution and the lateral dimensions of microfibers in a transparent or partially turbid medium, such as special plastics, so to use the invention for technical applications. in the NIR region, the analysis of Si structures in transmission can be carried out, the structures should have an approximately constant thickness due to the spherical aberration. It is with the inventive solution also a crystal analysis can be carried out. According to the invention, the determination of refractive index changes in carried transparent media with high precision and depth-resolved in the microscopic scale lateral. the applications mentioned can take place in the DUV, UV, VIS or NIR-range. It can also be carried out with immersion techniques in oil, water or glycerol, in each case specifically matched lenses used werden. become.
  • Der erfinderische Ansatz ermöglicht auch die Auslesung von Volumen-Datenspeichern, die in Transmission arbeiten, indem Änderungen des Brechungsindexes im durchstrahlten Medium erfasst und ausgewertet werden. The inventive approach also allows the reading of volume data stores which operate in transmission by refractive index changes in the irradiated medium are recorded and evaluated.
  • Ziele der Erfindung Objects of the Invention
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung zur Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere zur Vermessung der optischen Dicken von transparenten und partiell trüben Objekten, auch als Phasenobjekte bekannt, besteht darin, Neues für die gewerbliche Anwendung bereitzustellen. The object of the present invention for transmitted-light microscopy, in particular for the measurement of the optical thicknesses of transparent and partially opaque objects, also known as phase objects known to provide new one for industrial use.
  • Das Ziel ist hierbei insbesondere auch die quantitative Erfassung von dünnen Phasenobjekten, zB einzelne, auch ungefärbte, lebende Zellen. The goal is especially the quantitative detection of thin phase objects, such as individual, even unstained living cells.
  • Das technische Ziel der Erfindung besteht in der Erhöhung der Geschwindigkeit beim Messen der optischen Dicken und der Vergrößerung des nutzbaren Tiefenmessbereiches, insbesondere bei Verwendung von einem Abbildungssystem mit einer vergleichsweise hohen numerischen Apertur, beispielsweise im Bereich von 0,4 bis 1,25 (Wasserimmersion) oder 1,5 (Ölimmersion) auf Werte, die einem Mehrfachen der wellenoptisch gegebenen Schärfentiefe entsprechen. The technical aim of the invention is to increase the speed of measuring the optical thickness and increase the effective depth measurement range, particularly when using an imaging system having a relatively high numerical aperture, for example in the range of 0.4 to 1.25 (water immersion) or 1.5 (oil immersion) to values ​​corresponding to a multiple of the wave-optically given depth of field.
  • Die mit dem erfinderischen Sensor beim Messen gewonnenen optischen Signale sollen mittels Strahlungsdetektor oder gerastertem Strahlungsdetektor wie eine Zeilen- oder eine Flächenkamera, erfasst werden. The data obtained with the inventive sensor in measuring optical signals are to be detected by radiation detector or halftone dot radiation detector such as a line or an area camera.
  • Ein weiteres Ziel ist, eine Lehre zur Auslesung von Volumen-Datenspeichern zu geben, die in Transmission arbeiten. Another goal is to give a lesson to read out volume data stores which operate in transmission.
  • Aufgabe der Erfindung OBJECT OF THE INVENTION
  • Es sollen in der Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere zur Prüfung von Phasenobjekten beim optischen Antasten der Objekte in verschiedenen Tiefen des Objektraumes optische Signale aus diesen Tiefen ohne das mechanische Bewegen von Komponenten – insbesondere im Objektraum – gewonnen werden, um insbesondere auch die optische Dicke oder die Veränderung der optischen Dicke von einem Objekt oder dessen Bestandteilen oder auch von mehreren Objekten bestimmen zu können. It should in the transmitted-light microscopy, in particular for the testing of phase objects in the optical probing of the objects at different depths of the object space optical signals from these depths without mechanical movement of components - are obtained, in particular, the optical thickness or - in particular in the object space be able to determine from an object or its components, or of several objects change in optical thickness. Dabei soll eine zumindest näherungsweise beugungsbegrenzte laterale Abbildung des Objekts durch ein Abbildungssystem mit vergleichsweise hoher numerischer Apertur, insbesondere auch bei der Immersionstechnik, erfolgen. The aim is an at least approximately diffraction limited lateral imaging of the object by an imaging system with a relatively high numerical aperture, particularly in immersion technique, take place.
  • Damit soll die erfinderische Aufgabe gelöst werden, für das Nomarski-Phasenkontrast-Verfahren, das Differenzielle Interferenzkontrast(DIC)-Verfahren, das Hoffinann-Modulationskontrast(HMC)-Verfahren oder mittels Mikroskopen auf Basis der Zwei-Strahl-Interferometrie, insbesondere auch mittels eines Mach-Zehnder-Interferometers, hochgenaue, quantitative Messungen der optischen Dicke oder der Dicken, einschließlich Variationen derselben, von transparenten Objekten mit sehr hoher Auflösung durchzuführen. Thus, the inventive object is to be solved, for the Nomarski phase contrast method, the Differential interference contrast (DIC) method, the Hoffmann Modulation Contrast (HMC) method or by means of microscopes on the basis of two-beam interferometry, in particular by means of a Mach-Zehnder interferometer, highly accurate, quantitative measurements of the optical thickness or the thicknesses, including variations of the same, carried out by transparent objects with very high resolution. Hierbei geht es also insbesondere um eine Auflösung in der Tiefenrichtung in der Größe von wenigen Nanometern. This therefore concerns in particular resolution in the depth direction in size from a few nanometers.
  • Andererseits soll beim Wellenlängen-Scan mittels einer zeitlich Wellenlägendurchstimmbaren, spektral schmalbandigen Strahlungsquelle die erfinderische Aufgabe gelöst werden, dass elektromagnetische Interferenzmodulationen über der Zeit erzeugt werden, die eine hinreichend kleine und damit technisch gut auswertbare Frequenz aufweisen, um aus diesen Informationen insbesondere die optische Dicke oder die Veränderung der optischen Dicke bestimmen zu können. On the other hand, the inventive object is to be solved at the wavelength scanning by a timed Wellenlägendurchstimmbaren, spectrally narrow-band radiation source that electromagnetic interference modulations are generated over time, which have a sufficiently small and therefore industrially readily analyzable frequency in order from this information, in particular the optical thickness or to determine the change in optical thickness. Diese erfinderische Aufgabe soll insbesondere für ein konfokales differentielles Interferenz-Mikroskop, insbesondere für das Normarski-DIC-Mikroskop, also auf der Basis polarisationsoptisch generierter Lateral-Shear, sowie auch ein konfokales Zwei-Strahl-Interferenz-Mikroskop, insbesondere auch für ein konfokales Mach-Zehnder-Interferenz-Mikroskop, gelöst werden. This inventive task is especially a confocal differential interference microscope, especially for the Nomarski DIC microscope, so on the basis of optical polarization generated lateral shear, as well as a confocal two-beam interference microscope, especially a confocal Mach -Zehnder interference microscope, be solved.
  • Beschreibung der Erfindung anhand der Merkmale Description of the invention based on the features
  • Das Ziel der Erfindung wird mit den nachstehenden erfinderischen Merkmalen erreicht: The object of the invention is achieved by the following inventive features:
    Hauptmerkmal: Erfindungsgemäß wird bei einem Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere auch zur quantitativen Prüfung von einem oder mehreren Objekten oder eines Teils oder Teilen desselben oder derselben im Objektraum Main Feature: According to the invention the same or in a method of transmitted-light microscopy, in particular also for the quantitative examination of one or more objects, or a part or parts of the same in the object space
    • – mit einer polychromatischen Lichtquelle im Beleuchtungsstrahlengang und mit einem Spektrometer im Detektionsstrahlengang - with a polychromatic light source in the illumination beam path and with a spectrometer in the detection beam path,
    • – oder mit einer Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle im Beleuchtungsstrahlengang - or with a wavelength-tunable light source in the illumination beam path
    und mit Mitteln zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang and means for confocal discrimination in the detection beam path
    • – wie mehrere Mikroblenden - as several micro aperture
    • – oder eine mittels mehrerer gerasterter Mikrooptiken, wie gerasterte Mikrolinsen, mehrfach abgebildete Blende - or a rasterized by a plurality of micro-optics, such as rasterized microlenses, aperture multiply mapped
    sowie einer Kamera im Detektionsstrahlengang bei der Objektabbildung eine chromatische Tiefenaufspaltung mittels einer zumindest partiell chromatischen Brechkraft im Detektionsstrahlengang durchgeführt. and a camera in the detection beam path in the object image has a chromatic depth splitting performed by means of an at least partially chromatic refractive power in the detection beam path. So wird erreicht, dass Bilder der Mittelpunkte der Mikroblenden oder Bilder des Mittelpunktes der mehrfach abgebildeten Blende bei der Rückabbildung in den Objektraum dort eine chromatisch verursachte Tiefenaufspaltung erfahren. It is thus achieved that images of the centers of the micro aperture or images of the center of the multi-aperture depicted in the remapping in the object space do not undergo a chromatic depth splitting caused. Damit sind diese Bilder bei einer polychromatischen Lichtquelle zu einem Zeitpunkt oder bei einer Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle sequentiell in der Lichtausbreitungsrichtung separiert, so dass Objektpunkte aus unterschiedlichen Tiefen mittels der Mikroblenden oder der Mikrolinsen erfasst werden können. Thus these images are separated in a polychromatic light source at a time or at a wavelength tunable light source sequentially in the light propagation direction so that the object points can be detected from different depths by means of the micro-shutters or micro-lenses.
  • So kann ein Wert für die Tiefenposition eines scharf abgebildeten Objektpunktes eines sehr dünnen Phasenobjektes sowie dessen Änderung der optischen Dicke in Bezug zum umgebenden Medium errechnet werden. Thus, a value for the depth position of an object in focus point a very thin phase object as well as the change in optical thickness can be calculated in relation to the surrounding medium. Dies kann in einem Bereich z_c erfolgen, der ein Mehrfaches der wellenoptischen Schärfentiefe betragen kann. This can be done in a range z_c, which may be a multiple of the wave-optical depth of field. Bei einem opaken dünnen Mikropartikel in einem transparenten Medium kann die Wellenlänge der Abschattung bestimmt werden, woraus die Kontur von Mikropartikeln bestimmt werden kann. When an opaque thin microparticles in a transparent medium, the wavelength of the shading can be determined, from which the contour may be determined by microparticles.
  • Dabei kann die Quelle elektromagnetischer Strahlung breitbandig, beispielsweise im DUV UV-, im VIS- oder auch im IR-Bereich, ausgebildet sein und auch kurzgepulst werden, beispielsweise ein Kurzpulslaser, und dessen Pulse mit einer Kamera, die als Detektor dient, beispielsweise im 100 Hz-Bereich, synchronisiert werden. Here, the source of electromagnetic radiation broadband, for example in the DUV UV, be in the VIS or IR range, formed and also kurzgepulst, for example, a short pulse laser, and the pulses with a camera serving as a detector, for example in 100 Hz range, are synchronized. Dies ist für bewegte Mikroszenen von Vorteil. This is for moving micro-scenes advantage. Andererseits kann auch ein Wellenlängen-durchstimmbarer Laser eingesetzt werden. On the other hand, a wavelength tunable laser can be used. Weiterhin kann auch eine spektral breitbandige Quelle elektromagnetischer Strahlung eingesetzt werden, beispielsweise auch ein fasergekoppelter, breitbandiger Weißlichtlaser, wobei hier ein steuerbarer Monochromator nachgeordnet ist, um die Wellenlänge durchzustimmen. Furthermore, a spectrally broadband source of electromagnetic radiation can be used, for example, a fiber-coupled, broad-band white-light laser, a controllable monochromator is followed here to tune the wavelength.
  • Merkmal 2. Weiterhin wird vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren das Licht im Objektraum räumlich strukturiert, in dem mittels mehrerer Mikroblenden oder einer mittels mehrerer Mikrolinsen mehrfach abgebildete Makroblende ein Foki-Muster oder ein Fokuslinien-Muster im Objektraum vorbestimmt gebildet werden, und dabei im Beleuchtungsstrahlengang eine chromatische Tiefenaufspaltung dieser Foki oder Fokuslinien mittels zumindest partiell chromatischer Brechkraft durchgeführt wird, so dass diese Foki oder Fokuslinien in Lichtausbreitungsrichtung, also in der Tiefe, separiert sind. Characteristic 2. Further, it is preferably structured spatially in the inventive method, the light in the object space, in which a focuses pattern or a focus line pattern in the object space to be formed is predetermined by a plurality of micro-apertures or a macro aperture repeatedly imaged by a plurality of microlenses, and thereby the illumination beam path a chromatic depth splitting these foci or focal lines is performed by means of at least partially chromatic refractive power, so that these foci or focal lines in the light propagation direction, so in depth, are separated. Dabei sind die zumindest partiell chromatische Brechkraft im Beleuchtungs- und die zumindest partiell chromatische Brechkraft im Detektionsstrahlengang so vorbestimmt eingebracht, dass im Objektraum der Betrag und die Richtung der chromatischen Tiefenaufspaltung der Foki oder der Fokuslinien zur Beleuchtung und im Detektionsstrahlengang der Betrag und die Richtung der chromatischen Tiefenaufspaltung der rückabgebildeten Mikroblenden oder der mehrfach abgebildeten Makroblende zumindest näherungsweise gleichgemacht sind. The at least partially chromatic refractive power in the illumination and the at least partially chromatic refractive power in the detection beam path are predetermined so placed that the amount and direction of the chromatic depth resolution of the foci or the focal lines for the illumination and detection beam path of the magnitude and the direction of the chromatic in the object space depth splitting the rückabgebildeten micro aperture or aperture of the macro repeatedly illustrated are at least approximately equal made. Dann sind im Objektraum die Bilder A' der Mittelpunkte A der Blenden BA des Beleuchtungsstrahlenganges oder die Bilder A' der Foki A und die Bilder B' der Mittelpunkte B der Blenden BB des Detektionsstrahlenganges, welche jeweils lateral und spektral korrespondieren, nämlich beispielsweise A'o_λmin-B'o_λmin und A'o_λmax-B'o_λmax, optisch konjugiert. Then, in the object space, the images A 'of the center points A of the diaphragm BA of the illumination beam path or the images A' of the foci A and the image B 'of the centers B of the diaphragm BB of the detection beam path, each of which correspond laterally and spectrally, namely for example A'o_λmin -B'o_λmin and A'o_λmax-B'o_λmax, optically conjugate. So fallen deren Schärfeebenen im Objektraum zumindest näherungsweise zusammen. So drop the focal planes in object space along at least approximately. Demzufolge besteht Konfokalität von der Beleuchtung bis zur Detektion, da bei dünnen Phasenobjekten im Objektraum die Bilder A' und B' aller Wellenlängen zusammenfallen, beziehungsweise das Bild A'' unabhängig von der Wellenlänge auch mit dem Mittelpunkt B einer Mikroblende BB im Detektionsstrahlengang zusammenfällt. Accordingly, there is confocality of the illumination to detection, since with thin phase objects in the object space coincide the images A 'and B' of all wavelengths, or the image A '' coincides independent of the wavelength with the center point B of a micro-diaphragm BB in the detection beam path. Durch die konfokale Diskriminierung im Detektionsstrahlengang wird das im Objektraum gegebenenfalls auftretende, probenverursachte Streulicht auf dem Weg zur Kamera stark reduziert. By confocal discrimination in the detection beam path which, if they occur in the object space, rehearse caused scattered light is greatly reduced towards the camera.
  • Weiterhin können bei dem erfinderischen Verfahren zur Vergrößerung des Tiefenmessbereiches über die wellenoptische Schärfentiefe hinaus auch nur zwei monochromatische Quellen elektromagnetischer Strahlung unterschiedlicher Wellenlänge mit Frequenzmodulation eingesetzt werden, so dass das bekannte Heterodyn-Verfahren angewendet werden kann. Furthermore, only two monochromatic sources of electromagnetic radiation of different wavelength are used with frequency modulation in the inventive method for increasing the depth of the measurement range via the optical wave depth addition, so that the known heterodyne method may be applied. Mit der Strahlung einer jeden Wellenlänge wird das Objekt in einer etwas anderen Tiefe abgetastet. With the radiation of each wavelength, the object is scanned in a slightly different depth.
  • Merkmal 3. Weiterhin kommt vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie das Verfahren der Dunkelfeldmikroskopie zur Anwendung. Feature 3. Further preferably, the method takes the darkfield microscopy in the inventive method for transmitted light microscopy for the application. Damit werden nur dünne durchscheinende Objekte oder Objektdetails von der Kamera erfasst, die das Licht auch streuen oder beugen und sich außerdem auch noch zumindest näherungsweise in der Schärfeebene einer rückabgebildeten Blende zur konfokalen Diskriminierung befinden, wobei die Schärfeebene eine von Licht einer vorbestimmten Wellenlänge des Spektrums der polychromatischen Lichtquelle oder der Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle ist. Thus, only thin translucent objects or object details are captured by the camera, which also scatter or diffract light and may also be made at least approximately located in the focal plane of a rückabgebildeten aperture for confocal discrimination, wherein the focal plane a light of a predetermined wavelength of the spectrum of the is polychromatic light source or the wavelength-tunable light source. Objekte, die nicht das Licht streuen oder beugen, bleiben dunkel, da das direkt transmittierte Licht Bekannterweise hierbei nicht erfasst wird. Objects that do not scatter light or bend, remain dark, as the directly transmitted light is known, not covered here. So kann in Abhängigkeit von der Intensität im Spektrum die Position eines Objektpunktes bestimmt werden, indem die Wellenlängenposition des Maximums der Intensität bestimmt wird und aus dieser die Tiefenposition. Thus, depending on the intensity in the spectrum of the position of an object point may be determined by the wavelength position of the maximum of intensity is determined and from this the depth position. Dazu ist jedoch eine Wellenlängen-Tiefenpositions-Referenzierung des Dunkelfeldmikroskops erforderlich, wobei der Messbereich durch den Grad der chromatischen Tiefenaufspaltung vorgegeben ist, der aus dem Betrag der chromatischen Brechkraft resultiert. For this purpose, however, a wavelength deep position referencing of the dark-field microscope is required, wherein the measurement area is determined by the degree of the chromatic depth splitting resulting from the amount of chromatic refractive power. Die optische Dickendifferenz eines dünnen, durchscheinenden Objekts, welches sich aus der Differenz der Brechungsindizes zum umgebenden Medium ergibt, wobei das umgebende Medium beispielsweise bei biologischen Objekten Wasser sein kann, sollte dabei nur so groß sein, das sich dadurch keine wesentlich größere optische Weglängenänderung als die wellenoptische Schärfentiefe ergibt, da dies zu einer Kontrastverschlechterung bei der Abbildung streuender oder beugender Objekte führen kann. The optical thickness difference of a thin, translucent object, which results from the difference of the refractive indices of the surrounding medium, the surrounding medium may be, for example, in biological objects water, should it be so large, that this causes no much larger optical path length than the wave-optical depth of field results, as this may lead to a deterioration in contrast when imaging scattering or diffracting objects. Anderenfalls kann hier vorzugsweise auch eine objektbezogene Anpassung des Abstandes von Kondensor und Objektiv, also eine axiale Verschiebung derselben, Abhilfe schaffen, welche die optische Dickendifferenz zwischen Objekt und Umgebungsmedium ausgleicht und somit wieder eine scharfe Objektanpassung ermöglicht. Otherwise also an object-related adjustment of the distance of the condenser lens and, therefore, an axial displacement may create the same, remedies that compensates the optical thickness difference between the object and the surrounding medium, and thus again allows a sharp object adjustment here preferably. Es ist aber auch möglich, die Mikroblenden im Beleuchtungsstrahlengang oder Mikroblenden im Detektionsstrahlengang axial, also in der Tiefe, zu verschieben, um die bei dickeren Phasenobjekten gestörte Konfokalität wieder herzustellen. However, it is also possible for the micro-shutters in the illumination beam path or micro apertures in the detection beam path axially, that is to move in the depth, to produce the disordered phase for thicker objects confocality again. Bei vergleichsweise dicken Phasenobjekten, wobei hier „dick" auf die wellenoptische Schärfentiefe der mikroskopischen Abbildung bezogen ist und hierbei in der Regel ein Mehrfaches derselben vorausgesetzt ist, kann durch die axiale Verschiebung von Komponenten zur Anpassung an die optische Dicke, nur das Streulicht aus dem dicken Objekt die konfokale Diskriminierung überwinden, so dass das Objekt eine höhere Intensität als das objektfreie Umfeld zur Abbildung bringt. At comparatively thick phase objects, which here is "thick" with respect to the wave-optical depth of field of the microscope image, and in this case a multiple of the same is generally required, by the axial displacement of the components to adapt to the optical thickness, only the scattered light from the thick object overcome the confocal discrimination, so that the object brings a higher intensity than the object-free environment for imaging.
  • Die Dunkelfeldmikroskopie wird zwar vor allem für die visuelle Beobachtung eingesetzt. The darkfield microscopy is indeed primarily used for visual observation. Jedoch kann bei dem erfinderischen Verfahren über der Wellenzahl beispielsweise ein Extremum bestimmt werden, wodurch auch quantitative Aussagen über das Objekt möglich sind. However, in the inventive process over the wave number, for example, an extreme value can be determined, whereby quantitative information about the object are possible.
  • Merkmal 4. Weiterhin kommt vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie das Verfahren der Phasenmikroskopie auf der Basis der Interferenz von elektromagnetischen Wellen zur Anwendung. Feature 4. Further preferably, the method takes the phase microscopy based on the interference of electromagnetic waves for use in the inventive method for transmitted light microscopy. Dies ermöglicht eine besonders hohe Auflösung und fotometrische Sensitivität bei der Vermessung von Objekten. This allows a particularly high resolution and photometric sensitivity in the measurement of objects.
  • Merkmal 5: Weiterhin kommt vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchficht-Mikroskopie mit chromatischer Tiefenaufspaltung das Phasenkontrast-Verfahren, insbesondere auch das nach F. Zernike, das differentielle Phasenkontrast-Verfahren, insbesondere auch das nach G. Nomarski, auch als DIC-Verfahren (DIC: Differential interference contrast) bezeichnet, also Verfahren auf der Basis polarisations-optischer Shear-Interferometrie, das Hoffinann-HMC-Verfahren (HMC: Hoffinann modulation contrast) oder auch ein phasenmikroskopisches Verfahren nach dem Zweistrahl-Interferenz-Verfahren, insbesondere auch auf der Basis eines Mach-Zehnder-Interferometers, zur Anwendung. Feature 5: Further is preferably used in the inventive method for performing Ficht microscopy chromatic depth splitting the phase contrast method, in particular also according to F. Zernike, the differential phase contrast method, in particular the (by G. Nomarski, as DIC procedure DIC: differential interference Contrast) denotes, ie method based on polarization-optical shear interferometry, which Hoffmann-HMC-method (HMC: Hoffmann Modulation Contrast) or a phase microscopic method according to the two-beam interference method, in particular also on the based on a Mach-Zehnder interferometer used. Dies sind eingeführte mikroskopische Verfahren, die durch die Anwendung der Erfindung für eine noch schnellere Objekterfassung, insbesondere auch zur hochgenauen Objektvermessung, genutzt werden können. These are introduced microscopic techniques that can be used by the application of the invention for even faster object detection, especially for high-precision object measurement.
  • Merkmal 6: Weiterhin wird vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie ein optischer Gangunterschied OPD (OPD: optical path difference) im Strahlengang eines Phasen-Mikroskops eingeführt, der mindestens eine Wellenlänge der maximalen, detektierten Wellenlänge beträgt, vorzugsweise jedoch bis zu 100 Wellenlängen der maximalen, detektierten Wellenlänge. Feature 6: (: optical path difference OPD) introduced in the beam path of a phase microscope that is at least a wavelength of the maximum detected wavelength, but preferably up to 100 wavelengths Further preferably, in the inventive process for the transmitted-light microscopy, an optical path difference OPD is the maximum detected wavelength. So werden Interferenzstreifen, insbesondere auch in Form eines Wavelets, auch als Müllersche Streifen oder Tolansky-Streifen bekannt, also Intensitätsverläufe über der Wellenlänge λ oder der Wellenzahl k, im detektierten Spektralbereich vorbestimmt gebildet. Thus, interference fringes, especially in the form of a wavelet, as Mullerian strip or strips Tolansky known, so intensity characteristics on the wavelength λ or wavenumber k, formed in the detected spectral range predetermined. Dabei erzeugt ein dünnes und lateral kleines Phasenobjekt – beispielsweise in der Größenordnung der Ausdehnung des beugungsbegrenzten Punktbildes des Mikroskops – erfindungsgemäß eine lokale Phasenänderung in den Interferenzstreifen, also auch insbesondere in einem Wavelet. Thereby producing a thin and small lateral phase object - for example in the order of the expansion of the diffraction limited spot image of the microscope - according to the invention a local phase change in the interference fringe, including in particular in a wavelet. Diese lokale Phasenänderung wird ausgewertet. This local phase change is evaluated. Ein lateral ausgedehntes Phasenobjekt, welches das Messfeld vollständig überdeckt, erzeugt eine Änderung der Frequenz im Interferenzmuster, also insbesondere auch in einem Wavelet, die über der Wellenzahl k zu einem veränderten Anstieg der Phase, also des Phasengradienten dϕ/dk führt. A laterally extensive phase object, which completely covers the measurement field, produces a change in frequency in the interference pattern, that is in particular also in a wavelet which dφ over the wave number k to a change in increase of the phase, ie the phase gradient / dk leads.
  • Insbesondere auch beim Nomarski-DIC-Verfahren können aufgrund der chromatischen Tiefenaufspaltung Zusatzinformationen gewonnen werden, indem beispielsweise über der Wellenzahl k ein Extremum bestimmt werden kann, wenn vorzugsweise ein hinreichend großer optischer Gangunterschied im DIC-Mikroskop mit polarisations-optischer Shear gegeben ist. In particular, when the Nomarski DIC process, additional information can be obtained due to the chromatic depth splitting by an extremum can be determined, for example, over the wave number k, when a sufficiently large optical path difference in the DIC microscope is preferably added with polarization-optical Shear. Vorzugsweise kann dabei auch eine vergleichsweise dicke Verzögerungsplatte im DIC-Mikroskop verwendet werden, welche vorzugsweise einen optischen Gangunterschied zwischen den beiden Polarisationsrichtungen in der Größenordnung von 100 Wellenlängen der größten genutzten Wellenlänge aufweist, um die Genauigkeit der Phasenauswertestrategien zu erhöhen. Preferably, also a comparatively thick retardation plate can be used in the DIC microscope, which preferably has an optical path difference between the two polarization directions in the order of 100 wavelengths of the longest wavelength used in order to increase the accuracy of the Phasenauswertestrategien.
  • Weiterhin ist es möglich, ein unterschiedlich in beiden Polarisations-Richtungen, die Phase schiebendes LCD im DIC-Mikroskop einzusetzen, um den optischen Gangunterschied in Sublambda-Schritten für das Phasenschiebeverfahren vorbestimmt variieren zu können. Furthermore, it is possible to use a differently-shifting in the two polarization directions, the phase in the LCD DIC microscope, to vary the optical path difference in Sublambda steps predetermined for the phase shift method.
  • Der optische Gangunterschied kann im Interferometer so eingestellt werden, dass die Interferenzstreifen über der Wellenlänge, insbesondere auch in Form eines Wavelet, mittels eines Spektrometers detektiert werden können. The optical path difference can be set in the interferometer so that the interference fringes can be detected via the wavelength, in particular in the form of a wavelet, by means of a spectrometer. Vorzugsweise kann dabei also ein optischer Gangunterschied von mehreren zehn bis zu einigen Hundert Wellenlängen der größten verwendeten Wellenlänge eingestellt werden, wobei hier bei einer Applikation im nahen Infrarotbereich vorzugsweise ein Wellenlängenbereich von etwa 150 nm ausgewertet wird. Preferably, therefore, an optical path difference of several tens can be set to a few hundred wavelengths of the largest wavelength used, preferably with a wavelength range of about 150 nm is evaluated here for an application in the near infrared region. Dabei ist für genaue Messungen eine Referenzierung der Wellenzahl über der Tiefe notwendig. While referencing the wave number versus depth for accurate measurement is necessary.
  • Vorzugsweise kann in einem Mikroskop auf der Basis des Phasenkontrast-Verfahrens nach F. Zernike ein in Bezug auf die Lichtwellenlänge vergleichsweise dicker Phasenring eingebracht sein, der also einen optischen Gangunterschied von mehreren Wellenlängen einführt, vorzugsweise in der Größenordnung von 100 Wellenlängen der größten genutzten Wellenlänge. Preferably, in a microscope based on the phase contrast method by F. Zernike a be introduced with respect to the wavelength of light relatively thicker phase ring, that introduces an optical path difference of a plurality of wavelengths, preferably in the order of 100 wavelengths of the longest wavelength in use. So können Zusatzinformationen gewonnen werden, indem bei lichtstreuenden Objekten eine Phasenvariation über der Wellenzahl – gegebenenfalls auch in Verbindung mit einer Intensitätsvariation – in einem Interferenzmuster ausgewertet werden kann. Thus, additional information can be obtained by a phase variation on the wave number at light-scattering objects - possibly in conjunction with an intensity variation - can be evaluated in an interference pattern.
  • Im erfinderischen Verfahren markieren sich lateral kleine und dünne Phasenobjekte durch lokale Phasenänderungen in den Interferenzstreifen über der Wellenlänge λ oder der Wellenzahl k, insbesondere auch in Form eines Wavelets, in Abhängigkeit von der optischen Dicke des oder der Phasenobjekte und auch in Abhängigkeit von deren Tiefenposition sowie also auch in Abhängigkeit von deren lateraler Ausdehnung. In the inventive method is small and thin phase objects Mark laterally by local phase changes in the interference fringes on the wavelength λ or the wave number k, in particular also in the form of a wavelet, depending on the optical thickness of the or phase objects, and also depending on its depth position, and so also, depending on their lateral extent. Der nutzbare Tiefenbereich Δz_c ist auch durch die Größe der chromatischen Tiefenaufspaltung im Abbildungsstrahlengang für die Objektbündel gegeben. The usable depth range Δz_c is given by the size of the chromatic depth splitting the imaging beam path of the object beam.
  • Die Gewinnung der Messgröße, beispielsweise die optische Dicke des Objekts in einer bestimmten Objekttiefe, kann mittels der Auswertung der Interferenzstreifen, die auch als Müllersche Streifen bezeichnet werden, erfolgen. The recovery of the measured parameter, for example the optical thickness of the object in a particular object depth, can be carried out by means of the evaluation of the interference fringes which are also referred to as Mullerian strip. Dazu kann beispielsweise der Nulldurchgang der ersten Ableitung dϕ/dk der Phasenkurve ϕ(k) hochgenau ausgewertet werden. For this purpose the zero crossing of the first derivative of the phase trajectory φ (k), for example, dφ / dk be evaluated highly accurately.
  • Die Art und Weise der Auswertung der Intensität des Interferenzmusters über der Wellenlänge, beziehungsweise der Phase ϕ über der Wellenzahl k, um eine Messgröße – wie beispielsweise eine Information über eine Änderung der optischen Dicke oder der optischen Dicken des Objekts – zu erhalten, ist in dieser Schrift kein erfinderischer Gegenstand. The manner of the evaluation of the intensity of the interference pattern on the wavelength, or the phase φ on the wave number k, a measurement variable - for example, information about a change in optical thickness or the optical thickness of the object - to obtain, in this font no inventive subject matter.
  • Weiterhin können bei einem Wellenlängen-Scan mittels einer Wellenlängendurchstimmbaren, monochromatischen Strahlungsquelle elektromagnetische Interferenzmodulationen über der Zeit erzeugt werden, die durch die Größe des im Interferometer eingestellten Gangunterschiedes und die Geschwindigkeit des Wellenlängen-Scans eine technisch gut auswertbare Frequenz aufweisen. Furthermore, electromagnetic interference modulations may be generated over time at a wavelength scanning by means of a wavelength tunable monochromatic radiation source which have by the size of the set in the interferometer path difference and the speed of wavelength scan a technically easily evaluable frequency.
  • Bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie ist es vorteilhaft, bei der mikroskopischen Objektabbildung die sphärische Aberration, also den Öffnungsfehler, hinreichend gut zu korrigieren, so dass eine zumindest näherungsweise beugungsbegrenzte Abbildung erfolgen kann. In the inventive method for transmitted-light microscopy it is advantageous in the microscopic object image, the spherical aberration, so to correct sufficiently good, so that an at least approximately diffraction limited can be carried out the opening error.
  • Merkmal 7: Weiterhin wird vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie die Phase der Interferenz, also insbesondere auch die in einem Wavelet gegebene Phase, ausgewertet. Feature 7: Further, the phase of the interference, thus in particular also in a given wavelet phase preferably evaluated in the inventive process for the transmitted-light microscopy. Dadurch kann eine Auflösung in axialer Richtung in der Größe von wenigen Nanometern erreicht werden, wobei dies stark von der Form des Interferenzmusters, also insbesondere auch eines Wavelets, sowie auch der Auswertestrategie abhängt. Can thereby be achieved in the size of a few nanometers is a resolution in the axial direction, this being strongly dependent on the shape of the interference pattern, so in particular a wavelet, as well as the evaluation strategy. Dabei ist es auch möglich, dass eine mehrfache Phasenschiebung im Interferometer durchgeführt wird, um auch bei sehr dünnen Phasenobjekten noch sehr kleine Abweichungen von der zumindest näherungsweise geraden Phasenkurve detektieren zu können, wobei hier eine kleine lokale Abweichungen der Phase ϕ – im Sinne einer lokalen Störung des Phasenverlaufs ϕ(k), vorzugsweise mit einem lokalen Extremum – ja die Existenz eines Phasenobjektes anzeigt. It is also possible that a multiple phase shift is performed in the interferometer to even with very thin phase objects still to be able to detect very small deviations from the at least approximately straight phase curve, in which case φ a small local deviations in the phase - in the sense of a local disturbance the phase profile φ (k), preferably to a local extremum - yes indicating the existence of a phase object.
  • Merkmal 8: Weiterhin wird vorzugsweise bei dem erfinderischen Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie der optische Gangunterschied im Unendlich-Strahlengang oder im chromatisch schwach fokussierten Strahlengang der mikroskopischen Abbildung eingebracht. Feature 8: Further, it is preferably introduced in the inventive process for the transmitted-light microscopy of the optical path difference in the infinite beam or chromatic weakly focused beam path of the microscope image. So werden Abbildungsfehler wie die sphärische Aberration minimiert oder weitgehend vermieden. So aberrations are minimized as the spherical aberration or largely avoided.
  • Das Verfahren der chromatischen Tiefenaufspaltung und Kompensation derselben in Verbindung mit konfokaler Diskriminierung ist für alle interferometrischen Verfahren einsetzbar, einschließlich in der digitalen Holografie in der mikroskopischen Skala. The process of the chromatic depth splitting and compensation thereof in conjunction with confocal discrimination is applicable for all interferometric methods, including in digital holography in the microscopic scale.
  • Weiterhin kann es vorteilhaft kann sein, den Grad der Tiefenaufspaltung an das Messobjekt anzupassen, um dickere und auch dünnere Phasenobjekte jeweils optimal erfassen zu können. Furthermore, it may be advantageous may adjust the amount of depth splitting to the DUT to capture thicker and thinner phase objects each optimally.
  • Merkmal 9: Bei einer erfinderischen Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere auch mit Kondensor und Objektiv und insbesondere auch zur quantitativen Prüfung von einem Mikroobjekt im Objektraum, mit einer polychromatischen Lichtquelle im Beleuchtungsstrahlengang und mit einem Spektrometer im Detektionsstrahlengang oder einer Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle im Beleuchtungsstrahlengang, mit Mitteln zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang, wie mehrere Mikroblenden, vorzugsweise ein Mikroblenden-Array, oder eine mittels mehrerer Mikrolinsen mehrfach abgebildete Makroblende sowie einer Kamera im Detektionsstrahlengang sind Mittel mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung im Detektionsstrahlengang angeordnet. Feature 9: In an inventive arrangement for transmitted light microscopy, in particular with condenser and objective and in particular also for the quantitative testing of a micro-object in the object space, with a polychromatic light source in the illumination beam path and with a spectrometer in the detection beam path or a wavelength-tunable light source in the illumination beam path , having means for confocal discrimination at the detection beam path, such as a plurality of micro aperture, preferably a micro-shutter array or macro-aperture repeatedly imaged by a plurality of micro lenses and a camera in the detection beam path means having at least partially chromatic power to the chromatic depth splitting the detection beam path are arranged. Diese Mittel ermöglichen eine scharfe Abbildung von Objekten oder Objektdetails aus unterschiedlichen Tiefen des Objektraumes gleichzeitig, wodurch mittels einer spektralen Analyse des Lichts mehr Informationen im Vergleich zu einem mechanisch durchgeführten Tiefen-Scan gewonnen werden sollen. These means allow a sharp image of objects or object details from different depths of the object space at the same time, which are to be obtained more information compared to a mechanically carried out depth scanning by means of a spectral analysis of light. Die konfokale Diskriminierung verringert sehr stark das Streulicht bei der optischen Abbildung, welches bei lichtstreuenden Proben wie biologischen Geweben oder partiell trüben Medien auftritt. The confocal discrimination greatly reduces the stray light in the optical imaging that occurs in light-scattering samples, such as biological tissues or partially turbid media.
  • Merkmal 10: Weiterhin sind vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie die Mittel mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung in der Fourier-Ebene, also der rückwärtigen Brennebene des Objektivs, oder in einer zu dieser optisch konjugierten Ebene angeordnet. Feature 10: Furthermore, the medium comprising at least partially chromatic power to the chromatic depth splitting in the Fourier plane, so the rear focal plane of the lens, or in this optically conjugate plane are preferably disposed in the inventive arrangement for transmitted light microscopy. Dadurch wird erreicht, dass der Abbildungsmaßstab bei der Detektion unabhängig von der Wellenlänge ist. It is thereby achieved that the imaging scale in the detection is independent of the wavelength.
  • Merkmal 11: Weiterhin sind vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie Mittel mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet. Characteristic 11: Further are preferably arranged in the inventive arrangement for transmitted light microscopy means to at least partially chromatic power to the chromatic depth splitting the illumination beam path. Weiterhin sind vorzugsweise Mittel zur strukturierten Beleuchtung des Objektraumes angeordnet. Further preferably, means for structured illumination of the object space are arranged. Mit diesen wird strukturiertes Licht, beispielsweise in Form einen Foki-Musters mit äquidistanten Fokusabständen, also eines Arrays von Lichtpunkten, erzeugt, wodurch sich das Streulicht bei der Abbildung des Objekts wesentlich reduzieren kann, da nur der Bereich des Objekts fokussiert beleuchtet wird, der auch detektiert wird. With these is structured light, for example in the form of a foci pattern with equidistant focus intervals, so generating an array of light spots, whereby the stray light can be significantly reduced in the imaging of the object, there is illuminated focused only the area of ​​the object, and is detected. Dabei kann das Array von Lichtpunkten flächig, beispielsweise wie in Here, the array of light spots can surface, for example as in DE 10 2006 007 172 A1 DE 10 2006 007 172 A1 dargestellt, ausgebildet sein, wobei zur spektralen Detektion in dieser Anordnung eine hochpixlige Kamera eingesetzt wird. be shown, is formed, wherein a hochpixlige camera is used for spectral detection in this arrangement. Es können beispielsweise 64 × 64 Objektpunkte gleichzeitig spektral analysiert werden. It can be analyzed 64 object points simultaneously spectrally for example, 64 ×.
  • Merkmal 12: Weiterhin sind vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie Mittel mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung in der Fourier-Ebene, also der rückwärtigen Brennebene des Kondensors, oder in einer zu dieser optisch konjugierten Ebene angeordnet. Characteristic 12: Further, preferably the inventive arrangement for transmitted light microscopy means to at least partially chromatic power to the chromatic depth splitting in the Fourier plane, which is the back focal plane of the condenser, or arranged in a to these optically conjugate plane. Dadurch wird erreicht, dass der Abbildungsmaßstab bei der Beleuchtung unabhängig von der Wellenlänge ist. It is thereby achieved that the imaging scale in the illumination is independent of the wavelength.
  • Merkmal 13: Weiterhin ist vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie bei der Anwendung eines Nomarski-DIC-Mikroskops mit zwei Wollastonprismen ein optischer, doppelbrechender Verzögerer (Retarder) mit einem optischen Gangunterschied zwischen den beiden Polarisationsrichtungen zur Erzeugung von Interferenz, also Interferenzstreifen über der Wellenlänge λ oder der Wellenzahl k, insbesondere auch mit Interferenzstreifen in Form eines Wavelets, angeordnet. Characteristic 13: Furthermore, it is preferably used in the inventive arrangement for transmitted light microscopy when using a Nomarski DIC microscope with two Wollaston prisms, an optical birefringent retarder (Retarder) having an optical path difference between the two polarization directions for generating interference, ie interference fringes the wavelength λ or wavenumber k, and in particular with the interference fringes in the form of a wavelet is disposed. Dabei beträgt der optische Gangunterschied des doppelbrechenden Verzögerers mindestens eine Wellenlänge der maximalen, detektierten Wellenlänge, wobei der Verzögerer vorzugsweise im Raum zwischen den beiden Wollastonprismen des Nomarski-DIC-Mikroskops angeordnet ist. Here, the optical path difference of the birefringent retarder is at least one wavelength of maximum, the detected wavelength, the retarder is preferably disposed in the space between the two Wollaston prisms of the Nomarski DIC microscope. Die Auslegung des optischen Verzögerers ermöglicht es, die Ortsfrequenz der Interferenzstreifen, insbesondere auch in Form eines Wavelets, so einzustellen, dass diese optimal an die spektrale Auflösung des Spektrometers angepasst ist, so dass eine Auswertung der Streifen noch technisch möglich ist. The design of the optical retarder makes it possible to set the spatial frequency of the interference fringes, especially in the form of a wavelet that it is optimally matched to the spectral resolution of the spectrometer, so that an evaluation of the strip is still technically feasible.
  • Merkmal 14: Weiterhin ist vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie der optische, doppelbrechende Verzögerer in Form einer Kalkspatplatte (calcite plate) ausgebildet. Characteristic 14: Furthermore, it is preferably formed in the inventive arrangement for transmitted light microscopy of the optical, birefringent retarder in the form of a Kalkspatplatte (calcite plate). Dieses Material weist eine besonders hohe Doppelbrechung auf. This material has a particularly high birefringence.
  • Merkmal 15: Weiterhin sind vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie die Mittel mit chromatischer Brechkraft als diffraktiv-optische Elemente (DOEs) ausgebildet. Characteristic 15: Further, preferably the inventive arrangement for transmitted light microscopy, the means having chromatic refractive power as diffractive optical elements (DOEs) are formed. Diese weisen eine hohe chromatische Aufspaltung auf. These have a high chromatic splitting.
  • Merkmal 16: Weiterhin sind vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie die Mittel zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang, wie ein Mikroblenden-Array oder auch ein Mikrolinsen-Array, hochgenau lateral verschiebbar angeordnet. Characteristic 16: Furthermore, the means for confocal discrimination at the detection beam path, such as a micro-shutter array or a microlens array are preferably highly accurately arranged laterally displaceable in the inventive arrangement for transmitted light microscopy. So kann mittels Lateral-Scan der Mittel zur konfokalen Diskriminierung eine lückenlose laterale Abtastung eines zumindest teilweise transparenten Objekts erfolgen. Thus, a complete lateral scanning of an at least partially transparent object can be performed by lateral scanning of the means for confocal discrimination.
  • Merkmal 17: Weiterhin sind vorzugsweise bei der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie die Mittel zur Strukturierung des Lichts im Beleuchtungsstrahlengang, wie ein Mikroblenden-Array oder auch ein Mikrolinsen-Array, hochgenau lateral verschiebbar angeordnet. Characteristic 17: Further, preferably the inventive arrangement for transmitted light microscopy, the means for patterning the light in the illumination beam path, such as a micro-shutter array or a microlens array, highly accurately arranged laterally displaceable. Diese Mittel werden synchron mit den Mittel zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang verschoben, so dass die laterale Zuordnung der Bilder derselben im Objektraum bei der Verschiebung und bei der Bildaufnahme mittels Kamera stets erhalten bleibt. These means are moved in synchronism with the means for confocal discrimination at the detection beam path, so that the lateral assignment of the images is always maintained in the object space during the displacement and during the image capture by camera thereof. Dabei ist es vorzugsweise auch möglich, dass durch eine Faltung des optischen Strahlenganges die Mittel zur Strukturierung des Lichts im Beleuchtungsstrahlengang und die Mittel zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang starr gekoppelt werden, wobei auch der Abbildungsmaßstab im Beleuchtungs- und im Detektionsstrahlengang gleich gemacht ist, so dass nur ein einziges mechanisches Scan-System zur lateralen Verschiebung derselben Mittel notwendig ist. It is preferably also possible that the means for patterning the light in the illumination beam path and the means for confocal discrimination at the detection beam path are rigidly coupled by a convolution of the optical beam path, whereby the magnification in the illumination and the detection beam path is made the same so that a single mechanical scan system for lateral displacement thereof agent is necessary.
  • Merkmal 18: Für Applikationen in der biologischen Forschung kann die optische Kopplung der erfinderischen Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie, also vorzugsweise ein quantitatives Phasenmikroskop, mit einer optischen, rechnergesteuerten Pinzette durchgeführt werden. Characteristic 18: For applications in biological research, the optical coupling of the inventive arrangement for transmitted-light microscopy, ie preferably a quantitative phase microscope can be carried out with an optical, computer-controlled forceps. So können insbesondere auch lebende Zellen im Objektraum eines Phasenmikroskops vorbestimmt und hochpräzise bewegt werden. Thus, in particular living cells predetermined in the object space of a phase microscope and high-precision moves. Dabei kann mittels Phasenmikroskops eine Zelle hinsichtlich ihrer optischen Dicke oder ihrer optischen Dicken vermessen werden. In this case, a cell can be measured in terms of their optical thickness of their optical thicknesses or by means of phase microscope. Insbesondere kann auch die laterale Variation der optischen Dicke einer Zelle bestimmt werden. In particular, the lateral variation of the optical thickness of a cell can be determined. Außerdem ist eine Positionsbestimmung und Mikroformbestimmung von Zellen mit Hilfe einer optischen Pinzette möglich, indem beispielsweise ausgewählte Zellen in das Messvolumen zum Vermessen transportiert werden. In addition, a position determination and microform determination of cells by means of optical tweezers is possible by, for example, selected cells are transported to the measurement in the measurement volume.
  • Weitere erfinderische Merkmale: Additional inventive features:
  • Es kann beim Mach-Zehnder-Interferometer auf der Basis der erfinderischen Anordnung eine Phasen-Schiebung mittels mechanischem Scan im Referenzarm durchgeführt werden. It can be carried out by means of mechanical scanning in the reference arm in the Mach-Zehnder interferometer on the basis of the inventive arrangement, a phase shift. Insbesondere ist bei sehr schwachen Signalen aufgrund einer hohen und stark lichtschwächenden Objektdichte dadurch eine Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses erreichbar. Particularly to an improvement of the signal-to-noise ratio is with very weak signals due to a high and strong light debilitating object density thereby attainable. Diese Phasen-Schiebung kann mittels mechanischem Scan an einem Winkelspiegel, aber auch mittels eines Phase-mostly-LCDs durchgeführt werden. This phase shift can be performed by means of mechanical scanning at an angle mirror, but also by means of a phase-mostly LCD. Dieses LCD befindet sich dann vorzugsweise in einer Zwischenbildebene ZBE im Referenzstrahlengang. This LCD is then preferably at an intermediate image plane DBE in the reference beam path. Es ist aber auch möglich, durch Amplitudenteilung Interferenzen über der Wellenlänge λ in verschiedener Phasenlage gleichzeitig auf einem Detektor aufzunehmen. However, it is also possible to record by amplitude division interference to the wavelength λ in different phase position at the same time on a detector. Dies kann vorzugsweise auch unter Nutzung des zweiten Ausganges des Mach-Zehnder-Interferometers erfolgen. This can be done preferably also using the second output of the Mach-Zehnder interferometer.
  • Die zu messenden Phasenobjekte sollten bei der erfinderischen Anordnung im Messvolumen eher vereinzelt angeordnet sein, können aber auch gegebenenfalls übereinander liegen, wenn die partielle Transmission einer Kugelwelle zu einem Objektpunkt im Messvolumen immer noch gegeben ist, ohne dass die Beleuchtungsapertur wesentlich verringert wird. To be measured phase objects should be arranged more isolated in the inventive arrangement in the measuring volume, but may also optionally overlie each other when the partial transmission of a spherical wave is still added to an object point in the measurement volume, without requiring the illumination is substantially reduced. Anderenfalls wird die Auswertung sehr viel schwieriger oder ist gar nicht mehr möglich. Otherwise, the evaluation is much more difficult or even impossible.
  • Weiterhin ist es möglich, mittels der erfinderischen Anordnung zusätzlich auch noch spektrale Informationen, beispielsweise im IR-Fluoreszenzlicht zur Stoffwechsel-Analyse lebender Zellen zu gewinnen, wobei dazu ein zusätzlicher Auskoppelstrahlengang in der Anordnung verwendet wird. Furthermore, it is possible by means of the inventive arrangement additionally also spectral information, for example in the IR fluorescence light for metabolic analysis of living cells to gain, for which purpose an additional Auskoppelstrahlengang is used in the assembly. Außerdem kann die NIR-Fourier-Transform-Spektroskopie oder die dispersive Spektroskopie zur Gewinnung weiterer Informationen mit der Durchlicht-Mikroskopie verbunden werden, indem dazu Licht aus dem Objektstrahlengang ausgekoppelt wird. Moreover, the NIR Fourier Transform spectroscopy or dispersive spectroscopy can be connected to obtain further information with the transmitted-light microscopy, by directing light to be coupled out from the object beam path.
  • Es kann für biologische Objekte in Wasser-Immersions-Technik im optischen System eine Numerische Apertur von über 1 realisiert werden. There may be a numerical aperture of about 1 be realized for biological objects in water-immersion technique in the optical system. Auch für technische Objekte in Öl-Immersions-Technik kann im optischen System eine Numerische Apertur von über 1 realisiert werden. Also, for technical objects in oil-immersion technique in the optical system has a numerical aperture of more than 1 can be realized. Bei dicken Proben, wobei dick hier beschreibt, wenn die axiale Bildverschiebung die Größenordnung der mittleren Lichtwellenlänge oder mehr erreicht, muss deshalb wegen der wellenoptischen Schärfentiefe, die bei hoher Numerischer Apertur gering ist, gegebenenfalls eine axiale Nachjustierung an einem der beiden Mikroskopobjektive zur Abstandsanpassung erfolgen, damit die Konfokalität im optischen System erhalten bleibt. For thick samples, said thick here describes, when the axial image displacement reaches the order of the average light wavelength or more, must therefore be due to the wave-optical depth of field, which is low at a high numerical aperture, optionally carried out an axial readjustment of one of the two microscope objectives for distance adjustment, thus the confocality remains in the optical system. Es kann dann bereits ein Öffnungsfehler bei der Abbildung auftreten, der jedoch durch ein adaptives optisches System behoben werden kann. It may be a spherical aberration in the imaging then occur already, but which can be overcome by an adaptive optical system.
  • Weiterhin ist erfindungsgemäß bei einem erfindungsgemäßen Durchlichtmikroskop mit chromatischer Tiefenaufspaltung vorzugsweise der Kondensor mittels einer GRIN-Linse ausgebildet. Further preferably, the condenser according to the invention is formed by a GRIN lens according to the invention in a transmitted light microscope with chromatic depth splitting. Weiterhin ist erfindungsgemäß bei einem erfindungsgemäßen Durchlichtmikroskop mit chromatischer Tiefenaufspaltung vorzugsweise das Objektiv mittels einer GRIN-Linse ausgebildet. Furthermore, the lens is formed according to the invention by means of a GRIN lens according to the invention in a transmitted light microscope with chromatic depth splitting preferably. Dies führt jeweils zu einer sehr kompakten Anordnung. This in each case results in a very compact arrangement.
  • Weiterhin ist erfindungsgemäß bei einem erfindungsgemäßen Durchlichtmikroskop mit chromatischer Tiefenaufspaltung vorzugsweise eine Kamera mit logarithmischer Kennlinie eingesetzt. Furthermore, a camera according to the invention is used with a logarithmic characteristic in a transmitted light microscope according to the invention with chromatic depth splitting preferably. Mit dieser ist in der Regel ein wesentlich größerer Helligkeitsbereich auf dem Objekt im Vergleich zu Kameras mit linearer Kennlinie erfassbar. This is usually a much greater range of brightness on the object compared to cameras with linear characteristic can be detected.
  • Weiterhin kann bei einem erfindungsgemäßen Durchlichtmikroskop im Objektstrahlengang vorzugsweise ein System aus einem elektrisch-steuerbaren, diffraktiv-optischen Element und einer elektrisch-steuerbaren Elektrowetting-Linse angeordnet sein, welche die mittlere Brechkraft des diffraktiv-optischen Elements zumindest teilweise kompensiert. Furthermore, in an inventive microscope with transmitted light in the object beam path, a system of an electrically-controllable, diffractive optical element and an electrically-controllable electrowetting lens may be preferably arranged, which compensates for the average refractive power of the diffractive optical element at least partially. Dabei kann der Grad der chromatischen Tiefenaufspaltung mittels diffraktiv-optischen Elements verändert werden, wobei die Nachregelung der Brechkraft der Elektrowetting-Linse die Schärfeebenen und damit die Lage des Tiefenmessbereiches im Objektraum in der gleichen Tiefe hält. The degree of chromatic depth splitting can be changed by diffractive optical element, wherein the adjustment of the refractive power of the electrowetting lens holds the edge planes and thus the position of the low measurement range in the object space at the same depth. So kann eine optimale Anpassung des optischen Systems erreicht werden. So an optimal adjustment of the optical system can be achieved. Dies ist kann bei einer Anordnung mit Immersionsflüssigkeit im Objektraum vorteilhaft sein. This is may be advantageous in an arrangement with immersion liquid in the object space.
  • Weiterhin kann dem Detektor oder der Kamera des erfindungsgemäßen Durchlicht-Mikroskops vorzugsweise ein weiteres Zweistrahl-Interferometer vorgeordnet sein, mit welchem durch einen Scan des optischen Gangunterschieds in demselben eine spektrale Analyse der interferierenden Strahlung des Zweistrahl-Interferometers erfolgen kann. Furthermore, the detector or the camera of the transmitted-light microscope according to the invention may preferably be arranged upstream of a further two-beam interferometer with which by a scan of the optical path difference can be carried out in the same spectral analysis of the interfering radiation of the two-beam interferometer.
  • Es ist auch möglich, für die Anwendung der Erfindung insbesondere auch ein invertiertes Mikroskop einzusetzen. It is also possible to use for the application of the invention, in particular an inverted microscope.
  • Beschreibung der Figuren DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Die The 1 1 stellt eine Anwendung für ein quantitatives 3D-Durchlicht-Mikroskop für dünne Phasenobjekte auf der Basis eines Mach-Zehnder-Interferometers (MZI) dar, um die optische Dicke oder die Variationen der optische Dicke eines Objekts ortsaufgelöst und hochgenau zu bestimmen. illustrates an application for a quantitative 3D transmitted light microscope for thin phase objects based on a Mach-Zehnder interferometer (MZI) to spatially resolved optical thickness or the variations in the optical thickness of an object and to determine highly accurate. Hierbei ist die Anordnung als chromatisch-konfokales Spektral-Interferometer aufgebaut. Here, the arrangement is designed as a chromatic confocal spectral interferometer. Die Anwendung kann in der biologischen Forschung, beispielsweise zur hoch genauen Bestimmung der optischen Dicken von Zellbestandteilen in der Krebsforschung, in der medizinischen Diagnostik, aber auch für technische Applikationen genutzt werden. The application can be used in biological research, for example, for highly accurate determination of the optical thicknesses of cell components in cancer research, in medical diagnostics, but also for technical applications.
  • Die Lichtquelle The light source 1a 1a ist als fasergekoppelter Weißlichtlaser ausgebildet. is formed as a fiber-coupled laser white light. Das aus der Faser austretende Licht passiert einen Kollimator The light emerging from the fiber light passes through a collimator 2 2 und beleuchtet ein Mikrolinsen-Array and illuminates a microlens array 3 3 , welchem ein Mikroblenden-Array To which a micro-aperture array 4 4 nachgeordnet ist, wobei die Mikroblenden jeweils in der Fokusposition der Mikrolinsen angeordnet sind. is arranged downstream of said micro-apertures are each arranged in the focus position of the microlens. Die The 1a 1a zeigt diesen Sachverhalt für eine Mikroblende BA mit dem Blendenmittelpunkt A, welcher auch einem Fokus entspricht und auch den Ursprung einer Kugelwelle K darstellt. shows this situation for a micro aperture BA with the aperture center point A, which also corresponds to a focus, and also represents the origin of a spherical wave K. Das Mikrolinsen-Array The microlens array 3 3 und das Mikroblenden-Array and the micro-aperture array 4 4 sind miteinander fest verbunden, wobei dieser Baugruppe ein hier nicht dargestellter schneller Präzisons-xy-Scanner zugeordnet ist, der auch eine hochgenaue laterale Startposition aufweist. are firmly connected to each other, this assembly is not shown, a fast associated here Precision dual xy scanner, which also has a highly accurate lateral starting position. Die Kugelwelle K, die hier stellvertretend für eine Vielzahl von Kugelwellen dargestellt ist, wird am Strahlteiler The spherical wave K which is representative shown here for a plurality of spherical waves is at the beam splitter 5 5 in eine Objektwelle und eine Referenzwelle aufgeteilt. divided into an object wave and a reference wave. Die von einer Mikroblende BA vom Mittelpunkt A derselben ausgehende Kugelwelle wird vom Objektiv Which is from a micro aperture BA from the center point A of the same outgoing spherical wave from the lens 6 6 kollimiert, also in eine Planwelle gewandelt, dh der Punkt A wird nach Unendlich abgebildet und passiert dabei ein diffraktiv-optisches Element in Form einer Fresnelschen Zonenlinse collimated, that is converted into a plane wave, that is, the point A is imaged to infinity and passes a diffractive optical element in the form of a Fresnel zone lens 7 7 mit fokussierender Wirkung. having a focusing effect. Diese Zonenlinse This zone lens 7 7 steht zumindest näherungsweise in einer Ebene PE'10, welche zur Pupillenebene PE10 und zur Fourier-Ebene eines nachgeordneten Kondensors is at least approximately in a plane PE'10 which the pupil plane PE10 and the Fourier plane of a downstream condenser 10 10 optisch konjugiert ist. is optically conjugate. Es erfolgt mittels dieser Fresnelschen Zonenlinse It is effected by means of the Fresnel zone lens 7 7 in Abhängigkeit von der Wellenlänge eine unterschiedliche Fokussierung. in dependence on the wavelength, a different focusing. Für die mittlere Wellenlänge λ0 des Spektrums ist die Brechkraft der Fresnelschen Zonenlinse For the central wavelength λ0 of the spectrum, the refractive power of the Fresnel zone lens is 7 7 mittels einer direkt nachgeordneten, schwach refraktiven Zerstreuungslinse by means of a directly downstream, weak refractive diverging lens 8 8th kompensiert, um nur geringe Abweichungen vom Zustand der idealen Kollimation zuzulassen, so dass für die mittlere Wellenlänge λ0 stets nur eine plane oder sehr schwach gekrümmte Wellenfront entsteht. compensated to allow only small deviations from the ideal state of collimation so that λ0 is always produced only one plane or very slightly curved wavefront for the mean wavelength. Die nachfolgende erste Abbildungsstufe The following first imaging stage 9 9 bildet die Fresnelsche Zonenlinse forms the Fresnel zone lens 7 7 in die Fourier-Ebene F10 des Kondensors in the Fourier plane of the condenser F10 10 10 ab, die mit der Pupillenebene PE10 identisch ist, so dass dort sowohl schwach divergierende, zumindest näherungsweise plane, als auch schwach konvergierende Wellen in Abhängigkeit von der Wellenlänge vorhanden sind. from, which is identical to the pupil plane PE10, so that there is both slightly diverging, at least approximately plane, and weakly converging waves as a function of wavelength are provided. So erfolgt mittels der Fresnelschen Zonenlinse So by means of the Fresnel zone lens 7 7 und des Wasser-Immersions-Kondensors and water-immersion condenser 10 10 eine chromatische Tiefenaufspaltung im Objektraum, wodurch Kugelwellen unterschiedlicher Fokussierung je nach Wellenlänge entstehen, deren Zentren in der Tiefe verschoben sind, so dass bei der Abbildung des Punktes A hier die Foki A'o_λmin bis A'o_λmin entstehen. a chromatic depth splitting in the object space, thereby focusing spherical waves of different result depending on the wavelength, the centers of which are shifted in depth so that the foci A'o_λmin arise when imaging the point A here to A'o_λmin. Die rückabgebildeten Bilder B'o_λmin bis B'o_λmin des korrespondieren Punktes B der den Mittelpunkt einer konfokalen Mikroblende BB darstellt, siehe auch The rückabgebildeten images B'o_λmin to B'o_λmin of the corresponding point B represents the center of a confocal microshutter BB, see also 1b 1b , fallen mit den Foki A'o_λmin bis A'o_λmin zusammen. , Coincide with the foci A'o_λmin to A'o_λmin. Der Kondensor the condenser 10 10 kann in der Tiefe und gegebenenfalls auch lateral nachjustiert werden, um die Konfokalität des Durchlicht-Mikroskops präzise sicherzustellen. can be in the depth, and optionally also adjusted laterally to ensure the confocality of the transmitted-light microscope with precision. Ein im Objektraum vorhandenes dünnes Phasenobjekt An existing in the object space-thin phase object 11 11 verändert den optischen Gangunterschied, also verschiebt auch die Phase im MZI. changes the optical path difference, including the phase shifts MZI. Das Phasenobjekt The phase object 11 11 ist aber in der Regel optisch so dünn, dass die Konfokalität des Durchlicht-Mikroskops noch besteht, dh die objektverursachte optische Weglängenänderung noch unterhalb der wellenoptischen Schärfentiefe ist. but is visually so thin that the Confocality of transmitted light microscope still exists, that is, the object caused optical path length is still below the wave-optical depth in the rule. Ein Wasser-Immersions-Objektiv A water-immersion lens 12 12 bildet das Objekt forms the object 11 11 . , Die vom Objektiv The objective of 12 12 erfassten Kugelwellen werden in näherungsweise plane oder schwach fokussiert oder divergierende Wellen gewandelt und treffen auf die zweite Abbildungsstufe detected spherical waves are plane in approximately or slightly focused or converted diverging waves and incident on the second imaging stage 13 13 , welche eine Abbildung auf das diffraktiv-optische Element in Form einer Fresnelschen Zonenlinse Which an image on the diffractive optical element in the form of a Fresnel zone lens 14 14 mit divergierender Wirkung ermöglicht. allows with divergent effect. Diese Fresnelsche Zonenlinse This Fresnel zone lens 14 14 steht zumindest näherungsweise in einer zur Pupillenebene und Fourier-Ebene F'12 konjugierten Ebene des Objektivs is at least approximately in a plane conjugate to the pupil plane and the Fourier plane f'12 plane of the lens 12 12 , also in der Ebene F''12. So in the plane F''12. Der Betrag der Brechkraft dieser Fresnelschen Zonenlinse The amount of power that Fresnel zone lens 14 14 ist für jede Wellenlänge zumindest näherungsweise gleich der Fresnelschen Zonenlinse is for each wavelength at least approximately equal to the Fresnel zone lens 14 14 . , Die nachfolgende, direkt nachgeordnete, schwach refraktive Sammellinse The following, directly downstream, weak refractive converging lens 15 15 kompensiert wieder die mittlere Brechkraft der Fresnelschen Zonenlinse compensated for the average power of the Fresnel zone lens 14 14 . , Im Ergebnis des Passierens der Fresnelschen Zonenlinse As a result of the passage of the Fresnel zone lens 14 14 ist die chromatische Aufspaltung des Beleuchtungsstrahlenganges, also die Tiefenaufspaltung durch die Fresnelschen Zonenlinse is the chromatic splitting the illuminating beam path, so the depth splitting by the Fresnel zone lens 7 7 kompensiert. compensated. Der nachgeordnete Winkelspiegel The downstream angle mirror 16 16 bewirkt die Umlenkung auf das Tubusobjektiv causes the deflection of the tube lens 17 17 mit einer Wellenfront-Inversion. with a wavefront inversion. Nach dem Passieren des Strahlteilers After passing through the beam splitter 18 18 , der hier zur Strahlvereinigung mit den Licht aus dem Referenzstrahlengang dient, entstehen die Foki aller Wellenlängen durch die kompensierende Wirkung der Fresnelschen Zonenlinse Which here is used for beam-combining with the light from the reference beam path, the foci of all wavelengths caused by the compensating effect of the Fresnel zone lens 14 14 zumindest näherungsweise wieder in einer Ebene. at least approximately back in the same plane. In dieser Ebene befindet sich das zweite Mikroblenden-Array This level is the second micro-aperture array 25 25 zur konfokalen Diskriminierung. for confocal discrimination. Die The 1b 1b stellt das Mikroblenden-Array provides the micro-aperture array 25 25 mit der Mikroblende BB dar. with the micro panel is BB.
  • Die in In the 1 1 am Strahlteiler at the beam splitter 5 5 in den Referenzarm des MZI reflektierten Kugelwellen, bzw. das Referenzbündel, erfahren keine chromatische Aufspaltung. in the reference arm of the MZI reflected spherical waves, and the reference beam do not experience any chromatic splitting. Die Abbildung im Referenzarm erfolgt über das langbrennweitige Objektiv The figure in the reference via the long focal length lens 19 19 , den Winkelspiegel The angle mirror 20 20 , der eine für die Detektion der Müllerschen Streifen geeignete Einstellung des optischen Gangunterschieds im MZI ermöglicht. Which allows a form suitable for the detection of the Mullerian strip adjustment of the optical path difference in the MZI. Beispielsweise ist mittels des Winkelspiegels For example, by means of the angle mirror 20 20 ein optischer Gangunterschied von 80 μm für das MZI eingestellt. an optical path difference of 80 microns for the MZI set. Die Abbildung im Referenzarm erfolgt weiterhin über das Keilplatten-Paar The figure in the reference occurs through the wedge plate pair 21 21 , das zum Dispersionsausgleich dient, wobei die Keilwinkel hinreichend klein gewählt sind, sowie die Objektive Which serves to dispersion compensation, wherein the wedge angle are chosen to be sufficiently small, and the lenses 22 22 , . 23 23 und and 24 24 , wobei eine Zwischenabbildung in der Ebene ZBE erfolgt. Wherein an intermediate image in the plane ZBE is performed. Hier entsteht das Bild A'r von BA sowie auch das rückabgebildete Bild B'r des Mittelpunktes B der korrespondierenden Mikroblende BB. Here is the picture of Kr BA as well as the rückabgebildete image b 'r of the center point B of the corresponding micro panel BB. In der Zwischenbildebene ZBE kann für optisch dichte Proben ein Amplituden-Matching, also eine Anpassung der Intensität für die Referenzstrahlung durchgeführt werden. In the intermediate image plane ZBE an amplitude matching, so an adaptation of the intensity of the reference radiation may be performed for optically dense samples. So stellt die Ebene ZBE also eine mögliche Position für ein LCD zwecks Amplituden-Matching und Phasen-Matching dar. Thus, the level DBE therefore represents a possible position for LCD for the purpose of amplitude matching and phase matching.
  • Die Einkopplung des Lichts aus dem Referenzarm in den Detektionsstrahlengang erfolgt über den Strahlteiler The coupling of the light from the reference in the detection beam path via the beam splitter 18 18 . , In der Ebene des zweiten Mikroblenden-Arrays In the plane of the second micro-aperture array 25 25 fallen die kohärenten Foki des Objekt- und die des Referenzstrahlenganges A''o_1 A''r_1 zusammen, beispielsweise im Punkt B der Mikroblende BB zum interferierenden Fokuspunkt A''or_1. drop the coherent foci of the object and the reference beam path together A''o_1 A''r_1, for example at point B of the micro-aperture BB for interfering focus point A''or_1. Durch das Mikroblenden-Array Through the micro-aperture array 25 25 erfolgt eine konfokale Filterung, hier beispielsweise in der Mikroblende BB mit dem Mittelpunkt B. Dem Mikroblenden-Array carried out a confocal filtering, here for example in the micro aperture BB with the center as the micro-shutter array 25 25 ist ebenfalls ein hier nicht dargestellter, schneller Präzisons-xy-Scanner zugeordnet, der synchron und hochgenau in Bezug auf den schnellen Präzisons-xy-Scanner von der Baugruppe Mikrolinsen-Array is also a not shown here, fast associated Precision dual xy scanner which synchronously and highly precisely in relation to the fast Precision dual xy scanner assembly of the microlens array 3 3 und Mikroblenden-Array and micro-aperture array 4 4 bewegt wird. is moved. So wird erreicht, dass in jeder Position eine Mikroblende des Mikroblenden-Arrays Thus it is achieved that in any position a micro-panel of the micro-aperture array 4 4 auf eine und dieselbe, jeweils korrespondierende Mikroblende des Mikroblenden-Arrays on one and the same, respectively corresponding micro-panel of the micro-aperture array 25 25 abgebildet wird, beispielsweise die Mikroblende BA auf die korrespondierende Mikroblende BB. For example, the micro-aperture BA to the corresponding micro panel BB is mapped. So besteht im System Konfokalität, welche in der Regel auch durch dünne Phasenobjekte nicht wesentlich beeinflusst wird. Thus, in the system Confocality which is not significantly affected generally by thin phase objects. Bei etwas dickeren Phasenobjekten erfolgt zum Herstellen der Konfokalität des Systems notwendigerweise eine axiale Nachjustierung am Kondensor At somewhat thicker phase objects for producing the confocality of the system is necessarily an axial readjustment on the condenser 10 10 , die auch von einer lateralen Nachjustierung begleitet sein kann. Which can also be accompanied by a lateral adjustment. Die interferierenden Kugelwellen, die aus den Mikroblenden des Mikroblenden-Arrays The interfering spherical waves from the micro-aperture of the micro-aperture arrays 25 25 austreten passieren ein Spektrometer, welches aus der refraktiv-diffraktiven Baugruppe leak pass a spectrometer selected from the refractive-diffractive assembly 27 27 und dem Abbildungssystem mit den Objektiven and the imaging system with lenses 26 26 und and 28 28 besteht. consists. Die spektral aufspalteten, interferierenden Bündel gelangen auf eine Kamera The spectrally segregating, interfering rays arrive at a camera 29 29 und werden dort detektiert. and detected there. Auf der Kamera On camera 29 29 entsteht das Spektrum der Intensität über der Wellenlänge, die Müllerschen Interferenzstreifen, in Form eines Wavelets. produced the spectrum of intensity versus wavelength Mullerian interference fringes in the form of a wavelet. Die Auswertung kann mittels der Auswertung der Phasenvariation über der Wellenlänge erfolgen, da die Intensität über der Wellenlänge vom optischen Gangunterschied im MZI abhängig ist. The evaluation can be performed by means of the evaluation of the phase variation over wavelength, since the intensity is dependent on the wavelength by the optical path difference in the MZI. Die Auswertung der Interferenzstreifen wird in dieser Schrift nicht dargestellt. The evaluation of the interference fringes is not shown in this document.
  • Ein MZI in A MZI in 1 1 weist am Strahlteiler has at the beam splitter 18 18 einen zweiten Interferometer-Ausgang auf. a second interferometer output. So kann über ein feststehendes Mikroblenden-Array Thus, over a stationary micro-aperture array 30 30 und das Mikrolinsen-Array and the microlens array 31 31 und ein mikroskopisches Abbildungssystem and a microscopic imaging system 32 32 mit einem nicht dargestellten optischen Schmalbandfilter eine visuelle Beobachtung erfolgen, wenn der schnelle Präzisons-xy-Scanner von der Baugruppe Mikrolinsen-Array carried out with a non-illustrated optical narrow-band filter, visual observation, when the fast Precision dual xy scanner assembly of the microlens array 3 3 und das Mikroblenden-Array and the micro-aperture array 4 4 sich in der Startposition befinden, da das feststehende Mikroblenden-Array be in the starting position, since the fixed micro-aperture array 30 30 auf diese Position hin lateral ausgerichtet ist. is laterally aligned in this position. Durch einen Wechsel des optischen Schmalbandfilters kann eine andere Tiefe des Objektraumes scharf gesehen werden. By a change of the optical narrow-band filter a different depth of the object space can be seen sharp. Diese Möglichkeit der visuellen Beobachtung kann zu Forschungszwecken, aber auch für die Objektpositionierung mitverwendet werden. This possibility of visual observation may for research purposes, but also be used for the object positioning.
  • Wegen der Beleuchtung des Objekts Due to the illumination of the object 11 11 mit einem Fokus-Muster ergibt sich ein verringerter Füllgrad, also ein „optisches Nadelkissen" bei der optischen Abtastung. Dies kann jedoch mittels synchronisiertem Lateral-Scan von Mikroblenden-Array with a focus pattern results in a decreased degree of filling, that is an "optical pincushion" during optical scanning. However, this can by means of a synchronized lateral scan of micro-shutter array 3 3 und Mikroblenden-Array and micro-aperture array 4 4 sowie des Mikroblenden-Arrays and the micro-aperture array 25 25 völlig ausgeglichen werden, so dass ein Vollbild des Objekts are fully balanced, so that a full image of the object 11 11 gewonnen wird. is won. Es gibt dabei zwei Modi: There are two modes:
    • 1. Innerhalb der Zeit eines Kamera-Frames wird der Lateral-Scan ausgeführt, so dass eine Integration über alle Positionen erfolgt. 1. Within the time of a camera frames the lateral scan is performed, so that an integration over all positions.
    • 2. In jeder Position beim Lateral-Scan wird ein Bild aufgenommen, gespeichert und zu einem Datensatz verrechnet. 2. an image is captured, stored and charged to a record in any position in the lateral scan. Das ergibt gegenüber Modus 1 mehr laterale Informationen. This results in more lateral information to mode. 1
  • Die Komponenten Mikrolinsen-Array The components microlens array 3 3 und gekoppeltes Mikroblenden-Array and coupled micro-aperture array 4 4 sowie das Mikroblenden-Array and the micro-aperture array 25 25 werden beispielsweise gemeinsam in 10 × 10 Positionen gescannt, da das hierbei das Verhältnis des Fokusfleckdurchmessers zum Fokusabstand um 1:10 liegen soll. for example, scanned together in 10 x 10 positions, as intended here to be the ratio of the focal spot diameter to the focal distance at 1:10. Am Besten wird in jeder Position ein Kamerabild mittels der Kamera The best in each position is a camera image by the camera 29 29 aufgenommen, die am besten als High-Speed-Kamera ausgebildet ist. added that is best designed as a high-speed camera.
  • Das Spektrometer ist als ein Flächenspektrometer, wie in The spectrometer is designed as a surface spectrometer as in DE 10 2006 007 172 A1 DE 10 2006 007 172 A1 dargestellt, mit einer 4 Mega-Pixel Kamera ausgebildet. shown, formed with a 4 mega-pixel camera. Es werden beispielsweise 64 × 64 Objektpunkte gleichzeitig spektral, zB mittels 2048 Spektralelementen für jeden Objektpunkt des Objekts There are 64 points spectrally object simultaneously, for example, 64 ×, for example, by means of spectral elements 2048 for each object point of the object 11 11 , analysiert, so dass beispielsweise 10 × 10 = 100 Scans mit je einer Detektion eines Bildes in jeder Scan-Position durch die Kamera , Analyzed, so that for example, 10 x 10 = 100 scans, each with a detection of an image in any scanning position by the camera 29 29 ausgeführt werden. be executed.
  • Die The 2 2 stellt die Bündel beim Durchlicht-Mikroskop mit chromatischer Aufspaltung der Bündel bei der Beleuchtung auf der Basis eines Mach-Zehnder-Interferometers im Objektstrahlengang des MZI von , the bundle in transmitted light microscope with chromatic splitting of the bundle in the illumination based on a Mach-Zehnder interferometer in the object beam path of the MZI of 1 1 dar. Das Objekt . The object 11 11 ist hierbei ein dünnes Phasenobjekt. here is a thin phase object. Es ist der Bereich der Tiefenaufspaltung z_λ sowie der Bereich z_c, in welchem dünne Phasenobjekte erfasst werden können, dargestellt. It is the range of depth splitting z_λ and the area z_c can be detected in which thin phase objects represented.
  • Die The 3 3 stellt den Strahlengang im Referenzarm des MZI von represents the optical path in the reference arm of the MZI of 1 1 dar. Da es keine chromatischen Komponenten im Referenzarm gibt, fallen die Wellenfronten aller Wellenlängen zusammen und der Punkt A liefert in der ZBE genau einen Bildpunkt A'r für alle Wellenlängen. . Since there is no chromatic components in the reference, the wave fronts of all wavelengths coincide and the point A supplies in the DBE exactly one pixel Kr for all wavelengths.
  • Die The 4 4 stellt ein errechnetes Wavelet für drei übereinander liegende Phasenobjekte dar. represents a calculated wavelet for three superimposed phase objects.
  • In In 5 5 ist die zugehörige spektrale Phase über der Wellenzahl angegeben, wobei sich aus der Abweichung Δϕ_o von der Phasengeraden, also der spektralen Phase ϕ(k), die optische Dicke des Phasenobjekts errechnen lässt. the related spectral phase is indicated above the wave number, and can be calculated from the deviation of the phase Δφ_o straight line, so the spectral phase φ (k), the optical thickness of the phase object. 6 6 zeigt die erste Ableitung der spektralen Phase ϕ über der Wellenzahl k. shows the first derivative of spectral phase φ k over the wave number. Aus dem Nulldurchgang der differenzierten spektralen Phase dϕ/dk kann die Position k_o des Phasenobjektes hochgenau bestimmt werden. dφ from the zero crossing of the differentiated spectral phase / dk k_o the position of the phase object can be determined with high precision.
  • Die The 7 7 stellt eine wirtschaftlich und technisch sehr interessante Ausführung dar. Die Lichtquelle is an economically and technically very interesting design. The light source 1b 1b ist als fasergekoppelter Wellenlängen-durchstimmbarer Laser ausgebildet. is formed as a fiber-coupled wavelength tunable laser. Das aus der Faser austretende Licht passiert einen Kollimator The light emerging from the fiber light passes through a collimator 2 2 und beleuchtet ein Mikrolinsen-Array and illuminates a microlens array 3 3 , welchem ein Mikroblenden-Array To which a micro-aperture array 4 4 nachgeordnet ist, wobei die Mikroblenden, jeweils in der Fokusposition der Mikrolinsen angeordnet sind. is disposed downstream, wherein the micro-apertures, each arranged in the focus position of the microlens. Das Mikrolinsen-Array The microlens array 3 3 und das Mikroblenden-Array and the micro-aperture array 4 4 sind miteinander fest verbunden, wobei dieser Baugruppe ein hier nicht dargestellter schneller Präzisons-xy-Scanner zugeordnet ist, der auch eine hochgenaue Startposition aufweist. are firmly connected to each other, this assembly is not shown, a fast associated here Precision dual xy scanner, which also has a highly accurate starting position.
  • Die von einer Mikroblende vom Mittelpunkt A derselben ausgehende Kugelwelle wird vom Objektiv That is of a micro-panel from the center point A of the same outgoing spherical wave from the lens 6 6 kollimiert, also in eine Planwelle gewandelt, dh der Punkt A wird nach Unendlich abgebildet und passiert dabei im Bereich der Fourier-Ebene des langbrennweitigen Objektivs collimated, that is converted into a plane wave, that is, the point A is imaged to infinity and passes the region of the Fourier plane of the long focal length lens 6 6 einen Polarisator a polarizer 33 33 , ein Wollastonprisma , A Wollaston prism 34 34 und ein diffraktiv-optisches Element in Form einer Fresnelschen Zonenlinse and a diffractive optical element in the form of a Fresnel zone lens 7 7 mit fokussierender Wirkung. having a focusing effect. Am Wollastonprisma On Wollaston prism 34 34 erfolgt eine Aufspaltung in ordentliche und außerordentliche Bündel, die senkrecht zueinander polarisiert sind und einen sehr kleinen Winkel bei der Ausbreitung zueinander aufweisen. takes place a separation into ordinary and extraordinary beams which are polarized perpendicularly to one another and have mutually a very small angle in the spread.
  • Es erfolgt mittels Fresnelscher Zonenlinse It is carried out by means of Fresnel zone lens 7 7 in Abhängigkeit von der Wellenlänge eine unterschiedliche Fokussierung. in dependence on the wavelength, a different focusing. Für die mittlere Wellenlänge des Spektrums ist die Brechkraft der Fresnelschen Zonenlinse For the mean wavelength of the spectrum, the refractive power of the Fresnel zone lens is 7 7 mittels einer direkt nachgeordneten, schwach refraktiven Zerstreuungslinse by means of a directly downstream, weak refractive diverging lens 8 8th kompensiert, um nur geringe Abweichungen vom Zustand der idealen Kollimation zuzulassen. compensated to allow only small deviations from the ideal state of collimation. Die nachfolgende erste Abbildungsstufe The following first imaging stage 9 9 bildet die Fresnelschen Zonenlinse forms the Fresnel zone lens 7 7 in die Fourier-Ebene des Kondensors in the Fourier plane of the condenser 10 10 ab, so dass dort sowohl schwach divergierende sowie zumindest näherungsweise plane als auch schwach konvergierende Wellen in Abhängigkeit von der Wellenlänge vorhanden sind. , so that there both slightly diverging and at least approximately plane and weakly converging waves as a function of wavelength are provided. In dieser Abbildungsstufe In this imaging stage 9 9 befindet sich ein optischer Verzögerer is an optical retarder 35 35 mit einer dicken Kalkspatplatte, so dass eine optische Verzögerung von etwa 80 μm zwischen der senkrechten und der waagerechten Poalarisationsrichtung, also den ordentlichen und den außerordentlichen Bündeln besteht. with a thick Kalkspatplatte, so that an optical delay of about 80 microns between the vertical and horizontal Poalarisationsrichtung, so the ordinary and extraordinary beams is. Anschließend erfolgt mittels des Wasser-Immersions-Kondensors Subsequently, by means of water-immersion condenser 10 10 eine chromatische Tiefenaufspaltung im Objektraum, wodurch zwei Gruppen von Kugelwellen unterschiedlicher Fokussierung je nach Wellenlänge entstehen, deren Zentren in der Tiefe verschoben sind, so dass bei der Abbildung des Punktes A hier die Foki A's_λmin bis A's_λmin entstehen und A'p_λmin bis A'p_λmin die eine Lateral-Shear 2Δq zueinander aufweisen. a chromatic depth splitting in the object space, thereby forming two groups of spherical waves of different focusing arise depending on the wavelength, the centers of which are shifted in depth so that the foci A's_λmin arise when imaging the point A here to A's_λmin and to A'p_λmin have mutually A'p_λmin a lateral Shear 2Δq. Das ist in den This is in the 8 8th und and 9 9 dargestellt. shown. Der Wasser-Immersions-Kondensor The water-immersion condenser 10 10 in in 7 7 kann in der Tiefe nachjustiert werden, um die Konfokalität des Durchlicht-Mikroskops sicherzustellen. can be adjusted in height to ensure the confocality of the transmitted-light microscope. Ein im Objektraum vorhandenes dünnes Phasenobjekt An existing in the object space-thin phase object 11 11 verändert den optischen Gangunterschied, also verschiebt auch die Phase im Interferometer zwischen den Bündeln mit polarisationsoptischer Lateral-Shear. changing the optical path difference, including the phase shifts in the interferometer between the bundles of optical polarization lateral shear. Das Phasenobjekt The phase object 11 11 ist aber in der Regel optisch so dünn, dass die Konfokalität des Durchlicht-Mikroskops noch besteht, dh die objektverursachte optische Weglängenänderung noch kleiner als der Bereich der wellenoptischen Schärfentiefe ist. but is optically so thin that the confocality of the transmitted-light microscope still exists, that is, the object-induced optical path length is still smaller than the area of ​​the wave-optical depth of field in general. Ein Wasser-Immersions-Objektiv A water-immersion lens 12 12 bildet das Objekt forms the object 11 11 ab sowie auch das Licht der unterschiedlich fokussierten Kugelwellen, so dass hier eine Hellfeldanordnung gegeben ist. from as well as the light of the differently focused spherical waves, so that a bright-field configuration is given here. Die vom Objektiv erfassten Kugelwellen werden in näherungsweise plane oder schwach fokussiert oder divergierende Wellen gewandelt und treffen auf die zweite Abbildungsstufe The spherical waves recorded by the lens is converted into approximately flat or slightly focused or diverging waves and incident on the second imaging stage 13 13 , welche als afokale Stufe eine Abbildung auf das diffraktiv-optische Element in Form einer Fresnelschen Zonenlinse Which as afocal stage an image on the diffractive optical element in the form of a Fresnel zone lens 14 14 mit divergierender Wirkung ermöglicht. allows with divergent effect. Diese Fresnelsche Zonenlinse This Fresnel zone lens 14 14 steht zumindest näherungsweise in der Pupillenebene. is at least approximately in the pupil plane. Der Betrag der Brechkraft dieser Fresnelschen Zonenlinse The amount of power that Fresnel zone lens 14 14 ist für jede Wellenlänge zumindest näherungsweise gleich der Fresnelschen Zonenlinse is for each wavelength at least approximately equal to the Fresnel zone lens 14 14 . , Die nachfolgende, direkt nachgeordnete, schwach refraktive Sammellinse The following, directly downstream, weak refractive converging lens 15 15 kompensiert wieder die mittlere Brechkraft der Fresnelschen Zonenlinse compensated for the average power of the Fresnel zone lens 14 14 . , Im Ergebnis des Passierens der Fresnelschen Zonenlinse As a result of the passage of the Fresnel zone lens 14 14 ist die chromatische Aufspaltung des Beleuchtungsstrahlenganges, als die Tiefenaufspaltung durch die Fresnelschen Zonenlinse is the chromatic splitting the illumination beam path, when the depth splitting by the Fresnel zone lens 7 7 kompensiert. compensated. Der Polarisator the polarizer 33 33 , das Wollastonprisma , The Wollaston prism 34 34 sowie das Wollastonprisma and the Wollaston prism 36 36 und der Analysator and the analyzer 37 37 bilden mit den Mikroskop-Komponenten ein polarisationsoptisches Shear-Interferometer. forming an optical polarization Shear Interferometer with the microscope components.
  • Der weitere Strahlengang entspricht dem bereits in der The further beam path corresponds to the already in the 1 1 beschriebenen. described. Die chromatischen Wavelets entstehen hier jedoch in Abhängigkeit von der Wellenlängen-Durchstimmung mittels der Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle However, the chromatic wavelets arise here as a function of wavelength tuning by means of the wavelength tunable light source 1b 1b . ,
  • Die The 8 8th stellt den Strahlengang der Bündel im Objektraum beim Durchlicht-Mikroskop mit differentiellem Interferenz-Kontrast (DIC) nach Nomarski für dünne Phasenobjekte dar. Die Lateral-Shear beträgt hierbei etwa 0,5 μm. represents the optical path of the bundle in object space when transmitted light microscope with differential interference contrast (DIC) Nomarski phase for thin objects. The lateral shear in this case is about 0.5 microns. Die The 9 9 stellt den Sachverhalt für eine einzelne Wellenlänge λi dar, wobei der vergleichsweise große optische Gangunterschied OPD hier symbolisch angedeutet ist. represents the situation for a single wavelength is .lambda..sub.i, wherein the relatively large optical path difference OPD is indicated symbolically here.

Claims (18)

  1. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere auch zur quantitativen Prüfung von einem oder mehreren Objekten ( A process for the transmitted-light microscopy, in particular also for the quantitative testing of one or more objects ( 11 11 ) oder eines Teils oder Teilen desselben oder derselben im Objektraum, – mit einer polychromatischen Lichtquelle ( ) Or a part or parts of the same or of the same in the object space, - (with a polychromatic light source 1a 1a ) im Beleuchtungsstrahlengang und mit einem Spektrometer ( ) In the illumination beam path and with a spectrometer ( 26 26 , . 27 27 , . 28 28 ) im Detektionsstrahlengang – oder einer Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle ( (Or a wavelength tunable light source -) in the detection beam path, 1b 1b ) im Beleuchtungsstrahlengang und mit Mitteln zur konfokalen Diskriminierung ( () In the illumination beam path and means for confocal discrimination 25 25 , . 30 30 ) im Detektionsstrahlengang, wie mehrere Mikroblenden (B) oder eine mittels mehrerer gerasterter Mikrooptiken – wie gerasterte Mikrolinsen – mehrfach abgebildete Blende, sowie einer Kamera ( (Aperture repeatedly imaged, and a camera -) in the detection beam path, such as a plurality of micro apertures (B), or a rasterized by a plurality of micro-optics - as rasterized microlenses 29 29 ) im Detektionsstrahlengang gekennzeichnet dadurch, dass bei der Objektabbildung eine chromatische Tiefenaufspaltung mittels zumindest partiell chromatischer Brechkraft im Detektionsstrahlengang durchgeführt wird, so dass Bilder der Mittelpunkte der Mikroblenden ( ) In the detection beam path in that, when the object image has a chromatic depth splitting is performed by means of at least partially chromatic refractive power in the detection beam path, so that images (the centers of the micro aperture 25 25 , B)' oder Bilder des Mittelpunktes der mehrfach abgebildeten Blende bei der Rückabbildung in den Objektraum dort eine chromatisch verursachte Tiefenaufspaltung erfahren, so dass diese Bilder (B'o_λmin, B'o_λmax) bei einer polychromatischen Lichtquelle zu einem Zeitpunkt oder bei einer Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle sequentiell in der Lichtausbreitungsrichtung separiert sind. B) 'or images of the center of multiple imaged aperture in the back image in the object space there experienced a depth splitting chromatic caused, so that these images (B'o_λmin, B'o_λmax) at a polychromatic light source at a time or at a wavelength tunable light source are sequentially separated in the light propagation direction.
  2. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass das Licht im Objektraum räumlich strukturiert wird, in dem mittels mehrerer Mikroblenden ( A process for the transmitted light microscopy as claimed in claim 1, characterized in that the light is spatially structured in object space, in which (by means of several microshutters 4 4 , A) oder einer mittels mehrerer Mikrolinsen mehrfach abgebildeten Makroblende – ein Foki-Muster – oder ein Fokuslinien-Muster im Objektraum vorbestimmt gebildet werden, und dabei im Beleuchtungsstrahlengang eine chromatische Tiefenaufspaltung dieser Foki oder Fokuslinien mittels zumindest partiell chromatischer Brechkraft durchgeführt wird, so dass die Bilder (A'o_λmin, A'o_λmax) in Lichtausbreitungsrichtung separiert sind und dass dabei die zumindest partiell chromatische Brechkraft im Beleuchtungs- und die im Detektionsstrahlengang so vorbestimmt eingebracht sind, dass im Objektraum der Betrag und die Richtung der chromatischen Tiefenaufspaltung der Foki oder der Fokuslinien zur Beleuchtung und im Detektionsstrahlengang der Betrag und die Richtung der chromatischen Tiefenaufspaltung der rückabgebildeten Mikroblenden ( , A) or a multiple imaged by a plurality of microlenses macro aperture - a foci pattern - or a focus line pattern in the object space to be formed is predetermined, while a chromatic depth splitting these foci or focal lines is performed by means of at least partially chromatic refractive power in the illumination optical path, so that the images (A'o_λmin, A'o_λmax) are separated in the light propagation direction and that thereby at least partially chromatic refractive power in the illumination and which are introduced as predetermined in the detection beam path, that in the object space, the amount and direction of the chromatic depth resolution of the foci or focal lines (for illumination and the detection beam path, the magnitude and direction of the chromatic depth splitting the rückabgebildeten micro aperture 25 25 , BB) oder der mehrfach abgebildeten Makroblende zumindest näherungsweise gleichgemacht sind, so dass im Objektraum die Bilder (A') der Mittelpunkte (A) der Blenden ( , BB) or of the macro-aperture repeatedly illustrated are at least approximately equal made so that the images in the object space (A ') of the center points (A) of the diaphragm ( 4 4 , AB) des Beleuchtungsstrahlenganges oder die Bilder (A') der Foki (A) und die Bilder (B') der Mittelpunkte (B) der Blenden ( , AB) of the illumination beam path or the images (A ') of the foci (A) and the image (B') (the center points (B) of the diaphragm 25 25 , BB) des Detektionsstrahlenganges, welche lateral und spektral korrespondieren, nämlich A'o_λmin-B'o_λmin und A'o_λmax-B'o_λmax optisch konjugiert sind. , BB) of the detection beam path, which correspond laterally and spectrally, namely A'o_λmin-B'o_λmin and A'o_λmax-B'o_λmax are optically conjugate.
  3. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, dass das Verfahren der Dunkelfeldmikroskopie zur Anwendung kommt. A process for the transmitted light microscopy according to at least one of claims 1 and 2, characterized in that the method of the dark field microscopy is used.
  4. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, dass das Verfahren der Phasenmikroskopie auf der Basis der Interferenz von elektromagnetischen Wellen zur Anwendung kommt. A process for the transmitted light microscopy according to at least one of claims 1 and 2, characterized in that the method of phase microscopy is based on the interference of electromagnetic waves used.
  5. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, dass das Phasenkontrast-Verfahren, insbesondere auch das nach F. Zernike, das differentielle Phasenkontrast-Verfahren, insbesondere auch das nach G. Nomarski, auch als DIC-Verfahren (DIC: Differential interference contrast) bezeichnet, das Hoffinann-HMC-Verfahren (HMC: Hoffmann modulation contrast) oder auch ein phasenmikroskopisches Verfahren nach dem Zweistrahl-Interferenz-Verfahren, insbesondere auch auf der Basis eines Mach-Zehnder-Interferometers, zur Anwendung kommen A process for the transmitted light microscopy as claimed in claim 4, characterized in that the phase contrast method, in particular also according to F. Zernike, the differential phase contrast method, in particular the (by G. Nomarski, as DIC method DIC: Differential Interference Contrast) denotes that Hoffmann-HMC-method (HMC: Hoffmann Modulation Contrast) or a microscopic phase method according to the two-beam interference method, in particular based on a Mach-Zehnder interferometer come to application
  6. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 4 und 5, gekennzeichnet dadurch, dass ein optischer Gangunterschied im Strahlengang eines Phasen-Mikroskops eingeführt wird, der mindestens eine Wellenlänge der maximalen, detektierten Wellenlänge beträgt, so dass Interferenzstreifen, insbesondere auch in Form eines Wavelets, also Intensitätsverläufe über der Wellenlänge λ oder der Wellenzahl k, im detektierten Spektralbereich vorbestimmt gebildet werden, wobei ein dünnes und lateral kleines Phasenobjekt ( A process for the transmitted light microscopy according to at least one of claims 4 and 5, characterized in that an optical path difference is inserted in the beam path of a phase microscope that is at least a wavelength of the maximum detected wavelength so that the interference fringes, especially in the form of a wavelets, so intensity characteristics on the wavelength λ or the wave number are formed in the detected spectral range predetermined k, whereby a thin and small lateral phase object ( 11 11 ) eine lokale Phasenänderung in den Interferenzstreifen, insbesondere auch in Form eines Wavelets, erzeugt. ), Generates a local phase change in the interference fringes, especially in the form of a wavelet.
  7. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, dass die Phase der Interferenz ausgewertet wird. A process for the transmitted light microscopy as claimed in claim 6, characterized in that the phase of the interference is evaluated.
  8. Verfahren zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 7, gekennzeichnet dadurch, dass der optische Gangunterschied im Unendlich-Strahlengang oder im chromatisch schwach fokussierten Strahlengang der mikroskopischen Abbildung eingebracht wird. A process for the transmitted light microscopy according to at least one of claims 5 to 7, characterized in that the optical path difference is introduced in the infinite beam or chromatic weakly focused beam path of the microscope image.
  9. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie, insbesondere auch mit Kondensor ( Arrangement for transmitted-light microscopy, in particular with condenser ( 10 10 ) und Objektiv ( () And lens 12 12 ) und insbesondere auch zur quantitativen Prüfung von einem Mikroobjekt im Objektraum, – mit einer polychromatischen Lichtquelle ( ) And in particular also for the quantitative testing of a micro-object in the object space, - (with a polychromatic light source 1a 1a ) im Beleuchtungsstrahlengang und mit einem Spektrometer ( ) In the illumination beam path and with a spectrometer ( 26 26 , . 27 27 , . 28 28 ) im Detektionsstrahlengang – oder einer Wellenlängen-durchstimmbaren Lichtquelle ( (Or a wavelength tunable light source -) in the detection beam path, 1b 1b ) im Beleuchtungsstrahlengang, mit Mitteln zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang, wie mehrere Mikroblenden ( ) In the illumination beam path (with means for confocal discrimination in the detection beam path, as several micro aperture 25 25 , B) oder eine mittels mehrerer Mikrolinsen mehrfach abgebildete Makroblende, sowie einer Kamera ( , B) or a macro-aperture repeatedly imaged by a plurality of microlenses, and a camera ( 29 29 ) im Detektionsstrahlengang, gekennzeichnet dadurch, dass Mittel ( ) In the detection beam path, characterized in that means ( 14 14 ) mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung im Detektionsstrahlengang angeordnet sind. ) Are arranged at least partially chromatic power to the chromatic depth splitting the detection beam path.
  10. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 9, gekennzeichnet dadurch, dass die Mittel ( Arrangement for transmitted light microscopy as claimed in claim 9, characterized in that the means ( 14 14 ) mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung in der Fourier-Ebene (F'12), also der rückwärtigen Brennebene des Objektivs ( ) (With at least partially chromatic power to the chromatic depth splitting in the Fourier plane f'12), ie the back focal plane of the objective ( 12 12 ), oder in einer zu dieser optisch konjugierten Ebene (F''12) angeordnet sind. ), Or arranged in a (at this optically conjugate plane F''12) are.
  11. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 9, gekennzeichnet dadurch, dass Mittel ( Arrangement for transmitted light microscopy as claimed in claim 9, characterized in that means ( 7 7 ) mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet sind. ) Are arranged at least partially chromatic power to the chromatic depth splitting the illumination beam path.
  12. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, dass Mittel ( Arrangement for transmitted light microscopy as claimed in claim 11, characterized in that means ( 7 7 ) mit zumindest partiell chromatischer Brechkraft zur chromatischen Tiefenaufspaltung in der Fourier-Ebene, also der rückwärtigen Brennebene (F10), des Kondensors ( ) (With at least partially chromatic power to the chromatic depth splitting in the Fourier plane, so the rear focal plane F10), the condenser ( 10 10 ), oder in einer zu dieser optisch konjugierten Ebene (PE'10) angeordnet sind. ), Or arranged in a (at this optically conjugate plane PE'10) are.
  13. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 12, gekennzeichnet dadurch, dass bei der Anwendung eines Nomarski-DIC-Mikroskops mit zwei Wollastonprismen ( Arrangement for transmitted light microscopy according to at least one of claims 9 to 12, characterized in that when using a Nomarski DIC microscope (with two Wollaston prisms 34 34 ) ( () 36 36 ) ein optischer, doppelbrechender Verzögerer einen optischen Gangunterschied zwischen den beiden Polarisationsrichtungen von mindestens einer Wellenlänge der maximalen, detektierten Wellenlänge erzeugt, wobei der Verzögerer im Raum zwischen den beiden Wollastonprismen ( ) Is a birefringent optical retarder generates an optical path difference between the two polarization directions of at least one wavelength of maximum, the detected wavelength, the retarder (in the space between the two Wollaston prisms 34 34 ) ( () 36 36 ) des Nomarski-DIC-Mikroskops angeordnet ist. is disposed) of the Nomarski DIC microscope.
  14. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, dass der optische, doppelbrechende Verzögerer in Form einer Kalkspatplatte ( Arrangement for transmitted light microscopy as claimed in claim 13, characterized in that the optical, birefringent retarder (in the form of a Kalkspatplatte 35 35 ) (calcite plate) ausgebildet ist. ) Is formed (calcite plate).
  15. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 14, gekennzeichnet dadurch, dass die Mittel mit chromatischer Brechkraft als diffraktiv-optische Elemente ( Arrangement for transmitted light microscopy according to at least one of claims 9 to 14, characterized in that the means (chromatic refractive power as a diffractive-optical elements 7 7 ), ( ), ( 14 14 ) ausgebildet sind. ) Are formed.
  16. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 15, gekennzeichnet dadurch, dass die Mittel ( Arrangement for transmitted light microscopy according to at least one of claims 9 to 15, characterized in that the means ( 25 25 ) zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang lateral verschiebbar angeordnet sind. ) Are arranged laterally displaceable for confocal discrimination at the detection beam path.
  17. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 15, gekennzeichnet dadurch, dass die Mittel ( Arrangement for transmitted light microscopy according to at least one of claims 9 to 15, characterized in that the means ( 4 4 ) zur Strukturierung des Lichts im Beleuchtungsstrahlengang lateral verschiebbar angeordnet sind und synchron mit den Mitteln ( ) Are arranged laterally displaceable for patterning the light in the illumination beam path and synchronously (with the means 25 25 ) zur konfokalen Diskriminierung im Detektionsstrahlengang verschoben werden, so dass die laterale Zuordnung der Bilder (A', B') derselben im Objektraum bei der Verschiebung und bei der Bildaufnahme mittels Kamera ( ) Are shifted for confocal discrimination at the detection beam path, so that the lateral assignment of the images (A ', B') of the same (in object space during the displacement and during the image capture by camera 29 29 ) stets erhalten bleibt. ) Is always maintained.
  18. Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 17, gekennzeichnet dadurch, dass eine optische Kopplung der Anordnung zur Durchlicht-Mikroskopie mit einer optischen, rechnergesteuerten Pinzette durchgeführt wird. Arrangement for transmitted light microscopy according to at least one of claims 9 to 17, characterized in that an optical coupling of the arrangement for transmitted light microscopy is performed with an optical, computer-controlled forceps.
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