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Die vorliegende Erfindung betrifft einen Peptid-Inhibitor einer pflanzlichen Cysteinprotease, der die Ausbildung von Haustorien bei Pflanzenpathogenen hemmt und dessen Verwendung als Pflanzenschutzmittel, insbesondere bei Tomate oder Sojabohne.
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Die Familie der Cuscutaceae (manchmal wird diese Familie auch zu den Convolvulaceae gezählt) umfasst ca. 150 Spezies der Gattung Cuscuta, die alle parasitisch auf anderen Angiospermen leben. Alle Cuscuta-Arten bestehen aus einem gewundenen Spross, besitzen keine Wurzeln und nur rudimentäre, schuppenförmige Blätter. In hiesigen Breiten ist Cuscuta europaea, auch Teufelszwirn oder Springseide genannt, heimisch und vor allem an Flußauen anzutreffen, wobei meist die Brennnessel als Wirtspflanze dient.
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Mit speziellen Organen, den sog. Haustorien, stellen Cuscuta-Pflanzen Kontakt zum Gefäßsystem der Wirtspflanzen her und entziehen diesen organische und anorganische Nährstoffe. Doch werden durch diese Haustorien nicht nur Nährstoffe geschleust. Cuscuta dient ebenso als effektiver Vektor zur Übertragung von verschiedenen Viren, und auch die Übertragung von RNAs bzw. RNA-Protein Komplexen kann nicht ausgeschlossen werden.
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Der pflanzliche Parasit Cuscuta reflexa infiziert nahezu jede Pflanze und entzieht den Wirtspflanzen wichtige Nährstoffe, welches zu einem Absterben der infizierten Pflanzen führen kann. Ganze Felder von Nutzpflanzen können auf diese Art vernichtet werden. Vor allem beim Sojabohnen- und Tomatenanbau in Amerika und im südostasiatischen Raum hat dies verheerende Folgen. Da es sich bei Cuscuta reflexa um eine höhere Pflanze handelt, bereitet es besondere Schwierigkeiten den Parasiten wirksam zu bekämpfen ohne die Nutzpflanzen zu schädigen.
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Heutzutage werden die Samen von Cuscuta und Nutzpflanzen aufwendig getrennt, um zu vermeiden, dass es einer unkontrollierten Ausbreitung des Schädlings kommt. In vielen Ländern besteht ein striktes Verbot Samen zu verkaufen, welche mit Cuscuta Samen infiziert sind. Falls es zu einem Cuscuta-Befall kommt werden die Pflanzen, bei kleinerem Befall, per Hand entfernt Bei größerem Befall wird das Feld unter Umständen abgebrannt um eine Epidemie zu verhindern. (Quelle: http://www.ipm.ucdavis.edulPMGIPESTNOTESlpn7496.html) Als Alternative verwendet man das Spritzmittel Glyphosat („RoundUp“®)
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Die Entwicklung von Haustorien ist für Cuscuta überlebenswichtig und stellt den zentralen Schritt für eine erfolgreiche Infektion dar. Bei der Ausbildung von Haustorien spielen zelluläre Faktoren eine essentielle Rolle.
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Albert et al (in Albert M, Werner M, Proksch P, Fry SC, Kaldenhoff R. The cell wallmodifying xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase LeXTH1 is expressed during the defence reaction of tomato against the plant parasite Cuscuta reflexa. Plant Biol (Stuttg). 2004 Jul; 6(4): 402–7.) beschreiben die Identifizierung von Genen, die im Frühstadium der Infektion mit Cuscuta induziert werden. Ein identifiziertes Gen war eine Hydrolase, XTH.
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Albert (in Albert M. Studien zur Interaktion des pflanzlichen Parasiten Cuscuta reflexa mit dem inkompatiblen Wirt Lycopersicon esculentum. Dissertation, Technische Universität Darmstadt (Darmstadt 2005), Internetseite: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/629/1/Albert .pdf) beschreibt eine cDNA-Bibliothek des Parasiten Cuscuta reflexa und das differentielle Screening auf Gene der Haustorienentwicklung, die während einer Infektion induziert werden.
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Nadler-Hassar et al. (Nadler-Hassar T, Goldshmidt A, Rubin B, Wolf S. Glyphosate inhibits the translocation of green fluorescent protein and sucrose from a transgenic tobacco host to Cuscuta campestris Yunk. Planta. 2004 Sep; 219(5): 790–6. Epub 2004 Jun 2.) beschreiben die Wirkung von Glyphosat auf Cuscuta campestris an Tabak.
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Torres et al. (Torres MJ, Tomilov AA, Tomilova N, Reagan RL, Yoder JI. Pscroph, a parasitic plant EST database enriched for parasite associated transcripts. BMC Plant Biol. 2005 Nov 16; 5: 24.) beschreiben eine Haustorien-relevante EST-Datenbank.
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Tada et al. (Tada Y, Wakasugi T, Nishikawa A, Furuhashi K, Yamada K. Developmental regulation of a gene coding for a low-molecular-weight heat shock protein during haustorium formation in the seedlings of a holoparasitic plant, Cuscuta japonica. Plant Cell Physiol. 2000 Dec; 41(12): 1373–80.) beschreiben die Identifizierung eines Gens, das an der Bildung von Haustorien in Cuscuta japonica beteiligt ist.
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Die Sequenz Nummer AF138265 betrifft eine bestimmte Cysteinprotease (papain-like cysteine proteinase isoform II) aus der Süßkartoffel (Ipomoea batatas). Diese wurde am 26. März 1999 in der Datenbank hinterlegt.
US 6 451 604 B1 beschreibt ebenfalls eine bestimmte Cysteinprotease (Sequenz 165).
WO 02/22675 A2 betrifft eine bestimmte Cysteinprotease (Sequenz 500) aus Arabidopsis thaliana.
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US 4 915 726 A betrifft ein Verfahren zur Kontrolle von Cuscuta, wobei die Pflanze mit einer Pilzkultur als Mycoherbizid besprüht wird.
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Valueva und Mosolov (Role of inhibitors of proteolytic enzymes in plant defense against phytopathogenic microorganisms. Biochemistry (Mosc). 2004 Nov; 69(11): 1305–9) beschreiben verschiedene Verwendungen von Proteinasen und deren Inhibitoren.
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Im Hinblick auf die oben genannten Nachteile des Standes der Technik ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues und Umwelt-schonendes Verfahren zur Hemmung von Haustorien-bildenden Pflanzenpathogenen zur Verfügung zu stellen. Weiterhin soll dazu ein Wirkstoff bereitgestellt werden, der wirksam, unbedenklich und kostengünstig herzustellen ist.
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Gemäß eines ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird diese Aufgabe durch ein Polypeptid einer Cystein-Protease, umfassend ein Inhibitor-Peptid gemäß SEQ ID Nr. 1 gelöst. Erfindungsgemäß bevorzugte Peptide bestehen aus dem Inhibitor-Peptid gemäß SEQ ID Nr. 1, Das erfindungsgemäße Peptid kann jede Länge aufweisen, solange das Peptid die Haustorien-Bildung unter geeigneten Bedingungen inhibiert. Bevorzugt sind jedoch erfindungsgemäße Inhibitor-Peptide, die nicht die vollständige Proteasesequenz umfassen. Das erfindungsgemäße Peptid kann auch sein Homolog oder Ortholog des Peptids der SEQ ID Nr. 1 sein.
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Durch die vorliegende Erfindung wird ein Weg aufgezeigt, der einen Parasitenbefall von Wirtspflanzen durch Haustorien-bildenden Pflanzenpathogene, bevorzugt Cuscuta, pathogene Pilze und besonders bevorzugt C. reflexa verhindert und bereits befallene Pflanzen vom Parasiten befreit. Durch die Anwendung eines erfindungsgemäßen ungefährlichen Peptids in einer z.B. wässrigen Lösung, das zudem biologisch abbaubar ist, wird ein Eindringen von Infektionsorganen des Parasiten (Haustorien), verhindert bzw. löst sich der Parasit von der behandelten Pflanze ab. Auf diese Weise wird eine Ausbreitung des Parasiten auf landwirtschaftlich genutzten Anbauflächen unterbunden.
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Die Proteinase (SEQ ID Nr. 2) wird als so genanntes Prä-Pro-Protein vom Parasiten hergestellt und dann mittels Prä-Peptid nach außen in die Nahe des potentiellen Wirtes geschleust. Durch Abspalten des Pro-Peptids, welches als Inhibitor der Proteinasefunktion wirkt. wird die eigentliche Proteinase aktiviert. Ist die Proteinase gehemmt, wird dadurch die erfolgreiche Infektion verhindert und eine Verbreitung des Parasiten unterbunden.
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Bei der Erfindung handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungsform um einen Cysteinproteinase-Inhibitor, ein Peptid aus dem Parasiten Cuscuta reflexa, das dem Pflanzenschutz dienen soll. Dieses Peptid lässt sich einfach mit gängigen biotechnologischen Methoden herstellen. Durch Aufsprühen dieses Peptids auf Wirtspflanzen für den Parasiten C. reflexa lässt sich eine Parasitierung erfolgreich verhindern. Die vorliegende Erfindung ist aus mehreren Gründen innovativ: Sie ist leicht herzustellen, leicht anzuwenden und umweltverträglich.
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Das erfindungsgemäße Polypeptid kann dadurch gekennzeichnet sein, daß es synthetisch hergestellt worden ist. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bestens bekannt und in der Literatur beschrieben. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Peptide auch als retroinverse Peptide oder Peptidomimetika vorliegen, die sich insbesondere durch den Aufbau des Peptidrückgrats von herkömmlichen Peptiden unterscheiden.
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Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Optimierung eines erfindungsgemäßen Inhibitor-Peptids, bei dem das Inhibitor-Peptid in seiner Aminosäuresequenz durch Standardverfahren verändert wird (z.B. durch konservative oder nicht-konservative Aminosäure-Austausche) und das so veränderte Peptid auf seine Eigenschaften hin untersucht wird, die normalerwiese Effektivität bei der Inhibierung der Hautorien und Stabilität in Zusammensetzungen, aber auch eine reduzierte Toxizität oder Abbaubarkeit einschließen können. Entsprechend veränderte Inhibitor-Peptide sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt und weisen ebenfalls zu mindestens 80% und bevorzugt 90% Aminosäure-Identität zu SEQ ID Nr. 1 auf.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert. Die Nukleinsäure ist dadurch gekennzeichnet, daß sie eine DNA, RNA, mRNA, cDNA, CNA, PNA, vorzugsweise eine DNA, insbesondere eine doppelsträngige DNA ist. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können aber auch länger sein. Weiter bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz der Nukleinsäure mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz aufweist. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäße Nukleinsäure in Form ihrer komplementären ”antisense”-Sequenz.
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Erfindungsgemäß kann die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet sein, daß sie synthetisch hergestellt worden ist. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bestens bekannt und in der Literatur beschrieben. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann einen Vektor, vorzugsweise in Form eines Plasmids, shuttle Vektors, Phagemids, Cosmids, Expressionsvektors, retroviralen Vektors, adenoviralen Vektors oder Partikels und/oder gentherapeutisch wirksamen Vektors, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure.
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Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanzenschutz-Zusammensetzung gelöst, umfassend Mischen eines Polypeptids, nämlich umfassend ein Inhibitor-Peptid gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein Polypeptid mit einer Peptidsequenz mit mindestens 90% Aminosäure-Identität zu SEQ ID Nr. 1, mit einem geeigneten Träger. Bevorzugt kann der Träger eine wäßrige Lösung, eine Kombination mit einem herkömmlichen Pflanzenschutzmittel oder ein Zellysat sein. Weiter bevorzugt ist eine erfindungsgemäß hergestellte Pflanzenschutz-Zusammensetzung, umfassend das genannte Polypeptid und/oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, gegebenenfalls mit einem geeigneten Träger wie oben.
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Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Bekämpfung von Haustorien-bildenden Pflanzenpathogenen, umfassend Aufbringen einer Pflanzenschutz-Zusammensetzung wie oben auf eine Pflanze gelöst. Durch die erfindungsgemäß bevorzugte äußere Applikation des Inhibitor-Peptids, bevorzugt des Pro-Peptids (PIN, SEQ ID Nr. 1), das von der Vorläufersequenz der Cysteinproteinase abstammt, die z.B. in E. coli hergestellt wird und entweder aufgereinigt oder sogar im E. coli Lysat aufgetragen werden kann, kann die Ausbildung von Haustorien gezielt verhindert werden. In der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können auch mehrere erfindungsgemäße Cysteinproteinase Inhibitor-Peptide vorhanden sein.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bekämpfung von Haustorien-bildenden Pflanzenpathogenen kann grundsätzlich für alle Pflanzenpathogene verwendet werden, die Haustorien ausbilden, da angenommen wird, dass die vorliegenden Cysteinproteinase Inhibitor-Peptide einen zentralen Angriffspunkt auf die Haustorienbildung darstellen, da die Effektivität in den im Rahmen der Erfindung durchgeführten Experimenten bei 100% lag. Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bekämpfung von Haustorien-bildenden Pflanzenpathogenen, wobei die Pflanzenpathogene ausgewählt sind aus Cuscuta, pathogenen Pilzen, Rostpilzen, Mehltau und Parasiten der Familie der Orobranchaceae.
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Die zu behandelnden Pflanzen sind alle Pflanzen, die durch Haustorien-bildende Pflanzenpathogene befallen werden, besonders jedoch Pflanzen wie Tomaten (Lycopersicon spec.) oder Sojabohnen (Glycine max).
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Besonders bevorzugt ist ein Verfahren zur Bekämpfung von Haustorien-bildenden Pflanzenpathogenen wobei das Aufbringen der erfindungsgemäßen Peptide und/oder der Zusammensetzung durch Aufsprühen auf die Pflanze erfolgt.
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Zuletzt betrifft ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Bekämpfung von Haustorien-bildenden Pflanzenpathogenen wie oben ereits erläutert.
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Durch die hier dargestellte Erfindung wird ein Weg aufgezeigt, der einen Parasitenbefall von Wirtspflanzen durch bevorzugt C. reflexa verhindert und bereits befallene Pflanzen vom Parasiten befreit. Durch die Anwendung eines ungefährlichen Peptids z.B. in einer wässrigen Lösung, das zudem biologisch abbaubar ist, wird ein Eindringen von Infektionsorganen des Parasiten, verhindert bzw. löst sich der Parasit von der behandelten Pflanze ab. Auf diese Weise wird eine Ausbreitung des Parasiten auf landwirtschaftlich genutzten Anbauflächen unterbunden.
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Das Peptid ist ein natürliches Produkt, das vollständig abbaubar ist. Es lässt sich spezifisch nur gegen den Parasiten anwenden, eventuelle Nützlinge, sowie die zu schützende Nutzpflanze (= Wirtspflanze) nehmen aller Voraussicht nach keinen Schaden.
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Die vorliegende Erfindung soll im folgenden anhand der beigefügten Beispiele weiter beschrieben werden, ohne jedoch auf diese beschränkt zu werden. In den Figuren und Sequenzen zeigt:
SEQ ID Nr. 1: Die Aminosäure-Sequenz des erfindungsgemäßen Propeptids (Inhibitor-Sequenz) aus C. reflexa.
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SEQ ID Nr. 2: Die Aminosäure-Sequenz der gesamten Cystein-Proteinase aus C. reflexa.
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SEQ ID Nr. 3: Die cDNA-Sequenz der gesamten Cystein-Proteinase aus C. reflexa.
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SEQ ID Nr. 4: Die erfindungsgemäße cDNA-Sequenz des Propeptids (Inhibitor-Sequenz).
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1: die Wirkung des erfindungsgemäßen Inhibitor-Pro-Peptids. (A) normaler unbeeinflusster Befall, (B) Wirkung des erfindungsgemäßen Inhibitor-Pro-Peptids 7 Tage nach Applikation.
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Beispiele
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde eine cDNA-Bibliothek im Umfang von ca. 7000 cDNA Klonen des Parasiten Cuscuta angelegt. Es wurde speziell Gewebe aus Prähaustorien und Haustorien zur Herstellung der cDNA-Bibliothek verwendet. Die parasitären cDNA-Klone wurden in zweifacher Ausführung auf „Microarray chips“ aufgetragen. Zwei identische „Chips“ wurden mit zwei unterschiedlichen cDNASonden hybridisiert, die einmal mit Gesamt-RNA aus prähaustorialem und haustorialem Gewebe als Matrize, und im andern Fall mit Gesamt-RNA aus Cuscuta-Spross als Matrize synthetisiert wurden. Auf diese Weise sind bis jetzt 2000 cDNA-Klone differentiell nach cDNAs durchmustert worden, deren Gene bei der Haustorienentwicklung, also während der Infektion im Parasiten Cuscuta reflexa induziert sind.
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cDNA-Klone deren Gene während der Infektion in Cuscuta-Prähaustorien induziert sind, auf dem Chip also deutliche Signale gaben, wurden sequenziert. Deren cDNA, sowie Protein-Sequenzen wurden in Datenbanken (NCBI) mit bekannten Sequenzen verglichen.
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Dabei wurde die Sequenz für die erfindungsgemäße Cystein Proteinase, sowie die darin enthaltene Teilsequenz des erfindungsgemäßen Inhibitor-Peptids identifiziert, die in der cDNA zu 86% und in der Aminosäuresequenz zu 90% zu einer Cystein-Protease aus der Süßkartoffel (Ipomoea batatas) identisch war.
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Die cDNA-Sequenz der gesamten Cystein-Proteinase (SEQ ID Nr. 3) lautet:
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Die erfindungsgemäße cDNA-Sequenz des Propeptids (Inhibitor-Sequenz) (SEQ ID Nr. 4) ist:
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Die Aminosäure-Sequenz des Polypeptids (Protease-Sequenz) (SEQ ID Nr. 2) lautet (Start-Methionin unterstrichen):
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Die Aminosäure-Sequenz des erfindungsgemäßen Propeptids (Inhibitor-Sequenz) (SEQ ID Nr. 1) lautet:
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Die oben beschriebene Wirkung des Pro-Peptid wurde in Gewächshausversuchen an Cuscuta reflexa mit den Wirtspflanzenspezies Tabak (Nicotiana tabacum var. Samsun). Tomate (Lycopersicon esculentum var. Money Maker) und Buntnessel (Coleus blumei) durchgeführt.
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Beispiele der Wirkung des Pro-Peptids verdeutlicht 1. Links (A) ist der normale unbeeinflusste Befall zu sehen, in der rechten Abbildung (B) die Wirkung des Pro-Peptids 7 Tage nach Applikation. Diese Ergebnisse wurden in 100% der Fälle erhalten.
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
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