DE102006011345A1

DE102006011345A1 - Charakterisierung biologischer Gewebe durch die aktivelektrischen Membraneigenschaften nach einem ultrakurzen Hochspannungspuls

Info

Publication number: DE102006011345A1
Application number: DE200610011345
Authority: DE
Inventors: Uwe Pliquett; Monika Altmann; Fritz Pliquett
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-03-11
Filing date: 2006-03-11
Publication date: 2007-09-13

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Stimulation vitaler biologischer Gewebe durch ultrakurze Hochspannungspulse mit dem Ziel, die Membransysteme unsymmetrisch zu permeabilisieren und damit ein elektrisches Potential zu erzeugen, dessen Höhe und zeitlicher Verlauf Auskunft über den energetischen Zustand der Zellen, aber auch ihre unmittelbare weitere Entwicklung geben kann, um damit Gewebe durch ein spezifisches Merkmal zu charakterisieren. Neben der Qualitätsbestimmung von Fleisch unmittelbar nach dem Schlachten lässt sich die Erfindung auch für die Vitalitätsbestimmung dicht gepackter Zellen, beispielsweise in Bioreaktoren oder bei Hochdurchsatzmesstechniken zur Bestimmung des Zellmembranpotentials einsetzen.

Description

Der Erfindung erlaubt mittels einer einfachen Anordnung elektrophysiologische Parameter lebender Zellen zu bestimmen. Dies ist bisher nur mittels aufwändiger Techniken wie Patch-Clamp oder Markierung mit potentialsensitiven Farbstoffen möglich.
Bei nicht polarisierten Zellen tritt über biologischen Geweben normalerweise keine Spannung auf. Bei einer einseitigen Depolarisation der Zellmembran durch einen Hochspannungspuls heben sich die Ruhepotentiale nicht mehr auf, und es stellt sich zwischen den Monitorelektroden eine Spannung ein.
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur unsymmetrischen Permeabilisierung von Zellmembranen mit gleichzeitiger Registrierung der über einem Monitorelektrodenpaar anliegenden Spannung. Diese Spannung, die eine Funktion der Membranintegrität sowie des energetischen Zustandes der Zelle ist, kann zur Charakterisierung von biologischen Geweben herangezogen werden.
Neben der Qualitätsbestimmung von Fleisch unmittelbar nach dem Schlachten lässt sich die Erfindung auch für Vitalitätsbestimmung dicht gepackter Zellen, beispielsweise in Bioreaktoren oder bei Hochdurchsatzmesstechniken zur Bestimmung des Zellmembranpotentials einsetzten.
Ein Koaxialkabel (2) wird von einem Transverter (1) geladen. Eine Funkenstrecke (3) zündet durch und entlädt somit das Koaxialkabel über dem Objekt, welches sich zwischen den auf Schienen (4) verstellbaren Elektroden (7) befindet. Die Monitorelektroden (6) sind als Ag/AgCl-Elektroden ausgeführt. Die Verbindung zur Monitorelektronik (5) erfolgt über geschirmte Kabel.
Stand der Technik
Biologische Gewebe lassen sich durch ihre physiko-chemischen Eigenschaften, und dazu zählen ihre elektrischen Eigenschaften, charakterisierten. Die elektrischen Eigenschaften biologischer Gewebe wurden bisher durch ihr passiv-elektrisches Verhalten (elektrische Impedanz und ihre Frequenzabhängigkeit) in der Zell- und Membranbiophysik mit Anwendungen in medizinischer Diagnostik und Fleischqualitätsuntersuchungen bestimmt. Hierfür stehen kommerzielle Geräte (HP-2994A, Solartron 1260) zur Verfügung und für spezielle Zwecke wurden geeignete Geräte entwickelt.
Neben den passiv-elektrischen Eigenschaften besitzen Gewebe, bedingt durch ihre Membransysteme auch aktive elektrische Eigenschaften, die durch Impedanzmessungen nicht erfasst werden. Durch die selektive Permeabilität für verschiedene Ionen und durch die Wirkung von Ionenpumpen sind Membranen elektrisch polarisiert. Die Membranpotentiale hängen vom energetischen Zustand der Zellen ab.
Impedanzmessungen an Geweben liefern Informationen über die Integrität der Zellmembranen. Die Bestimmung der Transmembranspannung ist nicht möglich, da sich die Potentiale durch die Symmetrie der Zellen aufheben. Mit Hilfe von Patch Clamp oder Whole cell clamp ist es möglich, mit in der Zelle angebrachten Mikroelektroden sowohl die Transmembranspannung als auch Impedanz der Zellmembran zu bestimmen. Für praktische Zwecke, wie die Untersuchung ganzer Gewebestrukturen, ist der Aufwand jedoch zu hoch.
Eine Spannungsmessung über einem Gewebestück führt nicht zum Ziel, denn im Ruhezustand ist die Spannung über den inneren Elektroden wegen der Zellsymmetrie null.
Beschreibung
Bei einer einseitigen Depolarisation der Zellmembran durch einen Hochspannungspuls heben sich die Ruhepotentiale nicht mehr auf, und es stellt sich zwischen den Monitorelektroden eine Spannung ein.

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur unsymmetrischen Permeabilisierung von Zellmembranen mit gleichzeitiger Registrierung der über einem Monitorelektrodenpaar anliegenden Spannung. Diese Spannung, die eine Funktion der Membranintegrität sowie des energetischen Zustandes der Zelle ist, kann zur Charakterisierung von biologischen Geweben herangezogen werden.

Über ein äußerers Elektrodenpaar wird ein ultrakurzer Hochspannungspuls appliziert. Dadurch werden die Zellmembranen transient permebilisiert. Die resultierende Spannung an den inneren Elektroden wird einem Verstärker zugeführt und registriert. Da die post mortale Reifung von Fleisch vom Zustand der Zellen zu Zeitpunkt des Schlachtens abhängt, ist es damit möglich, die Eigenschaften von Muskelgewebe (beispielsweise sofort nach dem Schlachten) zur Qualitätsbestimmung von Fleisch (nach dem Reifeprozess) zu verwenden.

Erfindungsgemäß werden aktiv elektrische Gewebeeigenschaften zugänglich gemacht, indem die Zellen durch einen ultrakurzen Hochspannungsimpuls, der das Gewebe nicht permanent schädigt, einseitig elektroporiert werden, um Aussagen über die Spannung auf der nicht elektroporierten Seite zu gewinnen. Da diese Spannung vom physiologischen Zustand der Zellen abhängt, ist in einem kurzen Zeitbereich, bis zu Wiederherstellung der elektroporierten Membranen eine Charakterisierung der Zellen oder des Gewebes möglich.

Eine für diese Zwecke geeignete Messanordnung wurde entwickelt, gebaut und unter Praxisbedingungen erprobt.

Ausführungsbeispiel
Qualitätssensor für Frischfleisch
(Hochspannungspulsgenerator mit Kabelentladung, innere Elektroden als Elektroden 2. Art)
1 zeigt den prinzipiellen Aufbau. Ein Koaxialkabel (2) von 3 m Länge wird von einem Transverter (1) auf bis zu 30 kV geladen. Eine zum Objekt in Reihe geschaltete Funkenstrecke (3) zündet abhängig vom eingestellten Elektrodenabstand bei Spannungen zwischen 5 und 30 kV durch und entlädt somit das Koaxialkabel über dem Objekt, welches sich zwischen den auf Schienen (4) verstellbaren Elektroden (7) befindet. Die Elektroden (7) bestehen aus planparallelen Edelstahlplatten (4 × 4 cm). Ein in die Funkenstrecke integrierter Lichtwellenleiter mit angeschlossener Photodiode dient als Trigger, um den Transverter abzuschalten. Der Abstand kann zwischen 2 und 6 cm durch Verschiebung auf einer Schiene variiert werden.
Die inneren Elektroden (6) sind als Ag/AgCl-Elektroden ausgeführt. Dabei befindet sich ein chloridierter Silberdraht in einer mit 140 mM KCl gefüllten Glaspipette. Beide Elektroden sind auf einem Block fixiert, wodurch ihr Abstand konstant 1,5 cm beträgt. Zur genauen Platzierung der Monitorelektroden sind diese wie die Applikatorelektroden auf zwei Schienen (4) montiert. Die gesamte Objekthalterung sowie die Elektrodenbefestigungen sind aus Kunststoff gefertigt, um parasitäre Potentiale zu minimieren. Die Verbindung zur Monitorelektronik (5) erfolgt über geschirmte Kabel.
Die Monitorelektroden werden während der Hochspannungsapplikation durch ein Relais galvanisch getrennt, wodurch elektrodenbedingte Artefakte vermieden werden.
Die Spannung an den inneren Elektroden liegt bei einigen Millivolt, so dass ebenfalls Maßnahmen zur Unterdrückung von Störsignalen getroffen werden müssen. Neben der aktiven Filterung mit einer oberen Grenzfrequenz von 500 Hz wurden die Brummeinstreuungen durch die Mittelung über 20 ms minimiert. Dadurch beträgt die Auflösung des Monitorverstärkers 90 μV unter den rauen Bedingungen einer Schlachtlinie.

Claims

1 System mit dem Zellen im Gewebeverband durch einen ultrakurzen Hochspannungsimpuls einseitig elektroporiert werden, um über Messung der aktiv-elektrischen Eigenschaften, für den Einsatz in der Biotechnologie, der medizinischen Diagnostik oder der Lebensmittelindustrie, Aussagen über die Integrität der Membranen und den energetischen Zustand der Zellen erhalten.

System nach Anspruch 1 zur unsymmetrischen Permeabilisierung von Zellmembranen und anschließenden Messung der aktiv elektrischen Potentiale, bestehend aus einem Hochspannungsgenerator und einer Präzisionsspannungsmesseinrichtung gekennzeichnet dadurch, dass der Hochspannungsgenerator Pulse bis zu 150 kV mir einer Länge von bis zu 200 ns erzeugt und an einem äußeren Elektrodenpaar appliziert. Nach dem Stimulus wird die Spannung über einem inneren Elektrodenpaar, bestehend aus symmetrischen Elektroden 2. Art, gemessen und registriert.

Vorrichtung nach Anspruch 2 gekennzeichnet dadurch, dass der Hochspannungsgenerator ein Koaxialkabel lädt, dessen Ladung durch spontane Gasentladung in einer gekapselten Funkenstrecke auf das Objekt übertragen wird.

Vorrichtung nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, dass die Pulsamplitude durch die Art und den Druck des Gases bestimmt wird.

Vorrichtung nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, dass die Pulslänge nur durch die Länge des Koaxialkabels bestimmt wird.

Vorrichtung nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, dass eine Blumlein-Konfiguration zur Pulsformung eingesetzt wird

Vorrichtung nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, dass der Hochspannungsgenerator von einem Transverter mit einem Ausgang bis zu 30 kV gespeist wird und die Hochspannung durch eine Marxx-Kaskade mit anschließendem Netzwerk zur Pulsformung erzeugt wird.

Vorrichtung nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, dass ein Hochspannungskondensator geladen wird, der den Stimulus über eine durch Unterdruck widerstandsbehaftete Funkenstrecke an das Objekt appliziert und die Länge des Pulses durch eine niederohmige Stopp-Funkenstrecke gesteuert wird.

Vorrichtung nach Anspruch 8, gekennzeichnet dadurch, dass die Länge des Pulses durch die Länge eines Koaxialkabels zwischen dem Objekt und der Stopfunkenstrecke bestimmt wird.

Vorrichtung nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, dass die Stopp-Funkenstrecke über eine Hilfselektrode nach der vorgegebenen Pulsdauer gezündet wird.

Vorrichtung nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, dass die Monitorelektroden als Ag/AgCl-Elektroden ausgeführt sind.

Vorrichtung nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, dass die Monitorelektroden als Kalomel-Elektroden ausgeführt sind.

Vorrichtung nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, dass die Monitorelektroden aus iridiumbesputtertem Titan bestehen.

Vorrichtung nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, dass die Monitorelektroden während der Pulsapplikation abgeschaltet werden.

Vorrichtung nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, dass die Monitorelektroden durch Induktivitäten entkoppelt werden.

Vorrichtung nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, dass das Signal der Monitorelektroden durch einen hochohmigen Verstärker konditioniert wird.

Vorrichtung nach Anspruch 16, gekennzeichnet dadurch, dass das Monitorsignal mit der Netzfrequenz synchronisiert wird, um den Abschirmaufwand für die Gesamtapparatur zu minimieren.

Vorrichtung nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, dass der Spannungs- und Stromverlauf während des Pulses aufgezeichnet wird.

Vorrichtung nach Anspruch 18, gekennzeichnet dadurch, dass die Pulsspannung durch Umwandlung der elektrischen Spannung in ein optisches Signal unter Ausnutzung des elektrooptischen Effekts potentialfrei an den inneren Elektroden gemessen wird.