Kurzbeschreibung
der Erfindung
Es
wurde überraschenderweise
gefunden, daß spezielle
Substanzen, die sich als Geruchsrezeptorliganden eignen und dabei
spezifisch an den Geruchsrezeptor 51E2 (auch PSGR genannt) binden,
wie z.B. das Wachstum von Prostatatumoren deutlich verlangsamen.
Da dieser Rezeptor im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung
auch in Hautkrebs-Biopsaten identifiziert werden konnte, und humane
Melanocyten auf β-Ionon
Applikation auch einen Calcium-Einstrom aufweisen, lassen sich β-Ionon und β-Ionon verwandte
Substanzen generell zur Melanombehandlung einsetzen. Die vorliegende
Erfindung betrifft somit
- (1) die Verwendung
eines Liganden, der an den Geruchsrezeptor 51E2 (PSGR) bindet, zur
Behandlung von Krebs oder Tumoren ausgewählt aus Krebs/Tumoren der Haut,
der Prostata (Prostatakarzinom), der Lunge und der Leber;
- (2) eine bevorzugte Ausführungsform
von (1), wobei der Geruchsrezeptorligand ausgewählt ist aus der Gruppe der
Riech- oder Aromastoffe
und Steroide; und
- (3) die Verwendung eines steroidischen Geruchsrezeptorliganden,
der ein Gonan, Estran- oder Pregnanderivat ist, zur Behandlung von
Krebs und Tumoren, die den Geruchsrezeptor 51E2 exprimieren und
vorzugsweise ausgewählt
aus Krebs/Tumoren der Brust, der Ovars (Eierstöcke), der Leber und des Pankreas; und
- (4) Verwendung eines Riech- oder Aromastoffes zur Behandlung
von Krebs und Tumoren, die ausgewählt sind aus Krebs/Tumoren
der Brust, der Ovars (Eierstöcke)
und des Pankreas.
Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung der vorstehend
genannten Krebs- oder Tumorarten, sofern diese den Geruchsrezeptor
51E2 exprimieren, umfassend die Verabreichung eines Geruchsrezeptor-liganden,
wie in (1) bis (4) definiert, an einen Patienten, der einer solchen
Behandlung bedarf.
Kurzbeschreibung
der Figuren
1:
(A) Calcium-Imaging in HEK293 Zellen (Beispielspuren) nach Transfektion
mit einem erstellten Plasmid, welches für den Rezeptor PSGR kodiert.
(A) aus einer Mischung mit 100 verschiedenen Duftsubstanzen der
Firma Henkel wurde als Ligand für
PSGR β-Ionon
identifiziert. (B) aus einer Mischung strukturell ganz verschiedener
Steroide wurde 6-Dehydrotestosteron,
ADT und 1,4,6-Androstatrien-17β-ol-3-on,
die alle ein dem β-Ionon
vergleichbares Strukturmotiv enthalten, als Ligand identifiziert.
2:
(A) β-Ionon
erzeugt auch in Zellen der Prostataepithel-Zelllinie LNCaP Calcium-Anstiege
(Beispielspuren). (B) Diese Calcium-Anstiege verschwinden nach Reduktion
der PSGR Expression durch PSGR spezifische siRNA, was die Spezifität des beobachteten
Effekts beweist. Die Quantifizierung des Calcium-Anstiegs in unbehandelten LNCaP Zellen
(Control) und in Zellen, die das siRNA Plasmid aufgenommen haben (erkennbar
durch Koexpression von auf demselben Plasmid kodiertem GFP), zeigt
eine deutliche Abhängigkeit der
Aktivierung der Zellen durch β-Ionon
von der Expressionsstärke
des PSGR. (C) Calcium-Imaging Experiment (beispielhaft), in dem
der fehlende β-Ionon
induzierte Calcium-Anstieg in den GFP exprimierenden LNCaP Zellen
deutlich zu sehen ist. (D) Die als Liganden für den heterolog exprimierten
PSGR Rezeptor identifizierten Steroide erzeugen auch in LNCaP Zellen
Calcium-Anstiege:
Beispielspuren für
ADT induzierte Calcium-Anstiege in LNCaP Zellen. (E) Quantifizierung
des ADT induzierten Calciumanstiegs in LNCaP Zellen, in denen die
PSGR Expression durch Transfektion mit siRNA unterdrückt wurde.
(F) Calcium-Imaging Experiment, in dem der fehlende ADT induzierte
Calcium-Anstieg
in den GFP exprimierenden LNCaP Zellen deutlich ist.
3:
(A) Der durch β-Ionon
induzierte Calcium-Anstieg (control) wird durch Inkubation der LNCaP Zellen
mit U73122, aber nicht durch MDL geblockt. Der Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration hängt somit
von der Aktivierung der Phospholipase C vermittelten Signaltransduktionskaskade
ab, Adenylatzyklasen scheinen nicht beteiligt zu sein. (B) Die intrazelluläre Calcium-Konzentration
steigt auch in Calcium freier extrazellulärer Lösung nach Applikation von β-Ionon an,
es findet also eine Calcium-Freisetzung aus intrazellulären Calciumspeichern
statt. (C) Die Entleerung der intrazellulären Calciumspeicher mit Thapsigargin vor
der Applikation von β-Ionon
verhindert einen β-Ionon
vermittelten Anstieg der intrazellulären Calcium-konzentration.
Der Anstieg der Calciumkonzentration nach Aktivierung des PSGR führt also
primär über eine
Freisetzung von Calcium-Ionen aus intrazellulären Calciumspeichern. (D) Die
Inkubation der Zellen mit Inhibitoren für zur TRP-Familie gehörende Calciumkanäle verhindert
einen deutlichen β-Ionon
vermittelten Anstieg der cytosolischen Calcium-konzentration. Diese
Kanäle
sind also essentiell am Calciumeinstrom beteiligt.
4:
Western Blot Analyse der β-Ionon
induzierten Phosphorylierung von zur MAPK Kaskade gehörenden Kinasen.
LNCaP Zellen wurden hierzu für
5, 10, 20 und 30 Minuten mit dem Liganden stimuliert, die Zellen
wurden lysiert und die entsprechenden Zelllysate wurden auf SDS-PAGE
Gelen aufgetrennt. Jeweils gleiche Mengen der auf Nitrozellulose
transferierten Lysate wurden dann mit Antikörpern, die nur gegen die phosphorylierte
Form der p38 bzw. SAPK/JNK MAPK gerichtet sind inkubiert, und mit
solchen verglichen, die die jeweilige MAPK unabhängig vom Phosphorylierungsstatus
des Proteins detektieren. Erkennbar ist, dass durch Inkubation der
LNCaP Zellen mit β-Ionon sowohl p38,
als auch SAPK/JNK Kinasen phosphoryliert, und damit aktiviert werden.
5:
(A und B) Die Proliferationsrate von LNCaP Zellen kann (im Vergleich
zur unbehandelten Kontrolle) durch Dehydrotestosterone (DHT), wie
in der Literatur beschrieben, stimuliert werden. Die Applikation von β-Ionon (250 μM) führt dagegen
zur Inhibierung der Zellproli-feration. Die Koapplikation von DHT
und β-Ionon
führt zu
einer deutlichen Senkung der DHT induzierten Proliferationsraten.
(C und D) Auch die Proliferationsrate von primären Prostataepithelzellen kann
durch DHT stimuliert und durch β-Ionon
verringert werden. Auch hier führt
die Koapplikation von DHT und β-Ionon
zur Senkung der DHT induzierten Proliferationsraten. Die Behandlung
von LNCaP und PCE Zellen mit 5 bzw. 250 μM β-Ionon führt im Vergleich zu unbehandelten Zellen zu
einer deutlichen Fragmentiertung der aus den jeweiligen Zellen isolierten
DNA (erkennbar an der starken Zunahme der Anzahl und Intensität an niedermolekularen
DNA Banden).
6:
(A) Die genaue Untersuchung der kultivierten Zellen mit Phasenkontrastmikroskopie
zeigt, dass nahezu alle Zellen eine typische Morphologie von Epithelzellen
aufweisen. (B) Die kultivierten Epithelzellen, und im Vergleich
dazu die auch untersuchten LNCaP Zellen, wurden mit RT-PCR auf die Expression
verschiedener Markerproteine hin untersucht. Beide Zelltypen exprimieren
die typischen Marker von Prostataepithel-Karzinomzellen PSA (Prostata-spezifisches
Antigen), AR (Androgen Rezeptor), CK8 (Cytokeratin 8) und CK18 (Cytokeratin
18). Beide Zelltypen exprimieren zudem den PSGR Rezeptor. (C) Primäre Prostataepithelzellen
wurden mit Calcium-Imaging Experimenten untersucht. Die Zellen reagieren
auf Applikation von β-Ionon und
ADT mit einem Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration, ähnlich wie
die zuvor untersuchten LNCaP Zellen. Der Calcium-Einstrom konnte
zudem hier auch mit einem pharmakologischen Blocker der Phospholipase
C unterdrückt
werden, was darauf hin deutet, dass in beiden Zelltypen derselbe
Signaltransduktions-mechanismus abläuft.
Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
Bei
der Ausarbeitung der vorliegenden Erfindung ist dazu gezielt nach
Liganden für
den Geruchsrezeptor 51E2 (PSGR) gesucht worden, und zwar in Mischungen
von in der Parfümerie
häufig
verwendeten, chemisch sehr unterschiedlichen Duftsubstanzen (Alkohole,
Aldehyde, Ketone, Amine, aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe,
Heterocyclen usw.). Hierzu wurde der Rezeptor kloniert, in einem
heterologen Zellsystem zur Expression gebracht, und mit Calcium-Imaging
Experimenten auf Aktivierbarkeit durch die erwähnten Duftsubstanzen hin untersucht.
Durch diese Experimente konnte β-Ionon
als Ligand identifiziert werden. Mit demselben Ansatz wurden weiterhin
Steroide mit ähnlichen
strukturellen Motiven wie β-Ionon
auf eine mögliche
Aktivierung des heterolog exprimierten Rezeptors hin untersucht
und verschiedene Steroidliganden konnten identifiziert werden, nämlich 6- Dehydrotestosteron,
ADT und 1,4,6-Androstatrien-17β-ol-3-on.
Im Verlauf weiterer Experimente zeigte sich, dass diesselben Substanzen
auch den endogenen PSGR in LNCaP-Zellen (humane Prostatakarzinomzellinie)
und in Primärkulturen
von Prostatatumoren aktivieren.
Es
ist dann untersucht worden, welche Auswirkungen die Aktivierung
des PSGR durch die identifizierten Liganden auf Zellzyklus und Apoptose
von Prostatakarzinomzellinien und primären Prostatazellen haben, und
welcher Mechanismus dieser Wirkung zugrunde liegt. Die Applikation
von β-Ionon
auf die erwähnten
Zellen führt
dabei zu einer Aktivierung (Phosphorylierung) von zur Familien der
MAP-Kinasen gehörenden
Proteinen (p38 und SAPK/Jnk). Die Aktivierung dieser Enzyme führt dann
zur Inhibition der Proliferationsrate der Zellen und induziert den
sogenannten programmierten Zelltod (Apoptose). Die proliferationshemmende
Wirkung der Liganden bremst sogar die durch Testosteron induzierte
vermehrte Zellproliferation ab.
In
einem bevorzugten Aspekt der Ausführungsformen (1) oder (2) der
Erfindung ist der Geruchsrezeptorligand ein Riech- oder Aromastoff
und vorzugsweise ein Terpen oder Terpenderivat. Hierbei ist beonders
bevorzugt, dass das Terpen oder Terpenderivat ein Ionon oder Iononderivat,
insbesondere ein β-Ionon
oder ein Derivat desselben ist.
In
einem weiteren bevorzugten Aspekt der Ausführungsformen (1) oder (2) der
Erfindung ist der Geruchsrezeptorligand ein ein Steroid ist. Hierbei
ist das Steroid vorzugsweise ein Gonanderivat der nachfolgenden
Formel (I), ein Androstanderivat der nachfolgenden Formel (II),
ein Pregnanderivat der nachfolgenden Formel (III) oder ein Estranderivat
der nachfolgenden Formel (IV).
Hierbei
sind solche Derivate besonders bevorzugt, die
- (i)
wenigstens eine, vorzugsweise wenigstens zwei C-C-Doppelbindungen
aufweisen, bevorzugt wenigstens zwei C-C-Doppelbindungen in den
Positionen 4 und 6 aufweisen, und/oder
- (ii) wenigstens eine, vorzugsweise wenigstens zwei funktionelle
Gruppen ausgewählt
aus OH, =O, NH2 und Derivate derselben (insbesondere
Ester, Acetale Ketale, Amide oder Imide) in den Positionen 3 und/oder 17
tragen, bevorzugt unabhängig
voneinander einen OH und/oder =O Rest in den Positionen 3 und 17
tragen.
Weiterhin
können
die genannten Derivate einen oder mehrere C1-6 Alkyl-,
Alkylen- oder Cycloalkylenreste aufweisen, insbesondere einen oder
zwei Methylreste in den Positionen 10 und 13, besonders bevorzugt zwei
Methylreste in den Positionen 10 und 13 tragen, wie dies bei den
Androstan- und Estranderivaten
der Formeln (II) und (IV) der Fall ist.
Bevorzugte
steroidische Geruchsrezeptorliganden sind z.B. 6-Dehydrotestosteron, 1,4,6-Androstatrien
(ADT) und 1,4,6-Androstatrien-17β-ol-3-on, Exemestan
(6-Methylenandrosta-1,4-dien-3,17-dion), 4,6-Androstadien-17α-methyl-17β-ol-3-on, 4,6-Androstadien-17β-ol-3-on
Acetat, 4,6-Androstadien-3,17-dion, 4,6-Androstadien-17β-ol-3-on
Benzoat, 4,6-Androstadien-17β-ol-3-on
Carboxymethyloxim, 4-Androsten-3,6,17-trion; 4,6-Estradien-3,17-dion, 4,6-Estradien-17β-ol-3-on,
4,6-Estradien-17β-ol-3-on
Acetat, 4,6-Pregnadien-3,20-dion, 4,6-Pregnadien-6-methyl-17-ol-3,20-dion
Acetat, und 1,4,6-Pregnatrien-3,20-dion. Besonders bevorzugt sind
6-Dehydrotestosteron,
1,4,6-Androstatrien, 1,4,6-Androstatrien-17β-ol-3-on und Exemestan.
Als
Gonan, Estran- oder Pregnanderivate der Ausführungsform (3) bzw. Riech- oder Aromastoffe
in der Ausführungsform
(4) der Erfindung können
die vorstehend erwähnten
bevorzugten Verbindungen eingesetzt werden.
Die
Menge an Geruchsrezeptorliganden, die zur Krebs-/Tumorbehandlung
eingesetzt wird, kann von dem behandelnden Arzt durch sein Fachwissen
bestimmt werden. Sie richtet sich dabei unter Anderem nach der Art
des Krebses/Tumors, der Schwere der Erkrankung, dem Alter und der
Konstitution des Patienten. Üblicherweise
wird die verabreichte Dosis an Geruchsrezeptorligand im Bereich
von 1 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 5 mg/kg Körpergewicht des Patienten pro
Tag liegen. Die Verabreichung der erforderlichen Dosis kann dabei
in einer einzigen oder mehreren Gaben erfolgen.
Die
Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Diese
Beispiele sollen den Schutzbereich der Erfindung jedoch nicht einschränken.
Beispiele
Materialien und Methoden
Vektorkonstruktion:
Der
komplette Leserahmen des PSGR Rezeptors (NM_030774 (erhältlich im
Internet unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=1992363 0);
gi:11875777) wurde von humaner genomischer DNA mittels PCR amplifiziert;
die hierfür
verwendeten spezifischen Primer PSGR_up GCGAATTCACCATGAGTTCCTGCAACTTCACACATGC
(Seq ID NO:1)
und
PSGR_dw GCGAATTCTCACTTGCCTCCCACAGCCTGCAAGTCC
(SEQ ID NO:2
enthielten Restriktionsstellen für die Klonierung
und das PCR Produkt wurde in die EcoRI Restriktionsschnittstelle
des Vektors pcDNA3 (Invitrogen) kloniert.
Zellkultur:
HEK293
cells wurden in MEM Medium (Invitrogen) kultiviert, welches mit
10 % FBS und Antibiotika (Penicillin/Streptomycin) supplementiert
war. Semikonfluente HEK Zellen wurden in 35 mm Zellkulturschalen ausgesät und mittels
Calcium-Phosphat Präzipitationstechnik
mit dem PSGR Plasmid transfeziert. Die Messungen wurden 48–72 Stunden
nach der Transfektion durchgeführt.
LNCaP Zellen wurden in RPMI 1640 Medium (Invitrogen) kultiviert,
welches mit 10 % FBS (Invitrogen) und Antibiotika (Penicillin/Streptomycin)
supplementiert war. Primäre
Epithelzellen der Prostata wurden aus Prostatakrebs-Biopsaten gewonnen.
Die Biopsate wurden dazu dissoziiert (0,1 % Trypsin für 30 min,
37°C) und
in KSF Medium (Invitrogen) supplementiert mit 50 μg/ml Hypophysenextrakt
und 50ng/ml EGF ausgesät.
Die Zellen wurden in 50 ml Zellkulturflaschen bei 37°C in einem
humidifizierten Inkubator in einer 5%igen CO2-Atmosphäre angezogen.
Für die
Proliferationsassays und Calcium Imaging Experimente wurden die
Zellen in Petrischalen (Nunc) kultiviert und nach 3–6 Tagen
verwendet. Die Zellmorphologie wurde mit Phasenkontrast Mikroskopie überprüft.
Calcium-Imaging:
Für Calcium-Imaging-Messungen
wurden HEK Zellen 2–3
Tage nach transienter Transfektion, LNCaP und primäre Prostataepithelzellen
3–6 Tage
nach Aussaat benutzt. Die Zellen wurden vor Messbeginn 30 min bei
37°C in
modifizierter Ringer-Lösung
mit 3 μM
Fura-2/AM (Molecular Probes) beladen und anschließend 30 min
in modifizierter Ringerlösung
inkubiert. Die Ringerlösung
enthielt gegebenenfalls die jeweils verwendeten Inhibitoren (50 μM MDL (Sigma)
als Blocker der Adenylatzyklase; 10 μM U73122 (Calbiochem) als Blocker
der PhospholipaseC; Ruthenium Red (3 μM) und 2-APB (50 μM) als TRP-Kanal Inhibitoren;
1 μM Tharpasigargin (Calbiochem)
zur Entleerung intrazellulärer
Calciumspeicher).
Zur
Messung wurde ein inverses Mikroskop Axiovert 100 der Firma Zeiss
verwendet, die verschiedenen monochromatischen Wellenlängen wurde
mit einem Monochromator der Firma T.I.L.L. Photonics erzeugt. Sämtliche
Aufnahmen erfolgen über
eine CCD-Kamera (Modell PXL37 der Firma Photometrics); die Kamerasteuerung,
Aufzeichnung der Meßergebnisse,
Datenspeicherung sowie Datenbearbeitung erfolgt mittels des Programms
Till Vision 3.03 der Firma T.I.L.L. Photonics.
Die
Liganden wurden automatisiert über
druckluftbetriebene Kanülen
appliziert, die verwendete Konzentration von β-Ionon und anderen Duftstoffen
war 500 μM,
Steroidhormone (Steraloids, USA) wurden in Konzentrationen von 50 μM auf die
Zellen appliziert. Duftstoffe und Steroide wurden in mehreren unabhängigen Experimenten
auf eine potentielle Aktivierung von PSGR in HEK Zellen getestet
und dann auf Aktivität
in LNCaP Zellen hin überprüft. Alle
Komponenten wurden als Liganden gewertet, wenn eindeutige Ca2+ Antworten in mehreren unabhängigen Experimenten
(n > 7) beobachtet
werden konnten und keine Ca2+ Signale in
untransfizierten HEK Zellen auftraten. ATP (200 μM) wurde als Positivkontrolle
am Ende jedes Experimentes in HEK Zellen appliziert.
SiRNA Design und Transfektion:
PSGR
hairpin siRNA wurde mit dem siRNA Target Designer (Version 1.51
von Promega) entworfen, und die nachfolgend gezeigten, von Invitrogen
bezogenen Oligonukleotide
5'-TCTCGCTGCCTCCTGTCATCAATAAGTTCTATTGATGACAGGAGGCAGCCT-3' (SEQ ID NO:3)
5'-CTGCAGGCTGCCTCCTGTCATCAATAGAACTTATTGATGACAGGAGGCAGC-3' (SEQ ID NO:4)
wurden
in den Vektor pGeneClipTM hMGFP (Promega)
nach Angaben des Hersteller kloniert. LNCaP Zellen wurden in a 35
mm Zellkulturschalen mit 3 μg/Schälchen siRNA
und 9.9 μl
Exgene500 (Fermentas) transfiziert. Die Zellen wurden 48 h nach
der Transfektion gemessen.
MAPK Assay:
LNCaP
Zellen wurden mit 500 μM β-Ionon für 0, 5,
10, 20 und 30 Minuten inkubiert. Lyse-Puffer (50 mM Tris HCl, pH
7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton® X-100,
Protease Inhibitor Cocktail (Roche)) wurde direkt nach der Duftapplikation
in die Kulturflaschen pipettiert, die Zellen wurden abgelöst und 10
Minuten bei 12,000 g zentrifugiert. Die Überstände wurden dann mit Laemmli
Puffer (30 % Glycerin, 3 % SDS, 125 mM Tris/Cl, pH 6.8) gemischt, über 10%ige
SDS-PAGE Gele aufgetrennt und auf Nitrozellulose (Protran; Schleicher & Schuell) transferiert.
Die Nitrozellulosemembran wurde mit Ponceau 5 (Sigma) gefärbt, mit
TBST-M (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, Tween20, pH 7.4, 5 % fettfreie
Trockenmilch) blockiert und mit den primären Antikörpern inkubiert. Verwendet
wurden polyklonale Antikörper
gegen SAPK/JNK MAPK und gegen phosphorylierte SAPK/JNK MAPK, sowie
polyklonale Antikörper
gegen p38 MAPK und phosphorylierte p38 MAPK (alle von New England
Biolabs). Nach Waschen und Inkubation mit HRP gekoppelten Sekundärantikörpern (Biorad) wurden
die Signale mit ECL plus (Amersham) auf Hyperfilm ECL (Amersham)
detektiert.
Proliferationsassay:
LNCaP
Zellen und primäre
humane Prostataepithelzellen wurden in 96 Well Platten mit einer
Dichte 5 × 103 Zellen/Well ausgesät. Nach 24 Stunden bei 37°C mit 5 %
CO2 wurden die Zellen entweder mit verschiedenen
Konzentrationen β-Ionon
(50 nM bis 250 μM),
DHT (10 nM), oder einer Mischung aus β-Ionon (250 μM und 100 μM) und DHT (10 nM) behandelt.
Die Proliferationsraten wurden mit dem CyQUANT Zellproliferations Reagenz
(Molecular Probes) wie vom Hersteller beschrieben durchgeführt.
Agoptose Assay:
LNCaP
Zellen und primäre
humane Prostataepithelzellen wurden mit 10 μM, 100 μM und 250 μM β-Ionon für 3 Tage behandelt und mikroskopisch
untersucht. Die Induktion der Apoptose wurde dann molekularbiologisch über die
entstehende DNA Fragmentierung mit einem "Apoptotic DNA Ladder Kit" (Roche) nachgewiesen.
RT-PCR Nachweise:
RNA
von LNCaP Zellen und primären
humanen Prostataepithelzellen wurde mit Trizol Reagenz (Invitrogen)
isoliert, mit DNaseI verdaut und wiederum mit Trizol Reagenz gereinigt
vor der Isolation der polyA+ mRNA durch Binden an oligo-dT-beschichtete
paramagnetische Partikel (Dynal). cDNA wurde mit MMLV reverser Transkriptase
(Invitrogen) und oligo(dT12-18) Primern synthetisiert. Die nachfoldenden
Amplifikationen wurden mit 1ng cDNA und spezifischen Primerpaaren
für PSGR,
PSA, Androgenrezeptor, Cytokeratin8, und Cytokeratin18 über 35 Zyklen
(94°C, 1
min/58°C,
1 min/72°C
45 s) durchgeführt.
Der
zur Familie der Geruchsrezeptoren gehörende G-Protein gekoppelte
Rezeptor PSGR kommt in den Epithelzellen der Prostata vor und wird
bei der Entstehung von Prostatakrebs im Prostataepithel überexprimiert.
Da dieser Rezeptor damit ein potentielles Zielprotein für die Behandlung
von Prostatakarzinomen ist, wurde gezielt nach Liganden für diesen
speziellen Geruchsrezeptor (OR51E2 oder PSGR) gesucht. Die Aktivierung
des Rezeptors durch spezifische Liganden stellt eine Möglichkeit
zur Entwicklung einer möglichst
gezielten Chemotherapie von Prostatakarzinomen dar. Da der G-Protein gekoppelte
Rezeptor PSGR zur Familie der Geruchsrezeptoren gehört, die
normalerweise in der Riechschleimhaut Duftmoleküle detektieren, wurde in Mischungen
von in der Parfümerie
häufig
verwendeten, chemisch sehr unterschiedlichen Duftsubstanzen (Alkohole,
Aldehyde. Ketone, Amine, aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe,
Heterocyclen usw.) nach potentiellen Liganden für PSGR gesucht worden. Hierzu
wurde der Rezeptor kloniert, heterolog in HEK293 Zellen exprimiert
und mit Calcium-Imaging Experimenten auf Aktivierbarkeit durch die
erwähnten
Duftsubstanzen hin untersucht. Aus der Mischung Henkel 100-Mix (enthaltend
die fogenden 100 Verbindungen: Geranonitril, Acetophenon, Eucalyptol,
Thymol, Anethol, Menthol, Kampfer, Muscone, Citronellol, Süssorangenöl, Cymol (p-Cymen),
Eugenol, Geraniol, Hedione, Helional, Lyral, D-Carvon, L-Carvon,
Citral a, Benzylacetat, Sassafrasöl, 15-Pentadecanolide, Methylsalicylat,
Linalool, Phenylethylalkohol, α-Hexylzimtaldehyd, α-Amylzimtaldehyd,
Isobornylacetat, Dihydromyrcenol, Benzylsalicylat, Galaxolid, Terpentinöl, Fixolide
NP, Cumarin, Styrylacetat, Piperonal, β-Ionon, PTBCA 25 cis, Traseolid,
Aldehyd C12, Benzylbenzoat, Cyclamenaldehyd, DMBCA, iso-Nonylacetat,
Benzophenon, Bourgeonal, Benzylalkohol, OTBCA, Zimtalkohol, Allylheptanoat,
Oxyphenylon, Zimtaldehyd, Agrunitril, Brahmanol, Citrathal, Dimetol,
Epitone, iso-Nonylalkohol,
Phenylethylacetat, Phenirat, Octanal, Ethylfruitat, Hexylacetat,
Neobergamat, Anisaldehyd, Citrusal, Cedrylacetate, Ethylvanillin, Evernyl,
Ligustral, Dimedon, Sandalore, Vanillin, Aldehyde 11-11 (n-/iso-Undecanal),
Aldehyde 13-13 (n-/iso-Tridecanal), Ambroxan (Dodecahydro-3a,6,6,9a-etramethyl-[3aR-(3a.alpha,5a.beta,9a.-alpha,9b.beta]naphto[2,1-b]FIRAN),
Anthoxan (4-Isopropyl-5,5-dimethyl-1,3-dioxan), Boisambrene forte
(Ethoxymethly-cyclododecylether), Cyclohexylsalicylat, Cyclovertal
(3,6(4,6)-Dimethyl-3-cyclohexen-1-carbaldehyd),
Floramat (Ethyl-2-tert-butylcyclohexylcarbonat),
Herbavert (3,3,5-Trimethylcyclohexylethylether), Irotyl (2-Ethylethylcapronat),
Jasmacyclat (2-Cyclohexylpropanal), Melusat (3,5,5-Trimethylethylcapronat),
Peranat (2-Methyl,2-methylphenylehter-Pentansäure), Romilat (3-Methly-3-butenyl-2,2-dimethylpropionat),
Sandelice, Trivalon, Troenan (5-Methyl-5-propyl-2-(1-methylbutyl)-1,3-dioxan),
Verdoxan (2,2,5,5-Tetramethyl-4-isorpopyl-1,3-dioxan), Propidyl,
Heptanal, Oktanol, Amylbutyrat, Prenylacetat, Ethylamylketon, Methylhexylketon und
Acedyl) konnte als Ligand für
PSGR β-Ionon
identifiziert werden (1A).
Um
nach möglichen
endogenen Liganden zu suchen wurde eine Mischung strukturell ganz
verschiedener Steroide auf potentielle Aktivierung des PSGR hin
untersucht Die hierfür
eingesetzte Mischung enthält folgende
Verbindungen: 4,6-Androstadien-17β-ol-3-on,
4, 6-Androstadien-3-on, 5α-Androstan-3β,16β-diol, 5α-Androsten-3β,17β-diol, 5α-Androstan-3,7-dion,
5β-Androsten-3α-ol-11,17-dion,
5β-Androstan-3α-ol-17-on, 1,4,6-Androstatrien-3,17-dion,
1,4,6-Androstatrien-17β-ol-3-on,
1,(5α)-Androstan-4-aza-3-on-17β-(N-tert-butyl-carboxamid),
1,(5α)-Androsten-17β-ol-3-on,
4-Androsten-3β,17β-diol, 4-Androsten-6β,17β-diol-3-on,
4-Androsten-11α,
17β-diol-3-on, 4-Androsten-16α,17β-diol-3-on,
4-Androsten-11β-ol-3,17-dion,
5-Androsten-3β,17β-diol, 5-Androsten-3β-ol-17-on,
5-Androsten-3β,7α-diol-17-on, 16, (5α)-Androsten-3α-ol, 16,(5α)-Androsten-3-on,
3,3'-bis(3,5-Cholestadien), 5α-Cholansäure-3β-ol, 5β-Cholansäure, 5β-Cholansäure-3α,6α-diol, 5β-Cholansäure-3α,6β-diol, 5β-Cholansäure-3α,7α-diol, 5β-Cholansäure-3α,12α-diol, 5β-Cholansäure-3α-ol, 5β-Cholansäure-3α,6α,7α-triol, 5β- Cholansäure-3α,7α,12α-triol, 5,22-Cholestadien-24β-methyl-3β-ol, 5α-Cholestan, 5β-Cholestan,
5β-Cholestan-3α-ol, 5,7,22-Cholestatrien-24β-methyl-3β-ol, 5-Cholesten-3β, 25-diol,
5-Cholesten-24β-ethyl-3β-ol ~54 %,
5-Cholesten-3β-ol, 5-Cholesten-3β-ol-7-on,
Diethylstilbestrol, d-1,3,5(10),5,8-Estrapentaen-3-ol-17-on, 1,3,5(10),7-Estratetraen-3-ol-17-on,
1,3,5(10)-Estratrien-3,17α-diol, 1,3,5(10)-Estratrien-3,17β-diol, 1,3,5(10)-Estratrien-3,17β-diol-6-on,
1,3,5(10)-Estratrien-17α-ethinyl-3,17β-diol, 1,3,5(10)-Estratrien-3-ol-17-on,
1,3,5(10)-Estratrien-2,3,17β-triol
2-Methylether, 1,3,5(10)-Estratrien-3,4,17β-triol, 1,3,5(10)-Estratrien-3,16α,17β-triol, 4-Estren-17α-ethinyl-18-homo-17β-ol-3-on(+/–), 4-Estren-17α-ethinyl-17α-ol-3-on,
4-Estren-17β-ol-3-on,
23-Nor-5β-cholansäure-3α,12α-diol, 1,4-Pregnadien-9α-chloro-16β-methyl-11β,17α,21-triol-3,20-dion,
1,4-Pregnadien-17,21-diol-3,11,20-trion,
1,4-Pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β,17,21-triol-3,20-dion, 1,4-Pregnadien-9α-fluoro-16β-methyl-11β,17,21-triol-3,20-dion,
1,4-Pregnadien-(R,S)-11β,16α,17,21-tetrol-3,20-dion
cyclisches 16,17 Aacetal mit Butyraldehyd, 4,6-Pregnadien-6-chloro-1α, 2α-methylene-17-ol-3,20-dion
Acetat, 5α-Pregnan-3α,21-diol-11,20-dion,
5α-Pregnan-3β, 17-diol-20-on,
5α-Pregnan-3, 20-dion,
5α-Pregnan-3α-ol-11, 20-dion,
5α-Pregnan-3α-ol-20-on,
5β-Pregnan-3α-ol-20-on,
5β-Pregnan-3β-ol-20-on,
5β-Pregnen-3α,17,20α,21-tetrol-11-on, 4-Pregnen-11β,17-diol-3,20-dion,
4-Pregnen-11β,21-diol-3,20-dion, 4-Pregnen-17,21-diol-3,20-dion,
4-Pregnen-17,20β-diol-3-on,
4-Pregnen-11β,21-diol-3,18,20-trion,
4-Pregnen-17,21-diol-3,11,20-triol, 4-Pregnen-3,20-dion, 4-Pregnen-17-ol-3,20-dion,
4-Pregnen-21-ol-3,20-dion, 4-Pregnen-11β,17,21-triol-3,20-dion,
5-Pregnen-3β,17-diol-20-on,
5-Pregnen-3β-ol-20-on,
Spirolacton, 5α,20α,22α,25D-Spirostan-3β-ol, 5α,20α,22α,25D-Spirostan-3β-ol-12-on,
5β,20α,22β,25L-Spirostan-3β-ol und 5,20α,22α,25D-Spirosten-3β-ol.
