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DE102005034443A1 - Sample e.g. cell particle, luminescence microscopy method, involves prevailing one of sample regions for image of sample, so that image has local resolution which is enhanced in relation to excitation radiation distribution - Google Patents

Sample e.g. cell particle, luminescence microscopy method, involves prevailing one of sample regions for image of sample, so that image has local resolution which is enhanced in relation to excitation radiation distribution

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DE102005034443A1
DE102005034443A1 DE200510034443 DE102005034443A DE102005034443A1 DE 102005034443 A1 DE102005034443 A1 DE 102005034443A1 DE 200510034443 DE200510034443 DE 200510034443 DE 102005034443 A DE102005034443 A DE 102005034443A DE 102005034443 A1 DE102005034443 A1 DE 102005034443A1
Authority
DE
Grant status
Application
Patent type
Prior art keywords
sample
image
regions
excitation
distribution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE200510034443
Other languages
German (de)
Inventor
Michael Dr. Kempe
Ralf Dipl.-Phys. Wolleschensky
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Original Assignee
Jenoptik AG
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Publication date

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    • GPHYSICS
    • G02OPTICS
    • G02BOPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS, OR APPARATUS
    • G02B21/00Microscopes
    • G02B21/16Microscopes adapted for ultra-violet illumination ; Fluorescence microscopes
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using infra-red, visible or ultra-violet light
    • G01N21/62Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458Fluorescence microscopy

Abstract

The method involves displacing two partial regions of a sample in two states, respectively, while irradiation of excitation radiation (A) takes place with an excitation radiation distribution. An image of a luminescent sample has two sample regions in the states, respectively. One of the sample regions prevails for the image of the sample, so that the image has a local resolution which is enhanced in relation to the distribution. An independent claim is also included for a microscope for resolution enhanced luminescence microscopy of a sample.

Description

  • [0001] [0001]
    Die Erfindung bezieht sich auf die auflösungsgesteigerte Lumineszenzmikroskopie und insbesondere auf ein Verfahren, bei dem eine zu untersuchende lumineszierende Probe mit Anregungsstrahlung beleuchtet wird und ein Bild der zur Lumineszenz angeregten Probe gewonnen wird. The invention relates to the resolution enhanced luminescence microscopy and more particularly to a method in which a to be examined luminescent sample with excitation radiation is illuminated and an image of the excited to luminescence sample is obtained. Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Mikroskop zur auflösungsgesteigerten Lumineszenzmikroskopie einer Probe, das Mittel zur Anregung von Lumineszenz, die in der Probe Anregungsstrahlung einstrahlen und Mittel zur Gewinnung eines Bildes der angeregten Probe aufweist. The invention further relates to a microscope for resolution-enhanced luminescence of a sample, the means for excitation of luminescence, which radiate into the sample excitation radiation and means for obtaining an image of the excited sample.
  • [0002] [0002]
    Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Lumineszenzmikroskopie. A classic application of light microscopy for analyzing biological specimens is the luminescence. Hierbei werden bestimmte Farbstoffe (sogenannte Phosphore oder Fluorophore) zur spezifischen Markierung von Proben, zB von Zellteilen, verwendet. Here, certain dyes (so-called phosphors or fluorophores) for the specific labeling of samples, for example, parts of cell used. Die Probe wird, wie erwähnt, mit Anregungsstrahlung beleuchtet und das dadurch angeregte Lumineszenzlicht mit geeigneten Detektoren erfaßt. The sample is, as mentioned, is illuminated with excitation radiation and detects the luminescence light excited characterized with suitable detectors. Üblicherweise ist dazu im Lichtmikroskop ein dichroitischer Strahlteiler in Kombination mit Blockfiltern vorgesehen, die die Fluoreszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung abspalten und eine getrennte Beobachtung ermöglichen. Typically, a dichroic beam splitter in combination is provided with blocking filters to the light microscope, which release the fluorescent radiation from the excitation radiation and permit separate observation. Durch dieses Vorgehen ist die Darstellung einzelner, verschieden gefärbter Zellteile im Lichtmikroskop möglich. By doing so, the representation of individual, differently colored cell parts in the light microscope is possible. Natürlich können auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen, sich spezifisch an unterschiedliche Strukturen des Präparates anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden. Of course, several parts of a preparation can be dyed simultaneously with different, bind in a specific to different structures of the preparation dyes. Dieses Verfahren bezeichnet man als Mehrfachlumineszenz. This process is known as multiple luminescence. Auch kann man Proben vermessen, die per se, also ohne Farbstoffzugabe lumineszieren. One can also measure samples which luminesce per se, without dye addition.
  • [0003] [0003]
    Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und Fluoreszenz verstanden, erfaßt also beide Prozesse. Luminescence is here, as is common, understood as a generic term for phosphorescence and fluorescence, that detects both processes.
  • [0004] [0004]
    Weiter ist es zur Probenuntersuchung bekannt, Laser-Scanning-Mikroskope (auch LSM abgekürzt) zu verwenden, die aus einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild mittels einer konfokalen Detektionsanordnung (dann spricht man von einem konfokalen LSM) oder einer nichtlinearen Probenwechselwirkung (sogenannte Multiphotonenmikroskopie) nur diejenige Ebene wiedergeben, die sich in der Fokusebene des Objektives befindet. It is also known to sample analysis, (also LSM hereinafter) to use laser scanning microscope, consisting of a three-dimensionally illuminated image (one speaks of a confocal LSM) by means of a confocal detection device or a nonlinear sample interaction (so-called multi-photon microscopy) only that level play, which is located in the focal plane of the lens. Es wird ein optischer Schnitt gewonnen, und die Aufzeichnung mehrerer optischer Schnitte in verschiedenen Tiefen der Probe erlaubt es anschließend, mit Hilfe eines geeigneten Datenverarbeitungsgerätes ein dreidimensionales Bild der Probe zu generieren, das aus den verschiedenen optischen Schnitten zusammengesetzt ist. There is obtained an optical section, and recording a plurality of optical sections at different depths of the sample then allows to generate a three-dimensional image of the sample, using a suitable data processing device, which is composed of the various optical sections. Die Laser-Scanning-Mikroskopie ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. The laser scanning microscopy is suitable for examination of thick preparations.
  • [0005] [0005]
    Natürlich wird auch eine Kombination von Lumineszenzmikroskopie und Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet, bei der eine lumineszierende Probe in verschiedenen Tiefenebenen mit Hilfe eines LSM abgebildet wird. Naturally, a combination of luminescence microscopy and laser scanning microscopy in which a luminescent specimen is imaged at different depth levels using a LSM is used.
  • [0006] [0006]
    Prinzipiell ist die optische Auflösung eines Lichtmikroskopes, auch eines LSM, durch die physikalischen Gesetze beugungsbegrenzt. In principle, the optical resolution of a light microscope, even a LSM diffraction limited by the physical laws. Zur optimalen Auflösung innerhalb dieser Grenzen sind spezielle Beleuchtungskonfigurationen bekannt, wie beispielsweise 4Pi-Anordnung oder Anordnungen mit Stehwellenfeldern. For optimum resolution within these limits special lighting configurations are known, such as 4Pi arrangement or arrangements with standing wave fields. Damit kann die Auflösung, insbesondere in axialer Richtung gegenüber einem klassischen LSM deutlich verbessert werden. Thus the resolution, especially in the axial direction relative to a classical LSM may be significantly improved. Mit Hilfe nicht-linearer Entvölkerungsprozesse kann weiter die Auflösung auf einen Faktor von bis zu 10 gegenüber einem beugungsbegrenzten konfokalen LSM angehoben werden. With the help of nonlinear depopulation, the resolution can be further increased to a factor of up to 10 compared with a diffraction limited confocal LSM.
  • [0007] [0007]
    Die The 1a 1a /b zeigen ein solches Verfahren, wie es zB in / B show such a process, such as it in US 5866911 US 5866911 beschrieben ist. is described. Dabei wird zur Auflösungssteigerung mit einer zwei Wellenlängen aufweisenden Lichtstrahlung gearbeitet. In this case, light having radiation is worked for increasing resolution with a two wavelengths. Die Lichtstrahlung der einen Wellenlänge wird als Anregungslichtstrahl The light radiation of a wavelength as an excitation light beam 1 1 auf die zu messende Probe mittels eines Objektives fokussiert und regt dort Lumineszenz, hier Fluoreszenz, an. focused on the sample to be measured by means of a lens and excites luminescence, here fluorescence, to. Die Darstellung in den The illustrations in the 1a 1a /b zeigt zur Vereinfachung nur den eindimensionalen Fall. / B shows only the one-dimensional case for simplicity. Die Erhöhung der Ortsauflösung erfolgt nun dadurch, daß ein Lichtstrahl Increasing the spatial resolution is now characterized in that a light beam 2 2 mit der anderen Wellenlänge in Teilbereichen den durch den Anregungslichtstrahl angeregten fluoreszierenden Zustand entvölkert. depopulated with the other wavelength in partial regions excited by the excitation light beam fluorescent state. Man bezeichnet diesen Lichtstrahl deshalb auch als „Entvölkerungs-Strahlung". Nun erfolgt die Einstrahlung zB so, daß sich das Hauptmaximum des Entvölkerungs-Lichtstrahls Is referred to this light beam, therefore, also called "depopulation radiation". Now, the irradiation is carried out, for example, so that the main maximum of the light beam depopulation 2 2 und das Hauptmaximum des Anregungslichtstrahls and the main maximum of the excitation light beam 1 1 teilweise überdecken, wie es in partially overlap, as shown in 1a 1a gut zu erkennen ist. is clearly visible. Durch diese „Abregung" der Probe an den Rändern des mit Anregungsstrahlung Through these "de-excitation" of the sample at the edges of the excitation radiation with 1 1 beleuchteten Bereiches, sendet nur noch ein reduziertes Volumen illuminated area, only sends a reduced volume 3 3 Fluoreszenz aus, wie in Fluorescence from, as shown in 1b 1b gut zu sehen ist. is good to see. Die Auflösung ist durch diese Volumenreduktion folglich gesteigert. The resolution is thus increased by this volume reduction.
  • [0008] [0008]
    2a 2a –c zeigen drei mögliche Mechanismen, mit denen eine solche Entvölkerung erfolgen kann. c show three possible mechanisms by which such depopulation can be done. In In 2a 2a ist der Prozeß der Abregung durch stimulierte Emission (STED) dargestellt. the process of de-excitation by stimulated emission (STED) is shown. Die Anregungsstrahlung liegt im Fluorophor des Niveaus S1 an (Pfeil A). The excitation radiation is in the fluorophore of the levels S1 (arrow A). Die Entvölkerung des derart angeregten Niveaus S1 wird in Richtung des Grundniveaus S0 durch Lichtstrahlung mit einer Wellenlänge im Bereich der Fluoreszenzwellenlänge bewerkstelligt. The depopulation of the excited state S1 is accomplished in such a way in the direction of the ground level S0 by light radiation with a wavelength in the range of the fluorescence wavelength. Pfeil SE zeigt diese stimulierte Emission, deren Wellenlänge der der Lumineszenz (Pfeil F) fast identisch entspricht. SE arrow shows this stimulated emission whose wavelength of luminescence (arrow F) is almost identical. Somit ist die Anregungswellenlänge um den Betrag des Stokesshiftes kurzwelliger als die der Entvölkerungs-Strahlung. Thus, the excitation wavelength by the amount of the Stokes shift with a wavelength shorter than that of the depopulation radiation. Die Auflösungssteigerung gemäß dieses Ansatzes benötigt also zwei unterschiedliche Lichtquellen, wie auch der Stand der Technik in Form der The resolution enhancement in accordance with this approach, therefore, requires two different light sources, as well as the state of the art in the form of DE 4416558 C2 DE 4416558 C2 belegt. occupied.
  • [0009] [0009]
    2b 2 B veranschaulicht einen weiteren möglichen Prozeß der Entvölkerung für das angeregte Niveau S1 (Pfeil A), indem eine Anregung in ein noch höheres Niveau S2 (Pfeil A+) erfolgt, das keine Lumineszenz mehr aussenden kann. illustrates another possible process of the depopulation of the excited level S1 (arrow A) by an excitation in an even higher level S2 (arrow A +) is carried out, which can not emit more luminescence. Dieses Anheben wird im Englischen als Excited State Absorption bezeichnet, weshalb dieses Vorgehen auch mit dem Kürzel ESA belegt ist. This raising is referred to in English as Excited State Absorption, which is why this procedure is also assigned the symbol ESA. Eine entsprechende Schilderung dieses Prozesses findet sich beispielsweise in der An appropriate description of this process is found for example in the US 6633432 US 6633432 . , Da der Abstand der Energieniveaus in einer Probe bzw. einem Farbstoff zu höheren Niveaus hin abnimmt, verwendet man zur Entvölkerung bei dem ESA-Prozeß eine Lichtquelle mit einer geringeren Energie und damit längeren Wellenlänge, als zur Anregung. Since the distance of the energy levels in a sample or a dye decreases to higher levels out using depopulation in the ESA process, a light source with a lower energy and longer wavelength than for excitation. Man braucht also wiederum zwei verschiedene Lichtquellen. So you need turn two different light sources.
  • [0010] [0010]
    Ein weiteres Verfahren zur Entvölkerung stellt für die Fluoreszenz die sogenannte Reversible Saturable Optical Fluorescence Transition dar, die zB in Another method for depopulation provides for the fluorescence is so-called Reversible Saturable Optical Fluorescence transition, for example, in DE 10325460 A1 DE 10325460 A1 beschrieben und in and described in 2c 2c veranschaulicht ist. is illustrated. Dieser Ansatz verwendet zum räumlich hochauflösenden Abbilden einen Farbstoff, der mit Hilfe eines Umschaltstrahls This approach used for high spatial resolution imaging of a dye with the aid of a Umschaltstrahls 4 4 wiederholt aus einem ersten Zustand repeated from a first state 5 5 , in dem Fluoreszenz stattfindet, in einen zweiten Zustand Takes place in the fluorescence in a second state 6 6 , in dem der Farbstoff nicht fluoresziert, überführbar ist, wobei der Farbstoff aus dem zweiten Zustand In which the dye does not fluoresce, is transferable, the dye from the second state 6 6 in den ersten Zustand in the first state 5 5 zurückkehren kann, wie can return as 2c 2c veranschaulicht. illustrated. Die Probe mit dem Farbstoff wird in Teilbereichen mit dem Umschaltstrahl The sample with the dye is in partial areas with the Umschaltstrahl 4 4 in den zweiten Zustand in the second state 6 6 überführt, wobei ein definierter Bereich der Probe ausgelassen wird. transferred, wherein a defined area of ​​the sample is omitted. Mit einem Anregungsstrahl With an excitation beam 1 1 wird dann Fluoreszenzlicht then fluorescent light 7 7 angeregt und anschließend registriert. stimulated and then registered. Das Fluoreszenzlicht The fluorescent light 7 7 stammt dann nur aus Probenvolumina, die zuvor nicht mit dem Umschaltstrahl then only comes from sample volumes not previously with the Umschaltstrahl 7 7 beaufschlagt wurden. were applied. Durch geeignete Überlappung von Anregungsstrahl By a suitable overlap of the excitation beam 1 1 und Umschaltstrahl and Umschaltstrahl 4 4 ist das Volumen, aus dem Fluoreszenzlicht is the volume from which fluorescent light 7 7 emittiert wird, kleiner, als es die Auflösung des Anregungsstrahls is emitted is smaller than the resolution of the excitation beam 1 1 und die Schärfe der Nullstelle des Umschaltstrahls and the sharpness of the zero of the Umschaltstrahls 4a 4a priori erlaubten. priori allowed.
  • [0011] [0011]
    In allen drei genannten Verfahren gemäß In all three above-mentioned method according to 2a 2a bis to 2c 2c erfolgt also die Verhinderung von Fluoreszenz durch den Einsatz von Lichtstrahlung mit einer Wellenlänge, die ungleich der Wellenlänge zur Anregung ist. So is done to prevent fluorescence through the use of light radiation with a wavelength that is not equal to the wavelength for excitation. Zugleich muß diese Lichtstrahlung mindestens eine schart begrenzte örtliche Nullstelle der Strahlungsleistung aufweisen, die die endgültige Auflösung der detektierten Fluoreszenzstrahlung bestimmt. At the same time, this light radiation must have at least one sharply limited local zero of the radiation power, which determines the final resolution of the detected fluorescence radiation. Sobald die Nullstelle nur mehr als Minimum ausgebildet ist und nicht völlig auf Null zurückgeht, verringert sich weiter die Fluoreszenzleistung und damit die Effizienz des Verfahrens. Once the root is more designed as a minimum and not fully return to zero, further reducing the fluorescence power and thus the efficiency of the process. Dies liegt zB bei Aberrationen der optischen Anordnung bzw. im Präparat vor. This is for example at aberrations of the optical assembly, or in the preparation.
  • [0012] [0012]
    3 3 zeigt eine bekannte Vorrichtung, die eines der drei genannten Verfahren zur Auflösungssteigerung verwendet, im Beispiel der shows a prior art device using one of the three processes mentioned for increasing the resolution, in the example of 3 3 den STED-Prozeß. the STED process. Eine Anregungsstrahlquelle An excitation beam source 8 8th erzeugt eine Airy-Verteilung in der Probe produces an Airy distribution in the sample 10 10 , mit der die Probe aus dem Grundniveau S0 in den angeregten Zustand S1 überführt wird. With which the sample is transferred from the ground level to the excited state S0 S1. Die Entvölkerung des Zustands S1 erfolgt mittels einer Entvölkerungslichtquelle The depopulation of the state S1 by means of a Entvölkerungslichtquelle 11 11 , die unter die Verwendung einer Phasenplatte Under the use of a phase plate 12 12 eine donut- oder torus-förmigen Strahlverteilung a donut or torus-shaped beam distribution 13 13 in der Probe in the sample 10 10 hat. Has. Die Lumineszenzstrahlung der nicht-entvölkerten dh nicht-abgeregten Farbstoffmoleküle wird mit Hilfe eines Detektors The luminescence of non-depopulated ie not-excited dye molecules is measured using a detector 14 14 erfaßt. detected. Durch die Entvölkerung wird die Auflösung des Mikroskops über die Beugungsbegrenzung, die sich aus der Airy-Verteilung ergibt, hinaus gesteigert. By depopulation, the resolution of the microscope over the diffraction limit, which results from the Airy distribution is also increased. Dies kommt durch eine verkleinerte Punktverwaschungsverteilung This is due to a reduced point-spread 15 15 des hochauflösenden Mikroskops im Vergleich zum konventionellen Mikroskop the high-resolution microscope in comparison with the conventional microscope 16 16 zum Ausdruck. to expression.
  • [0013] [0013]
    Ein weiteres Verfahren zur Auflösungssteigerung wird in der Another method for increasing the resolution is in the EP 1157297 B1 EP 1157297 B1 angesprochen. addressed. Dabei sollen mittels strukturierter Beleuchtung nichtlineare Prozesse ausgenützt werden. In this non-linear processes are to be exploited by means of structured illumination. Als Nichtlinearität erwähnt die Druckschrift dabei die Sättigung der Fluoreszenz. As a non-linearity, document it mentions the saturation of fluorescence. Das geschilderte Verfahren nimmt in Anspruch, durch eine strukturierte Beleuchtung eine Verschiebung des Objektraumspektrums relativ zur Übertragungsfunktion des optischen Systems zu realisieren. The described method takes, to be realized by a structured illumination, a displacement of the object space spectrum relative to the transfer function of the optical system. Konkret bedeutet die Verschiebung des Spektrums, daß Objektraumfrequenzen V0 bei einer Raumfrequenz V0–Vm, wobei Vm die Frequenz der strukturierten Beleuchtung ist, übertragen werden. In concrete terms the shift of the spectrum, that object space frequencies V0 are transmitted at a spatial frequency V0-Vm wherein Vm is the frequency of the structured illumination. Bei gegebener durch das System maximal übertragbarer Raumfrequenz ermöglicht dies den Transfer von um die Verschiebefrequenz Vm über der maximalen Frequenz der Übertragungsfunktion liegender Raumfrequenzen des Objektes. For a given maximum transmitted by the system frequency space, this enables the transfer of the displacement frequency Vm to the maximum frequency of the transfer function lying spatial frequencies of the object. Dieser Ansatz erfordert einen Rekonstruktionsalgorithmus zur Bilderzeugung und die Verwertung mehrerer Aufnahmen für ein Bild. This approach requires a reconstruction algorithm for imaging and recovery of several recordings for an image.
  • [0014] [0014]
    Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Lumineszenzmikroskopieverfahren bzw. ein Lumineszenzmikroskop anzugeben, das eine Auflösungssteigerung ohne Rückgriff auf mehrere Wellenlängen bzw. ohne aufwendige Bildrekonstruktionsalgorithmen erreicht. The invention is therefore based on the object of specifying a Lumineszenzmikroskopieverfahren or a luminescence that achieves a resolution enhancement without resorting to a plurality of wavelengths or without complex image reconstruction algorithms.
  • [0015] [0015]
    Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einem auflösungsgesteigerten Lumineszenz-Mikroskopieverfahren, bei dem eine Probe durch Einstrahlung von Anregungsstrahlung zur Emission von bestimmter Lumineszenzstrahlung angeregt wird und ein Bild der lumineszierenden Probe gewonnen wird, wobei die lumineszierende Probe aus einem ersten Lumineszenz-Zustand, in dem die Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung mit steigender Anregungsstrahlungsleistung bis zu einem Maximalwert, welcher einem Anregungsstrahlungsleistungs-Schwellwert zugeordnet ist, steigt, in einen zweiten Lumineszenz-Zustand überführbar ist, in dem die Probe gegenüber dem ersten Zustand verminderte Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung aufweist, wobei die Probe durch Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes in den zweiten Zustand bringbar ist, die Probe in Teil-Bereichen in den ersten Zustand und in angrenzenden Teil-Bereichen in den zweiten This object is achieved with a resolution-enhanced luminescence microscopy method in which a sample by irradiation with excitation radiation to emit certain luminescent radiation is stimulated, and an image of the luminescent sample is obtained, wherein the luminescent sample from a first luminescence state in which the excitability for emission of the determined luminescence with increasing excitation radiation power to a maximum value which is assigned to an excitation radiation power threshold, increasing, can be transferred into a second luminescence state in which the sample to the first state having reduced excitability for emission of the determined luminescence radiation, wherein the sample by irradiation with excitation radiation performance can be brought above the threshold value in the second state, the sample in part-regions in the first state and in the adjoining partial areas into the second Zustand versetzt wird, indem die Einstrahlung von Anregungsstrahlung mit einer Anregungsstrahlungsverteilung erfolgt, die zumindest ein örtliches Leistungsmaximum über dem Schwellwert und zumindest ein örtliches, lokales Leistungsminimum unter dem Schwellwert aufweist, das Bild der lumineszierenden Probe Proben-Bereiche im ersten Zustand und Proben-Bereiche im zweiten Zustand umfaßt, wobei zum Bild der lumineszierenden Probe überwiegend Proben-Bereiche im ersten Zustand beitragen und dadurch das Bild eine gegenüber der Anregungsstrahlungs-verteilung gesteigerte Ortsauflösung hat. Is displaced state by the irradiation of excitation radiation is performed with an excitation radiation distribution which has at least a local power maximum is above the threshold and at least a local, local power minimum below the threshold, the image of the luminescent sample sample areas in the first state and sample areas in the second state, wherein the image of the luminescent sample mainly contribute sample areas in the first state and therefore the image has a relation to the excitation radiation distribution increased spatial resolution.
  • [0016] [0016]
    Die Aufgabe wird weiter gelöst mit einem Mikroskop zur auflösungsgesteigerten Lumineszenz-Mikroskopie, das Mittel aufweist zur Anregung von Lumineszenz, die Anregungsstrahlung auf die Probe einstrahlen und damit die Emission bestimmter Lumineszenzstrahlung in der Probe anregen, Mittel zur Gewinnung eines Bildes der lumineszierenden Probe, wobei die Mittel zur Anregung die Anregungsstrahlung mit einer bestimmten Anregungsstrahlungsverteilung einstrahlen, die zumindest ein örtliches Leistungsmaximum aufweist, das über einem Schwellwert liegt, und zumindest ein örtliches, lokales Leistungsminimum aufweist, das unter dem Schwellwert liegt, wobei der Schwellwert zwei Lumineszenz-Regionen der Probe trennt, eine erste, bei Anregungsstrahlungsleistungen unterhalb des Schwellwertes vorliegende Zustands-Region, in der die Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung mit steigender Anregungsstrahlungsleistung bis zu einem Maximalwert, welcher am Schwellwert erreicht wird, st The object is further solved by a microscope for resolution-enhanced luminescence microscopy, which has means for excitation of luminescence, irradiate the excitation radiation to the sample, and thus the emission of certain luminescence in the sample to stimulate, means for obtaining an image of the luminescent sample, wherein the means for exciting the excitation radiation are irradiated with a specific excitation radiation distribution which has at least a local power maximum which is above a threshold value, and having at least a local, local power minimum which is below the threshold, wherein the threshold separates two luminescence regions of the sample, a first, present at excitation radiation powers below the threshold value state region in which the excitability for emission of the determined luminescence with increasing excitation radiation power to a maximum value which is reached at the threshold value, st eigt, und einer zweiten bei und/oder nach Anregungsstrahlungsleistungen oberhalb des Schwellwertes vorliegende Zustands-Region, in der die Probe eine gegenüber der ersten Region verminderte Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung aufweist, und wobei die Mittel zur Bildgewinnung Proben-Bereiche in der ersten Region, die mit Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwertes bestrahlt wurden, und Proben-Bereiche in der zweiten Region, die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes bestrahlt wurden, erfassen, wobei zum Bild der Probe überwiegend Proben-Bereiche in der ersten Region beitragen und dadurch das Bild eine gegenüber der Anregungsstrahlungsverteilung gesteigerte Ortsauflösung hat. isplays, and a second and / or after excitation radiation powers above the threshold value present state region in which the sample has a relation to the first region of reduced excitability for emission of the determined luminescence radiation, and wherein the means for imaging sample areas in the first region which were irradiated with excitation radiation power below the threshold value, and sample areas in the second region which have been irradiated with excitation radiation power above the threshold value, detecting, with the image of the sample predominantly sample areas contribute in the first region, and thereby the image has opposite the exciting radiation distribution has increased spatial resolution.
  • [0017] [0017]
    Es wird also eine Probe verwendet bzw. das Mikroskop ist für eine entsprechende Probe ausgelegt, deren lumineszierendes Material sich im wesentlichen in zwei Zuständen befinden kann. There is thus a sample used or the microscope is designed for a respective sample, the luminescent material may be located in essentially two states. In einem ersten Zustand, der sich bei der Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwertes einstellt und der mittels der Mittel zur Anregung erreicht wird, strahlt das Material Lumineszenzstrahlung ab, deren Leistung in der Regel mit der Anregungsstrahlungsleistung zunimmt. In a first state, which is established at the input of excitation radiation power below the threshold value and which is achieved by means of the means for exciting the material emits luminescent radiation, the power increases generally with the excitation radiation power. In einem zweiten Zustand, der bei Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes vorliegt, erfolgt entweder gar keine oder verminderte Lumineszenz. In a second state, which is present upon irradiation with excitation radiation power above the threshold value, occurs either no or reduced luminescence. Auch können gegenüber dem ersten Zustand geänderte Absorptionseigenschaften und/oder Lumineszenzstrahlungsemission mit anderen optischen Eigenschaften als im ersten Zustand, beispielsweise mit anderer spektraler Zusammensetzung, Polarisation oder Lebensdauer, erfolgen. Also, compared to the first state modified absorption properties and / or Lumineszenzstrahlungsemission with other optical properties than in the first state, for example having different spectral composition, polarization or lifetime take place. Bezogen auf die Probe, die sich natürlich aus einer Vielzahl von fluoreszierenden oder auto-fluoreszierenden Molekülen zusammensetzt, ergeben sich zwei Zustandsregionen. Based on the sample, which of course composed of a variety of fluorescent or auto-fluorescent molecules, there are two state regions. In einer ersten Zustandsregion ist die Mehrzahl der Moleküle im ersten Zustand, in einer zweiten Zustandsregion ist die Mehrzahl im zweiten Zustand. In a first condition region is the majority of the molecules in the first state, second state in a region, the plurality is in the second state. Erfindungsgemäß werden nun Proben-Bereiche in die erste Zustandsregion (oder kurz Zustand) und andere Proben-Bereiche in die zweite Zustandsregion (oder kurz Zustand) verbracht. According to the invention sample areas are now in the first state region (or short state) and other sample areas in the second state region (or short state) spent. Die örtliche Nähe der Bereiche, die in den ersten Zustand gebracht wurden, also auf die Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwertes fällt, und Bereichen im zweiten Zustand, dh Bereiche, die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes bestrahlt werden, erlaubt eine signifikante Steigerung der Auflösung gegenüber der Anregungsstrahlungsverteilung. The physical proximity of the areas that have been placed in the first state, that is incident on the excitation radiation power is below the threshold value, and regions in the second state, that is, areas which are irradiated with excitation radiation power above the threshold value, allows a significant increase in resolution compared to the excitation radiation distribution ,
  • [0018] [0018]
    Die erfindungsgemäße Lösung erreicht also die Auflösungssteigerung durch eine nichtlineare Lumineszenzkennlinie, die die emittierte Lumineszenzleistung als Funktion der Anregungsstrahlungsleistung beschreibt und ein lokales Maximum hat. Thus, the inventive solution achieves the increase in resolution by a nonlinear luminescence characteristic which describes the emitted luminescence as a function of excitation radiation power, and has a local maximum. Es ist dabei vorteilhaft, aber nicht zwingend erforderlich, wenn die Kennlinie beiderseits dieses Maximums relativ steile Flanken aufweist. It is advantageous, but not required, when the characteristic on either side of this maximum has relatively steep edges. Auch kann zur Anregung ein Multiphotonenprozeß zum Einsatz kommen. Also to stimulate a multiphoton process can be used.
  • [0019] [0019]
    Da beim erfindungsgemäßen Ansatz möglichst ausschließlich Proben-Bereiche im ersten Zustand zum Bild Lumineszenzstrahlung beitragen und Proben-Bereiche im zweiten Zustand zumindest in einem geringeren Maße lumineszieren, ist eine Auflösungssteigerung erreicht, da das Probenbild eine über die Anregungsstrahlungsverteilung hinausgehende Struktur zeigt. Since only possible sample areas contribute the inventive approach in the first state to image luminescence and luminescent sample areas in the second state at least to a lesser extent, an increase in resolution is achieved, since the sample image is an excess of the excitation radiation distribution structure. Diese Intensitätsstruktur ist um so ausgeprägter, je deutlicher die Emissionsleistung sich zwischen erstem und zweitem Zustand unterscheidet. This intensity pattern is more pronounced, the more pronounced the emission performance differs between first and second state.
  • [0020] [0020]
    Durch Einstrahlung der Anregungsleistung oberhalb des Schwellwertes, der dem Maximum der Fluoreszenzkennlinie entspricht, wird weniger Fluoreszenz angeregt als im ersten Zustand. By irradiation of the excitation power above the threshold value corresponding to the maximum of the fluorescence characteristic, less fluorescence is excited than in the first state. Im Mikroskop ist dazu die Anregungsstrahlungsverteilung mit Leistungen über dem Schwellwert versehen. In the microscope, the excitation radiation distribution is provided with services to above the threshold. Strahlung anderer Wellenlänge, wie sie im Stand der Technik bislang erforderlich war, ist nicht mehr nötig. Radiation of a different wavelength, as was previously required in the prior art, is no longer necessary. Das erfindungsgemäße Mikroskop bzw. eine Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind deshalb sehr viel einfacher, benötigen insbesondere nur eine einzige Lichtquelle, deren Auflösung sich auf die Bildqualität auswirkt. The microscope according to the invention and an apparatus for performing the method according to the invention are much easier, therefore, need particular only a single light source, the resolution will affect the image quality. Auch sind die chromatischen Anforderungen hinsichtlich der Einkopplung der Anregungsstrahlung gegenüber dem Stand der Technik deutlich vereinfacht, da nicht mehr ein relativ breiter Wellenlängenbereich abgedeckt werden muß. The chromatic requirements concerning the coupling of the excitation radiation are compared to the prior art significantly simplified since no longer a relatively wide wavelength range must be covered.
  • [0021] [0021]
    Das Mikroskop ist auf die Probe abgestimmt, da die eingestrahlte Anregungsstrahlungsverteilung den Schwellwert für die Leitung berücksichtigt. The microscope is matched to the sample since the incident excitation radiation distribution takes into account the threshold value for the line.
  • [0022] [0022]
    Für den erfindungsgemäßen Ansatz ist es darüber hinaus nicht zwingend erforderlich, daß die Probenbereiche, die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes beleuchtet werden, zuvor „normal" angeregt wurden (wie dies beispielsweise beim STED- oder beim ESA-Ansatz erforderlich ist), wenn eine Probe verwendet wird, die nach Bestrahlung mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung dauerhaft oder zumindest für eine gewisse Zeitdauer eine deutlich herabgesetzte oder gar verschwindende Anregbarkeit zeigt. For the inventive approach, it is also not absolutely necessary that the sample areas that are illuminated with exciting radiation power above the threshold value, previously stimulated "normal" (as required for example in the STED or in ESA approach) when a sample is used, the opposing after irradiation with excitation radiation power above the threshold value exhibits a significantly reduced or even disappearing excitability permanently or at least for a certain period of time.
  • [0023] [0023]
    Es ist bevorzugt, daß eine Probe bzw. ein Farbstoff verwendet wird, die/der bei einer Anregungsstrahlungsleistung über dem Schwellwert nicht luminesziert, Lumineszenzstrahlung mit anderen Eigenschaften als die bestimmte Lumineszenzstrahlung abstrahlt und/oder geänderte, zu verminderter Lumineszenz führende Absorptionseigenschaften für Anregungsstrahlung aufweist. It is preferred that a sample or a dye is used, the / the non luminesces at an excitation radiation power above the threshold value, emits luminescent radiation having different characteristics than the specific luminescence and / or altered, leading to reduced luminescence absorption characteristics for the excitation radiation has.
  • [0024] [0024]
    Die Auflösungssteigerung wird also erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß aus Proben-Bereichen, die mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsintensität beleuchtet werden, keine oder nur mehr wenig Lumineszenzstrahlung zur Bilderzeugung beiträgt. The increase in resolution is thus according to the invention achieved in that of sample areas that are illuminated with opposing the threshold excitation radiation intensity, or no more little luminescence radiation contributes to the image formation. Je nach Lumineszenzeigenschaft, die die Probe im zweiten Zustand, dh bei und/oder nach oberhalb dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung zeigt, erfolgt dieser verminderte Beitrag zum Bild auf unterschiedliche Weise. Depending on the luminescence showing the sample in the second state, ie with and / or after the above threshold value lying excitation radiation power, this reduced contribution to the image is carried out in different ways. Zeigt die Probe überhaupt keine Lumineszenz mehr, wird aus Proben-Bereichen, die im zweiten Zustand sind, auch keine Lumineszenzstrahlung mehr detektiert. The sample shows no more luminescence, no luminescence is obtained from sample areas that are in the second state, longer detected. Zeigt die Probe im zweiten Zustand hingegen Lumineszenzstrahlung mit geänderten optischen Eigenschaften, wird man eine entsprechend optische Filterung, beispielsweise hinsichtlich spektraler Zusammensetzung oder Polarisation zum Ausblenden vornehmen. Shows the sample in the second state, however, luminescence radiation with modified optical properties, one is a corresponding optical filtering, make to hide for example in terms of spectral composition or polarization. Zeigen sich veränderte Lebensdauern der angeregten Lumineszenzzustände, erreicht eine zeitliche Filterung eine Ausblendung. Show was changing lifetimes of the excited Lumineszenzzustände, temporal filtering achieves suppression.
  • [0025] [0025]
    Um die Proben-Bereichen im ersten Zustand weiter einzugrenzen bzw. einige dieser Proben-Bereiche auszuwählen, ist es bevorzugt eine konfokale Detektion vorzunehmen. To the sample areas in the first state further limit or to select some of these sample regions, it is preferable to carry out a confocal detection. Durch die erfindungsgemäße Reduktion des zur Lumineszenz angeregten Volumens unterhalb der Beugungsgrenze wird dabei eine Ortsauflösung erreicht, die diejenige bei normaler konfokaler Detektion übertrifft. Due to the inventive reduction of the excited to luminescence volume below the diffraction limit thereby a spatial resolution is achieved, exceeding that at normal confocal detection.
  • [0026] [0026]
    Wesentlich ist, daß nicht alle mit Anregungsstrahlung beleuchteten Bereiche zum Lumineszenzbild beitragen, sondern daß mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung beleuchtete Proben-Bereiche im Bild nicht oder nur vermindert enthalten sind, wodurch sich automatisch die Auflösungssteigerung gegenüber der Einstrahlung der Anregungsstrahlung ergibt, da eine räumliche Reduktion des lumineszierenden Probenvolumens gegenüber dem angeregten Probenvolumen erreicht ist. It is essential that not all contribute illuminated with excitation radiation areas to luminescence, but that with are above the threshold value lying exciting radiation power illuminated sample areas in the image or only reduces contain, thus automatically results in the increase in resolution with respect to the irradiation of the exciting radiation, as a spatial reduction of the luminescent sample volume compared to the excited sample volume is achieved. Es finden sich im Bild optische Strukturen, die in der Anregungsstrahlungsverteilung nicht vorhanden waren. It can be found in the image optical structures, which were not present in the exciting radiation distribution. Die Auflösung des Bildes ist also über die Auflösung der Anregungsstrahlungseinkopplung hinaus gesteigert. The resolution of the image is thus increased the dissolution of the Anregungsstrahlungseinkopplung out.
  • [0027] [0027]
    In besonders vorteilhafter Weise verwendet man eine Probe bzw. Farbstoffe bzw. stimmt das erfindungsgemäße Mikroskop darauf ab, die vom zweiten Zustand durch Einstrahlung einer Rücksetzstrahlung, die andere optische Eigenschaften als die Anregungsstrahlung hat, wieder in den (ursprünglichen) ersten Zustand zurückgesetzt werden können. In a particularly advantageous manner using a sample or dyes or true microscope according to the invention it from having the second state by irradiation of a resetting radiation, the different optical properties than the excitation radiation, may be returned to the (original) first state. Das Mikroskop weist dazu geeignete Mittel auf. The microscope has to suitable means. Dies bedeutet, daß der zweite Zustand ein zumindest weitgehend reversibler Zustand ist. This means that the second state is an at least largely reversible state. Durch Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes aus dem Lumineszenzbild ausgeblendete Bereiche können dann nach Einstrahlung der Rücksetzstrahlung wieder zur normalen Lumineszenz im ersten Zustand angeregt werden. By irradiation of excitation radiation power above the threshold from the luminescence hidden sections of the resetting radiation can then be re-excited to luminescence in the normal state after the first exposure. Ein derart weitergebildetes Verfahren bzw. ein derart ausgestaltetes Mikroskop eignet sich dann für Anwendungen, bei denen verschiedene Bereiche einer Probe mehrfach abgebildet werden sollen. Such a method and a further formed such configuration microscope is then suitable for applications in which different areas of a sample to be imaged several times. Es wird für solche Anwendungen deshalb bevorzugt, daß eine Probe bzw. ein Farbstoff verwendet wird, die bzw. der im zweiten Zustand, also nach Beleuchtung mit Anregungsstrahlung über dem Schwellwert, verminderte Empfindlichkeit für Anregungsstrahlung zeigt, wobei durch Einstrahlung einer Rücksetzstrahlung, die andere optische Eigenschaften als die Anregungsstrahlung hat, die Empfindlichkeitsverminderung zumindest teilweise reversiert wird (und der erste Zustand wiederhergestellt wird). It is preferred for such applications, therefore, that a sample or a dye is used, or in the second state, ie, after illumination with excitation radiation above the threshold value, decreased sensitivity to excitation radiation shows, wherein by irradiating a reset radiation, the other optical has properties than the exciting radiation, the sensitivity decrease is at least partially reversed (and the first state is recovered). Zumindest die mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung beleuchteten Proben-Bereiche werden mit Rücksetzstrahlung bestrahlt. At least the opposed to above the threshold excitation radiation power illuminated sample areas are irradiated with resetting radiation. Es ist dabei bedeutsam, daß die Rücksetzstrahlung, die die Probe wieder in den ersten Zustand überführt, zur Bewerkstellung der Auflösungssteigerung nichts beiträgt, also auch nur sehr grob oder überhaupt nicht strukturiert in die Probe eingekoppelt werden kann. It is significant here that the resetting radiation, the sample converted back into the first state to Bewerkstellung the increase in resolution does nothing, so even very rough or not structured to be coupled into the sample.
  • [0028] [0028]
    In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung erlaubt die hinsichtlich ihrer Lumineszenzeigenschaften wieder in den ersten Zustand rückführbare Probe eine Bilderzeugung durch Abscannen. In a particularly advantageous development of the invention, the back traceable to the first state with respect to their luminescent sample allows image formation by scanning. Dabei kann die Probe beispielsweise mit einem Spot-, Zeilen- oder Multispotbereich abgerastert werden, zB durch eine Scannereinrichtung. The sample can be scanned, for example using a spot, line or multi-spot area, for example, by a scanner device. Zwischen zwei Scanschritten wird dann jeweils Rücksetzstrahlung eingestrahlt, um beim neuen Scanschritt jeweils erneut Anregungsstrahlung unter und über dem Schwellwert einstrahlen zu können. each resetting radiation is then irradiated to each re-irradiate excitation radiation below and above the threshold at the new scanning step between two scan steps. Dadurch wird in jedem Scanschritt eine gesteigerte Auflösung erzielt, was insgesamt ein deutlich auflösungsverbessertes Bild liefert. This enhanced resolution is achieved in each scanning step, which total a noticeably auflösungsverbessertes image.
  • [0029] [0029]
    Die Einstrahlung der Anregungsstrahlungsverteilung erzeugt also eine örtliche Struktur der Fluoreszenzstrahlung. The irradiation of the exciting radiation distribution thus generates a local structure of the fluorescent radiation. Diese ist meist symmetrisch bezüglich der Anregungsstrahlungsverteilung. This is usually symmetrical with respect to the exciting radiation distribution. Möchte man eine bestimmte fluoreszierende Flächenform, zB einen Punkt, so werden vorteilhafterweise Teile der fluoreszierenden Probe ausgeblendet. Advantageously, portions of the fluorescent sample one would like to a predetermined fluorescent surface shape, such as a point, they will be hidden. Dies ist ohne Auswirkung auf die Auflösung der erwünschten Flächenform möglich, da man für ausreichende Abstände zwischen benachbarten fluoreszierenden Bereichen sorgen kann. This is possible without any effect on the dissolution of the desired surface form, since one can ensure sufficient spacing between adjacent fluorescent regions.
  • [0030] [0030]
    Für die Anregung der Probe über bzw. unter dem Schwellwert sind prinzipiell zwei Varianten möglich. Two variants are possible in principle for the excitation of the sample above or below the threshold value. In einer ersten Variante erfolgt eine prinzipiell beugungsbegrenzte Beleuchtung, wobei diese punktförmig sein kann, radial symmetrisch sein kann oder ein zentrales Maximum, wie die bekannte Airy-Funktion aufweisen kann, jedoch nicht muß. In a first variant of a principally diffraction-limited illumination, this may be point-shaped, may be radially symmetrical or may have a central maximum, as the known Airy function is performed, but need not. In dieser Form der Anregungsverteilung ist es bevorzugt, daß die Anregungsstrahlungsverteilung beugungsbegrenzt ist. In this form of the excitation distribution, it is preferred that the excitation radiation distribution is diffraction limited.
  • [0031] [0031]
    Bei der beugungsbegrenzten Anregungsstrahlungsverteilung kann man besonders vorteilhaft eine torusförmige Verteilung verwenden, die im Kernbereich der torusförmigen Verteilung eine Anregungsstrahlungsleistung über dem Schwellwert, in Randbereichen unter dem Schwellwert hat. In the diffraction-limited excitation radiation distribution can be particularly advantageous to use a toroidal distribution having an excitation radiation power above the threshold value, in the edge regions below the threshold in the core region of the toroidal distribution. Im vom Torus umschriebenen Zentrum erhält man dann eine punktförmige Lumineszenzverteilung, die deutlich kleiner ist, als es ein beugungsbegrenztes Airy-Scheibchen wäre. In circumscribed by the torus center then you get a point luminescence, which is significantly smaller than it would be a diffraction-limited Airy disk. Da natürlich aus den erwähnten Symmetriegründen auch am Außenrand des Torus liegende Proben-Bereiche mit unter dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung beleuchtet werden, wird auch dort Lumineszenzstrahlung angeregt. Because of course also be illuminated from the above-mentioned symmetry, on the outer edge of the torus lies sample areas with lying below the threshold excitation radiation power, luminescence is excited there. Um ein punktförmiges Fluoreszenzbild zu erzeugen, ist es zweckmäßig, diese Bereiche auszublenden, beispielsweise mit Hilfe einer konfokalen Detektion, die lediglich im vom Torus umschriebenen Zentrum entstehende Lumineszenzstrahlung passieren läßt. To create a point-like fluorescence image, it is convenient to hide these areas, for example by means of a confocal detection, allowing the resulting only in circumscribed by the torus center luminescence happen. Das lumineszierende Zentrum ist dabei dennoch kleiner, als es die (beugungsbegrenzte) Auflösung der konfokalen Detektion per se erlaubt. The luminescent center is still small there when time permits (diffraction-limited) resolution of confocal detection per se. Das Ausblenden kann natürlich auch anders bewerkstelligt werden. Hiding can of course also be accomplished differently. ZB können die Außenbereiche bezüglich der Lumineszenzanregbarkeit gezielt ausgeschaltet bzw. das umschriebene Zentrum gezielt eingeschaltet werden. For example, the outside areas may, with respect Lumineszenzanregbarkeit selectively inhibited or the circumscribed center be specifically switched on. Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. Mikroskop erlaubt damit eine Auflösung über die physikalische Beugungsgrenze hinaus bei gleichzeitiger Beeinflussung der fluoreszierenden Bereichsform. thus the method and the microscope according to the invention allows a resolution of the physical diffraction limit at the same time influencing the fluorescent area shape.
  • [0032] [0032]
    In einer zweiten Variante wird eine flächige, strukturierte Beleuchtung eingesetzt, wobei die Fläche auch als eine oder mehrere, in einer Richtung beugungsbegrenzte Linie(n) ausgebildet werden kann. In a second variant, a flat, structured illumination is used, wherein the surface as one or more diffraction-limited in one direction line (s) can be formed. Teilbereiche der beleuchteten Fläche weisen eine Anregungsstrahlungsleistung über und andere Teilbereiche eine Anregungsstrahlungsleistung unter dem Schwellwert auf. Partial areas of the illuminated surface point on an excitation radiation power and other portions of an excitation radiation power below the threshold value at. Eine solche flächige Beleuchtung erlaubt es, eine größere Probe besonders schnell abzurastern. Such area illumination allows particularly fast abzurastern a larger sample. Gleiches gilt natürlich auch für eine Multispot-Anordnung, bei der mehrere beugungsbegrenzte Beleuchtungsspots auf die Probe fallen, die so weit voneinander räumlich getrennt sind, daß sie eindeutig voneinander getrennt detektiert werden können. The same applies of course to a multi-spot arrangement in which a plurality of diffraction-limited illumination spot incident on the sample, which are so far spaced from each other that they can be clearly detected separately. Als flächige strukturierte Probenbeleuchtung kommt insbesondere ein Streifen- oder Kreuzgitter in Frage. As flat structured sample illumination in particular a strip or cross grid of the question.
  • [0033] [0033]
    Je nach Probe können Proben-Bereiche im zweiten Zustand noch eine gewisse Restlumineszenz zeigen. Depending on the specimen sample areas may still show a certain residual luminescence in the second state. Dies kann entweder durch die Probe selbst bedingt sein, oder durch Wanderungen von lumineszierendem Material zwischen den unterschiedlich beleuchteten Proben-Bereichen, beispielsweise durch Diffusion. This can be either by the sample itself conditionally, or by migration of luminescent material between the differently illuminated sample areas, for example by diffusion. Die Probe selbst kann zB störend autofluoreszieren oder andere Farbstoffe enthalten, die nicht in einen zweiten, reversiblen Zustand überführbar sind. The sample itself may, for example autofluoresce disturbing or contain other dyes that are not transferred into a second, reversible state. Im Ergebnis hat man eine Restlumineszenzstrahlung in Bereichen, die mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung beleuchtet wurden. As a result, one has a Restlumineszenzstrahlung in areas that have been illuminated with excitation radiation lying above the threshold power. Prinzipiell kann diese Restlumineszenz durch einen geeigneten Schwellwert bei der Detektion unterdrückt werden. In principle, this residual luminescence can be suppressed by a suitable threshold value in the detection.
  • [0034] [0034]
    Die Verwendung einer an und für sich bekannten Lock-In-Technik unterdrückt diese Hintergrundstrahlung bei verbessertem Bildsignal. The use of a known per se lock-in technique suppresses this background radiation with improved image signal. Dazu wird man entweder in Proben-Bereiche, die in den zweiten Zustand versetzt werden oder in Proben-Bereiche, die im ersten Zustand verbleiben, die Anregungsstrahlung gemäß einer Referenzfrequenz intensitätsmodulieren und diese Referenzfrequenz bei der Detektion der Lumineszenzstrahlung im Wege der Lock-In-Technik verwerten. For this purpose, either in sample areas that are placed in said second state or in the sample areas, which remain in the first state, intensity-modulating the excitation radiation according to a reference frequency and said reference frequency in the detection of the luminescent radiation in the way of lock-in technique recycle. Das Mikroskop weist dazu einen Modulator und einen dem Lumineszenzdetektor nachgeschalteten Lock-In-Verstärker auf. The microscope has for this purpose a modulator and a downstream of the luminescence lock-in amplifier. Dieser separiert dann die modulierten Signale und unterdrückt die unmodulierten Signale, was eine hochaufgelöste Detektion auch bei der genannten Restlumineszenz ermöglicht, ohne daß der Spitzenpegel des Nutzsignals sinkt. This then separates the modulated signals and suppresses the unmodulated signals, which enables a high-resolution detection even when the above residual luminescence without the peak level of the useful signal decreases. Dadurch tragen die modulierten Signale voll zum hochaufgelösten Bild bei. Thus, the modulated signals contribute fully in the high-resolution image.
  • [0035] [0035]
    Eine alternative Möglichkeit zur Unterdrückung einer Restlumineszenz ist ein Differenzverfahren, bei dem zwei Bilder voneinander substrahiert werden. An alternative possibility for suppressing a residual luminescence is a difference method, in which two images are subtracted from each other. Ein erstes Bild wird mit Anregungsstrahlungsleistung unter dem Schwellwert, ein zweites Bild mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes aufgezeichnet. A first image is recorded with excitation radiation power below the threshold value, a second image with excitation radiation power above the threshold value. Die Differenz zwischen den beiden Bildern bewirkt die Abseparierung der Restlumineszenz. The difference between the two images causes Abseparierung the residual luminescence. Andere mögliche Ansätze zur Unterdrückung der Restlumineszenz nutzen weitere Eigenschaften von in Varianten der Erfindung verwendeten Proben bzw. Farbstoffen, beispielsweise die Auswertung unterschiedlicher Lumineszenzlebensdauern im ersten bzw. zweiten Zustand, die Nutzung unterschiedlicher optischer Eigenschaften der Lumineszenzstrahlung im ersten oder zweiten Zustand o.ä. Other possible approaches to the suppression of residual luminescence use other properties of materials used in variants of the invention samples or dyes, for example, the evaluation of different luminescence in the first or second state, the use of different optical properties of the luminescent radiation in the first or second state, etc.
  • [0036] [0036]
    Weiter werden in vorteilhaften Ausgestaltungen Probenteile, die außerhalb der zu detektierenden Fokusebene liegen, ausgeblendet, um die Tiefenschärfe zu steigern. Next, be hidden to increase the depth of field in advantageous embodiments, sample parts that are outside of the detected focal plane. Dadurch wird gleichzeitig die axiale von der lateralen Auflösung entkoppelt. Characterized the axial of the lateral resolution is decoupled simultaneously. Dazu wird zuerst die Probe unstrukturiert in den zweiten Zustand überführt und dann nur in der Fokusebene rückgesetzt. For this purpose, the sample is first brushed transferred to the second state and then reset only in the focal plane. Gleiches erreicht eine entsprechende Tiefenstrukturierung der Anregungsstrahlungsintensität, mit einem Minimum in der Fokusebene. The same reached a corresponding depth structuring of the exciting radiation intensity with a minimum in the focal plane. Hierzu kann man eine Anordnung gemäß den Prinzipien der For this one can an arrangement according to the principles of DE 102 57 423 A1 DE 102 57 423 A1 geeignet abwandeln. modify suitable.
  • [0037] [0037]
    Das eingangs genannte erfindungsgemäße Mikroskop verwirklicht in vorteilhaften Ausgestaltungen eine oder mehrere der oben genannten Weiterbildungen. The aforementioned microscope according to the invention realizes one or more of the above developments in advantageous embodiments. Da die Anregungsstrahlung sowohl zur Anregung der Lumineszenz als auch zur Verhinderung bzw. Minderung von Lumineszenz verwendet wird, ist es vorteilhafterweise möglich, eine einzige Anregungsstrahlungsquelle vorzusehen, welche die Anregungsstrahlung abgibt und der eine Einrichtung nachgeordnet ist, welche dem Strahlprofil ein Minimum, vorzugsweise mit variabler Tiefe, aufprägt, wobei im Minimum die Leistung unter dem Schwellwert liegt. Because the excitation radiation is used both for excitation of luminescence, as well as for the prevention or reduction of luminescence, it is advantageously possible to provide a single excitation radiation source which emits the excitation radiation and which is arranged downstream of a device which the beam profile of a minimum preferably variable, depth, imparts, wherein the power is in the minimum below the threshold.
  • [0038] [0038]
    Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielhalber noch näher erläutert. The invention is explained below with reference to the drawings by way of example in more detail. In den Zeichnungen zeigt: In the drawings:
  • [0039] [0039]
    1a 1a und and 1b 1b ortsabhängige Leistungsverteilungen für Verfahren des Standes der Technik, location-dependent power distributions for processes of the prior art,
  • [0040] [0040]
    2a 2a - 2c 2c Schemazeichnungen für verschiedene Verfahren zur Auflösungssteigerung gemäß dem Stand der Technik, Diagrams for various methods of resolution enhancement according to the prior art,
  • [0041] [0041]
    3 3 ein auflösungsgesteigertes Fluoreszenzmikroskop nach dem Stand der Technik, a resolution-enhanced fluorescence microscope according to the prior art,
  • [0042] [0042]
    4 4 eine Fluoreszenzkennlinie einer Probe, a fluorescent characteristic of a sample,
  • [0043] [0043]
    5 5 eine Schemazeichnung zur erfindungsgemäßen Auflösungssteigerung, a schematic drawing of the inventive resolution enhancement,
  • [0044] [0044]
    6a 6a /b ein- bzw. zweidimensionale Leistungsverteilungen, wie sie bei der Auflösungssteigerung nach einer ersten und zweiten Verfahrensform anfallen, / B show or two-dimensional power distributions, as obtained in the resolution enhancement according to a first and second form of the method,
  • [0045] [0045]
    7 7 eine Darstellung ähnlich der a view similar to 6a 6a /b für eine dritte Verfahrensform, / B for a third form of the method,
  • [0046] [0046]
    8a 8a /b Darstellungen ähnlich der / B representations similar to the 6a 6a /b für eine vierte und fünfte Verfahrensform, / B for a fourth and fifth form of the method,
  • [0047] [0047]
    9a 9a /b eine Schemazeichnung für ein erstes auflösungsgesteigertes Mikroskop, / B is a schematic diagram for a first resolution-enhanced microscope,
  • [0048] [0048]
    10 10 eine Leistungsverteilung ähnlich der a power distribution similar to 6a 6a zur Verdeutlichung der Wirkungsweise des Mikroskops der to illustrate the operation of the microscope of the 9 9 , .
  • [0049] [0049]
    11a 11a /b eine Kennlinie ähnlich der / B a characteristic similar to the 4 4 sowie eine Leistungsverteilung zur Verdeutlichung eines zweiten auflösungsgesteigerten Mikroskops, and a power distribution to illustrate a second resolution-enhanced microscope,
  • [0050] [0050]
    12 12 eine Schemadarstellung des zweiten Mikroskops, a schematic representation of the second microscope,
  • [0051] [0051]
    13 13 eine Schemadarstellung eines dritten auflösungsgesteigerten Mikroskops, a schematic representation of a third resolution-enhanced microscope,
  • [0052] [0052]
    14 14 eine Schemadarstellung zur Funktionsweise des dritten Mikroskops, a schematic diagram for operation of the third microscope,
  • [0053] [0053]
    15a 15a /b Schemadarstellungen von Teilen eines vierten Mikroskops, / B schematic views of parts of a fourth microscope,
  • [0054] [0054]
    16a 16a eine Verteilung der Anregungs- bzw. Rücksetzstrahlung in einer Pupille des vierten Mikroskops, a distribution of the excitation or resetting radiation in a pupil of the fourth microscope,
  • [0055] [0055]
    16b 16b eine mit dem vierten Mikroskop realisierte Multispotverteilung, a handled with the fourth microscope multi-spot distribution,
  • [0056] [0056]
    17 17 eine Fluoreszenzverteilung beim vierten Mikroskop und a fluorescent microscope and the fourth distribution
  • [0057] [0057]
    18 18 eine Verteilung der Anregungs- bzw. Rücksetzstrahlung in einer Pupille einer Variante des vierten Mikroskops. a distribution of the excitation or resetting radiation in a pupil of a variant of the fourth microscope.
  • [0058] [0058]
    Nachfolgend werden in verfahrenstechnischer Erläuterung sowie in Mikroskopbeschreibungen verschiedene Ausführungsformen zur auflösungsgesteigerten Lumineszenzmikroskopie dargestellt. Various embodiments for the resolution-enhanced luminescence microscopy are shown in procedural explanation and descriptions in microscope. Dies geschieht rein exemplarisch anhand verschiedener Fluoreszenzmikroskope bzw. Fluoreszenzmikroskopieverfahren. This is done by way of example with reference to various fluorescent microscopes and fluorescence microscopy methods. Natürlich sind die nachfolgend geschilderten Ausführungsbeispiele, dh Verfahrensformen und Mikroskope, auch für andersartig lumineszierende Substanzen einsetzbar, beispielsweise für phosphorisierende Proben oder Farbstoffe. Of course, the below described embodiments, that method forms and microscopes, can also be used for otherwise luminescent substances, for example, samples or phosphorescent dyes. Soweit nachfolgend von einem Farbstoff gesprochen wird, so ist auch dies nur beispielshalber aufzufassen. As far as is mentioned in the following a dye, so this is just to be construed by way of example. Anstelle eines Farbstoffes, der zur Präparation einer Probe eingesetzt werden kann, kann natürlich auch eine direkt fluoreszierende (oder phosphorisierende) Substanz als Probe treten, wodurch eine Farbstoffzugabe entbehrlich ist. Instead of a dye which can be used for preparation of a sample, of course, can occur as a sample a directly fluorescent (or phosphorescent) substance, whereby a dye addition is unnecessary. Auch können zusätzliche Farbstoffe verwendet werden, die andere Eigenschaften zeigen und nicht in einen zweiten Zustand bringbar sind. Also, additional dyes can be used, which exhibit different properties and are not brought into a second state. Weiter können für einzelne Verfahrensformen oder Mikroskope geschilderte Merkmale auch für andere beschriebene Verfahrensformen oder Mikroskope eingesetzt werden, so daß auch hier nicht geschilderte Kombinationen möglich sind. Next described for individual forms of methods or microscopes features to other described forms of methods or microscopes can be used, so that not described here combinations are possible.
  • [0059] [0059]
    4 4 zeigt beispielshalber eine Fluoreszenz-Kennlinie by way of example shows a fluorescence characteristic 17 17 für einen Farbstoff, der erfindungsgemäß verwendet wird. for a dye that is used according to the invention. Diese Fluoreszenz-Kennlinie This fluorescence characteristic 17 17 gibt die Leistung L der abgegebenen Fluoreszenzstrahlung F als Funktion der Leistung L der Anregungsstrahlung A wieder. is the output L of the emitted fluorescence radiation F as a function of the power L of the excitation radiation A again. Wie zu sehen ist, steigt die Kennlinie As can be seen, the curve rises 17 17 weitgehend linear, jedenfalls monoton, bis zu einem Maximum largely linear, at least monotonous, up to a maximum 18 18 und fällt dann oberhalb eines Schwellwerts and then falls above a threshold 19 19 für die Anregungsstrahlungsleistung wieder ab. for the exciting radiation power again. Erkennbar sind zwei Zustands-Regionen, die jeweils links und rechts vom Schwellwert Recognized two-state regions, the left and right of the threshold 19 19 bzw. dem Maximum or the maximum 18 18 liegen. lie. Wird eine Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwerts If an exciting radiation power below the threshold 19 19 eingestrahlt, befindet sich der Farbstoff vorrangig in einem ersten Zustand irradiated, the dye is mainly in a first state 5 5 . , In diesem kann er Fluoreszenzstrahlung abstrahlen. In this he can emit fluorescent radiation. Wird die Anregungsstrahlungsleistung über den Schwellwert If the exciting radiation power above the threshold 19 19 erhöht, findet eine Umschichtung der Farbstoffmoleküle in einen zweiten Zustand increased, is a shift of the dye molecules in a second state 6 6 statt. instead of. Farbstoffmoleküle im zweiten Zustand Dye molecules in the second state 6 6 können entweder nicht fluoreszieren, strahlen eine Fluoreszenzstrahlung mit geänderten optischen Eigenschaften ab und/oder besitzen eine gegenüber dem ersten Zustand either can not fluoresce emit a fluorescent radiation with modified optical properties, and / or have a relation to the first state 5 5 geänderte Absorptionseigenschaft. modified absorption property. Die geänderten optischen Eigenschaften für Fluoreszenzemission oder Absorption können die spektrale Zusammensetzung, die Polarisation und/oder die Lebensdauer der Fluoreszenzstrahlung betreffen. The modified optical properties for fluorescence emission or absorption can affect the spectral composition, the polarization and / or lifetime of the fluorescence radiation. Im Ergebnis fällt in der zweiten Zustands-Region die Leistung der Fluoreszenzstrahlung F, wenn man sich auf die Art der Fluoreszenzstrahlung, die im ersten Zustand As a result, the performance of the fluorescence radiation F falls in the second state region, if you look at the type of fluorescent radiation in the first state 5 5 abgeben wird, bezieht, wieder ab. will issue relates, again.
  • [0060] [0060]
    Die Erfindung setzt nun die Kennlinie The invention now uses the characteristic 17 17 dahingehend ein, daß die Einstrahlung der Anregungsstrahlung A nur einen Teil der Probe in die erste Zustands-Region (oder kurz ersten Zustand) there arises a, that the irradiation of the exciting radiation A, only a portion of the sample in the first state region (or shortly first state) 5 5 , einen anderen Teil der Probe jedoch in die zweite Zustands-Region (oder kurz zweiten Zustand) Another part of the sample, however, in the second state region (or shortly second state) 6 6 bringt. brings. Bereiche, die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes Areas with excitation radiation power above the threshold value 19 19 beleuchtet wurden/werden, emittieren somit die bestimmte Fluoreszenzstrahlung nur vermindert. were lit / are thus emit only reduces the specific fluorescence radiation. Dabei ist es vorteilhaft, wenn der zweite Zustand It is advantageous if the second state 6 6 ein reversibler Zustand ist. is a reversible state. Dies bedeutet, daß zumindest nach einer gewissen Zeit oder nach aktiver Einwirkung ein einmal mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes This means that, at least after a certain time or after exposure to an active once with exciting radiation power above the threshold value 19 19 bestrahlter Farbstoff wieder die Eigenschaften des ersten Zustandes irradiated dye again the properties of the first state 5 5 zeigt. shows. Ein Beispiel für einen Farbstoff, für den die Erfinder eine Kennlinie gemäß der An example of a dye for which the inventor of a characteristic curve according to the 4 4 erkannten, ist die als Dronpa bezeichnete Substanz, die in der Veröffentlichung R. Ando et al., „Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting", Science, 19. November 2004, Vol. 306, S. 1370-1373, beschrieben ist. Der Farbstoff ist von der Firma Amalgaam, Woburn, Massachusetts, USA, unter der Bezeichnung Dronpa-Green, Code-Nr. AM-V0071, verfügbar und bislang im Zusammenhang mit der Fluoreszenzmarkierung von Molekülen, deren Transporteigenschaften durch Zellmembranen untersucht werden sollen, bekannt. Der Farbstoff Dronpa kann bei einer Wellenlänge von 488 nm angeregt werden, und nach Anregung in den zweiten Zustand realized the called Dronpa substance in the publication R. Ando et al., "Regulated almost nucleocytoplasmic shuttling Observed by reversible protein highlighting", Science, November 19, 2004 Vol. 306, pp 1370-1373, described . dye is from the company Amalgaam, Woburn, Massachusetts, USA, under the name Dronpa Green, code no. AM-V0071, available and so far in connection with the fluorescent labeling of molecules whose transport properties will be investigated through cell membranes, known. the dye Dronpa can be excited at a wavelength of 488 nm, and after excitation to the second state 6 6 durch Strahlung bei einer Wellenlänge von 405 nm wieder in den ersten Zustand radiation at a wavelength of 405 nm return to the first state 5 5 zurückgeführt werden. to be led back.
  • [0061] [0061]
    In Kombination mit einer geeigneten Anregungsstrahlungsverteilung beim Beleuchten der Probe führt die Verwendung des Farbstoffes mit der Kennlinie der In combination with an appropriate excitation radiation distribution in illuminating the sample, the use of the dye with the characteristic of the leads 4 4 oder einer entsprechenden Kennlinie zu einer deutlichen Steigerung der Auflösung. or a corresponding characteristic to a significant increase in resolution. Dabei wird im Gegensatz zum Stand der Technik nur Strahlung mit einer Wellenlänge eingestrahlt, und nur diese Strahlung trägt zur Auflösung bei. In this case, only radiation having a wavelength is radiated in contrast to the prior art, and only those radiation contributes to the resolution. Das Rückschalten kann den Ausführungsformen, bei denen der Farbstoff nicht spontan in den ersten Zustand The downshifting can the embodiments in which the dye does not spontaneously in the first state 5 5 zurückkehrt, durch Einstrahlung einer Rücksetzstrahlung R erreicht werden, die jedoch zur Auflösungssteigerung unbeachtlich ist. returns be achieved by irradiation of a resetting radiation R, which is, however, irrelevant to the increase in resolution.
  • [0062] [0062]
    Mit der Anregungsstrahlung A wird neben der Anregung der Farbstoffmoleküle aus dem Grundniveau heraus in das erste angeregte Niveau (erster Zustand With the excitation radiation A is adjacent to the excitation of the dye molecules from the ground level out in the first excited level (first state 5 5 ) auch die Verhinderung von Fluoreszenz oder auch eine Entvölkerung (zweiter Zustand ) And the prevention of fluorescence or a depopulation (second state 6 6 ) bewerkstelligt. ) Accomplished. Bei der Entvölkerung erfolgt eine Umlagerung der Farbstoffmoleküle aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand. In the depopulation a rearrangement of the dye molecules from the first state to the second state occurs. Die beiden Zustände haben voneinander verschiedene optische Fluoreszenzeigenschaften. The two states have mutually different optical fluorescence properties. Nach der Anregung mit der Anregungsstrahlung A kann sofort das hochaufgelöste Fluoreszenzbild gewonnen werden, wobei hochaufgelöst sich auf die optische Auflösung der Anregungsstrahlung A bezieht. After excitation with the excitation radiation, A a high-resolution fluorescence image can be obtained immediately, high-resolution refers to the resolution of optical excitation radiation A. Falls der Farbstoff aus dem zweiten Zustand nicht spontan in den ersten Zustand zurückkehrt, wird aktiv eine Rücksetzung, beispielsweise mittels einer Rücksetzstrahlung R, die von der Anregungsstrahlung A verschiedene optische Eigenschaften aufweist, bewerkstelligt. If the dye does not return from the second state to the first state spontaneously becomes active a reset, for example by means of a resetting radiation R having from the excitation radiation A different optical properties accomplished. Das entsprechende Schema zeigt That format shows 5 5 . ,
  • [0063] [0063]
    Ursprünglich befindet sich zB die zu untersuchende Probe P im ersten Zustand Initially, the sample to be examined P located, for example, in the first state 5 5 , in dem die Leistung der Fluoreszenzstrahlung F mit der Leistung der Anregungsstrahlung A steigt. In which increases the performance of the fluorescence radiation F with the power of the excitation radiation A. Die Einstrahlung der Anregungsstrahlung A erfolgt nun so, daß in einzelnen Proben-Bereichen B2 die Anregungsstrahlungsleistung über dem Schwellwert The irradiation of the exciting radiation A is now such that, in each sample areas B2, the excitation radiation power is above the threshold 19 19 liegt. lies. In anderen Bereichen B1 liegt sie darunter. In other areas it is below B1. Somit sind einige Probenbereiche im ersten Zustand Thus, some sample areas are in the first state 5 5 , andere im zweiten Zustand Other in the second state 6 6 , je nach dem ob die Leistung der Anregungsstrahlung über oder unter dem Schwellwert , Depending on whether the power of the excitation radiation above or below the threshold value 19 19 liegt. lies. 5 5 zeigt schematisch die Überführung der Probe durch Einstrahlung von Anregungsstrahlung A in Probenbereiche B1 im ersten Zustand schematically shows the transfer of the sample by irradiation with excitation radiation in A sample zones B1 in the first state 5 5 (rechter Teil der unteren Hälfte der (Right part of the lower half of the 5 5 ) sowie Probenbereiche B2 im zweiten Zustand ) As well as sample areas B2 in the second state 6 6 (linker Teil). (Left panel). Probenbereiche B2 im zweiten Zustand Sample zones B2 in the second state 6 6 können nicht mehr effizient fluoreszieren, vor allem wenn eine Anregungsstrahlungsleistung deutlich über dem Schwellwert can no longer fluoresce efficiently, especially when an exciting radiation power well above the threshold 19 19 verwendet wurde. has been used. Der Begriff „fluoreszieren" bezieht sich dabei auf Fluoreszenzstrahlung mit bestimmten Eigenschaften. Es ist also durchaus möglich, daß auch im zweiten Zustand The term "fluorescence" refers to fluorescence radiation with certain characteristics. So it is quite possible that in the second state 6 6 Fluoreszenzstrahlung abgegeben wird, jedoch mit anderen Eigenschaften als im ersten Zustand Fluorescence radiation is emitted, but with different characteristics than in the first state 5 5 . , Entweder ändern sich im zweiten Zustand also die Absorptionseigenschaften oder/und die Fluoreszenzeigenschaften der Probe. Thus, either the absorption properties and / or fluorescence properties of the sample change in the second state.
  • [0064] [0064]
    Bereiche B1 der Probe, die im ersten Zustand Areas B1 of the sample in the first state 5 5 bleiben, emittieren nach Einstrahlung von Anregungsstrahlung A weiterhin dieselbe Fluoreszenzstrahlung F. Einstrahlung von Rücksetzstrahlung R (in Stay according to emit radiation of excitation radiation A continues the same fluorescence F. irradiation of resetting radiation R (in 5 5 ist dieser Vorgang durch einen entsprechenden Pfeil veranschaulicht) bringt die gesamte Probe P wieder in den ersten Zustand This process is illustrated by a corresponding arrow) brings the entire sample P back to the first state 5 5 , reversiert also die Aufteilung in zwei verschieden fluoreszierende Probenbereiche B1 und B2. thus, reverses the division into two different fluorescent sample areas B1 and B2.
  • [0065] [0065]
    Die Aufteilung der Probe in Probenbereiche B1, die sich im ersten Zustand The division of the sample into sample areas B1, which in the first state 5 5 befinden, und Probenbereiche B2, die sich im zweiten Zustand are, and sample regions B2, which in the second state 6 6 befinden, ermöglicht es nun, die Emission von Fluoreszenzstrahlung F auf ein Volumen der Probe P zu beschränken, das kleiner ist, als das ursprüngliche mit Anregungsstrahlung A beleuchtete Volumen. are now makes it possible to limit the emission of fluorescence radiation F on a volume of the sample P, which is smaller than the illuminated with excitation radiation A volume original. Es läßt sich somit also eine Struktur im fluoreszierenden Bild erreichen, die ursprünglich in der Anregungsstrahlungsverteilung nicht vorhanden war. thus it can therefore achieve a structure in the fluorescent image, which was not originally present in the exciting radiation distribution. Ursache dafür ist die geschickt eingesetzte Nichtlinearität der Kennlinie This is due to the non-linearity of the characteristic curve sent used 17 17 . ,
  • [0066] [0066]
    Die The 6a 6a und and 6b 6b zeigen zwei Verfahrensformen, wie die Anregungsstrahlungsverteilung zur Auflösungssteigerung aussehen kann. show two forms of methods, such as the exciting radiation distribution may look for increasing resolution. Beide Figuren zeigen links einen eindimensionalen Schnitt durch die Anregungsstrahlungsverteilung bzw. Fluoreszenzstrahlungsverteilung. Both figures on the left show a one-dimensional section of the exciting radiation distribution or fluorescence radiation distribution. Jeweils rechts ist das zweidimensionale Bild der Fluoreszenzstrahlungsverteilung in Draufsicht zu sehen. To the right is shown in plan view, the two-dimensional image of the fluorescence radiation distribution.
  • [0067] [0067]
    In In 6a 6a wird eine punkförmige verteilte Anregungsstrahlung A eingestrahlt. a dot-like distributed excitation radiation A is radiated. Die Verteilung ist hier eine beugungsbegrenzte Airy-Verteilung. The distribution is a diffraction-limited Airy distribution here. Hierdurch wird im Farbstoff Fluoreszenzstrahlung F mit einer ellipsoidförmigen Donut-Verteilung angeregt, die sich im zweidimensionalen Bild als lateral fluoreszierender, kreisförmiger Ring darstellt. In this way F is excited with an ellipsoidal donut distribution in dye fluorescence radiation, which is located in the two-dimensional image as a fluorescent lateral, annular ring. Es fluoreszieren nur die Proben-Bereiche B1. It fluoresce only the sample areas B1. Axial liegt ein fluoreszierender ellipsenförmiger Ring dar. Dieser Probenbereich B1 ist kleiner als die Beugungsgrenze der Anregungsstrahlung erlaubt. Axially located represent a fluorescent elliptical ring. This sample area B1 is smaller than the diffraction limit of the excitation radiation allowed.
  • [0068] [0068]
    Strahlt man dagegen, wie in Radiates to the contrary, as in 6b 6b gezeigt, eine ebenfalls beugungsbegrenzte Donut-förmige Verteilung der Anregungsstrahlung A ein, ergibt sich ein abstrahlender Proben-Bereich B1, der einer verkleinerten Airy-Verteilung entspricht, welche von einem ringförmigen fluoreszierenden Bereich umgeben ist. shown, a diffraction-limited also donut-shaped distribution of the excitation radiation a A, there is a radiating sample area B1, which corresponds to a reduced Airy distribution which is surrounded by an annular fluorescent area. In der Schnittdarstellung zeigen sich in der Verteilung der Fluoreszenzstrahlung F deshalb drei Peaks als Proben-Bereiche B1. Therefore, in the sectional view three peaks are reflected in the distribution of fluorescence radiation F as sample areas B1. Auch hier ist die Punktverwaschungsverteilung Again, the point-spread 16 16 kleiner als die Beugungsgrenze zuläßt. smaller than the diffraction limit allows. Die Verbesserung der Auflösung über die normale Punktverwaschungsverteilung hängt wesentlich von der Kombination aus Kennlinie The improvement in resolution over the normal point-spread distribution depends largely on the combination of characteristics 17 17 und Leistungsverteilung der Anregungsstrahlung A ab. and power distribution from the excitation radiation A.
  • [0069] [0069]
    Zur Ausblendung des ringförmigen Außenbereichs ist es zusätzlich möglich, eine konfokale Detektion durchzuführen, die den mittleren Peak durch geeignete Einstellung eines konfokalen Detektionsvolumens D auswählt. For suppression of the annular outer region, it is also possible to carry out a confocal detection, which selects the mean peak by appropriate adjustment of a confocal detection volume D. Dies ist schematisch als dritte Verfahrensform in This is shown schematically as a third method in the form of 7 7 dargestellt. shown. Der nun noch detektierte fluoreszierende Proben-Bereich B1 besteht dann aus dem mittleren Peak. The now even detected fluorescent sample area B1 then consists of the central peak. Insgesamt ist zB ein bildgebendes Volumen B (punktierte Linie in der rechten Darstellung der Overall, eg an imaging volume B (dotted line in the right illustration of 7 7 ) erreicht, das zweieinhalb mal schmäler ist, als die konventionelle Punktverwaschungsverteilung, und sogar 1,7-mal schmäler, als eine konfokale Punktverwaschungsverteilung. ) Is reached, which is two and a half times narrower than the conventional point-spread, and even 1.7 times narrower than a confocal point-spread. Bei einer Donut-förmigen Anregungsverteilung, wie sie die durchgezogene Kurve in der rechten Darstellung der In a donut-shaped excitation distribution as the solid curve in the right illustration 6b 6b bzw. or. 7 7 zeigt, ist die resultierende Verteilung des bildgebenden Volumens B bzw. der mittlere Peak der Punktverwaschungsverteilung der shows the resulting distribution of the imaging volume B and the middle peak of the point-spread the 6b 6b radialsymmetrisch. radially symmetrical. Verwendet man zwei Beleuchtungsspots, erreicht man eine maximale Auflösungssteigerung entlang der Verbindungslinie der Spotmaxima. If two light spots, to reach a maximum resolution enhancement along the line connecting the spot maxima.
  • [0070] [0070]
    Alternativ wird der äußere fluoreszierende Ring in Alternatively, the outer ring is fluorescent in 6b 6b durch ein gezieltes Rückschalten des Farbstoffs aus dem zweiten Zustand by selective switching back of the dye from the second state 6 6 in den ersten Zustand in the first state 5 5 im Bereich des konfokalen Detektionsvolumens D ausgeblendet. hidden in the range of the confocal detection volume D. Das Vorgehen/Prinzip ist dann wie folgt: Zuerst wird mit Anregungsstrahlung so angeregt, daß der zu untersuchende Probenabschnitt vollständig in den zweiten Zustand gelangt. The approach / principle is then as follows: First is excited with excitation radiation such that the sample section to be examined fully enters the second state. Anschließend wird Rücksetzstrahlung R mit einer Verteilung entsprechend dem konfokalen Detektionsvolumen D eingestrahlt und damit ein Teil der Probe zurückgeschaltet. Then resetting radiation R is irradiated with a distribution corresponding to the confocal detection volume D and switched back part of the sample. Bei nochmaliger Anregung mit der Anregungsstrahlungsverteilung A gemäß In yet repeated excitation with the excitation radiation distribution A of 7 7 gelangt dann nur der in diesem Probenteil liegende bildgebende Bereich B in den ersten Zustand und emittiert Fluoreszenzstrahlung F in Form des mittleren Peaks, wie er auch in der Variante der then passes just the opposite in this sample portion imaging range B in the first state and emits fluorescence radiation F in the form of the central peak, as also in the variant of 7 7 verbleibt. remains. Der ringförmige Außenbereich verbleibt im zweiten Zustand und fluoresziert nicht. The annular outer area remains in the second state and does not fluoresce.
  • [0071] [0071]
    In einer vierten Verfahrensform erfolgt eine strukturierte flächige Beleuchtung, wie sie beispielsweise in In a fourth method form a structured area lighting is done, as for example in 8a 8a gezeigt ist. is shown. Eine in x-Richtung sinusförmig verteilte Anregungsstrahlung A führt in den Tälern der sinusförmigen Leistungsverteilung zu Fluoreszenzstrahlung F. Die fluoreszierenden Proben-Bereiche B1 sind streifenförmig. A sinusoidally distributed in the x-direction exciting radiation A into the valleys of the sinusoidal power distribution to fluorescence F. The fluorescent sample areas B1 are strip-shaped. Die Streifen sind jedoch deutlich schmaler als die Streifen der sinusförmigen Verteilung der Anregungsstrahlung A. Vorteilhaft ist hierbei, daß die sinusförmige Verteilung der Anregungsstrahlung A als Minima keine Nullstellen aufweist bzw. aufweisen muß. However, the strip are considerably narrower than the strips of the sinusoidal distribution of the excitation radiation A. An advantage is that the sinusoidal distribution of the excitation radiation having A as minima no zeros or must have. Die resultierende Verteilung der Fluoreszenzstrahlung F hängt zwar in ihrer Höhe, nicht jedoch in der Breite von der Leistung der Anregungsminima ab. However, although the resulting distribution of the fluorescence radiation F is stuck at its height, not in width on the performance of Anregungsminima from. Die Tiefe der Minima der sinusförmigen Anregungsstrahlungsverteilung ist also unkritisch für die Breite der Streifen und somit für die Auflösung. The depth of the minima of the sinusoidal excitation radiation distribution is therefore not critical to the width of the strip and thus the resolution. Im Beispielfall ist die Periode der sinusförmigen Streifenverteilung der Anregungsstrahlung A an der Grenzfrequenz der Auflösung eingestellt. In the example case, the period of the sinusoidal strip distribution of the excitation radiation A is set at the boundary frequency of the resolution. Als Detektor wird zB ein Matrixdetektor verwendet. The detector is a matrix detector is used for example. Die Streifenbreite und mithin die Auflösung ist um Faktor 6 gegenüber der Grenzfrequenz der Auflösung verbessert. The strip width and thus the resolution is compared to the cut-off frequency of the resolution improved by a factor of 6th Ein hochaufgelöstes Bild wird nun durch Verschiebung des Streifenmusters gewonnen. A high resolution image is now obtained by shifting the strip pattern.
  • [0072] [0072]
    Alternativ kann statt einer streifenförmigen Weitfeldbeleuchtung auch eine brennlinienförmige Beleuchtung verwendet werden, wobei die Linie entlang ihrer Längsachse (zB sinusförmig) moduliert ist, so daß die Leistung in Linienabschnitten über dem Schwellwert und in Linienabschnitten unter dem Schwellwert liegt. Alternatively, also a focal line-shaped illumination can be used instead of a strip-shaped wide-field illumination with the line along its longitudinal axis (eg, sinusoidal) modulated so that the power is in line segments above the threshold and line portions below the threshold. Die Scanbewegung erfolgt senkrecht zur Linie und entlang der Linie. The scan movement takes place perpendicular to the line and along the line. Der Detektor ist ein geeignet hochauflösender Zeilendetektor. The detector is a suitable high resolution line detector.
  • [0073] [0073]
    8b 8b zeigt eine Weiterbildung der vierten Verfahrensform der shows a development of the fourth method, the form of the 8a 8a . , In dieser fünften Verfahrensform erfolgt die Strukturierung der Verteilung der Auflösungsstrahlung A in beiden lateralen Achsen, dh in der Probenebene, so daß eine matrixförmige Beleuchtungsspotverteilung gegeben ist. In this fifth method form, the patterning of the distribution of the radiation A resolution in both lateral axes is performed, that is, so that a matrix-shaped light spot distribution is given in the sample plane. Dies ist in der Schnittdarstellung der linken Hälfte der This is in the sectional view of the left half of the 8b 8b eindimensional dargestellt. shown one-dimensionally. Senkrecht zur optischen Achse ist eine Matrix aus hellen Anregungsspots auf die Probe abgebildet. Perpendicular to the optical axis of a matrix of light excitation spots is imaged on the sample. Jedem Beleuchtungsspot wird nun ein Detektor zugeordnet. Each illumination spot, a detector is now assigned. Eine Verschiebung des Spotmusters relativ zur Probe erlaubt es, die Zwischenräume zwischen den Punkten ebenfalls zu vermessen. A shift of the spot pattern on the sample to measure the spaces between the points also allows relatively. Der Bereich in dem die Verschiebung des matrixförmigen Musters zu erfolgen hat, ist in The area has in which to take place, the displacement of the matrix-shaped pattern is in 8b 8b als Gebiet G1 dargestellt. shown as an area G1. Durch eine Abrasterung der Spotmatrix, beispielsweise wie mit einem konventionellen Laserscanningmikroskop bekannt, wird insgesamt das gesamte Gebiet G2 aus Einzelgebieten G1 zusammengesetzt. the entire area G2, known by a scanning of the spot matrix, for example as with a conventional laser scanning microscope is composed of individual areas G1 total. Durch diese Parallelisierung ist eine sehr hohe Scangeschwindigkeit erreicht. By this parallelization a very high scan speed is reached. Zugleich ist die Auflösung, wie die schmalen Peaks der Fluoreszenzstrahlung F in der Schnittdarstellung zeigen, über die Auflösung der Anregungsstrahlungsverteilung hinaus gesteigert. At the same time, the resolution, as the narrow peaks of the fluorescence radiation F in the sectional view, increased the dissolution of the exciting radiation distribution out.
  • [0074] [0074]
    Obwohl bislang nur die laterale Auflösung erwähnt wurde, ist auch die axiale Auflösung für die Ausführungsformen verbessert. Although so far only the lateral resolution has been mentioned, the axial resolution for the embodiments is improved.
  • [0075] [0075]
    9a 9a zeigt ein Laserscanningmikroskop, das jede der erläuterten Verfahrensformen realisieren kann. shows a laser scanning microscope that can realize any forms of methods explained. Für die Verfahrensformen For the method forms 1 1 bis to 3 3 ist das Laserscanningmikroskop is the laser scanning microscope 20 20 z. z. B. als einzelpunktscannendes Mikroskop ausgebildet. B. formed as a single-point-scanning microscope. Es weist ein Anregungsmodul It has an exciting module 21 21 , ein Mikroskopmodul A microscope module 22 22 sowie ein Detektormodul and a detector module 23 23 auf. on. Im Mikroskopmodul In the microscope module 22 22 befindet sich eine Probe is a sample 24 24 im Fokus eines Objektivs the focus of a lens 25 25 , dem in Beleuchtungsrichtung eine Tubuslinse , The tube lens in an illumination direction 26 26 vorgeschaltet ist. is connected upstream. Vor dieser Optik liegt eine Scanoptik Prior to this appearance is scanning optics 27 27 , die zusammen mit einem Scanner Which together with a scanner 28 28 ein Abscannen der Probe a scanning of the sample 24 24 durch Verschieben des Fokuspunktes auf der Probe ermöglicht. possible by shifting the focal point on the sample. Ein Hauptfarbteiler A main color splitter 29 29 koppelt die Strahlung aus dem Anregungsstrahlungsmodul coupling the radiation from the excitation radiation module 21 21 in das Mikroskopmodul in the microscope module 22 22 ein und trennt aus dem Mikroskopmodul and separates from the microscope module 22 22 von der Probe of the sample 24 24 aufgenommene Strahlung zum Detektormodul absorbed radiation to the detector module 23 23 ab. from.
  • [0076] [0076]
    Das Anregungsmodul The excitation module 21 21 verfügt über eine Lichtquelle has a light source 30 30 , deren Strahlung über den Hauptfarbteiler Whose radiation over the main color splitter 29 29 zum Fokuspunkt in der Probe to the focal point in the sample 24 24 gebündelt wird. is bundled. Die im Fokuspunkt der Probe The focus point of the sample 24 24 angeregte Fluoreszenzstrahlung F wird vom Objektiv excited fluorescence radiation F is the lens 25 25 gesammelt und am Hauptfarbteiler collected and the main color splitter 29 29 aufgrund der im Vergleich zur Anregungsstrahlung A geänderten Spektraleigenschaften zu einer Pinholeoptik due to the changed compared to the excitation radiation spectral A to a pinhole optics 31 31 ausgekoppelt, der ein Pinhole disengaged, the pinhole a 32 32 sowie ein (optionaler) Blockfilter and an (optional) block filter 33 33 nachgeschaltet sind. downstream. Ein Punkt-Detektor A point detector 34 34 erfaßt die Leistung der Fluoreszenzstrahlung F am Fokuspunkt. detects the power of the fluorescence radiation F at the focal point. Die Erfassung kann zusätzlich spektral aufgelöst, polarisationsaufgelöst und/oder zeitaufgelöst erfolgen. The acquisition can also spectrally resolved, polarization-resolved and / or time-resolved. Die Signale des Detektors The signals of the detector 34 34 werden von einem Steuergerät be from a control unit 35 35 ausgelesen, das insgesamt den Betrieb des Laserscanningmikroskops read out, the overall operation of the laser scanning microscope 20 20 steuert. controls.
  • [0077] [0077]
    Zur Auflösungssteigerung erfolgt die Einstrahlung der Anregungsstrahlung A in den Fokuspunkt the irradiation of the exciting radiation is for increasing resolution A in the focal point 24 24 mit einer bestimmten Leistungsverteilung. with a certain power distribution. Um diese vorzugeben und einzustellen, ist ein geeigneter Aufbau im Anregungsmodul In order to define these, and adjust, is a suitable structure in the excitation module 21 21 vorgesehen. intended. Die Bauweise der The construction of the 9a 9a weist einen Strahlteiler comprises a beam splitter 36 36 auf, der 50% der Strahlleistung der Lichtquelle to which 50% of the beam power of the light source 30 30 auskoppelt. couples out. In der Ausführungsform handelt es sich bei dem Strahlteiler In the embodiment, wherein the beam splitter 36 36 um einen Polarisationsstrahlteiler. a polarization beam splitter. Die derart aufgespaltenen Teilstrahlen werden nachher über einen weiteren Strahlteiler The thus split sub-beams are subsequently via a further beam splitter 40 40 wieder zu einem gemeinsamen Strahl überlagert, wobei die Intensitäten und Phasen der Teilstrahlen zuvor geeignet eingestellt werden. again superimposed to form a common beam, the intensities and phases of the sub-beams are previously suitably adjusted. Zusätzlich ist in einem Teilstrahl ein Phasenelement Additionally, in a partial beam is a phase element 39 39 gestellt, das entweder als festes Phasenelement oder als variabel einstellbares Phasenelement ausgebildet werden kann. provided that can be configured either as a solid phase member or as a variably adjustable phase element. Das Phasenelement The phase element 39 39 hat z. z has. B. einen phasenverändernden Bereich B. a phase-changing field 44 44 sowie einen phasenneutralen Bereich and a phase neutral range 49 49 , so daß eine donutförmige Leistungsverteilung im Strahl erzeugt wird. So that a donut-shaped power distribution in the beam is generated. Nach Überlagerung der beiden Teilstrahlen nach dem Strahlteiler After superposition of the two beams by the beam splitter 40 40 erhält man Anregungsstrahlung A gemäß obtained excitation radiation A of 10 10 . , Der Aufbau des Phasenelementes The structure of the phase element 39 39 ist exemplarisch in is exemplary in 9b 9b gezeigt. shown. Zur Einstellung der Leistungsanteile der beiden Teilstrahlen vor der Überlagerung sind in jeden Teilstrahl noch variable Abschwächer To the powers of the two beam adjustment before superposition in each partial beam still variable attenuator 37 37 bzw. or. 38 38 gestellt. posed.
  • [0078] [0078]
    Im Ergebnis erhält man eine Verteilung der Leistung der Anregungsstrahlung A, wie sie in As a result, we obtain a distribution of the power of the exciting radiation A, as in 10 10 als Schnittdarstellung entlang einer senkrecht zur optischen Achse verlaufende x-Achse gezeigt ist. is shown as a sectional view taken along a plane perpendicular to the optical axis x-axis. Die Verteilung weist ein Minimum The distribution has a minimum 45 45 auf, dessen Tiefe durch Einstellung der Abschwächer on whose depth by adjusting the attenuator 38 38 bzw. or. 37 37 , dh durch Änderung der relativen Leistung der beiden Teilstrahlen variabel einstellbar ist, z. , That is variably adjustable by changing the relative power of the two partial beams, z. B. durch das Steuergerät B. by the controller 35 35 . , Die Anpassung des Minimums The adjustment of the minimum 45 45 erlaubt es, die Intensität der ebenfalls in allows the intensity of the also in 10 10 eingezeichneten Fluoreszenzstrahlung F optimal einzustellen. drawn fluorescence radiation F optimally adjust.
  • [0079] [0079]
    Das hinsichtlich der Tiefe einstellbare Minimum The adjustable in terms of the Minimum Depth 45 45 kann auch durch den Einsatz eines variabel einstellbaren Phasenelementes ohne Bildung von Teilstrahlen erzeugt werden. can also be generated through the use of a variably adjustable phase element without the formation of sub-beams. Für ein solches Phasenelement kommt eine Matrix aus Flüssigkristallen in Frage, bei der die Phase jedes einzelnen Pixels einstellbar ist. For such a phase element a matrix of liquid crystals out of the question, at which the phase of each pixel can be adjusted. Natürlich sind noch andere Einrichtungen zur Erzeugung einer donatförmigen Strahlverteilung mit einstellbarem Minimum Of course, other means for generating a donat-shaped beam distribution with adjustable minimum 45 45 möglich. possible.
  • [0080] [0080]
    Für ein optionales Rückschalten der Proben-Bereiche B2 vom zweiten Zustand For an optional switching back of the sample areas B2 from the second state 6 6 in den ersten Zustand in the first state 5 5 kann eine Rücksetzstrahlungsquelle , a resetting radiation source 41 41 vorgesehen werden, die über einen dritten Teiler be provided via a third divider 42 42 in den Anregungsstrahlengang des Anregungsmoduls in the excitation beam path of the excitation module 21 21 eingebunden ist. is involved. Diese Bauweise ist jedoch optional, weshalb die Darstellung der However, this design is optional, so the presentation of the 9a 9a auch eine gestrichelte Darstellung für diese Elemente zeigt. a dashed representation for these elements shows. Die Rücksetzstrahlungsquelle The resetting radiation source 41 41 ist nur dann erforderlich, wenn der Farbstoff der Probe It is only necessary when the dye of the sample 24 24 nicht spontan wieder in den ersten Zustand zurückkehrt, sondern eines aktiven Rücksetzens durch optische Rücksetzstrahlung R bedarf. does not spontaneously return back to the first state, but an active reset by optical resetting radiation R needs. Rücksetzstrahlung kann jedoch auch anderweitig auf die Probe However, reset radiation can also otherwise to the test 24 24 aufgebracht werden, beispielsweise durch eine Einstrahlung schräg zur optischen Achse des Objektivs be applied, for example, by an irradiation obliquely to the optical axis of the lens 25 25 mit Hilfe einer seitlich vom Laserscanningmikroskop angebrachten Rücksetzstrahlquelle. by means of a mounted side of the laser scanning microscope reset ray source.
  • [0081] [0081]
    Das Mikroskop der The microscope of 9a 9a kann die eingangs geschilderten Verfahrensformen ausführen. can execute the initially described method forms. Die dritte Verfahrensform erfordert dabei die Verwendung des Pinholes The third method requires this form of the use of the pinhole 32 32 und der Pinholeoptik and the pinhole 31 31 im Detektormodul in the detector module 23 23 . , Immer dann, wenn man keine konfokale Detektion benötigt, können die dafür nötigen Bauteile ( Whenever you do not need confocal detection, for necessary components can ( 31 31 , . 32 32 ) entfallen. ) Account.
  • [0082] [0082]
    11a 11a zeigt eine weitere Verbesserungsmöglichkeit des erfindungsgemäßen Vorgehens auf. pointing to a further improvement possibility of the procedure according to the invention. Der Übergang der Probe im Teil-Bereich B2 aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand The transition of the sample in the partial region B2 from the first state to the second state 6 6 kann unvollständig stattfinden. can take place incomplete. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn die Fluoreszenzkennlinie This is for example the case when the fluorescence characteristics 17 17 nach dem Maximalwert after the maximum value 18 18 , dh für Leistungen der Anregungsstrahlung A oberhalb des Schwellwertes , That is, for performance of the excitation radiation above the threshold value A 19 19 , nicht steil genug abfällt. Not steeply enough. Im Beispiel der In the example of 11a 11a geht die Kennlinie is the characteristic 17 17 auch bei hohen Anregungsstrahlungsleistungen nicht auf Null zurück. even at high excitation radiation services not return to zero. Dies führt zu einer Restfluoreszenz This results in a residual fluorescence 47 47 in den Proben-Bereichen B2, die im zweiten Zustand in the sample areas B2, which in the second state 6 6 sind, da der geminderte Anteil are, because of the impaired portion 46 46 nicht dem Maximalwert not the maximum value 18 18 entspricht. equivalent. Würde man die Fluoreszenzstrahlung F dann mit dem Mikroskop gemäß Would be the fluorescence radiation F then the microscope in accordance with 9a 9a beispielsweise in Realisierung der dritten Verfahrensform vermessen, so würde sich das bildgebende Volumen B aus einem niedrig aufgelösten Sockel S und einer hochaufgelösten Verteilung V zusammensetzen. measured, for example, in implementation of the third form of the method, then the imaging volume B would consist of a low-resolution socket S and a high-resolution distribution V. Dies ist in This is in 11b 11b schematisch dargestellt, die den Sockel S schraffiert und die hochaufgelöste Verteilung V schwarz zeigt. shown schematically, which shades the socket S and the high-resolution distribution V shows black.
  • [0083] [0083]
    Der gleiche Effekt kann auftreten, wenn in der Probe eine starke Diffusion des fluoreszierenden Materials, beispielsweise der Farbstoffmoleküle, herrscht. The same effect can occur when a strong diffusion in the sample of the fluorescent material, for example of the dye molecules prevails. Auch dann ergibt sich eine Restfluoreszenz Even then, there is a residual fluorescence 47 47 in den Proben-Bereichen B2, jedoch nicht aufgrund einer vergleichsweise schwach abfallenden Kennlinie in the sample areas B2, but not due to a comparatively weak sloping characteristic 17 17 , sondern durch Diffusion des fluoreszierenden Materials. But by diffusion of the fluorescent material.
  • [0084] [0084]
    Der Sockel S läßt sich durch geeignete Bildaufnahme unterdrücken. The base S can be suppressed by appropriate image recording. Eine dies realisierende zweite Ausführungsform eines Laserscanningmikroskops A realized this second embodiment of a laser scanning microscope 20 20 ist exemplarisch in is exemplary in 12 12 dargestellt. shown. Mit der Bauweise gemäß With the construction according to 9a 9a übereinstimmende Komponenten sind mit denselben Bezugszeichen versehen, so daß auf ihre nochmalige Erläuterung verzichtet werden kann. matching components are given the same reference numerals and so may be dispensed with their repeated explanation.
  • [0085] [0085]
    Im Unterschied der Bauweise der Unlike the design of the 9a 9a ist nun der Detektor is now the detector 34 34 mit einem Lock-In-Verstärker with a lock-in amplifier 48 48 verbunden, wobei diese Verbindung in connected, said compound in 12 12 lediglich exemplarisch über das Steuergerät exemplary only via the control unit 35 35 realisiert ist. is realized. Natürlich ist auch eine direkte Verbindung möglich. Of course, a direct connection is possible. Auch kann der Lock-In-Verstärker Also, the lock-in amplifier 48 48 in das Steuergerät in the controller 35 35 integriert werden. to get integrated. Der Lock-In-Verstärker The lock-in amplifier 48 48 ist mit einem Frequenzgenerator is provided with a frequency generator 49 49 verbunden, der das Minimum connected to the minimum, the 45 45 in seiner Amplitude moduliert. modulated in its amplitude. Hierzu wird die Leistung einer der beiden Teilstrahlen im Anregungsmodul To this end, the performance of the two partial beams in the excitation module 21 21 geeignet moduliert, was z. appropriately modulated what z. B. durch eine Ansteuerung einer der beiden Abschwächer B. by driving one of the two attenuators 37 37 oder or 38 38 geschieht. happens. In der Darstellung der In the illustration of 12 12 ist die Ansteuerleitung für den Abschwächer is the driving line for the attenuator 38 38 gestrichelt dargestellt, um diese Option anzudeuten. shown in dashed lines to indicate this option. Natürlich kann die Ansteuerung der Abschwächer auch durch das Steuergerät Of course, the control of the attenuator by the control unit 35 35 erfolgen, das das Signal des Frequenzgenerators take place that the signal of the frequency generator 49 49 entsprechend auswertet. evaluates accordingly. Wie bereits erwähnt, können der Lock-In-Verstärker As already mentioned, the lock-in amplifier can 48 48 und/oder der Frequenzgenerator and / or the frequency generator 49 49 Bestandteile des Steuergerätes Components of the control unit 35 35 sein. be.
  • [0086] [0086]
    Die vom Frequenzgenerator By the frequency generator 49 49 zur Modulation des Minimums bereitgestellten Frequenz wird auch dem Lock-In-Verstärker to modulate the minimum frequency provided is also the lock-in amplifier 48 48 zugeführt. fed. Durch die Modulation des Minimums By modulating the minimum 45 45 verändert sich das Signal aus den Proben-Bereichen im ersten Zustand the signal from the sample areas changed in the first state 5 5 , wohingegen Signale aus dem Sockel S konstant bleiben. , Whereas signals from the base S remain constant. Der Lock-In-Verstärker The lock-in amplifier 48 48 separiert die modulierten Signale heraus und unterdrückt Signale aus dem Sockel S. Im Ergebnis erfolgt eine Trennung der Verteilung V vom Sockel S, und die hochaufgelöste Detektion ist auch bei einem unvollständigem Übergang in den zweiten Zustand separates the modulated signals out and suppresses signals out of the socket S. As a result, a separation of the distribution V from the base S, and the high-resolution detection is also in an incomplete transition to the second state 6 6 erreicht. reached.
  • [0087] [0087]
    Verwertet man gezielt den Gleichanteil des Signals, erreicht man eine zusätzliche Bildinformation, die nicht hochaufgelöst ist. Utilized to target the DC component of the signal to reach an additional image information is not high dissolved. Diese Bildinformation kann sich zB auf andersartig fluoreszierende Proben-Bereiche/-Eigenschaften beziehen. for example, this image information may relate to differently fluorescent sample areas / relate properties. Die hoch und niedrig aufgelösten können beliebig codiert (zB farbcodiert) überlagert dargestellt werden. The high and low resolution can arbitrarily coded (for example, color coded) are shown superimposed.
  • [0088] [0088]
    Alternativ oder zusätzlich zu dieser Lock-In-Detektion können auch zwei Bilder aufgezeichnet werden. Alternatively, or in addition to lock-in detection, two images can be recorded. Ein erstes Bild wird mit Anregungsstrahlungsverteilung mit Minimum A first image is to excitation radiation distribution with minimum 45 45 , das zweite ohne Minimum , The second with no minimum 45 45 aufgezeichnet. recorded. Zur Separierung der hochaufgelösten Verteilung V vom Sockel S werden dann nur noch die Bilder voneinander subtrahiert (erstes Bild minus zweites Bild). only the images are then to separate the high-resolution distribution V from the base S subtracted from each other (first image minus second image). Das Ergebnisbild enthält nur noch die Informationen mit der hochaufgelösten Verteilung V. Weitere Möglichkeiten zur Unterdrückung eines niedrig aufgelösten Sockels können die Nutzung der unterschiedlichen optischen Eigenschaften des ersten Zustands The resulting image contains only the information with the high resolution distribution V. Other ways to suppress low-resolution base can the use of different optical properties of the first state 5 5 und des zweiten Zustands and the second state 6 6 sein, beispielsweise wenn sich die Lebensdauer der beiden Zustände unterscheiden. be, for example, if they are different the life of the two states. Auch kann man eine unterschiedliche Charakteristik des Emissionsspektrums verwenden, bzw. eine unterschiedliche Charakteristik des Absorptionsspektrums zwischen erstem Zustand Also, one may use a different characteristic of the emission spectrum or a different characteristic of the absorption spectrum between the first state 5 5 und zweiten Zustand and second state 6 6 . ,
  • [0089] [0089]
    13 13 zeigt eine nochmalige Abwandlung des Laserscanningmikroskops shows a repeated modification of the laser scanning microscope 20 20 der of the 9a 9a zur Realisierung einer der Verfahrensformen mit linienförmiger Beleuchtung. for implementing the process forms line-shaped illumination. Auch hier sind mit der Again, with the 9a 9a übereinstimmende Elemente mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet, so daß auf deren Beschreibung wiederum verzichtet werden kann. matching elements having the same reference numerals, so that in turn can be omitted from the description. Weiter sind nur die Mittelstrahlen eingezeichnet. Further, only the central beams are shown.
  • [0090] [0090]
    Die nun kohärente Lichtquelle The now coherent light source 30 30 strahlt ihre Strahlung durch ein Gitter emits its radiation through a grating 50 50 , das zwei 1. Beugungsordnungen, o+ und o-, sowie eine 0.-Beugungsordnung erzeugt. Which produces two 1st diffraction orders, o + and o-, as well as a 0-order diffraction. Dem Gitter ist eine Zylinderlinse The grid is a cylindrical lens 50a 50a nachgeordnet, die hier ein Beispiel für ein anamorphotisches Element ist. downstream of which is an example of an anamorphic element here. Auf die Probe wird eine senkrecht zur optischen Achse liegende Linie fokussiert. an axis perpendicular to the optical axis line is focused on the sample.
  • [0091] [0091]
    Die Beugungsordnungen fallen beim Fokussieren streifend zueinander ein und gelangen so in der Probe zur Interferenz. The diffraction orders fall upon focusing roaming each other, and thus pass into the sample to interference. Durch den Talbot-Effekt entsteht ein sogenanntes Talbotgitter entlang der optischen Achse OA. By the Talbot effect a so-called Talbotgitter along the optical axis OA is formed. Dies ist schematisch in der oberen Hälfte der This is schematically illustrated in the upper half of 14 14 gezeigt. shown. Die +1., die 0. sowie die –1. The +1., The 0 and -1. Ordnung fallen in der Probe Procedure fall in the sample 24 24 unter verschiedenen Winkeln ein und die Interferenzen erzeugen die dem Fachmann bekannte Talbotstruktur. at different angles and the interferences produce known to those skilled Talbotstruktur.
  • [0092] [0092]
    Die Wirkung innerhalb der Probe zeigt sich in der unteren Hälfte The effect within the sample is shown in the lower half 14 14 , die einen Tiefenschnitt (x,z-Ebene) durch die Probe zeigt. Showing a depth slice (x, z-plane) by the sample. An den Stellen hoher Intensität (schwarze Bereiche B2) gelangt die Probe in den zweiten Zustand At the points of high intensity (black areas B2), the sample reaches the second state 6 6 , dh es wird eine Entvölkerung der angeregten Zustände durch Umschalten der Farbstoffmoleküle erreicht. , That it will reach a depopulation of the excited states by switching the dye molecules. In den Bereichen B1 geringer Intensität verbleibt die Probe im ersten Zustand In the areas of low intensity B1 and the sample remains in the first state 5 5 (schraffierte und weiße Bereiche). (Shaded and white areas).
  • [0093] [0093]
    Die Detektion erfolgt mit einem Zeilendetektor The detection is performed with a linear detector 34 34 , der in der Bauweise der Which in the design of the 13 13 exemplarisch als mit dem Steuergerät of example as to the control unit 35 35 vereinigt dargestellt ist. is shown combined. Dem Zeilendetektor The line detector 34 34 ist wieder (optional) ein Blockfilter again (optional) is a block filter 33 33 vorgestellt. presented. Weiter ist dem Zeilendetekor Next is the Zeilendetekor 34 34 eine (in a (in 13 13 nicht dargestellte, da direkt auf den Zeilendetektor not shown, as it was directly on the line detector 34 34 aufgebrachte) entlang der x-Achse liegende Schlitzblende vorgeordnet, um die erforderliche konfokale Selektion einer Tiefenebene zu bewirken und dadurch nur die schraffierten Bereiche zu detektieren. applied) slit diaphragm lying along the x-axis is arranged upstream, in order to effect the required confocal selection of a depth level and thereby detect only the hatched areas.
  • [0094] [0094]
    Der Scanner The scanner 28 28 ermöglicht die Bewegung der Anregungsstrahlungsverteilung über die Probe allowing the movement of the excitation radiation distribution over the sample 24 24 senkrecht zur optischen Achse, also entlang der x- und y-Achse. perpendicular to the optical axis, ie along the x and y axis. Optional kann mit der Rücksetzstrahlungsquelle Optionally, the resetting radiation source 41 41 beispielsweise eine homogene Line entlang der x-Achse in der Probe For example, a homogeneous line along the x-axis in the sample 24 24 erzeugt werden, die ein Umschalten der Farbstoffe aus dem zweiten Zustand are generated, the switching of the dye from the second state 6 6 in den ersten Zustand in the first state 5 5 ermöglicht, wie dies allows, as 5 5 veranschaulicht. illustrated. Diese Linie kann auch ein Beleuchtungsmuster aufweisen, daß passend zu den Proben-Bereichen B2 im zweiten Zustand This line may also include an illumination pattern that match the sample areas B2 in the second state 6 6 liegt, da nur diese Bereiche zurückgesetzt werden müssen. is because only these areas need to be reset.
  • [0095] [0095]
    Das Laserscanningmikroskop gemäß The laser scanning microscope according to 13 13 realisiert also die Verfahrensform gemäß thus realizes the method according to the form 8a 8a . , Die Tiefe der Minima The depth of the minima 45 45 kann durch die Güte des Gitters bzw. die individuelle Abschwächung der einzelnen Ordnungen erfolgen. can be done by the quality of the grid or the individual weakening of the individual orders.
  • [0096] [0096]
    15a 15a zeigt eine Anordnung zur Realisierung der Verfahrensform gemäß shows an arrangement for realizing the method according to the form 8b 8b , wobei vom Laserscanningmikroskop Wherein the laser scanning microscope 20 20 hier nur das Anregungsmodul only the excitation module 21 21 gezeigt ist, da das Mikroskopmodul is shown as the microscope module 22 22 ansonsten den bereits geschilderten Aufbau hat. otherwise has the already described construction. Aus der Lichtquelle From light source 30 30 werden mittels eines ersten Strahlteilers by means of a first beam splitter 53 53 zwei Teilstrahlen erzeugt, hier senkrecht zur Zeichenebene beabstandet. generates two partial beams, here spaced apart perpendicular to the plane. Ein zweiter Strahlteiler A second beam splitter 52 52 erzeugt insgesamt vier parallel laufende Teilstrahlen. Total produces four parallel component beams. 15b 15b zeigt die Anordnung in einem um 90° Grad gedrehten Schnitt. shows the arrangement in a rotated by 90 ° section. Insgesamt liegen vier Teilstrahlen Overall, there are four sub-beams 54 54 , . 55 55 gleicher Intensität (gezeichnet sind die Mittelstrahlen) vor. of equal intensity (the central rays are drawn) in front. In der Zeichnung nehmen jeweils zwei Teilstrahlen den gleichen Weg, so daß sie verdeckt sind. In the drawing, two sub-beams follow the same path, so that they are hidden.
  • [0097] [0097]
    Die Teilstrahlen werden durch Linsen in eine Pupille des Mikroskopmoduls The partial beams by lenses in a pupil of the microscope module 22 22 fokussiert, so daß sich innerhalb einer Berandung focused so that within a boundary 56 56 der Pupille die in the pupil in 16a 16a dargestellte Punktverteilung ergibt. Point distribution shown results. Die vier Teilstrahlen The four sub-beams 55 55 , . 54 54 nehmen die Ecken eines Quadrates ein. occupy the corners of a square. In der Probe In the sample 24 24 gelangen die Teilstrahlen zur Interferenz, wodurch senkrecht zur optischen Achse ein Multispotmuster reach the partial beams to interference, thus perpendicular to the optical axis of a multi-spot pattern 58 58 gemäß according to 16b 16b auf der Probe on the sample 24 24 entsteht. arises. Die Tiefe der Nullstellen dieses Multispotmusters The depth of the roots of this multi-spot pattern 58 58 kann beispielsweise durch die Änderung der Intensitäten der jeweils diagonal gegenüberliegenden Strahlen for example, the intensities of the respective diagonally opposite beams by the change of 54 54 , . 55 55 variiert werden. be varied. Hierzu sind geeignete einstellbare Abschwächer (nicht gezeigt) für die Teilstrahlen vorgesehen. For this purpose, suitable adjustable attenuator (not shown) is provided for the partial beams.
  • [0098] [0098]
    An den Stellen hoher Intensität (helle Bereiche B2) im Multispotmuster At the points of high intensity (bright areas B2) in the multi-spot pattern 58 58 der of the 16b 16b gelangt die Probe reaches the sample 24 24 in den zweiten Zustand in the second state 6 6 . , Fluoreszenzstrahlung F entsteht in den Bereichen B1 geringer Intensität (dunkle Bereiche). Fluorescence radiation F is produced in the areas B1 of low intensity (dark areas). Die Fluoreszenzstrahlung F wird dann wie üblich am Hauptfarbteiler The fluorescence radiation F is then as usual the main color splitter 29 29 abgeteilt. separated. Der Detektor the detector 54 54 ist ein auf das Spotmuster angepaßter Matrixdetektor, optional mit vorgeschalteter Pinholemaske. is matched to the spot pattern matrix detector, optionally with upstream pinhole. Die Detektorelemente sind auf die Bereiche B1 ausgerichtet. The detector elements are aligned with the areas B1. Der Scanner The scanner 28 28 ermöglicht wiederum die Verschiebung der Anregungsstrahlungsverteilung über die Probe in turn, allows the shift of the exciting radiation distribution over the sample 24 24 in x- und/oder y-Richtung. in the x and / or y-direction. 17 17 zeigt im unteren Bild das Multispotmuster showing in the image, the multi-spot pattern 58 58 und darüber das damit angeregte Fluoreszenzmuster and about the so excited fluorescence pattern 59 59 . ,
  • [0099] [0099]
    Von der Rücksetzlichtquelle From the reset light source 41 41 kann ein weiterer Strahl may be a further beam 57 57 in die Pupille fokussiert werden, der damit eine homogene Fläche in der Probe are focused into the pupil, so that a homogeneous surface of the sample in 24 24 ausleuchtet. illuminates. Dadurch erfolgt ein Rückschalten der Fluoreszenzmoleküle aus dem zweiten Zustand This results in a downshift of the fluorescent molecules from the second state 6 6 in den ersten Zustand in the first state 5 5 , wie bereits erläutert zwischen zwei Scanschritten und gegebenenfalls auch innerhalb eines Schanschrittes. As already explained between two scan steps, and possibly also within a shaving step.
  • [0100] [0100]
    Der Rücksetzstrahl The reset beam 47 47 kann aber auch ein Beleuchtungsmuster aufweisen, das den Bereichen B2 entspricht, da nur diese rückgesetzt werden müssen. but may also include an illumination pattern corresponding to the areas B2, as only they have to be reset. Hierzu wird der Strahl For this purpose, the beam 47 47 analog zu den Teilstrahlen analogous to the partial beams 54 54 , . 55 55 ebenfalls in vier Teilstrahlen zerlegt und in die Pupille abgebildet, so daß sich innerhalb der Berandung also divided into four sub-beams and imaged into the pupil, so that within the boundary 56 56 der Pupille beispielsweise die in the pupil, for example, in 18 18 gezeigte Verteilung ergibt. Distribution shown results. Zusätzlich ist die optische Achse der Teilstrahlen In addition, the optical axis of the partial beams 57 57 der Rücksetzstrahlung R gegenüber der optischen Achse der Anregungsstrahlung A derart verkippt, daß die in der Probe entstehenden Minima des Multispotmuster the resetting radiation R from the optical axis of the excitation radiation A tilted such that the minima occurring in the sample of the multi-spot pattern 58 58 der Anregungsstrahlung A mit den Maxima des Multispotrücksetzmusters zusammenfallen Die Ausführungsform gemäß of the excitation radiation A with the maxima of the multi-spot reset pattern coincide The embodiment of 15a 15a in der Variante von in the variant of 18 18 ist ein exemplarisches Beispiel dafür, daß durch geeignete Strukturierung der Rücksetzstrahlung eine proben- bzw. farbstoffschonende Rücksetzung nur in den Bereichen B2 erfolgt. is an exemplary example that by appropriate patterning of the resetting radiation takes place a sample or dye gentle reset only in the areas B2.
  • [0101] [0101]
    Es kommt darauf an, daß die Probe durch geeignete Einstrahlung von Anregungsstrahlung A in Bereiche B1 im ersten Zustand und in Bereiche B2 im zweiten Zustand aufgeteilt wird. It is important that the sample is divided by suitable irradiation of excitation radiation in regions A B1 in the first state and in the regions B2 in the second state. Die Überführung von Proben-Bereichen in den zweiten Zustand kann deshalb auch durch zur Auswahl einer Tiefenebene der Probe (vgl. The transfer of sample areas in the second state can therefore also to select a depth level of the sample (see FIG. 14 14 ) eingesetzt werden, so daß Proben-Bereiche B1 nicht zu einem Übersprechen benachbarter Detektorelemente/-regionen beitragen können. ) Are used, so that sample areas B1 can not contribute to crosstalk of adjacent detector elements / regions.
  • [0102] [0102]
    Für das vorstehend in verschiedenen Varianten geschilderte Verfahren bzw. Mikroskop ist die Einstellung der Leistung der Anregungsstrahlung A abhängig von der Fluoreszenzcharakteristik der Probe unter besonderer Berücksichtigung der örtlichen Verteilung der Anregungsstrahlung A von Bedeutung. adjusting the power of the excitation radiation A is dependent on the fluorescence characteristic of the sample under special consideration of the local distribution of the excitation radiation A of importance for the above-described method or in different variants microscope. Insbesondere bestimmt die Tiefe eines oder mehrer Minima Specifically, the depth of one or more minima determined 45 45 und die Höhe der entsprechenden Maxima der Anregungsstrahlung der Verteilung die erreichbare Auflösungssteigerung. and the amount of the corresponding maxima of the excitation radiation distributing the achievable increase in resolution. Ein Optimierung der Einstellung der örtlichen Leistungsverteilung der Anregungsstrahlung A kann auf zwei Wegen realisiert werden: Bei Kenntnis der Kennlinie An optimization of the setting of the local power distribution of the excitation radiation A can be realized in two ways: By knowing the characteristic 17 17 , die dazu beispielsweise dem Steuergerät Which, for example, to the control unit 35 35 entsprechend zur Verfügung gestellt ist/wird, wird für eine gegebene örtliche Anregungsverteilung der optimale Leistungspegel errechnet und entsprechend eingestellt, beispielsweise durch Ausgabe eines Sollwertes oder sogar direkte Ansteuerung des Anregungsmoduls is provided accordingly /, is calculated for a given local excitation distribution of the optimum power level and adjusted accordingly, for example by issuing a setpoint or even direct control of the excitation module 21 21 . ,
  • [0103] [0103]
    Alternativ oder zusätzlich kann an einem Testpräparat oder einer Referenzstelle der zu untersuchenden Probe die tatsächliche Auflösung ermittelt und der optimale Leistungspegel bei gebender Anregungsverteilung in einem interativen Prozeß ermittelt und dann zur Abbildung der Probe Alternatively or additionally, can be determined on a test preparation or a reference point of the test sample the actual resolution and the optimum power level determined for imaging excitation distribution in an iterative process and then to the image of the sample 24 24 verwendet werden. be used.
  • [0104] [0104]
    Anstelle einer reinen Leistungsskalierung kann natürlich auch die Verteilung verändert werden, beispielsweise durch entsprechende Einstellung des Phasenelements Instead of a pure power scaling of course, the distribution can be altered, for example by appropriate adjustment of the phase element 39 39 . ,
  • [0105] [0105]
    Die Fluoreszenzcharakteristik der Probe The fluorescence characteristic of the sample 24 24 , beispielsweise die Fluoreszenzcharakteristik eines Farbstoffs, kann durch Untersuchung an einem Testpräparat oder einer Referenzstelle der Probe bereits unter späteren Bildgewinnungsbedingungen ermittelt werden. , For example, the fluorescence characteristic of a dye can be determined by examination of a test preparation or a reference point of the sample already later image obtaining conditions. Dazu wird die Leistung der detektierten Fluoreszenzstrahlung F als Funktion der Leistung der Anregungsstrahlung A an einen Punkt oder einem Gebiet der Probe ermittelt. For this purpose, the power of the detected fluorescence radiation F is calculated as the power of the excitation radiation A function at a point or an area of ​​the sample. Für eine besonders gute Einstellung ist es günstig, wenn die Fluoreszenzcharakteristik, dh die Kennlinie For a particularly good attitude, it is advantageous if the fluorescence characteristic, that is the characteristic 17 17 nicht von der Konzentration des fluoreszierenden Materials, beispielsweise des Farbstoffs abhängt (im Gegensatz zur emittierten Leistung der Fluoreszenzstrahlung F). does not depend on the concentration of the fluorescent material, for example, of the dye (in contrast to the emitted power of the fluorescence radiation F). Das Steuergerät The control unit 35 35 des Scanningmikroskops the scanning microscope 20 20 kann dazu aus der ermittelten Kurve may thereto from the determined curve 17 17 oder einer zugeführten bzw. in einem Speicher abgelegten Kurve or a supplied or stored in a memory curve 17 17 automatisch die optimale Leistung ermitteln und entsprechend einstellen. automatically determine the optimal performance and adjust accordingly.
  • [0106] [0106]
    Die iterative Bestimmung ist immer dann vorteilhaft, wenn die Fluoreszenzeigenschaften stark probenabhängig sind und eine Referenzstelle an der Probe für die Ermittlung der Fluoreszenzcharakteristik vorhanden ist oder nicht gefunden werden kann. The iterative determination is always advantageous if the fluorescence properties are strongly depending on the sample and a reference point on the sample to determine the fluorescence characteristic is present or can not be found. In diesem Fall kann man entweder an einem begrenzten Gebiet innerhalb oder außerhalb des interessierenden Probenfeldes oder anhand einer Bildgebung im gesamten abzubildenden Probenfeld eine Leistungsoptimierung vornehmen bzw. durch das Steuergerät In this case one can either on a limited area within or outside the field or samples of interest using an imaging in the entire imaged sample field undertake a performance optimization or by the controller 35 35 ausführen lassen. can run. Anhand eines Gütekriteriums der Auflösung (z. B. der Kontrast in einer ausgewählten Stelle oder die Ausdehnung des im Bild übertragenen Frequenzbereichs im Fourierraum) wird die Anregungsleistung optimiert. the excitation power is optimized on the basis of a quality criterion of the resolution (for. example, the contrast in a selected location or the extent of the transmitted image in the frequency domain in the Fourier space). Dabei ist es im allgemeinen ausreichend, die Leistung im Minimum der Anregungsverteilung bzw. eine räumlich breit verteilte Untergrundleistung anzupassen. It is generally sufficient to adapt the power in the minimum of the excitation distribution or a spatially broadly distributed subsurface performance.
  • [0107] [0107]
    Die Anregungsstrahlung A und die Rücksetzungsstrahlung R können aus einer einzigen Strahlungsquelle erzeugt werden. The excitation radiation A and the reset radiation R may be generated from a single radiation source. Die Strahlungsquelle kann entweder direkt umschaltbar oder mit einer nachgeordneten Selektionsanordnung versehen sein. The radiation source may be provided either directly or with a downstream switchable selection device.

Claims (30)

  1. Auflösungsgesteigertes Lumineszenz-Mikroskopieverfahren, bei dem – eine Probe (P, Increased resolution luminescence microscopy method in which - a sample (P, 24 24 ) durch Einstrahlung von Anregungsstrahlung (A) zur Emission von bestimmter Lumineszenzstrahlung (F) angeregt wird und ein Bild der lumineszierenden Probe (P, ) Is excited (by irradiation of excitation radiation A) for the emission of certain luminescence radiation (F) and an image of the luminescent sample (P, 24 24 ) gewonnen wird, wobei – die lumineszierende Probe (P, is obtained), wherein - the luminescent sample (P, 24 24 ) aus einem ersten Lumineszenz-Zustand ( ) (Luminescence from a first state 5 5 ), in dem die Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung (F) mit steigender Anregungsstrahlungsleistung bis zu einem Maximalwert ( ) In which the excitability (for emission of the determined luminescence F) with increasing excitation radiation power to a maximum value ( 18 18 ), welcher einem Anregungsstrahlungsleistungs-Schwellwert ( ) Which (an excitation radiation power threshold 19 19 ) zugeordnet ist, steigt, in einen zweiten Lumineszenz-Zustand ( ) Is associated with increases (in a second luminescence state 6 6 ) überführbar ist, in dem die Probe (P, ) Can be transferred, in which the sample (P, 24 24 ) gegenüber dem ersten Zustand ( ) Compared to the first state ( 5 5 ) verminderte Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung (F) aufweist, wobei die Probe (P, having) reduced excitability for emission of the determined luminescence radiation (F), wherein the sample (P, 24 24 ) durch Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes ( ) (By irradiation of excitation radiation power above the threshold value 19 19 ) in den zweiten Zustand ( ) (In the second state 6 6 ) bringbar ist, – die Probe (P, ) Can be brought, - the sample (P, 24 24 ) in Teil-Bereichen (B1) in den ersten Zustand ( ) (In partial areas B1) (in the first state 5 5 ) und in angrenzenden Teil-Bereichen (B2) in den zweiten Zustand ( ) And (in adjacent part-areas B2) (in the second state 6 6 ) versetzt wird, indem die Einstrahlung von Anregungsstrahlung (A) mit einer Anregungsstrahlungsverteilung erfolgt, die zumindest ein örtliches Leistungsmaximum über dem Schwellwert ( ), Is set by the irradiation of excitation radiation (A) is carried out with an excitation radiation distribution, which (at least a local power maximum above the threshold 19 19 ) und zumindest ein örtliches, lokales Leistungsminimum ( () And at least a local, local power minimum 45 45 ) unter dem Schwellwert aufweist, – das Bild der lumineszierenden Probe (P, ) Which is less than the threshold - the image of the luminescent sample (P, 24 24 ) Proben-Bereiche (B1) im ersten Zustand ( ) Sample areas (B1) in the first state ( 5 5 ) und Proben-Bereiche (B2) im zweiten Zustand ( ) And sample areas (B2) (in the second state 6 6 ) umfaßt, wobei zum Bild der lumineszierenden Probe (P, ), Wherein (the image of the luminescent sample P, 24 24 ) überwiegend Proben-Bereiche (B1) im ersten Zustand ( ) Predominantly sample areas (B1) in the first state ( 5 5 ) beitragen und dadurch das Bild eine gegenüber der Anregungsstrahlungsverteilung gesteigerte Ortsauflösung hat. ) Contribute and thereby the image has a relation to the excitation radiation distribution increased spatial resolution.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem eine Probe (P, The method of claim 1, wherein a sample (P, 24 24 ) verwendet wird, die nach Überführung in den zweiten Zustand ( ) Is used, (after conversion to the second state 6 6 ) wieder in den ersten Zustand ( ) Again (in the first state 5 5 ) zurückkehrt, entweder durch aktive Einwirkung oder spontan. ) Returns, either spontaneously or by active action.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem eine Rücksetzstrahlung (R) eingestrahlt wird, die die Probe (P, The method of claim 2, wherein a reset radiation (R) is irradiated which the sample (P, 24 24 ) aus dem zweiten Zustand ( ) (From the second state 6 6 ) in den ersten Zustand ( ) (In the first state 5 5 ) zurücksetzt und die von der Anregungsstrahlung (A) verschiedene optische Eigenschaften hat. ) Resets and (from the excitation radiation A) has different optical properties.
  4. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Bild durch Abscannen der Probe (P, Method according to one of the above claims, wherein the image (by scanning of the sample P, 24 24 ) mit einem Spot-, Zeilen- oder Multispotmuster ( ) (Using a spot, line or multi-spot pattern 58 58 ) gewonnen wird und insbesondere zwischen zwei Scanschritten Rücksetzstrahlung (R) eingestellt wird. ) Is recovered and in particular between two scan steps reset radiation (R) is set.
  5. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem eine Probe (P, Method according to one of the above claims, in which a sample (P, 24 24 ) verwendet wird, die bei einer Anregungsstrahlungsleistung über dem Schwellwert ( ) Is used, the above threshold (at an excitation radiation power 19 19 ) nicht luminesziert, Lumineszenzstrahlung mit anderen Eigenschaften als die bestimmte Lumineszenzstrahlung (F) abstrahlt und/oder geänderte, zu verminderter Lumineszenz führende Eigenschaften aufweist. ) Does not luminesce, luminescence radiation with different properties than the determined luminescence radiation (F) emits and / or has changed, leading to reduced luminescence properties.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Anregungsstrahlungsverteilung beugungsbegrenzt ist. A method according to any one of claims 1 to 5, wherein the excitation radiation distribution is diffraction limited.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem eine torusförmig verteilte Anregungsstrahlung (A) verwendet wird und vorzugsweise zusätzlich bei der Detektion der Lumineszenzstrahlung (F) außerhalb des Torus liegende Proben-Bereiche ausgeblendet werden. The method of claim 6, wherein a torus distributed excitation radiation is used (A), and preferably also in the detection of the luminescence radiation are hidden lying sample areas (F) outside the torus.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Anregungsstrahlungsverteilung (A) eine linienförmige oder flächige strukturierte Probenbeleuchtung, insbesondere gemäß eines Streifen- oder Kreuzgitters, aufweist sowie bei dem eine ortsaufgelöste Detektion zur Bildgewinnung verwendet wird. A method according to any one of claims 1 to 5, wherein the excitation radiation distribution (A) a linear or two-dimensional structured sample illumination, in particular in accordance with a strip or grid having cross and in which a position-resolved detection is used for image recovery.
  9. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem eine konfokale Detektion (D) von im ersten Zustand ( Method according to one of the above claims, in which a confocal detection (D) of the first state ( 5 5 ) befindlichen Proben-Bereichen (B1) durchgeführt wird. ) Located sample areas (B1) is performed.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem eine Tiefenauflösungssteigerung entlang der optischen Achse (OA) erfolgt, indem das Leistungsminimum ( Method according to one of claims 1 to 9, wherein a depth resolution enhancement along the optical axis (OA) is effected by the power minimum ( 45 45 ) unter dem Schwellwert ( ) (Below the threshold 19 19 ) und das Leistungsmaximum über dem Schwellwert ( ) And the maximum power above the threshold value ( 19 19 ) entlang der optischen Achse (OA) benachbart sind. ) Along the optical axis (OA) are adjacent.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem eine Tiefenauflösungssteigerung entlang der optischen Achse erfolgt, indem zuerst in einem die Fokusebene enthaltenden Tiefenbereich Anregungsstrahlung (A) mit einer Leistung über dem Schwellwert eingestrahlt wird, in die Fokusebene Rücksetzstrahlung (R) eingestrahlt wird und anschließend die Anregungsstrahlung (A) mit der Anregungsstrahlungsverteilung eingestrahlt wird, wobei das Leistungsminimum ( Method according to one of claims 1 to 9, wherein a depth resolution enhancement along the optical axis is carried out by first converting the focal plane containing in a depth range excitation radiation (A) is irradiated with a power above the threshold value, in the focal plane reset radiation (R) is irradiated and then, the excitation radiation (A) is irradiated with the excitation radiation distribution, wherein the power minimum ( 45 45 ) im Fokusbereich liegt. ) Located in the focal region.
  12. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem entweder in Proben-Bereichen (B1), die den ersten Zustand ( Method according to one of the above claims, wherein either in sample areas (B1) (the first state 5 5 ), oder in Proben-Bereichen (B2), die den zweiten Zustand ( ), Or in sample areas (B2) (the second state 6 6 ) aufweisen, die Anregungsstrahlungsleistung gemäß einer Referenzfrequenz moduliert wird, und diese Referenzfrequenz bei der Detektion der Lumineszenzstrahlung im Wege der Lock-In-Technik verwendet wird. ) Which the excitation radiation power is modulated according to a reference frequency, and this reference frequency is used in the detection of the luminescent radiation in the way of lock-in technique.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem zusätzliche aus einem Gleichsignalanteil (S) ein niedrig aufgelöstes Bild gewonnen wird. The method of claim 12, wherein the additional of a direct signal component (S) is a low resolution image is recovered.
  14. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem eine fluoreszierende Probe (P, Method according to one of the above claims, in which (a fluorescent sample P, 24 24 ) verwendet wird, insbesondere eine mit mindestens einem Fluorophor versehene Probe (P, ) Is used, in particular, provided with at least one fluorophore sample (P, 24 24 ). ).
  15. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem zusätzlich ein Bild mit Anregungsstrahlungsverteilung ohne Leistungsminimum ( Method according to one of the above claims, wherein in addition an image with excitation radiation distribution without power minimum ( 45 45 ) unter dem Schwellwert aufgenommen und zur Differenzbildung verwendet wird. ) Is taken up below the threshold value and used for the difference formation.
  16. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem eine Lumineszenzkennlinie ( Method according to one of the above claims, in which (a luminescence characteristic 17 17 ), die emittierte Lumineszenzleistung als Funktion der Anregungsstrahlungsleistung angibt, ausgewertet, daraus der Schwellwert ( ), Indicating the emitted luminescence as a function of excitation radiation power, evaluated from the threshold value ( 19 19 ) ermittelt und/oder die Anregungsstrahlungsverteilung kennlinienabhängig gewählt wird. ) Is determined and / or the excitation radiation distribution is selected depending on characteristic curve.
  17. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem die Anregungsstrahlungsverteilung iterativ unter Auswertung der Bildauflösung optimiert wird. Method according to one of the above claims, wherein the excitation radiation distribution is optimized iteratively while evaluating the image resolution.
  18. Mikroskop zur auflösungsgesteigerten Lumineszenz-Mikroskopie, das aufweist: – Mittel ( Microscope for resolution enhanced luminescence microscopy, comprising: - means ( 21 21 , . 22 22 ) zur Anregung von Lumineszenz, die Anregungsstrahlung (A) auf die Probe (P, ) (For excitation of luminescence, the excitation radiation (A) to the sample P, 24 24 ) einstrahlen und damit die Emission bestimmter Lumineszenzstrahlung (F) in der Probe (P, ) Irradiating and thereby the emission of certain luminescence radiation (F) in the sample (P, 24 24 ) anregen, – Mittel ( ) Stimulate, - means ( 22 22 , . 23 23 ) zur Gewinnung eines Bildes der lumineszierenden Probe (P, ) For obtaining an image of the luminescent sample (P, 24 24 ), – wobei die Mittel zur Anregung die Anregungsstrahlung (A) mit einer bestimmten Anregungsstrahlungsverteilung einstrahlen, die zumindest ein örtliches Leistungsmaximum aufweist, das über einem Schwellwert ( ), - wherein the means for exciting the excitation radiation (A) with a particular excitation radiation distribution are irradiated, comprising at least a local power maximum, the (above a threshold 19 19 ) liegt, und zumindest ein örtliches, lokales Leistungsminimum ( ), And at least a local, local power minimum ( 45 45 ) aufweist, das unter dem Schwellwert ( ) Which (below the threshold 19 19 ) liegt, – wobei der Schwellwert ( ) Is located, - the threshold value ( 19 19 ) zwei Lumineszenz-Regionen ( () Two luminescent regions 5 5 , . 6 6 ) der Probe (P, ) Of the sample (P, 24 24 ) trennt, eine erste, bei Anregungsstrahlungsleistungen unterhalb des Schwellwertes ( ) Separates a first (at excitation radiation powers below the threshold value 19 19 ) vorliegende Zustands-Region ( ) This state region ( 5 5 ), in der die Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung (F) mit steigender Anregungsstrahlungsleistung bis zu einem Maximalwert ( ) In which the excitability (for emission of the determined luminescence F) with increasing excitation radiation power to a maximum value ( 18 18 ), welcher am Schwellwert ( ), Which (at the threshold 19 19 ) erreicht wird, steigt, und einer zweiten bei und/oder nach Anregungsstrahlungsleistungen oberhalb des Schwellwertes ( ) Is achieved increases, and a second and / or (after excitation radiation powers above the threshold 19 19 ) vorliegende Zustands-Region ( ) This state region ( 6 6 ), in der die Probe (P, ), In which the sample (P, 24 24 ) eine gegenüber der ersten Region ( ) A (opposite the first region 5 5 ) verminderte Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung (F) aufweist, und – wobei die Mittel zur Bildgewinnung Proben-Bereiche (B1) in der ersten Region ( having) reduced excitability for emission of the determined luminescence radiation (F), and - wherein the means for imaging sample areas (B1) (in the first region 5 5 ), die mit Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwertes ( ), Which (with excitation radiation power below the threshold value 19 19 ) bestrahlt wurden, und Proben-Bereiche (B2) in der zweiten Region ( ) Were irradiated, and sample areas (B2) in the second region ( 6 6 ), die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes ( ), Which (with excitation radiation power above the threshold value 19 19 ) bestrahlt wurden, erfassen, wobei zum Bild der Probe überwiegend Proben-Bereiche (B1) in der ersten Region ( ) Were irradiated capture, wherein the image of the sample (mainly sample areas B1) (in the first region 5 5 ) beitragen und dadurch das Bild eine gegenüber der Anregungsstrahlungsverteilung gesteigerte Ortsauflösung hat. ) Contribute and thereby the image has a relation to the excitation radiation distribution increased spatial resolution.
  19. Mikroskop nach Anspruch 18, mit einer Anregungsstrahlungsquelle ( A microscope according to claim 18 (with an excitation radiation source 30 30 ), welche die Anregungsstrahlung (A) abgibt, und einer der Anregungsstrahlungsquelle nachgeordneten Einrichtung ( ) Which emits the excitation radiation (A), and one of the excitation radiation source downstream device ( 36 36 - 40 40 ), welche einen Anregungsstrahl abgibt, der ein Strahlprofil mit dem Leistungsminimum ( ), Which emits an excitation beam (a beam profile with the power minimum 45 45 ) hat, das eine unter dem Schwellwert ( ), Has one (below the threshold 19 19 ) liegende Anregungsstrahlungsleistung hat. ) Exciting radiation power lying does.
  20. Mikroskop nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß eine Scannereinrichtung ( Microscope according to claim 18 or 19, characterized in that a scanner device ( 28 28 ) die Probe (P, ), The sample (P, 24 24 ) mit Anregungsstrahlung (A) abrastert. ) With excitation radiation (A) scans.
  21. Mikroskop nach Anspruch 20, wobei die Anregungsstrahlungsverteilung mindestens ein beugungsbegrenztes Punktbild aufweist. Microscope according to claim 20, wherein the excitation radiation distribution comprises at least one diffraction limited spot image.
  22. Mikroskop nach Anspruch 21, wobei die Anregungsstrahlungsverteilung mindestens einen linienförmigen oder streifen- oder gitterförmigen Proben-Bereich mit Anregungsstrahlung (A) beleuchtet, wobei die Anregungsstrahlungsleistung in Teilen des Streifens bzw. Gitters über dem Schwellwert ( Microscope according to claim 21, wherein the excitation radiation distribution at least one line-shaped or strip-like or lattice-like sample area with excitation radiation (A) is illuminated, wherein the excitation radiation power in portions of the strip or grating above the threshold value ( 19 19 ) und in Teilen des Streifen bzw. Gitters unter dem Schwellwert ( ) And (in parts of the strips or lattice below the threshold 19 19 ) liegt. ) lies.
  23. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei die Anregungsstrahlungsverteilung das örtliche Leistungsminimum ( Microscope according to one of claims 18 to 22, wherein the excitation radiation distribution, the local power minimum ( 45 45 ) und das örtliche Leistungsminimum entlang der optischen Achse (OA) benachbart sind. ) And the local power minimum along the optical axis (OA) are adjacent.
  24. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 23, gekennzeichnet durch Mittel ( Microscope according to one of claims 18 to 23, characterized by means ( 41 41 , . 42 42 ) zum Rücksetzen der Probe ( ) (For resetting of the sample 24 24 ) aus der zweiten ( ) From the second ( 6 6 ) in die erste Zustands-Region ( ) (In The First State Region 5 5 ), die eine Strahlquelle ( ) Which (a beam source 41 41 ), welche Rücksetzstrahlung (R) mit von der Anregungsstrahlung (A) verschiedenen optischen Eigenschaften aussendet, und eine Optik ( which reset radiation (R) (from the excitation radiation A) different optical properties) emits and an optic ( 42 42 ) zum Einkoppeln der Rücksetzstrahlung (R) aufweisen. have) for coupling the reset radiation (R).
  25. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 24, gekennzeichnet durch einen Intensitätsmodulator ( Microscope (according to any one of claims 18 to 24, characterized by an intensity modulator 37 37 , . 38 38 , . 49 49 , . 35 35 ), der die Verteilung der Anregungsstrahlung (A) mit einer Referenzfrequenz moduliert, und einen in den Mitteln zur Bildgewinnung vorgesehenen oder damit verbundenen Lock-In-Verstärker ( ), Of the distribution of the excitation radiation (A) is modulated with a reference frequency, and provided in the means for image acquisition or associated lock-in amplifier ( 48 48 ), der die Referenzfrequenz auswertet und Hintergrundstrahlung (S) reduziert. ), Which evaluates the reference frequency and background radiation (S) is reduced.
  26. Mikroskop nach Anspruch 25, mit einem Gleichsignalsausgang zur Gewinnung eines zusätzlichen niedrig aufgelösten Bildes. Microscope according to claim 25, comprising a DC signal output for obtaining an additional low resolution image.
  27. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 26 mit einem Steuergerät ( Microscope according to one of claims 18 to 26 (with a control device 35 35 ), das das Mikroskop zur Ausführung eines der Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 ansteuert. ) Which drives the microscope for performing one of the methods according to any one of claims 1 to 17.
  28. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 27, mit einem Steuergerät ( Microscope according to one of claims 18 to 27, (with a control device 35 35 ), das die Mittel zur Anregung und die Mittel zur Bildgewinnung ansteuert bzw. ausliest und die Anregungsstrahlungsverteilung zur Optimierung der Bildauflösung einstellt. ) Which drives the means for excitation and the means of image acquisition or reads and sets the excitation radiation distribution in order to optimize the image resolution.
  29. Mikroskop nach Anspruch 28, bei dem das Steuergerät ( Microscope according to claim 28, wherein (the control unit 35 35 ) eine Speicher- oder Dateneingabeeinrichtung aufweist, über die dem Steuergerät eine Lumineszenzkennlinie ( ) Comprises a storage or data input device, via which the control device a luminescence characteristic ( 17 17 ) verfügbar ist, wobei die Lumineszenzkennlinie ( is available), the luminescence characteristic ( 17 17 ) die emittierte Lumineszenzleistung als Funktion der Anregungsstrahlungsleistung wiedergibt und wobei das Steuergerät ( ) The emitted luminescence reflects as a function of excitation radiation power and wherein the controller ( 35 35 ) aus der Lumineszenzkennlinie ( ) (From the luminescence characteristic 17 17 ) den Schwellwert ( ) The threshold value ( 19 19 ) ermittelt und/oder die Anregungsstrahlungsverteilung kennlinienabhängig einstellt. ) Is determined and / or depending on characteristic curve sets the excitation radiation distribution.
  30. Mikroskop nach Anspruch 28, bei dem das Steuergerät ( Microscope according to claim 28, wherein (the control unit 35 35 ) aus dem Bild der Probe (P, ) From the image of the sample (P, 24 24 ) die Auflösung ermittelt und die Anregungsstrahlungsverteilung iterativ zur Optimierung der Bildauflösung einstellt. ) Determines the resolution and sets the excitation radiation distribution iteratively to optimize the image resolution.
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