DE102005004167A1

DE102005004167A1 - Diagnosis of tinnitus by detecting functionally disordered CIC-Kb, a chloride channel protein, also treatment using agents that modulate activity or expression of the altered protein

Info

Publication number: DE102005004167A1
Application number: DE200510004167
Authority: DE
Inventors: Florian Prof. Dr. Lang
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 2005-01-29
Filing date: 2005-01-29
Publication date: 2006-08-03

Abstract

Diagnosing tinnitus in humans comprising detecting, in a subject sample, the presence of a functionally disordered CIC-Kb protein (I), is new. An independent claim is included for treatment of tinnitus using a substance (II) that modulates, preferably inhibits, activity and/or expression of the functionally disordered and/or mutated form of (I). ACTIVITY : Auditory. No biological data given. MECHANISM OF ACTION : Inhibiting expression and/or activity of a mutated form of CIC-Kb protein (I), which is a chloride channel involved in inner ear potassium ion secretion, and mutations in (I) have already been associated with Bartter syndrome type III; hypertension; allergy; hair loss; and susceptibility to infection. The mutation Thr481 to Ser results in increased KCl secretion.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Tinnitus, die Verwendung einer Substanz zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tinnitus sowie ein Verfahren zur Behandlung von Tinnitus.The The present invention relates to a method for the diagnosis of tinnitus, the use of a substance for the manufacture of a medicament for the treatment of tinnitus and a method for the treatment of Tinnitus.

Verfahren der vorgenannten Art sind im Stand der Technik allgemein bekannt.method of the aforementioned type are well known in the art.

Unter Tinnitus versteht man das Krankheitsbild, bei dem ein betroffener Patient Geräusche wahrnimmt, die durch das Ohr und/oder das auditorische System erzeugt werden. Tinnitus, der wenige Wochen bis drei Monate auftritt, wird als akuter Tinnitus bezeichnet. Tritt der Tinnitus länger als ein Jahr auf, wird er als chronischer Tinnitus bezeichnet.Under Tinnitus is the disease in which an affected Patient noises perceived by the ear and / or the auditory system become. Tinnitus, which occurs a few weeks to three months, will referred to as acute tinnitus. If the tinnitus occurs longer than a year, he is referred to as chronic tinnitus.

Nach epidemiologischen Erhebungen sind in Deutschland ca. drei Millionen Erwachsene, d.h. etwa 4 % der Bevölkerung, von chronischem Tinnitus betroffen. Global betrachtet kommt es jährlich bei etwa zehn Millionen Menschen zu Tinnitus, der bei ca., 340.000 von einer akuten in eine chronische Form übergeht, sog. Neuerkrankungsrate.To epidemiological surveys in Germany are about three million Adults, i. about 4% of the population affected by chronic tinnitus. Globally, it happens every year in about ten million people to tinnitus, which at about, 340,000 from an acute to a chronic form, so-called new disease rate.

Zu den vielfältigen Ursachen des Tinnitus gehören chronische Lärmschädigungen, akute Knallverletzungen des Gehörs, Hörsturz und anderweitige Erkrankungen, die mit einem Hörverlust einhergehen. An der Entstehung und Aufrechterhaltung des Tinnitus sind auch Erkrankungen der Halswirbelsäule sowie des Kiefergelenks und Kaumuskelsystems beteiligt. Tinnitus scheint auch eine psychische Komponente aufzuweisen, so dass in diesem Zusammenhang von psychogenem Tinnitus gesprochen wird.To the diverse ones Causes of tinnitus include chronic noise damage, acute bang injuries of hearing, Sudden Hearing Loss and other disorders associated with hearing loss. At the Emergence and maintenance of tinnitus are also diseases the cervical spine as well involved in the temporomandibular joint and the musculoskeletal system. Tinnitus seems also have a psychic component, so in this context is spoken by psychogenic tinnitus.

Die Diagnose erfolgt bislang im Wesentlichen durch eine Befragung des betroffenen Patienten zu dessen Wahrnehmung der Ohrgeräusche. In diesem Zusammenhang können umfangreiche Untersuchungen des HNO-Bereiches einschließlich Hör- und Gleichgewichtsprüfungen durchgeführt werden. Ferner werden die Halsgefäße mittels Ultraschalls sowie das Blut des Patienten untersucht. Teilweise wird die Halswirbelsäule geröntgt.The So far, diagnosis has essentially taken place through a survey of the affected patients to the perception of the ear noises. In this Can connect Extensive examinations of the ENT area including hearing and balance tests are carried out. Furthermore, the neck vessels by means Ultrasound and the patient's blood. Partially becomes the cervical spine X-rayed.

Diese Vorgehensweise birgt insbesondere wegen der subjektiven Komponente durch den Patienten die Gefahr einer Fehldiagnose und falsch ausgerichteter Behandlung, was zu fatalen Folgen führen kann.These The procedure involves, in particular, the subjective component by the patient the risk of a misdiagnosis and misaligned Treatment, which can lead to fatal consequences.

Eine molekulare Diagnose einer Erkrankung an oder einer Veranlagung für eine Erkrankung an Tinnitus ist bislang nicht möglich, insbesondere deshalb nicht, da die molekularen Ursachen für die Entstehung von Tinnitus bislang völlig unbekannt sind. Die Bereitstellung eines solchen Verfahrens zur molekularen Diagnose von Tinnitus ist jedoch äußerst wünschenswert, um einerseits nicht der Gefahr einer Fehldiagnose zu unterliegen, und um andererseits auf die bislang durchgeführten umfangreichen und zeitaufwändigen Tinnitusdiagnoseverfahren verzichten zu können. Ferner ist es ebenfalls aus Sicherheitsgründen wünschenswert, erstmals eine Diagnose durch Erfassen der molekularen Ursache stellen zu können, mit der nicht, wie bislang, lediglich die Symptome der Tinnituskrankheit erfasst werden. Darüber hinaus kann das Verständnis, das der Entwicklung eines solchen Verfahrens zu Grunde liegt, als Ausgangspunkt für die Etablierung einer ursächlichen Therapie gegen Tinnitus dienen, bei der solche Arzneimittel eingesetzt werden, die an den molekularen Ursachen der Erkrankung ansetzen.A molecular diagnosis of a disease or predisposition to a disease Tinnitus is not yet possible especially not because of the molecular causes of its formation Tinnitus so far completely are unknown. The provision of such a method for However, molecular diagnosis of tinnitus is highly desirable, on the one hand not subject to the risk of misdiagnosis, and on the other hand the previously performed extensive and time-consuming Tinnitusdiagnoseverfahren to be able to do without. It is also the same for safety reasons desirable, first diagnosis by detecting the molecular cause to increase can, with the not, as before, only the symptoms of tinnitus disease be recorded. About that In addition, understanding, which underlies the development of such a process, as Starting point for the establishment of a causal Therapy against tinnitus serve in which such medicines are used which address the molecular causes of the disease.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein solches Verfahren zur molekularen Diagnose von Tinnitus bereitzustellen, mit dem die vorstehend beschriebenen Nachteile aus dem Stand der Technik vermieden werden.task Therefore, the present invention is such a method to provide molecular diagnosis of tinnitus with which the avoid the disadvantages of the prior art described above become.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Diagnose von Tinnitus bei einem menschlichen Lebewesen gelöst, das folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellung einer biologischen Probe des menschlichen Lebewesens; (b) Durchführung einer Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein eines funktionsgestörten ClC-Kb-Proteins, und (c) Korrelation eines positiven Befundes mit einer positiven Diagnose.These Task is by a method of diagnosing tinnitus in a solved human beings, comprising the following steps: (a) providing a biological Sample of the human being; (b) conducting an investigation of the biological assay for the presence of a dysfunctional ClC-Kb protein, and (c) correlation of a positive finding with a positive diagnosis.

Die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.The The object underlying the invention is hereby completed solved.

Die Erfinder haben nämlich überraschenderweise erstmals eine molekulare Ursache für die Entstehung der Tinnituserkrankung nachweisen können, die in der Funktionsstörung des ClC-Kb-Proteins liegt. Diese Erkenntnis war deshalb besonders überraschend, da das ClC-Kb-Protein bislang in keinerlei Zusammenhang mit der Tinnituserkrankung gebracht wurde.The In fact, inventors have surprisingly first a molecular cause for the development of tinnitus disease can prove that in malfunction of the ClC-Kb protein. This finding was therefore particularly surprising since the ClC-Kb protein so far has not been linked to tinnitus.

ClC-Kb ist ein Mitglied der ClC-Familie von Chloridkanälen und ist in die renale Reabsorption von NaCl involviert; cf. Waldegger S. und Jensch, T. (2000), The functional expression of ClC-Ka as another member of the ClC family, and of ClC-Kb channels, requires the coexpression of Barttin, which thus is an essential β-unit of these channels, J. Am. Soc. Nephrol. 11, Seiten 1331 bis 1339, und Estevez R. et al. (2001), Barttin is a Cl-channel subunit crucial for renal Cl- reabsorption and inner ear K+ secretion, Nature 414, Seiten 558 bis 561. Die vollständige Nucleotid- und Aminosäuresequenz von humanem ClC-Kb ist der Genbank NCBI über die Assession Number NM 000085, zu entnehmen; vgl. www.ncbi.nlm.nih.gov/.ClC-Kb is a member of the ClC family of chloride channels and is involved in the renal reabsorption of NaCl; See Waldegger S. and Jensch, T. (2000), The functional expression of ClC-Ka as another member of the ClC family, and of ClC-Kb channels, requires the co-expression of Barttin, which thus is an essential β-unit of these channels, J. Am. Soc. Nephrol. 11, pages 1331 to 1339, and Estevez R. et al. (2001), Barttin is a Cl-channel subunit crucial for renal cleabsorption and inner ear K + secretion, Nature 414, pages 558 to 561. The Complete Nu cleotid and amino acid sequence of human ClC-Kb can be seen from the Genebank NCBI on the Assession Number NM 000085; see. www.ncbi.nlm.nih.gov/.

Mutationen des ClC-Kb-Gens CLCNKB führen zum sog. Bartter-Syndrom Typ III, das durch renalen Salzverlust und niedrigen Blutdruck charakterisiert ist; vgl. Simon D. B. et al. (1997), Mutations in the chloride channel gene, CLCNKB, cause Bartter's syndrome type III, Nat. Genet. 17, Seiten 171 bis 178; vgl. Birkenhager R. et al. (2001), Mutation of BSND causes Bartter syndrome with sensorineural deafness and kidney failure, Nat. Genet. 29, Seiten 310 bis 314.mutations of the ClC-Kb gene CLCNKB to the so-called Bartter syndrome Type III, characterized by renal salt loss and low blood pressure is; see. Simon D.B. et al. (1997), Mutations in the chloride channel genes, CLCNKB, cause Bartter's syndrome type III, Nat. Genet. 17, pages 171 to 178; see. Birch Hager R. et al. (2001), Mutation of BSND causes Bartter syndrome with sensorineural deafness and kidney failure, Nat. Genet. 29, pages 310 to 314.

Vor Kurzem wurde erstmals ein Zusammenhang zwischen einer Mutation im ClC-Kb-Gen und der Bluthochdruckerkrankung beschrieben; vgl. Jeck et al. (2004), Activating mutation of the renal epithelial chloride channel ClC-Kb predisposing to hypertension, Hypertension 43, Seiten 1175 bis 1181.In front For the first time a connection between a mutation in the ClC-Kb gene and hypertensive disease; see. Jeck et al. (2004), Activating mutation of the renal epithelial chloride channel ClC-Kb predisposing to hypertension, Hypertension 43, pages 1175 to 1181.

In der nicht veröffentlichten internationalen PCT-Patentanmeldung PCT/EP2004/011192 ist ferner beschrieben, dass eine Mutation im ClC-Kb-Gen mit allergischen Erkrankungen, Haarausfall oder der Infektionsanfälligkeit eines Mutationsträgers korreliert.In the unpublished PCT International Patent Application PCT / EP2004 / 011192 is further described that a mutation in the ClC-Kb gene with allergic diseases, Hair loss or infection susceptibility of a mutation carrier correlated.

Im Stand der Technik gibt es jedoch keinerlei Hinweise, dass eine Funktionsstörung des ClC-Kb-Proteins mit einer Erkrankung an Tinnitus im Zusammenhang steht.in the However, there is no evidence in the prior art that a dysfunction of the ClC-Kb protein is related to a condition related to tinnitus.

Die Erfinder haben 12 Probanden untersucht, die an Tinnitus erkrankt waren. 11 dieser Probanden hatten überraschenderweise eine Funktionsstörung des ClC-Kb-Proteins. Die Erfinder haben ferner ca. 150 weitere Probanden untersucht, die nicht an Tinnitus erkrankt waren. Bemerkenswerterweise hatten hier nur etwa 20 % dieser Probanden eine Funktionsstörung im ClC-Kb-Protein.The Inventors have examined 12 subjects suffering from tinnitus were. 11 of these subjects had surprisingly a malfunction of the ClC-Kb protein. The inventors also have about 150 more subjects examined who were not suffering from tinnitus. Remarkably enough here only about 20% of these subjects a malfunction in the ClC-Kb protein.

Erfindungsgemäß wird unter einer biologischen Probe eine jegliche Probe des Lebewesens verstanden, die repräsentatives genetisches Material, wie genomische DNA, oder eine repräsentative Menge und Vielfalt an Protein aufweist. Beispiele für geeignete biologische Proben sind Blutproben, Gewebeproben, Zellen des Lebewesens, die genomische DNA enthalten, Zellextrakte, die Proteine und/oder genetisches Material des Lebewesens aufweisen.According to the invention is under a biological sample understood any sample of the animal, the representative ones genetic material, such as genomic DNA, or a representative amount and diversity of protein. Examples of suitable biological samples are blood samples, tissue samples, cells of the living being, the genomic DNA, cell extracts, proteins and / or genetic material of the living being.

Ein ClC-Kb-Protein ist erfindungsgemäß dann funktionsgestört, wenn dieses wesentlich stärker oder schwächer aktiv, exprimiert, stabil oder instabil ist als dies unter normalen physiologischen Bedingungen bspw. bei einer gesunden Kontrollperson der Fall ist. Die Untersuchung dieser Funktionsstörung kann erfindungsgemäß auf vielerlei Arten erfolgen. So kann bspw. festgestellt werden, ob der ClC-Kb-Chloridkanal eine veränderte, bspw. erhöhte, Ionenleitfähigkeit aufweist. Eine solche Untersuchung ist in Jeck et al. (a.a.O.) beschrieben. Andere Tests zur Feststellung der Aktivität eines Ionenkanals sind dem Fachmann, wie bspw. einem Molekularbiologen, geläufig. Darüber hinaus kann mittels dem Fachmann bekannter Verfahren festgestellt werden, ob das ClC-Kb-Protein oder die dieses kodierende mRNA besonders und über den Normalzustand hinaus stabil ist; vgl. Sambrook, J. and Russell, D. W. (2001), Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Die Funktionsstörung kann jedoch auch auf genetischer Ebene untersucht werden. So lässt sich bspw. feststellen, ob das ClC-Kb-Protein über- oder unterexprimiert wird und dadurch eine Funktionsstörung des Ionenkanals verursacht wird.One ClC-Kb protein according to the invention then dysfunctionally, when this much stronger or weaker active, expressed, stable or unstable than normal physiological conditions, for example, in a healthy control person of Case is. The investigation of this malfunction can according to the invention in many ways Species take place. For example, it can be determined whether the ClC-Kb chloride channel a changed, eg increased, ionic conductivity having. One such study is in Jeck et al. (supra). Other tests for determining the activity of an ion channel are the Expert, such as, for example, a molecular biologist, familiar. In addition, by means of the skilled person known method, whether the ClC-Kb protein or the coding this mRNA especially and beyond the normal state is stable; see. Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001), Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. The malfunction however, it can also be studied at the genetic level. That's how it works For example, determine whether the ClC-Kb protein is over- or under-expressed and thereby a malfunction of the ion channel is caused.

Unter einer Diagnose von Tinnitus wird erfindungsgemäß die Feststellung einer Erkrankung des Untersuchten an Tinnitus verstanden, die sowohl akut als auch chronisch sein kann, als auch die Feststellung einer Veranlagung des Untersuchten für eine Erkrankung an Tinnitus. So ist es nämlich mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erstmals möglich, auch die Prädisposition eines Lebewesens für eine Tinnituserkrankung festzustellen, ohne dass sich bereits Symptome zeigen. Dies hat den Vorteil, dass bei einer entsprechenden Veranlagung dem Ausbruch einer Tinnituserkrankung durch die prophylaktische Verabreichung gängiger Tinnitusmedikamente oder durch Maßnahmen zum Schutze des Gehörs vorgebeugt werden kann. Dies war bislang im Stand der Technik nicht möglich.Under A diagnosis of tinnitus according to the invention is the detection of a disease the examinee understood about tinnitus, both acute and can be chronic, as well as the determination of a predisposition of the examined for a condition of tinnitus. This is the case with the method according to the invention possible for the first time, too the predisposition of a living being for to detect a tinnitus disorder without already having symptoms demonstrate. This has the advantage that with a corresponding disposition the onset of tinnitus disease by prophylactic administration common Tinnitus medicines or by measures to protect the hearing prevented can be. This was previously not possible in the prior art.

Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird in Schritt (b) das biologische Material das ClC-Kb-Protein auf eine Mutation untersucht.To In a preferred embodiment of the invention, in step (b) the biological material examines the ClC-Kb protein for a mutation.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass hierdurch auf molekularer Ebene eine Funktionsstörung von ClC-Kb und damit eine Erkrankung an oder Veranlagung für Tinnitus zuverlässig diagnostiziert werden kann. So haben die Erfinder nämlich festgestellt, dass die untersuchten Tinnituspatienten sehr viel häufiger ein mutiertes ClC-Kb-Protein aufweisen als die Probanden aus der großen Gruppe von gesunden Kontrollpersonen. Diese Mutationsanalyse kann sowohl auf Proteinebene erfolgen, indem aus dem biologischen Material das ClC-Kb-Protein isoliert oder angereichert wird und bspw. mittels gängiger Peptidsequenzierung analysiert und mit der bekannten Sequenz des ClC-KB-Proteins verglichen wird. Die Mutation des ClC-Kb-Proteins kann ferner auf molekulargenetischer Ebene untersucht werden, indem bspw. geno mische DNA aus der biologischen Probe isoliert und mittels üblicher Mutationsanalysen auf das Vorhandensein einer Mutation analysiert wird. Die Erfinder haben in diesem Zusammenhang feststellen können, dass eine solche Mutation im ClC-Kb-Protein zu einer Veränderung der Ionenleitfähigkeit des Kanalproteins führt und dadurch für die Entstehung von Tinnitus (mit-)verantwortlich ist.This measure has the advantage that this can reliably diagnose a dysfunction of ClC-Kb and thus a disease or predisposition to tinnitus at the molecular level. In fact, the inventors have found that the tinnitus patients studied are much more likely to have a mutated ClC-Kb protein than the subjects from the large group of healthy controls. This mutation analysis can be carried out both at the protein level by isolating or enriching the ClC-Kb protein from the biological material and, for example, by means of conventional peptide sequencing, and compared with the known sequence of the ClC-KB protein. The mutation of the ClC-Kb protein can also be investigated on a molecular genetic level, for example, by isolating geno mix DNA from the biological sample and by means of conventional mutational analysis on the presence of a mutation is analyzed. In this connection, the inventors have been able to establish that such a mutation in the ClC-Kb protein leads to a change in the ionic conductivity of the channel protein and is therefore (co-) responsible for the development of tinnitus.

Für eine Diagnose von Tinnitus kann eine jegliche Mutation, d.h. eine Genom-, Chromosomen- oder auch Gen- oder Punktmutation, herangezogen werden, die in einer Funktionsstörung des ClC-Kb-Proteins resultiert. In diesem Zusammenhang wird besonders an Translokationen, Deletionen, Insertionen, Inversionen, aber auch an Nucleotidaustausche gedacht, die sich im ClC-Kb-Gen, also im CLCNKB-Gen ereignen. Insbesondere ist im letzteren Fall nicht entscheidend, an welcher Position ein Nucleotid und damit im kodierten Protein eine Aminosäure ausgetauscht wird. Die Erfinder haben vielmehr ein allgemein gültiges Prinzip erkannt, nach dem über eine Funktionsstörung des ClC-Kb-Proteins bzw. einer Mutation dieses Proteins oder Gens auf molekularer Ebene zuverlässig eine Tinnituserkrankung diagnostiziert werden kann.For a diagnosis Tinnitus can be any mutation, i. a genome, chromosome or also gene or point mutation, be used in a dysfunction of the ClC-Kb protein results. In this context, translocations, Deletions, insertions, inversions, but also nucleotide exchanges thought that occur in the ClC-Kb gene, ie in the CLCNKB gene. Especially in the latter case, it is not decisive in which position a nucleotide and thus an amino acid is exchanged in the encoded protein. The Rather, inventors have recognized a universally valid principle according to which a dysfunction of the ClC-Kb protein or a mutation of this protein or gene Reliable at the molecular level a tinnitus disorder can be diagnosed.

Dabei ist es bevorzugt, wenn die biologische Probe auf das Vorhandensein einer solchen Mutation des ClC-Kb-Proteins untersucht wird, bei der an Aminosäureposition 481 ein Threoninmolekül gegen ein Serinmolekül ausgetauscht ist (ClC-Kb^T481S).It is preferred if the biological sample is assayed for the presence of such a mutation of the ClC-Kb protein in which at amino acid position 481 a threonine molecule is replaced by a serine molecule (ClC-Kb ^T481S ).

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass so eine besonders sichere Diagnose von Tinnitus erfolgen kann. Die Erfinder haben nämlich bei den untersuchten Tinnituspatienten genau diese Mutation feststellen können. Dabei kann erfindungsgemäß so vorgegangen werden, dass auf Proteinebene an Position 481 des ClC-Kb-Proteins untersucht wird, ob anstelle eines Threonins ein Serin vorhanden ist. Alternativ kann auch auf genetischer Ebene unter Zuhilfenahme des genetischen Codes festgestellt werden, ob im Leseraster an der der Aminosäureposition 481 entsprechenden Position ein für Threonin kodierendes Triplet, d.h. ACT, ACC, ACA oder ACG, gegen ein für Serin kodierendes Triplet, d.h. gegen TCT, TCC, TCA, TCG, AGT oder AGC, ausgetauscht wurde. Entsprechendes gilt für eine Analyse auf mRNA-Ebene, wobei hier im genetischen Code anstelle eines T (Thymin) ein U (Uracil) steht. Die von den Erfindern aufgefundene Mutation war auf DNA-Ebene im CLCNKB-Gen wie folgt lokalisiert: 1441 A>T, Acc. No. NM_000085.1 in der Genbank NCBI (a.a.0.).These measure has the advantage of providing a particularly safe diagnosis of tinnitus can be done. The inventors have indeed in the investigated Tinnitus patients can detect exactly this mutation. there according to the invention, this can be done that at the protein level at position 481 of the ClC-Kb protein, whether instead of of a threonine a serine is present. Alternatively, too genetic level with the help of the genetic code be in in-frame reading at amino acid position 481 Position one for Threonine encoding triplet, i. ACT, ACC, ACA or ACG against for serine encoding triplet, i. against TCT, TCC, TCA, TCG, AGT or AGC, was exchanged. The same applies to an analysis at mRNA level, where here in the genetic code instead of a T (thymine) a U (uracil) stands. The mutation found by the inventors was at the DNA level in the CLCNKB gene localized as follows: 1441 A> T, Acc. No. NM_000085.1 in Genebank NCBI (a.a.0.).

Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die biologische Probe genomische DNA.To a preferred embodiment of the method according to the invention the biological sample is genomic DNA.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass über genomische DNA eine Funktionsstörung des ClC-Kb-Proteins bzw. eine diese verursachende Mutation besonders gut untersucht werden kann. So ist nämlich genomische DNA wesentlich stabiler als Protein oder mRNA und dadurch gut handhabbar. Ferner lässt sich genomische DNA aus biologischem Material unproblematisch und einfach über Standardverfahren auf reinigen. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass durch diese Maßnahme Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Zuhilfenahme üblicher Mutationsanalyseverfahren durchgeführt werden kann, da bei diesen üblicherweise genomische DNA als Ausgangsmaterial analysiert wird.These measure has the advantage of being over genomic DNA a dysfunction of the ClC-Kb protein or a mutation causing it in particular can be examined well. So genomic DNA is essential more stable than protein or mRNA and thus easy to handle. Furthermore, it is possible Genomic DNA from biological material unproblematic and easy via standard methods to clean. Another advantage is that through this measure Step (b) of the method according to the invention with the help of usual Mutation analysis method can be performed, since these are common Genomic DNA is analyzed as starting material.

Dabei ist es bevorzugt, wenn die genomische DNA mittels PCR-Technologie amplifiziert wird und die Amplifikate auf das Vorhandensein der Mutation untersucht werden.there For example, it is preferred that the genomic DNA be amplified by PCR technology and the amplificates are examined for the presence of the mutation become.

Durch diese Vorgehensweise wird auf vorteilhafte Art und Weise mittels eines im Labor eines Molekularbiologen wohl etablierten Verfahrens die zu untersuchende DNA derart vermehrt, dass eine etwaige Mutation vereinfacht nachzuweisen ist. Ein PCR-Verfahren kann mittlerweile weitgehend automatisiert durchgeführt werden und liefert zuverlässige Ergebnisse. Die Gefahr einer Fehldiagnose wird durch diese Maßnahme weiter reduziert.By This procedure is advantageously by means of a well-established method in the laboratory of a molecular biologist amplifies the DNA to be examined in such a way that any mutation has to be proved in a simplified way. A PCR procedure can meanwhile be largely done automated be and deliver reliable Results. The risk of a misdiagnosis continues through this measure reduced.

Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn im Rahmen der PCR als Vorwärtsprimer ein Nucleinsäuremolekül verwendet wird, das die Nucleotidsequenz SEQ ID-Nr. 1 aufweist und/oder als Rückwärtsprimer ein Nucleinsäuremolekül verwendet wird, das die Nucleotidsequenz SEQ ID-Nr. 2 aufweist.there it is particularly advantageous if in the context of PCR as a forward primer uses a nucleic acid molecule which is the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 1 and / or as Reverse primer on Used nucleic acid molecule which is the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 2 has.

Diese PCR-Primer eignen sich nach Erkenntnissen der Erfinder besonders gut für die Amplifizierung von genomischer DNA, insbesondere von solcher im Bereich des Codons, das für die Aminosäureposition 481 im ClC-Kb-Protein kodiert. Es versteht sich, dass die genannten Primer an ihrem 5'- und oder 3'-Ende weitere Nucleotide aufweisen können, ohne dass dadurch die Spezifität und damit Eignung derselben für die Amplifizierung der genomischen DNA verloren ginge. Darüber hinaus können einzelne Nucleotide gegen andere ausgetauscht werden, so lange dadurch die Hybridisierungseigenschaften der Primer nicht oder nur in geringem zu tolerierendem Maße beeinträchtigt werden.These PCR primers are particularly suitable according to findings of the inventors good for the amplification of genomic DNA, in particular of such in the area of the codon, that for the amino acid position 481 encoded in the ClC-Kb protein. It is understood that the said Primer on her 5'- and or 3'-end more May have nucleotides, without thereby the specificity and thus suitability of the same for the amplification of the genomic DNA would be lost. Furthermore can single Nucleotides are exchanged for others as long as the Hybridization properties of the primer not or only in small to tolerable extent impaired become.

Alternativ kann vorzugsweise als Vorwärtsprimer ein Nucleinsäuremolekül verwendet werden, das die Nucleotidsequenz SEQ ID-Nr. 3 aufweist, und/oder als Rückwärtsprimer ein Nucleinsäuremolekül, das die Nucleotidsequenz SEQ ID-Nr. 4 aufweist.alternative may preferably be used as a forward primer uses a nucleic acid molecule be the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 3, and / or as a reverse primer a nucleic acid molecule containing the Nucleotide sequence SEQ ID NO. 4 has.

Auch diese beiden Primer sind zur Amplifizierung der genomischen DNA, insbesondere im Bereich des Codons, das für die an Position 481 des ClC-Kb-Proteins positionierte Aminosäure kodiert, besonders geeignet. Die Erfinder haben die vorstehend genannten PCR-Primer erfolgreich im Rahmen des LightCycler-Systems eingesetzt (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland). Auch diese PCR-Primer können selbstverständlich an ihrem 5'- bzw. 3'-Ende weitere Nucleotide aufweisen. Ferner können auch hier einzelne Nucleotide ausgetauscht werden, sofern dadurch die Hybridisierungseigenschaften der Primer nicht erheblich verschlechtert werden.These two primers are also used to amplify the genomic DNA, especially in the region of the codon which codes for the amino acid positioned at position 481 of the ClC-Kb protein. particularly suitable. The inventors have successfully used the above-mentioned PCR primers as part of the LightCycler system (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Of course, these PCR primers may also have other nucleotides at their 5 'and 3' ends. Furthermore, individual nucleotides can also be exchanged here, provided that the hybridization properties of the primers are not significantly impaired.

Dabei ist es bevorzugt, wenn in dem erfindungsgemäßen Verfahren auf die Mutation mithilfe des 5'-Nucleaseassays untersucht wird.there it is preferred when in the method according to the invention to the mutation using the 5'-nuclease assay is examined.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine Echtzeit-PCR verwendet wird, mit der sich Mutationen besonders gut, hoch sensitiv und weitgehend automatisierbar nachweisen lassen. Neben den beiden PCR-Primern wird bei dem 5'-Nuclease- oder auch TaqMan-Assay ein zusätzliches, in der Regel fluoreszenzmarkiertes Oligonucleotid eingesetzt, das mit einem Bereich der zu amplifizierenden genomischen DNA hybridisiert, der zwischen den Bindestellen für die beiden PCR-Primer liegt. Diese sog. Taq-Man-Sonde ist in der Regel am 5'-Ende mit einem Reporterfluoreszenzfarbstoff und einem intern eingebauten oder am 3'-Ende liegenden Quencher markiert. Die Reporterfluoreszenzemission wird bei der intakten TaqMan-Sonde durch die Nähe zum Quencher unterdrückt.These measure has the advantage that a real-time PCR is used with the Mutations are particularly good, highly sensitive and largely automatable can be detected. In addition to the two PCR primers, in the case of the 5'-nuclease or TaqMan assay, an additional, usually fluorescently labeled oligonucleotide used, the hybridized with a region of the genomic DNA to be amplified, the one between the binding sites for the two PCR primers is located. This so-called Taq-Man probe is usually at the 5 'end with a reporter fluorescent dye and an internally built or 3'-end quencher. The Reporter fluorescence emission is performed on the intact TaqMan probe the roundabouts suppressed to the quencher.

Bei der Neustrangsynthese im Rahmen der PCR-Reaktion schneidet die dabei üblicherweise verwendete Taq-Polymerase durch ihre 5'-, 3'-Exonucleaseaktivität die TaqMan-Sonde in kleine Fragmente, wodurch es zu einer Loslösung des Reporters vom Quencher kommt und die Reporterfluoreszenz freigesetzt werden kann. Die Zunahme der Reporterfluoreszenz wird nach jedem Zyklus gemessen und ist wiederum proportional zu der Menge des DNA-Templates im Reaktionsansatz. Die Taq-Polymerase fragmentiert nur an die Zielsequenz gebundenen TaqMan-Sonden, nicht-hybridisierte Taq-Man-Sonden bleiben unbeschadet.at Neural synthesis in the context of the PCR reaction cuts the one commonly used Taq polymerase by its 5 ', 3'-exonuclease activity the TaqMan probe into small fragments, causing a release of the reporter from the quencher comes and the reporter fluorescence can be released. The increase the reporter fluorescence is measured after each cycle and is in turn proportional to the amount of DNA template in the reaction mixture. The Taq polymerase fragments only to the target sequence TaqMan probes, non-hybridized Taq-Man probes remain undamaged.

Häufig wird als Reporter Fluorescein und als Quencher Rhodamin verwendet. Für eine Echtzeit-quantitative PCR, sog. Multiplex-PCR, bei der mehrere Zielsequenzen in einer einzelnen PCR-Reaktion nachgewiesen werden, können für unterschiedliche Taq-Man-Sonden verschiedene Farbstoffe mit unterschiedlichen Extinktions- und Emissionswellenlängen eingesetzt werden.Frequently becomes used as a reporter fluorescein and as a quencher rhodamine. For a real-time quantitative PCR, so-called multiplex PCR, detected multiple target sequences in a single PCR reaction can, can for different Taq man probes different Dyes used with different extinction and emission wavelengths become.

In diesem Zusammenhang wird vorzugsweise im Rahmen des Mutationsscreenings eine Hybridisierungssonde verwendet, die die Nucleotidsequenz SEQ ID-Nr. 5 und/oder SEQ ID-Nr. 6 aufweist.In This relationship is preferably used in the context of mutation screening uses a hybridization probe comprising the nucleotide sequence SEQ ID no. 5 and / or SEQ ID NO. 6 has.

Diese Hybridisierungssonde kann als vorstehend beschriebene TaqMan-Sonde ausgestaltet werden, wobei die Sonde mit der Nucleotidsequenz SEQ ID-Nr. 5 an den Wildtyp, d.h. die nicht-mutierte Variante des ClC-Kb-Gens, und die Sonde mit der Nucleotidsequenz SEQ ID-Nr. 6 an die mutierte Form des ClC-Kb-Gens hybridisiert. Die Hybridisierungssonde weist vorzugsweise an ihrem 5'-Ende einen Reporterfluoreszenzfarbstoff, bspw. Fluorescein (FAM) oder VIC auf. Die Hybridisierungssonde wird vorzugsweise als sog. MGB-Sonde (engl.: minor groove binder) ausgestaltet, die am 3'-Ende einen nicht-fluoreszierenden Quencher aufweist. Ferner ist am 3'-Ende der Sonde ein Minor Groove Binder lokalisiert, der eine Erhöhung des Schmelzpunktes T_m, d.h. der Temperatur, bei der DNA zur Hälfte einzelsträngig vorliegt, verursacht. Dadurch ist es möglich, kürzere Sonden zu designen, ohne dass dadurch deren Spezifität für die nachzuweisende Mutation abnimmt. Derartige kürzere Sonden sind zur Detektion von Mutationen, bei denen nur einzelne Nucleotide ausgetauscht sind, besonders vorteilhaft. Die Gefahr von Fehldiagnosen wird durch diese Maßnahme reduziert.This hybridization probe can be designed as a TaqMan probe described above, wherein the probe with the nucleotide sequence SEQ ID NO. 5 to the wild type, ie the non-mutated variant of the ClC-Kb gene, and the probe having the nucleotide sequence SEQ ID NO. 6 hybridized to the mutated form of the ClC-Kb gene. The hybridization probe preferably has at its 5 'end a reporter fluorescent dye, for example fluorescein (FAM) or VIC. The hybridization probe is preferably designed as a so-called MGB probe (minor groove binder), which has a non-fluorescent quencher at the 3 'end. Furthermore, a minor groove binder is located at the 3 'end of the probe, which causes an increase in the melting point T _m , ie the temperature at which half of the DNA is single-stranded. This makes it possible to design shorter probes without thereby diminishing their specificity for the mutation to be detected. Such shorter probes are particularly advantageous for detection of mutations in which only single nucleotides are exchanged. The risk of misdiagnosis is reduced by this measure.

Es versteht sich, dass auch die vorstehend genannten Hybridisierungssonden an ihrem 5'- bzw. 3'-Ende weitere Nucleotide aufweisen können, ohne dass dadurch deren Hybridisierungseigenschaften verschlechtert würden. Gleiches gilt für den Austausch einzelner Nucleotide, sofern dadurch deren Hybridisierungeigenschaften höchstens geringfügig modifiziert werden.It It is understood that the above-mentioned hybridization probes other nucleotides at its 5 'and 3' ends, respectively can have without thereby degrading their hybridization properties would. The same applies to the replacement of individual nucleotides, provided that their hybridization properties at the most slightly modified become.

Alternativ ist es bevorzugt, wenn in Schritt (b) auf das Vorhandensein der Mutation mithilfe der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Technologie (FRET) untersucht wird.alternative it is preferred if in step (b) on the presence of Mutation using fluorescence resonance energy transfer technology (FRET) becomes.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine besonders gut etablierte Technologie eingesetzt wird, die eine Echtzeit-PCR ermöglicht. Bei dieser Technologie werden Hybridisierungssonden eingesetzt, die so ausgestaltet sind, dass diese hoch selektiv an definierte bzw. mutierte Sequenzen binden. Ein Detektionsan satz besteht aus einer Donor-Hybridisierungssonde und einer Akzeptor-Hybridisierungssonde. Die Donor-Hybridisierungssonde trägt ein Fluorophor, welches mit einer LED-Lichtquelle angeregt wird und seine Emissionsenergie auf einen Akzeptor, der an eine Akzeptor-Hybridisierungssonde gebunden ist. Diese Energieübertragung erfolgt nur, wenn sich Donor- und Akzeptor-Hybridisierungssonde in unmittelbarer Nähe befinden. Dies ist bspw. dann der Fall, wenn eine der Sonden hochspezifisch für die Mutation ist, die andere an eine direkt daneben liegende Sequenz bindet und sich ein solches, die unterteilte Sequenz aufweisendes Nucleinsäuremolekül im zu untersuchenden biologischen Material befindet. Der Akzeptor emittiert dann nach Energieübertragung vom Donor Licht mit einer höheren Wellenlänge, die mit einem entsprechenden Detektor gemessen werden kann. Die Lichtquelle kann den Akzeptor-Fluorophor selbst nicht anregen. Das FRET-Prinzip ist also abhängig von der räumlichen Nähe beider Fluorophore, d.h. der Nähe von Donor- zu Akzeptor-Hybridisierungssonde. In Abwesenheit des DNA-Targets kann der Energietransfer nicht stattfinden.This measure has the advantage that a particularly well-established technology is used, which enables a real-time PCR. This technology uses hybridization probes that are designed to bind highly selectively to defined or mutated sequences. A detection kit consists of a donor hybridization probe and an acceptor hybridization probe. The donor hybridization probe carries a fluorophore which is excited with an LED light source and its emission energy onto an acceptor bound to an acceptor hybridization probe. This energy transfer occurs only when donor and acceptor hybridization probes are in close proximity. This is the case, for example, when one of the probes is highly specific for the mutation, the other binds to an immediately adjacent sequence, and such a nucleic acid molecule having the subdivided sequence is in the biological material to be examined. The acceptor then emits energy From the donor light with a higher wavelength, which can be measured with a corresponding detector. The light source can not excite the acceptor fluorophore itself. The FRET principle thus depends on the spatial proximity of both fluorophores, ie the proximity of donor to acceptor hybridization probe. In the absence of the DNA target, the energy transfer can not take place.

Die Menge an hybridisierter Sondenpaare und damit an vom Akzeptorfarbstoff emittierten Signal steigt mit der Menge an Amplifikat. Das emittierte Signal ist proportional zur Menge des akkumulierten Amplifikates. Die Verwendung des FRET-Systems ermöglicht deshalb eine besonders schnelle, hoch präzise, leicht zu automatisierende, und damit besonders zweckmäßige Mutationsanalyse. Die Gefahr von Fehldiagnosen wird auch durch diese Maßnahme reduziert.The Amount of hybridized probe pairs and thus on the acceptor dye emitted signal increases with the amount of amplificate. The emitted signal is proportional to the amount of accumulated amplificate. The usage FRET system therefore a particularly fast, highly precise, easy-to-automate, and thus particularly appropriate mutational analysis. The risk of misdiagnosis is also reduced by this measure.

Dabei ist es vorteilhaft, wenn bei Verwendung der FRET-Technologie als Donor-Hybridisierungssonde ein Nucleinsäuremolekül, das die Nucleotidsequenz SEQ ID-Nr. 7 aufweist, und/oder als Akzeptor-Hybridisierungssonde ein Nucleinsäuremolekül, das die Nucleotidsequenz SEQ ID-Nr. 7 aufweist, verwendet wird.there It is advantageous when using the FRET technology as Donor hybridization probe is a nucleic acid molecule containing the nucleotide sequence SEQ ID NO. 7, and / or as an acceptor hybridization probe a nucleic acid molecule containing the Nucleotide sequence SEQ ID NO. 7 is used.

Wie die Erfinder herausgefunden haben, sind diese Sonden für den Nachweis einer Mutation im ClC-Kb-Gen, insbesondere im Bereich des Codons, das für die Aminosäureposition 481 kodiert, besonders geeignet. Die Donor-Hybridisierungssonde ist an ihrem 3'-Ende vorzugsweise mit Fluorescin als Energie-Donor gekoppelt, wohingegen die Akzeptor-Hybridisierungssonde an ihrem 5'-Ende vorzugsweise mit dem Energie-Akzeptor LCRed640 gekoppelt ist. Auch diese Sonden können an ihrem 5'- und/oder 3'-Ende weitere Nucleotide aufweisen, ohne dass dadurch deren Hybridisierungseigenschaften verändert werden. Selbstverständlich können auch einzelne Nucleotide ausgetauscht werden, sofern dadurch die Hybridisierungseigenschaften der Sonden nicht wesentlich verschlechtert werden.As The inventors have found that these probes are for detection a mutation in the ClC-Kb gene, especially in the codon region, that for the amino acid position 481 coded, particularly suitable. The donor hybridization probe is at her 3'-end preferably coupled with fluorescein as the energy donor, whereas the acceptor hybridization probe at its 5 'end preferably coupled to the energy acceptor LCRed640. Also these probes can at her 5'- and / or 3'-end more Having nucleotides without thereby their hybridization properties changed become. Of course can also individual nucleotides are exchanged, provided that the Hybridization properties of the probes did not deteriorate significantly become.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer solchen Substanz zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tinnitus, die eine in ihrer Funktion gestörte oder mutierte Form von ClC-Kb in ihrer Aktivität und/oder Expression moduliert, vorzugsweise inhibiert.One Another object of the present invention relates to the use such a substance for the manufacture of a medicament for the treatment of tinnitus, which is a functionally disturbed or mutated form of ClC-Kb in its activity and / or Expression is modulated, preferably inhibited.

Die Erfinder haben festgestellt, dass es bei einer Mutation von ClC-Kb, vorzugsweise an Aminosäureposition 481 nach einem Austausch des Threoninmoleküls gegen ein Serinmolekül, zu einer Modulation der Aktivität bzw. Expression des ClC-Kb-Proteins kommt, was in einer veränderten KCl-Sekretion im Innenohr resultiert. Die Veränderung liegt üblicherweise in einer Steigerung der KCl-Sekretion. Die erfindungsgemäße Verwendung der Substanz ist deshalb vorteilhaft, weil dadurch zielgerichtet die Ursache der Entstehung von Tinnitus, nämlich die veränderte KCl-Sekretion im Innenohr, moduliert bzw. reduziert wird.The Inventors have found that if a mutation of ClC-Kb, preferably at amino acid position 481 after an exchange of the threonine molecule for a serine molecule, to a Modulation of activity or expression of the ClC-Kb protein, resulting in an altered KCl secretion in the inner ear results. The change is usually in an increase in KCl secretion. The use according to the invention The substance is advantageous because it is targeted the cause of the development of tinnitus, namely the altered KCl secretion in the inner ear, modulated or reduced.

Eine solche Substanz lässt sich mittels Routineverfahren identifizieren, welche bspw. in der nicht veröffentlichten PCT/EP2004/011192 beschrieben sind. Dazu wird auf vorhandene und dem Fachmann zur Verfügung stehende Substanzbibliotheken zurückgegriffen, die eine beliebig große Anzahl von chemisch oder biologisch definierten Substanzen jeglicher Art und Ausgestaltung enthalten. Diese Substanzen werden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, ob sie mit der mutierten Form von ClC-Kb interagieren bzw. an diese binden können, und über Aktivitätsmessungen wird festgestellt, ob dabei die Aktivität des mutierten ClC-Kb-Proteins verändert, vorzugsweise inhibiert wird. Derartige Aktivitätsmessungen können bspw. über Elektronenspannungsklemmenexperimente an Xenopus laevis-Oocyten erfolgen, die in der Publikation von Jeck et al. (a.a.O.) detailliert erläutert sind.A leaves such substance identify themselves by means of routine procedures, which, for example, in the not published PCT / EP2004 / 011192 are described. This is done on existing and available to the skilled person recourse to standing substance libraries, which are arbitrary size Number of chemically or biologically defined substances of any Type and design included. These substances are on their ability to see if they interact with the mutated form of ClC-Kb or bind to them, and over activity measurements it is determined whether the activity of the mutated ClC-Kb protein changed is preferably inhibited. Such activity measurements may be, for example, via electron voltage clamp experiments Xenopus laevis oocytes described in the publication by Jeck et al. (supra) explained in detail are.

Eine solche mittels üblicher Screeningverfahren aufgefundene Substanz wird dann nach dem Fachmann bekannten Vorgehensweisen formuliert; vgl. Kibbe A. H. (2000), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.A such by usual The substance found by the screening method will then be known to those skilled in the art formulated known procedures; see. Kibbe A.H. (2000), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.

Eine wie vorstehend beschriebene Substanz weist vorzugsweise ein Nucleinsäuremolekül auf, das unter stringenten Bedingungen an ein anderes Nucleinsäuremolekül, das für funktionsgestörtes oder mutiertes ClC-Kb-Protein kodiert, bindet.A The substance as described above preferably has a nucleic acid molecule which under stringent conditions to another nucleic acid molecule that is functional or not mutated ClC-Kb protein binds.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass bereits beispielhaft eine oben beschriebene Substanz bereitgestellt wird, mit der die Funktionsstörung des ClC-Kb-Proteins bei Tinnituspatienten auf genetischer Ebene behoben werden kann. Das Nucleinsäuremolekül wird dabei vorzugsweise so ausgestaltet, dass es eine Nucleotidsequenz aufweist, die zur Nucleotidsequenz, die für das mutierte oder funktionsgestörte ClC-Kb-Protein kodiert, komplementär oder weitgehend komplementär ist. Das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül ist dadurch als sog. Antisense-Konstrukt ausgestaltet, das über die Hybridisierung mit dem für funktionsgestörtes oder mutiertes ClC-Kb kodierende Molekül die Expression des letzteren verhindert. Da die Kodierungssequenz für ClC-Kb bekannt ist (siehe oben), lässt sich ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül mittels üblicher Oligonucleotidsyntheseverfahren leicht herstellen, wobei an der Stelle im Antisense-Konstrukt, die der Mutation entspricht, eine zur Mutation komplementäre Sequenz vorgesehen wird.This measure has the advantage that a substance described above is already provided by way of example, with which the dysfunction of the ClC-Kb protein in tinnitus patients can be remedied at the genetic level. The nucleic acid molecule is preferably designed to have a nucleotide sequence that is complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence encoding the mutant or dysfunctional ClC-Kb protein. As a result, the nucleic acid molecule according to the invention is designed as a so-called antisense construct which prevents expression of the latter by hybridization with the molecule which codes for dysfunctional or mutated ClC-Kb. Since the coding sequence for ClC-Kb is known (see above), a nucleic acid molecule according to the invention can be easily prepared by conventional oligonucleotide synthesis method, where at the site in the antisense construct corresponding to the mutation, one for mutation komple mentary sequence is provided.

Unter stringenten Bedingungen werden erfindungsgemäß solche Bedingungen verstanden, unter denen nur solche Nucleinsäuremoleküle miteinander hybridisieren, die über längere Abschnitte weitgehend komplementäre Nucleotidsequenzen aufweisen. Stringente Bedingungen können durch geeignete Wahl von Salzkonzentrationen, geeignetem pH-Wert oder entsprechenden Temperaturen eingestellt werden.Under stringent conditions are understood according to the invention to mean such conditions, among which only such nucleic acid molecules with each other hybridize over longer Sections largely complementary Have nucleotide sequences. Stringent conditions can be due suitable choice of salt concentrations, suitable pH or appropriate temperatures are set.

Nach einer erfindungsgemäßen Weiterbildung ist es bevorzugt, wenn das in der Substanz enthaltende Nucleinsäuremolekül als siRNA-Molekül ausgestaltet ist.To a development of the invention For example, it is preferred that the nucleic acid molecule contained in the substance be designed as an siRNA molecule is.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass über eine siRNA die Expression von funktionsgestörtem bzw. mutiertem ClC-Kb effektiver inhibiert werden kann als mit einem bloßen Antisense-Konstrukt. Derartige siRNA-Moleküle (engl.: small interfering RNA) stellen doppelsträngige Strukturen aus Ribonucleinsäure dar, die einen Abschnitt aufweisen, der mit der Zielstruktur, hier mit der Kodierungssequenz für funktionsgestörtes oder mutiertes ClC-Kb, hybridisieren kann. siRNA-Moleküle sind gegenüber einfachen Antisense-Oligonucleotiden zur Inhibierung der Genexpression besser geeignet, da sie einen autokatalytischen posttranskriptionellen Prozess auslösen können, der als RNA-Interferenz (RNAi) bezeichnet wird und zu einer äußerst effektiven Stilllegung der Expression der Zelle, dem sog. „gene silencing", führt. In eine biologische Zelle eingebracht, werden die siRNA-Moleküle zu einem sog. Ribonucleasekomplex, dem sog. „RNA induced silencing complex (RISC)", rekrutiert. Dieser Komplex ist über das siRNA-Molekül in der Lage, bspw. an mRNA-Moleküle mit Sequenzen zu binden, die im Wesentlichen komplementär zu Sequenzabschnitten des siRNA-Moleküls sind. Nach der Bindung der mRNA-Moleküle werden diese durch die Endonucleaseaktivität des RISC degradiert. Dies führt im Ergebnis zur Inhibierung der Expression des entsprechenden Gens, das für die mRNA kodiert, d.h. des ClC-Kb-Gens CLCNKB.These measure has the advantage of having one siRNA expression of dysfunctional or mutated ClC-Kb can be inhibited more effectively than with a mere antisense construct. such siRNA molecules (English: small interfering RNA) represent double-stranded structures of ribonucleic acid, which have a section with the target structure, here with the coding sequence for dysfunctional or mutated ClC-Kb. siRNA molecules are across from simple antisense oligonucleotides for inhibiting gene expression more suitable because they have an autocatalytic posttranscriptional Trigger process can, referred to as RNA interference (RNAi) and to a highly effective Inactivation of the expression of the cell, the so-called "gene silencing" leads introduced a biological cell, the siRNA molecules become one so-called ribonuclease complex, the so-called "RNA induced silencing complex (RISC) ", recruited. This complex is over the siRNA molecule capable, for example, of mRNA molecules with sequences to bind, which is essentially complementary to sequence sections of the siRNA molecule. After binding the mRNA molecules these are degraded by the endonuclease activity of the RISC. This leads in the Result of inhibiting the expression of the corresponding gene, that for the mRNA encodes, i. of the ClC-Kb gene CLCNKB.

Vor diesem Hintergrund ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe von Tinnitus bei einem menschlichen Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellung einer Substanz, die eine funktionsgestörte oder mutierte Form von ClC-Kb in ihrer Aktivität und/oder Expression moduliert, vorzugsweise inhibiert; (b) Verabreichung der Substanz dem menschlichen Lebewesen, und ggf. (c) Wiederholung der Schritte (a) und (b).In front This background is another object of the present invention Invention A method for the treatment or prophylaxis of tinnitus in a human being, comprising the steps of: (a) providing a substance that is a dysfunctional or mutated form of ClC-Kb modulated in its activity and / or expression, preferably inhibited; (b) administration of the substance to the human Living beings, and if necessary (c) repetition of steps (a) and (b).

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It it is understood that the above and the following yet to be explained features not only in the specified combination, but also in other combinations or alone, without to leave the scope of the present invention.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die rein illustrativen Charakter haben und die Tragweite der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken.The The present invention will now be explained in more detail by means of embodiments which purely illustrative in nature and the scope of the present Restrict invention in any way.

Ausführungsbeispiele:EXAMPLES

1. Biologisches Material1. Biological material

Den zu untersuchenden Personen wird Blut abgenommen und daraus die DNA nach Standardverfahren isoliert.The People to be examined are bled and from this the DNA isolated by standard methods.

2. Mutationsanalyse2. Mutation analysis

(a) 5'-Nucleaseassay(a) 5'-Nuclease Assay

Zur Genotypisierung im 5'-Nucleaseassay unter Verwendung der TaqMan-Technologie werden folgende TaqMan-Sonden verwendet: Zum Nachweis des Wildtyps (A): FAM-ACCCACACCATCC; zum Nachweis der Mutation, die an Aminosäureposition 481 des ClC-Kb-Proteins zum Austausch von Threonin gegen Serin geführt hat (T): VIC- ACCCACTCCRTCTC; PCR-Primer werden Folgende verwendet: vorwärts: 5'-CTGAGCTGCCCTGCCTGA-3'; rückwärts: 5'-GCACTATCTGGCCGGTCAC-3'.to Genotyping in the 5'-Nucleaseassay under Using the TaqMan technology, the following TaqMan probes are used used: For detection of wild-type (A): FAM-ACCCACACCATCC; as proof of the mutation at amino acid position 481 of the ClC-Kb protein has led to the replacement of threonine by serine (T): VIC- ACCCACTCCRTCTC; PCR primers are used: forward: 5'-CTGAGCTGCCCTGCCTGA-3 '; backwards: 5'-GCACTATCTGGCCGGTCAC-3 '.

Die PCR wird in einem Reaktionsvolumen von 25 μl mit 20 ng genomischer DNA, die aus den Blutproben der Probanden isoliert wird, 200 nM einer jeden Sonde und 900 nM Vorwärts- und Rückwärtsprimer in 1 × TaqMan Universal PCR Mastermix (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Amplifizierungsbedingungen lauteten: 1 Zyklus bei 50°C für 2 min, 1 Zyklus bei 95°C für 10 min und 40 Zyklen bei jeweils 92°C für 15 Sek. und 60°C für 1 min.The PCR is carried out in a reaction volume of 25 μl with 20 ng of genomic DNA, which is isolated from the subjects' blood samples, 200 nM of each Probe and 900 nM forward and reverse primer in 1 × TaqMan Universal PCR Mastermix (Applied Biosystems). The Amplification conditions were: 1 cycle at 50 ° C for 2 min, 1 cycle at 95 ° C for 10 min and 40 cycles at 92 ° C each for 15 Sec. And 60 ° C for 1 min.

Die Fluoreszenzsignale werden mit einem ABI PRISM 770 Detektionssystem detektiert und die Ergebnisse unter Verwendung des Sequence Detection Systems (SDS), Softwareversion 1.7 (Applied Biosystems) analysiert.The Fluorescence signals are detected using an ABI PRISM 770 detection system detected and the results using the Sequence Detection Systems (SDS), software version 1.7 (Applied Biosystems).

(b) LightCycler(b) LightCycler

Zur Genotypisierung über Fluoreszenzresonanzenergietransfer mit dem LightCycler (Roche Diagnostics) werden zum Nachweis der ClC-Kb^T481S-Mutation (A/T) die folgenden Bedingungen gewählt: Vorwärtsprimer: 5'-CTGCCTGACTCTGCCTTTGCAG-3'; Rückwärtsprimer: 5'-CAGTCAGCCTGAGGTGGG CAC-3'; Donorhybridisierungssonde: 5'-GTGACCCACRCCATCTCCAC-Fluorescein-3'; Akzeptorhybridisierungssonde: 5'-LCRed640-GCTGCTGGCCTTCGAGGTGACCGGCCAGAT-3'.For genotyping via fluorescence resonance energy transfer with the LightCycler (Roche Diagnostics), the following conditions are selected to detect the ClC-Kb ^T481S mutation (A / T): Forward primer: 5'-CTGCCTGACTCTGCCTTTGCAG-3 '; Reverse primer: 5'-CAGTCAGCCTGAGGTGGG CAC-3 '; Donorhybri dissection probe: 5'-GTGACCCACRCCATCTCCAC-fluorescein-3 '; Acceptor hybridization probe: 5'-LCRed640-GCTGCTGGCCTTCGAGGTGACCGGCCAGAT-3 '.

Die PCR wird mit 50 ng genomischer DNA, die aus Blutproben der Probanden isoliert wurde, in einem Gesamtvolumen von 20 μl durchgeführt, das 2 μl Reaktionsmix, 0,5 μmol/l eines jeden Primers, 0,2 μmol/l einer jeden Hybridisierungssonde und 2 μmol/l MGCL2 gemäß der Angaben des Herstellers (Roche Diagnostics) enthält. Es werden 40 Zyklen durchgeführt: Denaturierung bei 95°C, 0 Sek., Rampenrate 20°C/Sek.; Anlagerung bei 60°C für 10 Sek., Rampenrate 20°C/Sek., Verlängerung bei 72°C für 10 Sek., Rampenrate 20°C/Sek. Eine Schmelzkurve wird durch Halten der Reaktion für 20 Sekunden bei 40°C und dann langsamem Halten auf 95°C mit einer Rampenrate von 0,2°C/Sek. erstellt. Die Fluoreszenzsignale werden gegen die Temperatur aufgetragen und liefern Peaks bei 65°C für den Wildtyp und bei 60°C für die Mutation.The PCR is performed with 50 ng of genomic DNA taken from blood samples of the subjects was isolated, carried out in a total volume of 20 .mu.l, the 2 .mu.l reaction mixture, 0.5 .mu.mol / l of a of each primer, 0.2 μmol / l of each hybridization probe and 2 μmol / L MGCL2 as indicated from the manufacturer (Roche Diagnostics). There are 40 cycles: denaturation at 95 ° C, 0 sec., Ramp rate 20 ° C / sec .; Annealing at 60 ° C for 10 Sec., Ramp rate 20 ° C / sec., renewal at 72 ° C for 10 seconds, Ramp rate 20 ° C / sec. A melting curve is made by holding the reaction for 20 seconds at 40 ° C and then slowly holding at 95 ° C with a ramp rate of 0.2 ° C / sec. created. The fluorescence signals are plotted against the temperature and provide peaks at 65 ° C for the Wild type and at 60 ° C for the Mutation.

3. Feststellungen der Erfinder3. Findings the inventor

Die Erfinder haben zwölf Tinnituspatienten sowie ca. 150 gesunden Kontrollpersonen Blut abgenommen und daraus die genomische DNA gemäß Standardverfahren isoliert.The Inventors have twelve Tinnitus patients and about 150 healthy controls were bled and isolated from the genomic DNA according to standard methods.

Unter Verwendung der unter 2(a) bzw. der unter 2(b) identifizierten PCR-Primer wurde das Gen, das für das ClC-Kb-Protein kodiert, amplifiziert und anschließend über Standardverfahren sequenziert.Under Use of the PCR primers identified under 2 (a) or under 2 (b) became the gene for encodes the ClC-Kb protein, amplified and then by standard methods sequenced.

Dabei konnte bei 11 von 12 Tinnituspatienten eine Mutation identifiziert werden, die bei dem ClC-Kb-Protein in einem Aminosäureaustausch an Position 481 resultierte, bei der in mindestens einem Allel ein Threonin gegen ein Serin ausgetauscht war. Bei den gesunden Kontrollpersonen hingegen wurde keine Mutation identifiziert.there was able to identify a mutation in 11 out of 12 tinnitus patients which are involved in the ClC-Kb protein in an amino acid exchange at position 481 resulted in at least one allele Threonine was exchanged for a serine. In healthy controls however, no mutation was identified.

Die Erfinder konnten also erstmals eine genetische Ursache für die Entstehung von Tinnitus aufzeigen und setzten diese Erkenntnis in die Bereitstellung eines entsprechenden Diagnose verfahrens sowie einer solchen Substanz um, mit der ursächlich Tinnitus behandelt werden kann.The For the first time, inventors were able to find a genetic cause for the genesis of tinnitus and put this insight into the provision a corresponding diagnostic method and such a substance around, with the causative tinnitus can be treated.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows a sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can from the official publication platform downloaded from the DPMA.

Claims

Method for the diagnosis of tinnitus in a human Living being, which has the following steps: (a) Provision a biological sample of the human being; (b) carrying out a Examination of the biological sample for the presence of a dysfunctional ClC-Kb protein, and (c) correlation of a positive finding with a positive diagnosis.

Method according to claim 1, characterized in that in step (b) the ClC-Kb protein is examined for a mutation becomes.

A method according to claim 2, characterized in that it is examined for such a mutation by which at amino acid position 481 a threonine molecule is replaced by a serine molecule (ClC-Kb ^T481S ).

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the biological sample is genomic DNA.

Method according to claim 4, characterized in that that the genomic DNA is amplified by PCR technology and the amplificates are examined for the presence of the mutation.

Method according to claim 5, characterized in that that for the PCR as forward primer uses a nucleic acid molecule which is the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 1, and / or as a reverse primer uses a nucleic acid molecule which is the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 2 has.

Method according to claim 5, characterized in that that for the PCR as forward primer uses a nucleic acid molecule which is the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 3, and / or as a reverse primer uses a nucleic acid molecule which is the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 4 has.

Method according to one of claims 5 to 7, characterized that on the mutation using the 5'-nuclease assay is examined.

Method according to claim 8, characterized in that that examined for the mutation using a hybridization probe which is the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 5 and / or 6 has.

Method according to one of claims 5 to 7, characterized that on the mutation using the fluorescence resonance energy transfer technology (FRET) is examined.

Method according to claim 10, characterized in that that under FRET technology as a donor hybridization probe uses a nucleic acid molecule which is the nucleotide sequence SEQ ID NO. 7, and / or as Acceptor hybridization probe, a nucleic acid molecule containing the nucleotide sequence SEQ ID NO. 8 has.

Use of a substance for the production of a Drug for the treatment of tinnitus, characterized that the substance is a dysfunctional and / or mutated form of ClC-Kb in their activity and / or expression is modulated, preferably inhibited.

Use according to claim 12, characterized in that the mutation at amino acid position 481 exchanges a threonine molecule for a serine molecule (ClC-Kb ^T481S ).

Use according to claim 12 or 13, characterized that the substance has a nucleic acid molecule, under stringent conditions to another nucleic acid molecule that is defective in function and / or mutated ClC-Kb encodes binds.

Use according to claim 14, characterized that the nucleic acid molecule designed as siRNA molecule is.

Method of treating tinnitus in one human beings, comprising the following steps: (A) Providing a substance that has a mutated form of ClC-Kb in their activity and / or expression is modulated, preferably inhibited; (B) Administration of the substance of a tinnitus patient, and possibly (C) Repetition of steps (a) and (b).