DE102004061903A1 - Polynukleotide kodierend für einen Insekten-Neurokinin-Rezeptor und Verwendungen davon - Google Patents

Polynukleotide kodierend für einen Insekten-Neurokinin-Rezeptor und Verwendungen davon Download PDF

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Klaus Ramig
Daniel A. San Carlos Elkes
Julie B. Novato Mazzotta
Kedan San Carlos Lin
Hartmut Tintrup
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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäuremoleküle bereit, die für einen Insekten-Neurokinin-Rezeptor kodieren, wie auch Neurokinin-Rezeptoren, die von diesen kodiert werden. Die Erfindung stellt des Weiteren Verfahren bereit zur Identifizierung von Agenzien, welche einen Spiegel von Neurokinin-Rezeptor mRNA, Polypeptid oder den Grad der Calcium-Ionenkanal-Aktivität modulieren. Solche Agenzien sind Kandidaten für insektentötende Verbindungen.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Insekten-Proteine und insbesondere einen Insekten-Neurokinin-Rezeptor
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Der Neurokinin-Rezeptor (NKD) ist ein G-Protein gebundener Rezeptor für Tachykininverwandte Neuropeptide. In Säugetieren werden diese Peptide beispielhaft dargestellt durch die Substanz P und sind eingeschlossen in Motor-, sensorischen, kardiovaskulären, respiratorischen und Magen-Darm-Trakt-Funktionen. In wirbellosen Tieren wurde eine steigende Zahl von insektischen Tachykinin-Neuropeptiden identifiziert. Wie bei den Säugetier-Tachykininen fungieren diese Peptide sowohl als Neuromodulatoren als auch als endokrine Signalmoleküle. Insektische Tachykinin-Neuropeptide werden während der Entwicklung exprimiert einschließend das zentrale Nervensystem (ZNS) der Larven und den Darm und sind einbezogen in neuromodulatorische und myostimularische Funktionen.
  • Pestizidentwicklung war herkömmlicherweise auf chemische und physikalische Eigenschaften des Pestizids selbst fokussiert, was ein relativ zeitraubender und teurer Prozess ist. Als eine Konsequenz wurden Bemühungen konzentriert auf die Modifikation von bereits existierenden, gut validierten Verbindungen anstelle der Entwicklung neuer Pestizide. Es besteht ein Bedürfnis auf dem Gebiet nach neuen pestizidialen Verbindungen, welche sicherer, selektiver und effizienter als derzeit verfügbare Pestizide sind. Die vorliegende Erfindung adressiert dieses Bedürfnis durch die Bereitstellung neuer Pestizid-Targets aus wirbellosen Tieren, wie z.B. dem "tobacco budworm" Heliothis virescens und dem "fall armyworm" Spodoptera frugiperda und durch Bereitstellen von Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, welche an solche Targets binden bzw. die Aktivität solcher Targets modulieren.
  • Literatur
    • Monnier et al., (1992) Chem. 267(2):1298–302; Li et al., (1991) EMBO J. 10(11):3221–3229; Nassel, (1999) Peptides 20(1):141–158; Gonzalez et al., (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 294(2):444–450; Sarau et al., (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 295(1):373–381; Allen et al., (2000) J. Biomol. Screen. 5(2):63–69; Banks et al., (2000) J. Biomol. Screen 5(5):329–334.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäuremoleküle bereit, die für einen Insekten-Neurokinin-Rezeptor kodieren, wie auch Neurokinin-Rezeptoren, die von diesen kodiert werden. Die Erfindung stellt des Weiteren Verfahren bereit zur Identifizierung von Agenzien, welche einen Spiegel von Neurokinin-Rezeptor mRNA, Polypeptid oder den Grad der Calcium-Ionenkanal-Aktivität modulieren. Solchen Agenzien sind Kandidaten für insektentötende Verbindungen.
  • Es ist eine Aufgabe der Erfindung, isolierte insektische Nukleinsäuremoleküle und Proteine, welche Targets für Pestizide sind, bereitzustellen. Die isolierten Insekten-Nukleinsäuremoleküle, wie hier bereitgestellt, sind verwendbar zur Produktion von Insekten-Proteinen, die von ihnen kodiert werden. Insekten-Proteine sind verwendbar in Assays, um Verbindungen zu identifizieren, welche eine biologische Aktivität der Proteine modulieren, wobei die Assays Verbindungen identifizieren, welche nützlich als Pestizide sein können. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Gene von wirbellosen Tieren zur Verfügung zu stellen, die für Polypeptide kodieren, welche in genetischen Screening-Verfahren verwendet werden können, um mechanistische Pfade zu charakterisieren, in welche solche Gene involviert sein können, wie auch andere wechselwirkende genetische mechanistische Pfade. Es ist des weiteren eine Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Verfügung zu stellen zum Screenen von Verbindungen, einem zentralen Polypeptid eines wirbellosen Tieres wechselwirken. Verbindungen, die mit einem zentralen Polypeptid eines wirbellosen Tieres interagieren, können Verwendbarkeit als Therapeutika oder Pestizide aufweisen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1 stellt die Nukleotidsequenz eines Heliothis Neurokinin-Rezeptors dar (SEQ ID NO:01).
  • 2 stellt die Aminosäuretranslation eines Heliothis Neurokinin-Rezeptors dar (SEQ ID NO:02).
  • 3 stellt die Nukleotidsequenz eines Spodoptera Neurokinin-Rezeptors dar (SEQ ID NO:03).
  • 4 stellt die Aminosäuretranslation eines Spodoptera Neurokinin-Rezeptors dar (SEQ ID NO:04).
  • DEFINITIONEN
  • Wie hier verwendet bedeutet der Begriff "isoliert", dass ein Polynukleotid ein Polypeptid, ein Antikörper oder eine Wirtszelle beschrieben werden, die in einer Umgebung sind, welche verschieden von derjenigen ist, in welcher das Polynukleotid, das Polypeptid, der Antikörper oder die Wirtszelle natürlicherweise vorkommen. Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff "substanziell gereinigt" auf eine Verbindung (beispielsweise entweder ein Polynukleotid oder ein Polypeptid oder ein Antikörper) die aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt wurde und zu zumindestens 60 % frei, 75 % frei oder 90 % frei von anderen Komponenten ist, mit denen sie natürlicherweise assoziiert ist.
  • Die Bezeichnung "Polynukleotid" und "Nukleinsäuremolekül", die hier austauschbar verwendet werden, beziehen sich auf polymere Formen von Nukleotiden in irgendeiner Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxynukleotide. Folglich schließt diese Bezeichnung ein, sind jedoch nicht limitiert auf einfach-, doppel- oder vielsträngige DNA oder RNA, genomische DNA, cDNA, DNA-RNA-Hybride, oder ein Polymer umfassend Purin- und Pyrimidinbasen oder andere natürliche, chemisch oder biochemisch modifizierte, nicht-natürliche oder derivatisierte Nukleotidbasen. Das Rückgrat (backbone) des Polynukleotids kann Zucker und Phosphatgruppen umfassen (wie sie typischerweise in RNA oder DNA gefunden werden), oder modifizierte oder substituierte Zucker- oder Phosphatgruppen. Alternativ kann das Rückgrat des Polynukleotids ein Polymer von synthetischen Subeinheiten umfassen, wie z.B. Phosphoramidite, und kann daher ein Oligodesoxynukleosidphosphoramidat oder ein gemischtes Phosphoramidat-Phosphodiester-Oligomer sein. Peyrottes et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24:1841–1848; Chaturvedi et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24:2318–2323. Ein Polynukleotid kann modifizierte Nukleotide umfassen, wie z.B. methylierte Nukleotide und Nukleotid-Analoga, Uracyl oder Zucker und verknüpfende Gruppen wie z.B. Fluororibose und Thioat und Nukleotid-Verzweigungen umfassen. Die Sequenz der Nukleotide kann durch Nicht-nukleotidkomponenten unterbrochen sein. Ein Polynukleotid kann des Weiteren nach Polymerisation modifiziert sein, wie z.B. durch Konjugation mit einer gelabelten Komponente. Andere Typen von Modifizierungen eingeschlossen in dieser Definition sind Caps, Substitutionen von einer oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotiden mit einem Analog und das Einbringen von Mitteln zum Anheften von Polynukleotiden an Proteine, Metallionen, Labeling-Komponenten, andere Polynukleotide oder eine feste Unterlage.
  • Für Hybridisierungssonden kann es wünschenswert sein, Nukleinsäureanaloga zu verwenden, um die Stabilität und die Bindungsaffinität zu verbessern. Eine Reihe von Modifikationen wurde beschrieben, die die Chemie des Phosphodiesterrückgrates, der Zucker oder der heterocyclischen Basen verhindert.
  • Unter den vollen Veränderungen in der Rückgratchemie sind Phosphorthioate; Phosphorodithioate, wo beide der nicht-verbrückenden Sauerstoffe mit Schwefel substituiert sind; Phosphoramidite; Alkylphosphotriester und Boranophosphate. Achirale Phosphatderivate schließen 3'-O-5'-S-Phosphorthioat, 3'-S-5'-O-Phosphorthioat, 3'-CH2-5'-O-Phosphonat und 3'-NH-5'-O-Phosphoramidat ein. Peptidnukleinsäuren ersetzen das gesamte Phosphodiesterrückgrat mit einer Peptidverknüpfung.
  • Zuckermodifizierungen werden auch verwendet, um die Stabilität oder Affinität zu verbessern. Das α-Anomer der Desoxyribose kann verwendet werden, wo die Base invertiert ist im Hinblick auf das natürliche β-Anomer. Das 2'-OH des Ribosezuckers kann verändert werden, um 2'-O-Methyl- oder 2'-O-Allylzucker auszubilden, was Resistenz gegen den Abbau verleiht, ohne die Affinität zu beeinträchtigen. Die Modifikation der heterocyclischen Basen muss die richtige Basenpaarbildung aufrechterhalten. Einige bedeutsame Substitutionen schließen Desoxyuridin für Desoxythymidin; 5-Methyl-2'-Desoxycytidin und 5-Bromo-2'-Desoxycytidin für Desoxycytidin ein. 5-Propinyl-2'-Desoxyuridin und 5-Propinyl-2'-Desoxycytidin konnten als die Affinität und die biologische Aktivität verbessernd gezeigt werden, wenn sie Desoxythymidin bzw. Desoxycytidin substituierten.
  • Die Bezeichnung "Polypeptid" und "Protein" wie hier austauschbar verwendet betrifft eine polymerische Form von Aminosäuren jeglicher Länge, welche kodierte und nicht-kodierte Aminosäuren einschließen, chemisch oder biochemisch modifizierte oder derivatisierte Aminosäuren und Polypeptide, die modifizierte Peptidrückgrate (backbones) aufweisen. Die Bezeichnung schließt Fusionsproteine ein, einschließend, jedoch nicht limitiert auf Fusionsproteine mit einer heterologen Aminosäuresequenz, Fusionen mit heterologen oder homologen Leadersequenzen, mit oder ohne N-terminale Methioninreste; immunologisch getagte Proteine und dergleichen ein.
  • Eine "Wirtszelle" wie hier verwendet bezeichnet Mikroorganismen oder eukaryontische Zellen oder Zellinien kultiviert als unizelluläre Entitäten, welche verwendet werden können als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere Transferpolynukleotide oder entsprechend verwendet worden sind und schließend die Nachkommen der originalen Zelle, welche transfiziert wurde, ein. Es versteht sich, dass die Nachkommen einer einzelnen Zelle nicht notwendigerweise vollständig identisch in ihrer Morphologie oder in genomischem oder gesamtem DNA-Komplement mit der originalen Elternzelle sein müssen, und zwar auf Grund von natürlicher, zufälliger oder gewünschter Mutation. Eine "rekombinante Wirtszelle" ist eine Wirtszelle, in welche ein gewünschtes Nukleinsäuremolekül oder ein gewünschter rekombinanter Vektor eingebracht worden ist.
  • Durch "Transformation" ist eine permanente oder vorübergehende genetische Veränderung induziert in einer Zelle gefolgt vom Einbringen einer neuen DNA (d.h. DNA-exogen zu der Zelle) gemeint. Genetische Veränderung kann entweder durch Einbringen der neuen DNA in das Genom der Wirtszelle oder durch vorübergehende oder stabiler Erhaltung der neuen DNA als ein episomales Element realisiert werden. Wenn die Zelle eine eukaryontische Zelle ist wird eine permanente genetische Veränderung im Allgemeinen durch Einbringen der DNA in das Genom der Zelle erreicht.
  • Bevor die vorliegende Erfindung weiter beschrieben wird, sollte es sich verstehen, dass diese Erfindung nicht limitiert auf besondere Ausführungsformen, wie sie beschrieben werden, ist, da diese selbstverständlich variieren können. Es sollte sich auch verstehen, dass die hier verwendete Terminologie nur zum Zwecke der Beschreibung spezieller Ausführungsformen dient und nicht limitierend gedacht ist, da der Umfang der Erfindung nur durch die angefügten Ansprüche limitiert sein wird.
  • Wo ein Bereich von Werten bereitgestellt wird, versteht es sich, dass jeder dazwischenliegende Wert, auf das Zehntel der Einheit der unteren Grenze, solange der Kontext nicht klar etwas anderes vorschreibt, zwischen der oberen und unteren Grenze des Bereichs, sowie jeder angegebene oder dazwischenliegende Wert im angegebenen Bereich innerhalb der Erfindung eingeschlossen ist. Die oberen und unteren Grenzen dieser kleineren Bereiche können unabhängig voneinander in den kleineren Bereichen eingeschlossen sein und sind auch innerhalb der Erfindung umfasst, unter Vorbehalt irgendwelcher speziell ausgeschlossener Grenzen im genannten Bereich. Wo der genannte Bereich eine oder beide der Grenzen einschließt, sind Bereiche die eine von beiden dieser eingeschlossenen Grenzen ausschließen, auch in der Erfindung eingeschlossen.
  • Solang nicht anderweitig definiert ist, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, die üblicherweise vom Fachmann auf dem Gebiet, zu welchem die Erfindung gehört, verstanden wird. Obwohl jegliche Verfahren und Materialien, die ähnlich oder gleichwertig zu denjenigen wie hier beschrieben sind, auch in der Praxis oder zum Test der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nun beschrieben. Alle Publikationen, die hier erwähnt werden, sind durch Verweis hierin eingeschlossen, um die Verfahren und/oder Materialien zu beschreiben in deren Zusammenhang die Publikationen zitiert werden.
  • Es sollte festgehalten werden, dass wie hier verwendet in den beigefügten Ansprüchen die Singularformen "ein", "und" und "der/die" plurale Bezüge einschließen, solange der Kontext nicht klar das Gegenteil angibt. Folglich schließt die Bezeichnung "ein pestizidales Agens" eine Vielzahl solcher Agenzien ein, und der Verweis auf "den Neurokinin- Rezeptor" schließt den Verweis auf einen oder mehrere solcher Rezeptoren und Äquivalente davon, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, ein usw.
  • Die hier diskutierten Publikationen werden alleine hinsichtlich ihrer Offenbarung vor dem Anmeldetag der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. Nichts hier soll als Zugeständnis konstruiert werden, dass die vorliegende Erfindung nicht berechtigt ist, einer solchen Publikation Kraft der früheren Erfindung vorauszugehen. Des Weiteren können die Daten der bereitgestellten Publikation verschieden von den aktuellen Publikationsdaten sein, welche der unabhängigen Bestätigung bedürfen können.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Eine cDNA kodierend für einen Volllängen- offenen- Leserahmen eines Neurokinin-Rezeptors wurde aus einer Heliothis virescens cDNA-Bibliothek und aus einer Spodoptera frugiperda-Bibliothek amplifiziert, und beide cDNAs wurden zur Gänze sequenziert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die insektischen Nukleinsäure- und Proteinzusammensetzungen des Neurokinin-Rezeptors bereit, wie auch Verfahren zum Identifizieren von Agenzien, welche den Spiegel der insektischen Neurokinin-Rezeptor mRNA, des Proteins oder den Grad der Neurokinin-Rezeptoraktivität modulieren.
  • ISOLIERTE NUKLEINSÄUREMOLEKÜLE DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt isolierte insektische Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung umfassend Nukleotidsequenzen des insektischen Neurokinin-Rezeptors (hier auch als "Tachykinin-Rezeptor", "NKD" oder "TKR" bezeichnet), insbesondere Nukleinsäuresequenzen von Lepidoptera NKD und mehr speziell Nukleinsäuresequenzen von Heliothis virescens NKD und Nukleinsäuresequenzen von Spodoptera frugiperda, sowie Verfahren zur Verwendung dieser Nukleinsäuremoleküle.
  • Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung, welche Nukleotidsequenzen umfassen, die insektische Proteine, welche potentielle Pestizidtargets darstellen, kodieren. Die isolierten Nukleinsäuremoleküle weisen eine Vielzahl von Verwendungen auf, beispielsweise als Hybridisierungssonden, beispielsweise zur Identi fizierung von Nukleinsäuremolekülen, welche Nukleotidsequenzidentität teilen; in Expressionsvektoren, um die Polypeptide, welche durch die Nukleinsäuremoleküle kodiert werden, herzustellen; und um eine Wirtszelle oder ein Tier zur Anwendung in Assays, wie hier unten beschrieben, zu modifizieren.
  • Die Bezeichnung "isolierte Nukleinsäuresequenz" wie hier verwendet schließt das reverse Komplement, das RNA-Äquivalent, einzel- oder doppelsträngige DNA- oder RNA-Sequenzen und DNA/RNA-Hybride der Sequenzen, die beschrieben werden, ein, solange nichts anderes angegeben wird.
  • 1 und 2 stellen die Nukleotid- (SEQ ID NO:01) und Aminosäure- (SEQ ID NO:02) Sequenzen jeweils eines NKDs von Heliothis virescens dar.
  • 3 und 4 stellen die Nukleotid- (SEQ ID NO:03) bzw. Aminosäure- (SEQ ID NO:04) Sequenzen eines NKD von Spodoptera frugiperda dar.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst ein insektisches NKD-Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die zumindest ungefähr 50 %, zumindest ungefähr 60 %, zumindest ungefähr 65 %, zumindest ungefähr 70 %, zumindest ungefähr 75 %, zumindest ungefähr 80 %, zumindest ungefähr 85 %, zumindest ungefähr 90 %, zumindest ungefähr 95 %, zumindest ungefähr 97 %, zumindest ungefähr 98 %, zumindest ungefähr 99 % oder mehr Nukleotidsequenz-Identität mit der Sequenz wie in SEQ ID NO:01 oder SED ID NO:03 dargestellt aufweist. In einigen Ausführungsformen umfasst ein insektisches NKD-Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die zumindest ungefähr 50 %, zumindest ungefähr 60 %, zumindest ungefähr 65 %, zumindest ungefähr 70 %, zumindest ungefähr 75 %, zumindest ungefähr 80 %, zumindest ungefähr 85 %, zumindest ungefähr 90 %, zumindest ungefähr 95 %, zumindest ungefähr 97 %, zumindest ungefähr 98 %, zumindest ungefähr 99 % oder mehr Nukleotidsequenz-Identität mit der Sequenz, wie in dem offenen Leserahmen von SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 dargestellt, aufweist. In anderen Ausführungsformen umfasst ein insektisches NKD-Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz mit der Sequenz wie in SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 dargestellt.
  • In anderen Ausführungsformen umfasst ein insektisches NKD-Nukleinsäuremolekül ein Fragment von zumindest ungefähr 18, zumindest ungefähr 25, zumindest ungefähr 30, zumindest ungefähr 35, zumindest ungefähr 40, zumindest ungefähr 50, zumindest ungefähr 75, zumindest ungefähr 100, zumindest ungefähr 125, zumindest ungefähr 150, zumindest ungefähr 200, zumindest ungefähr 250, zumindest ungefähr 300, zumindest ungefähr 350, zumindest ungefähr 400, zumindest ungefähr 450, zumindest ungefähr 500, zumindest ungefähr 550, zumindest ungefähr 600, zumindest ungefähr 650, zumindest ungefähr 700, zumindest ungefähr 750, zumindest ungefähr 800, zumindest ungefähr 850, zumindest ungefähr 900, zumindest ungefähr 950, zumindest ungefähr 1000, zumindest ungefähr 1100, zumindest ungefähr 1200 zusammenhängenden Nukleotiden von Nukleotiden der Sequenz wie in SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 dargestellt.
  • In anderen Ausführungsformen umfasst ein insektisches NKD-Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz kodierend für ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zumindest ungefähr 60 %, zumindest ungefähr 65 %, zumindest ungefähr 70 %, zumindest ungefähr 75 %, zumindest ungefähr 80 %, zumindest ungefähr 85 %, zumindest ungefähr 90 % oder zumindest ungefähr 95 % Aminosäuresequenz-Identität mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04 dargestellt aufweist. In einigen Ausführungsformen umfasst ein insektisches NKD-Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das die Sequenz in SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04 dargestellt umfasst. In vielen dieser Ausführungsformen weist das kodierte Polypeptid NKD-Aktivität auf.
  • In anderen Ausführungsformen umfasst ein insektisches NKD-Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das ein Fragment von zumindest ungefähr 6, zumindest ungefähr 10, zumindest ungefähr 15, zumindest ungefähr 20, zumindest ungefähr 25, zumindest ungefähr 30, zumindest ungefähr 40, zumindest ungefähr 50, zumindest ungefähr 75, zumindest ungefähr 100, zumindest ungefähr 125, zumindest ungefähr 150, zumindest ungefähr 175, zumindest ungefähr 200, zumindest ungefähr 225, zumindest ungefähr 250, zumindest ungefähr 275, zumindest ungefähr 300, zumindest ungefähr 350 oder zumindest ungefähr 390 zusammenhängenden Aminosäuren der Sequenz wie in SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04, bis zur gesamten Länge der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04 dargestellt ist. In vielen dieser Ausführungsformen weist das kodierte Polypeptid NKD-Aktivität auf.
  • Fragmente der zentralen Nukleinsäuremoleküle können für eine Reihe von Zwecken verwendet werden. Die interferierenden RNA (RNAi) Fragmente, insbesondere doppelsträngige (ds) RNAi, können verwendet werden, um Phänotypen mit Verlust der Funktion zu erzeugen oder, um Biopestizide zu formulieren (wie unten weiter diskutiert). Die zentralen Nukleinsäurefragmente sind auch verwendbar als Nukleinsäure-Hybridisierungssonden und Replikations/Amplifikationsprimer. Bestimmte "antisense" Fragmente, d.h. solche die reverse Komplemente von Teilen der kodierenden Sequenz von SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 sind, sind einsetzbar zur Inhibierung der Funktion eines zentralen Proteins. Die Fragmente sind von einer Länge, welche hinreichend ist, um spezifisch mit einem Nukleinsäuremolekül zu hybridisieren, das die Sequenz wie in SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 dargestellt, aufweist. Die Fragmente bestehen aus oder umfassen zumindest 12, zumindest 24, zumindest 36 oder zumindest 96 zusammenhängenden Nukleotiden von SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03. Wenn die Fragmente von anderen Nukleinsäuresequenzen flankiert werden, ist die gesamte Länge der kombinierten Nukleinsäuresequenz weniger als 15 kb, weniger als 10 kb, weniger als 5 kb oder weniger als 2 kb.
  • Die zentralen Nukleinsäuresequenzen können einzig aus SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 oder aus Fragmenten davon bestehen. Alternativ können die zentralen Nukleinsäuresequenzen und Fragmente davon mit anderen Komponenten verknüpft sein, wie z.B. Labeln, Peptiden, Agenzien, welche den Transport über Zellmembranen hinweg ermöglichen, hybridisierungs-getriggerten Spaltungsagenzien oder interkalierenden Agenzien. Die zentralen Nukleinsäuresequenzen und Fragmente davon können auch an andere Nukleinsäuresequenzen geknüpft sein (d.h. sie können Teil von größeren Sequenzen sein) und bestehen aus synthetischen/nicht-natürlichen Sequenzen und/oder sind isoliert und/oder sind aufgereinigt, d.h. nicht mehr in Begleitung von zumindest einigen der Materialien, mit welchen sie in ihrer natürlichen Umgebung assoziiert sind. Im Allgemeinen konstituieren die isolierten Nukleinsäuren zumindest ungefähr 0,5 % oder zumindest ungefähr 5 % bezogen auf das Gewicht der gesamten Nukleinsäure, die in einer gegebenen Fraktion vorliegt und sind üblicherweise rekombinant, d.h. dass sie eine nicht-natürliche Sequenz oder eine natürliche Sequenz gebunden an Nukleotid(e) umfassen, welche verschieden sind zu denjenigen, welche daran auf einem natürlichen Chromosom gebunden sind.
  • Derivate von Nukleinsäuremolekülen der zentralen Nukleinsäuremoleküle schließen Sequenzen ein, welche an die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 hybridisieren, oder an Nukleinsäuremoleküle, die den offenen Leserahmen von SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 enthalten, und zwar unter stringenten Bedingungen, so dass das Nukleinsäure-Hybridisierungsderivat mit der zentralen Nukleinsäure durch einen bestimmten Grad an Sequenzidentität in Beziehung steht. Ein Nukleinsäuremolekül ist "hybridisierbar" an ein anderes Nukleinsäuremolekül, wie z.B. eine cDNA, eine genomische DNA, oder RNA, wenn eine einzelsträngige Form des Nukleinsäuremoleküls an das andere Nukleinsäuremolekül annelieren kann. Die Stringenz der Hybridisierung bezieht sich auf die Bedingungen, unter welchen Nukleinsäuren hybridisierbar sind. Der Grad der Stringenz kann durch Temperatur, Ionenstärke, pH und die Gegenwart von denaturierenden Agenzien, wie z.B. Formamid, während der Hybridisierung und des Waschens kontrolliert werden. Wie hier verwendet stehen unter der Bezeichnung "stringente Hybridisierungsbedingungen" diejenigen, die normalerweise vom Fachmann auf dem Gebiet verwendet werden, um zumindest 90 % Sequenzidentität zwischen den komplementären Stücken von DNA oder DNA und RNA zu erzielen. "Moderat stringente Hybridisierungsbedingungen" werden verwendet, um Derivate zu finden, die zumindest 70 % Sequenzidentität aufweisen. Schließlich werden "niedrig-stringente Hybridisierungsbedingungen" verwendet, um Derivate von Nukleinsäuremolekülen zu isolieren, die zumindest ungefähr 50 % Identität mit der zentralen Nukleinsäuresequenz teilen.
  • Die ultimative Hybridisierungsstringenz reflektiert sowohl die aktuellen Hybridisierungsbedingungen wie auch die Waschbedingungen, die auf die Hybridisierung folgen, und es ist im Stand der Technik wohlbekannt, wie die Bedingungen variiert werden müssen, um die gewünschten Resultate zu erhalten. Bedingungen, die üblicherweise verwendet werden, sind in fertig verfügbaren Prozedurtexten dargestellt (beispielsweise Current Protocol in Molecular Biology, Vol. 1, Chap. 2.10, John Wiley & Sons, Publishers (1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989)). In einigen Ausführungsformen ist ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung in der Lage an ein Nukleinsäuremolekül zu hybridisieren, das eine Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO:01 enthält oder in SEQ ID NO:03 dargestellt und zwar unter stringenten Bedingungen, welche fol gendes umfassen: Prähybridisierung von Filtern enthaltend Nukleinsäure für 8 Stunden bis über Nacht bei 65°C in einer Lösung umfassend 6X einfach starkes Citrat (SSC, single strength citrate) (1X SSC ist 0,15 M NaCl, 0,015 M Na Citrat; pH 7,0), 5X Denhardts Lösung, 0,05 % Natriumpyrophosphat und 100 μg/ml Herringsspermien DNA; Hybridisierung für 18–20 Stunden bei 65°C in einer Lösung enthaltend 6X SSC, 1X Denhardt's Lösung, 100 μg/ml Hefe tRNA und 0,05 % Natriumpyrophosphat; und Waschen der Filter bei 65°C für 1 h in einer Lösung enthaltend 0,2X SSC und 0,1 % SDS (sodium dodecyl sulfat, Natriumdodecylsulfat).
  • Nukleinsäurederivatsequenzen, die zumindest ungefähr 70 % Identität mit SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 aufweisen, sind in der Lage, mit einem Nukleinsäuremolekül zu hybridisieren, das eine Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 dargestellt enthält, zu hybridisieren und zwar unter moderat-stringenten Bedingungen die folgendes umfassen: Vorbehandlung der Filter enthaltend Nukleinsäure für 6 h bei 40°C in einer Lösung enthaltend 35 % Formamid, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1 % PVP, 0,1 % Ficoll, 1 % BSA und 500 μg/ml denaturierte Lachsspermien DNA; Hybridisierung für 18–20 h bei 40°C in einer Lösung enthaltend 35 % Formamid, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,02 % PVP, 0,02 Ficoll, 0,2 % BSA, 100 μg/ml Lachsspermien DNA und 10 % (Gewicht/Volumen) Dextransulfat; gefolgt von zweimaligem Waschen für 1 Stunde bei 55°C in einer Lösung enthaltend 2X SSC und 0,1 % SDS.
  • Andere exemplarische Derivatnukleinsäuresequenzen sind in der Lage, an SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 unter niedrigstringenten Bedingungen zu hybridisieren, welche folgendes umfassen: Inkubierung für 8 Stunden bis über Nacht bei 37°C in einer Lösung umfassend 20 % Formamid, 5 × SSC, 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5X Denhardt's Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 μg/ml gescherte Lachsspermien DNA; Hybridisierung in dem gleichen Puffer für 18 bis 20 Stunden; Waschen der Filter in 1 × SSC bei ungefähr 37°C für 1 Stunde.
  • Wie hier verwendet ist die "prozentuale (%) Nukleinsäuresequenz-Identität" im Hinblick auf eine zentrale Sequenz oder einen speziellen Teil einer zentralen Sequenz definiert als die Prozentzahl der Nukleotide der in Frage kommenden Nukleinsäurederivat-Sequenz, die identisch mit den Nukleotiden der zentralen Sequenz (oder eines speziel len Teils davon) ist, und zwar nach Abgleich der beiden Sequenzen und der Einführung von Lücken, falls notwendig, um die maximale prozentuale Sequenzidentität zu erzielen wie sie durch das Programm WU-BLAST-2.0a19 (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1997) 215:403–410; httpa/blast.wustl.edu/blast/README.html; hier im Allgemeinen als "BLAST" bezeichnet) erzeugt werden, mit all den variablen Parametern gesetzt auf Default-Werte. Die HSP S- und HSP S2-Parameter sind dynamische Werte und werden durch das Programm selbst je nach der der Zusammensetzung der speziellen Sequenz und der Zusammensetzung der speziellen Datenbank, gegen welche die Sequenz von Interesse gesucht wird, etabliert. Ein prozentualer (%) Wert für die Nukleinsäuresequenzidentität wird durch die Zahl der übereinstimmenden identischen Nukleotide dividiert durch die Sequenzlänge, für welche die prozentuale Identität festgehalten wird, bestimmt.
  • In einer exemplarischen Ausführungsform kodiert das Derivat der Nukleinsäure für ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04 umfasst oder für ein Fragment oder Derivat davon, wie es des weiteren unten beschrieben wird. Ein Derivat eines zentralen Nukleinsäuremoleküls oder Fragments davon kann 100 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 umfassen, kann aber ein Derivat in dem Sinn sein, dass es eine oder mehrere Modifizierungen an der Basen- oder Zuckergruppe oder dem Phosphatrückgrat aufweist. Beispiele von Modifikationen sind im Stand der Technik wohlbekannt (Bailey, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1998), 6th ed. Wiley and Sons). Solche Derivate können verwendet werden, um modifizierte Stabilität oder irgendeine andere gewünschte Eigenschaft zu verleihen.
  • Wie hier verwendet schließt eine "Derivat" einer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz orthologe Sequenzen von SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 und SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04 ein, die von anderen Spezies erhalten wurden. In einigen Ausführungsformen ist das Ortholog aus einer Heliothin-Spezies, beispielsweise von Heliocoverpa armigera und Heliothis zea, welche zusammen mit Heliothis virescens drei der hauptsächlichen weltweiten Getreideschädlinge sind. Orthologe Gene von diesen drei Spezies sind extrem ähnlich. (The International Meeting on Genomics of Lepidoptera, Lyon, France August 16–17, 2001; "International Lepidopteran Genome Project Pro posal", Rev. September 10, 2001; available at world wide web site ab.a.u-tokyo.ac.jp/lep-genome/.)
  • In einem anderen Beispiel kann es gewünscht sein, ein pestizidales Agens zu entwickeln, welches spezifisch eine nicht-Heliothin-Insekten-Spezies zum Ziel hat. In solch einem Fall kann es am effizientesten sein, biochemische Screening-Assays entwickeln (d.h. Assays konzipiert, um Moleküle zu identifizieren, welche das Proteintarget wie hier im Folgenden weiter beschrieben, zu inhibieren) welche das orthologe Protein von diesem Insekt verwenden. Während die Orthologen in zwei Spezies die essentiell gleichen Funktionen aufweisen können, können Unterschiede in ihrer Proteinstruktur Eigenschaften, wie z.B. Interaktion mit anderen Proteinen, Verbindungs-Bindung und Stabilität beeinflussen. Daher sind die Ergebnisse von biochemischen Assays am bedeutendsten für das spezifische Protein, das im Assay verwendet wird. Wie hier verwendet schließen Orthologe Nukleinsäuren- und Polypeptidsequenzen ein.
  • Verfahren zum Identifizieren der Orthologen in anderen Spezies sind im Stand der Technik bekannt. Üblicherweise bewahren Orthologen in verschiedenen Spezies die gleiche Funktion aufgrund der Gegenwart von einem oder mehr Proteinmotiven und/oder dreidimensionalen Strukturen. In der Evolution, wenn ein Genverdoppelungsereignis auf eine Speziation folgt, kann ein einzelnes Gen in einer Spezies, wie z.B. Heliothis zu mehren Genen (Paralogen) in einer anderen korrespondieren. Wie hier verwendet schließt die Bezeichnung "Orthologe" Paraloge mit ein. Wenn Sequenzdaten für eine spezielle Spezies verfügbar sind, werden Orthologe allgemein durch Sequenzhomologieanalyse identifiziert, wie z.B. durch BLAST-Analyse, unter Verwendung von Proteinködersequenzen. Sequenzen werden als ein potenzielles Ortholog bestätigt, wenn die am besten passende Sequenz vom vorwärtsgerichteten BLAST-Ergebnis die Originalsequenz im rückwärtsgerichteten BLAST wiederfindet (Huynen MA and Bork P, Proc Natl Acad Sci (1998) 95:5849–5856; Huynen MA et al., Genome Research (2000) 10:1204–1210). Programme für multiplen Sequenzabgleich wie z.B. CLUSTAL-W (Thompson JD et al., 1994, Nucleic Acids Res 22:4673–4680) können verwendet werden, um konservierte Regionen und/oder Reste von orthologen Proteinen hervorzuheben, und um phylogenetische Stammbäume zu erzeugen. In einem phylogenetischen Stammbaum, welcher viele homologe Sequenzen von verschiedenen Spezies repräsentiert (beispielsweise wiedergefunden durch BLAST-Analyse), erscheinen orthologe Se quenzen von zwei Spezies generell am nächsten zueinander auf dem Stammbaum im Hinblick auf alle anderen Sequenzen von diesen zwei Spezies.
  • Strukturelle Windungen oder andere Analysen der Proteinfaltung (z.B. unter Verwendung von Software von ProCeryon, Biosciences, Salzburg, Austria) können auch potenzielle Orthologe identifizieren. Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahren können auch verwendet werden, um orthologe Gene aufzufinden, beispielsweise wenn Sequenzdaten nicht verfügbar sind. Degenerierte PCR und Screening von cDNA- oder genomischen DNA-Bibliotheken sind allgemeine Verfahren zum Auffinden verwandter Gensequenzen und sind im Stand der Technik wohlbekannt (siehe beispielsweise Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989; Dieffenbach C und Dveksler G (Eds.) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989). Beispielsweise werden Verfahren zum Erzeugen einer cDNA-Bibliothek aus einer Insektenspezies von Interesse und das Absuchen der Bibliothek mit partiell homologen Gensonden in Sambrook et al. beschrieben. Ein hoch konservierter Teil der Heliothis NKD-kodierenden Sequenz kann als eine Sonde verwendet werden. NKD orthologe Nukleinsäuren können an die Nukleinsäure von SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 unter hoch, moderat oder niedrig stringenten Bedingungen hybridisieren.
  • Nach Amplifikation oder Isolierung eines Segments eines putativen Orthologen kann das Segment durch Standardtechniken kloniert und sequenziert werden und als eine Sonde verwendet werden, um einen vollständigen cDNA- oder genomischen Klon zu isolieren. Alternativ ist es möglich, ein EST-Projekt zu initiieren, um eine Datenbank von Sequenzinformation für die Spezies von Interesse zu erzeugen. In anderen Ansätzen werden Antikörper, welche spezifisch bekannte NKD-Polypeptide binden, zur Isolierung von Orthologen verwendet (Harlow E and Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, New York; Harlow E and Lane D, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, New York).
  • Western Blot-Analysen können bestimmen, dass ein NKD-Ortholog (d.h. ein orthologes Protein) in einem Rohextrakt eines Gewebes einer speziellen Spezies vorliegt. Wenn die Reaktivität untersucht wird, kann die Sequenz, welche das in Frage kommende Ortholog kodiert, durch Screening von Expressionsbibliotheken, welche die spezielle Spezies repräsentieren, isoliert werden. Expressionsbibliotheken können konstruiert werden in einer Vielzahl von kommerziell verfügbaren Vektoren, einschließlich Lambda gt11, wie beschrieben in Sambrook et al. Sobald das/die in Frage kommende(n) Orthologe(n) durch irgendeines dieser Mittel identifiziert worden ist/sind, wird die in Frage kommende Orthologsequenz als Köder (die "Abfrage") für die rückwärtsgerichtete BLAST gegen die Sequenz von Heliothis oder einer anderen Spezies verwendet, in welcher NKD-Nukleinsäure- und/oder Polypeptidsequenzen identifiziert wurden.
  • Isolierung, Produktion und Expression der zentralen Nukleinsäuremoleküle Die zentralen Nukleinsäuremoleküle, Fragmente oder Derivate davon können aus einer geeigneten cDNA-Bibliothek erhalten werden, die von irgendeiner geeigneten Insektenspezies präpariert wurde (einschließlich, jedoch nicht limitiert auf Drosophila, Heliothis und Spodoptera). In vielen Ausführungsformen wird eine Lepidoptera-Spezies verwendet, z.B. eine Heliothin-Spezies. Wo das zentrale Nukleinsäuremolekül aus einer Heliothin-Spezies isoliert wird, kann irgendeiner einer Vielzahl von Feld- und Laborsträngen der verschiedenen Heliothis-Spezies verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht limitiert auf einer Heliothis virescens, Heliothis maritima, Heliothis ononis, Heliothis peltigera, Heliothis phloxiphaga, Helicoverpa punctigera, Heliothis subflexa, Helicoverpa armigera und Helicoverpa zea.
  • Eine Expressionsbibliothek kann unter Verwendung bekannter Verfahren konstruiert werden. Beispielsweise kann mRNA isoliert werden, um cDNA, welche in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert ist, zur Expression in einer Wirtszelle, in welche sie eingebracht werden soll, zu erzeugen. Verschiedene Screening-Assays können verwendet werden, um das Gen oder Genprodukt auszuwählen (beispielsweise Oligonukleotide von zumindest ungefähr 20 bis 80 Basen konzipiert, um das gewünschte Gen zu identifizieren oder gelabelte Antikörper, welche spezifisch an das Genprodukt binden). Das Gen und/oder Genprodukt kann dann aus der Wirtszelle unter Verwendung bekannter Techniken wiedergewonnen werden.
  • Eine polymerase Kettenreaktion (PCR) kann auch verwendet werden, um ein zentrales Nukleinsäuremolekül zu isolieren, wo Oligonukleotidprimer, die fragmentarische Sequenzen von Interesse repräsentieren, RNA- oder DNA-Sequenzen aus einer Quelle, beispielsweise einer genomischen oder cDNA-Bibliothek amplifizieren (wie beschrieben in Sambrook et al., supra). Darüber hinaus können degenerierte Primer zum Amplifizieren von Homologen von irgendeiner Spezies von Interesse verwendet werden. Sobald ein PCR-Produkt einer geeigneten Größe und Sequenz erhalten wurde, kann es durch Standardtechniken kloniert und sequenziert werden und als eine Sonde verwendet werden, um eine komplette cDNA oder einen genomischen Klon zu isolieren.
  • Fragmentarische Sequenzen der zentralen Nukleinsäuremoleküle und Derivate davon können unter Verwendung bekannter Verfahren synthetisiert werden. Beispielsweise können Oligonukleotide unter Verwendung eines automatisierten DNA-Syntheseautomaten verfügbar von kommerziellen Betreibern (beispielsweise Biosearch, Novato, CA; Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert werden. Antisense-RNA-Sequenzen können intrazellulär durch Transkription einer exogenen Sequenz produziert werden, beispielsweise aus Vektoren, die gewünschte Antisense-Nukleinsäuresequenzen enthalten. Neu erzeugte Sequenzen können unter Verwendung von Standardverfahren identifiziert und isoliert werden.
  • Ein isoliertes zentrales Nukleinsäuremolekül kann in irgendeinen geeigneten Klonierungsvektor eingebracht werden, beispielsweise in Bakteriophage, z.B. Lambda-Derivate, oder Plasmide wie z.B. pBR322, pUC-Plasmidderivate und den Bluescript-Vektor (Stratagene, San Diego, CA). Rekombinante Moleküle können in Wirtszellen via Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation, etc. eingebracht werden oder in transgene Tiere, wie z.B. eine Fliege. Die transformierten Zellen können kultiviert werden, um große Mengen der gewünschten Nukleinsäure zu erzeugen. Geeignete Verfahren zum Isolieren und Produzieren der gewünschten Nukleinsäuresequenzen sind im Stand der Technik wohlbekannt (Sambrook et al., supra; DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. 1, 2, 3, 4 (1995) Glover, ed., MRL Press, Ltd., Oxford, U.K.).
  • Die Nukleotidsequenz, die ein gewünschtes Protein oder Fragment oder Derivat davon kodiert, kann in irgendeinen Expressionsvektor geeignet für die Transkription und Translation der eingebrachten Protein-kodierenden Sequenz eingebracht werden. Alternativ können die notwendigen transkriptionellen und translatorischen Signale durch das natürliche zentrale Gen und/oder dessen flankierende Regionen zugeführt werden. Eine Vielzahl von Wirtsvektorsystemen kann verwendet werden, um die Proteinkodierende Sequenz zu exprimieren (beispielsweise Säugetierzellensysteme infiziert mit Virus (beispielsweise Vakzinavirus, Adenovirus, etc.); Insektenzellensysteme infiziert mit Virus (beispielsweise Baculovirus); Mikroorganismen, wie z.B. Hefe enthaltend Hefevektoren, oder Bakterien transformiert mit Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA. Die Expression eines zentralen Proteins kann durch ein geeignetes Promotor/Enhancer-Element gesteuert werden. Darüber hinaus kann ein Wirtszellstrang ausgewählt werden, der die Expression der eingefügten Sequenz moduliert, oder modifiziert und das Genprodukt in der speziell gewünschten Art und Weise prozessiert. Exemplarische Wirtszellen schließen E. coli, Lepidoptera Sf-9- oder S-21-Zellen und Drosophila S2-Zellen ein.
  • Um die Expression eines gewünschten Genproduktes zu detektieren, kann der Expressionsvektor einen Promotor umfassen, der operativ in ein gewünschtes Nukleinsäuremolekül geknüpft ist, einen oder mehrere Replikationsursprünge und einen oder mehrere selektierbare Marker (beispielsweise Thymidin-Kinase-Aktivität, Resistenz gegen Antibiotika etc.). Alternativ können rekombinante Expressionsvektoren durch Prüfen auf die Expression eines zentralen Genproduktes basierend auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften eines zentralen Proteins in in vitro-Assaysystemen (beispielsweise Immunoassays) identifiziert werden.
  • Ein zentrales Protein, Fragment oder Derivat kann optional als ein Fusions- oder chimäres Proteinprodukt exprimiert werden (d.h. es ist verknüpft über eine Peptidbindung an eine heterologe Proteinsequenz oder ein anderes, d.h. nicht-NKD Protein): In einer Ausführungsform ist das zentrale Protein exprimiert als ein Fusionsprotein mit einem "tag", welches die Aufreinigung ermöglicht, wie z.B. Glutathion-S-Transferase oder (His)6. Ein chimäres Produkt kann durch Ligation der geeigneten Nukleinsäuresequenzen, die für gewünschte Aminosäuresequenzen kodieren, aneinander hergestellt werden und zwar in dem geeigneten Kodierungsrahmen unter Verwendung von Standardverfahren und durch Expression des chimären Produktes. Ein chimäres Produkt kann auch durch Proteinsynthesetechniken erzeugt werden, beispielsweise durch die Verwendung eines Peptidsyntheseautomaten.
  • Sobald ein rekombinanter Vektor, der ein zentrales Nukleinsäuremolekül exprimiert identifiziert ist, kann das kodierte zentrale Polypeptid isoliert werden und unter Verwendung von Standardverfahren (beispielsweise Ionenaustausch, Affinitäts- und Gel- Ausschluss-Chromatografie; Zentrifugation; differenzielle Löslichkeit; Elektrophorese) aufgereinigt werden. Die Aminosäuresequenz des Proteins kann von der Nukleinsäuresequenz des rekombinanten Nukleinsäuremoleküls abgeleitet werden, das in dem rekombinanten Vektor enthalten ist und kann folglich durch standardchemische Verfahren (Hunkapiller et al., Nature (1984) 310:105–111) synthetisiert werden. Alternativ können native gewünschte Proteine aus natürlichen Quellen aufgereinigt werden durch Standardverfahren (beispielsweise Immunoaffinitätsaufreinigung).
  • REKOMBINANTE VEKTOREN UND WIRTSZELLEN
  • Auch bereitgestellt werden Konstrukte ("rekombinante Vektoren"), die die zentralen Nukleinsäuren eingebracht in einen Vektor enthalten, sowie Wirtszellen umfassend diese Konstrukte. Die zentralen Konstrukte werden für eine Anzahl von verschiedenen Anwendungen, einschließend Vervielfältigung, Proteinproduktion, etc. verwendet. Virale und nicht-virale Vektoren können hergestellt werden und verwendet werden, einschließend Plasmide. Die Wahl des Plasmids wird von dem Typ der Zelle abhängen, in welcher die Vervielfältigung gewünscht wird und dem Zweck der Vervielfältigung. Bestimmte Vektoren sind bedeutsam für die Amplifikation und zum Erzeugen großer Mengen der gewünschten DNA-Sequenz. Andere Vektoren sind geeignet für die Expression in Zellen in Kultur. Noch andere Vektoren sind geeignet zum Transfer und zur Expression in Zellen in einem ganzen Tier. Die Wahl des geeigneten Vektors liegt gut innerhalb des Fachwissens. Viele solcher Vektoren sind kommerziell verfügbar.
  • Um die Konstrukte herzustellen, wird das partielle oder Volllängen-Polynukleotid in einen Vektor eingeführt, typischerweise mit Hilfe von DNA-Ligaseanbindung an eine Restriktionsenzymschnittstelle in dem Vektor. Alternativ kann die gewünschte Nukleotidsequenz durch homologe Rekombination in vivo eingebracht werden. Typischerweise wird diese durch Anbinden homologer Regionen an den Vektor an den Flanken der gewünschten Nukleotidsequenzen erzielt. Regionen der Homologie werden durch Ligation von Oligonukleotiden hinzugefügt oder durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Primern, die beispielsweise sowohl die Region der Homologie als auch einen Abschnitt der gewünschten Nukleotidsequenz umfassen.
  • Ebenfalls bereitgestellt werden Expressionskassetten oder Systeme, die – neben anderen Anwendungen – Anwendung in der Synthese der zentralen Proteine finden. Zur Expression wird das Genprodukt kodiert durch ein Polynukleotid der Erfindung in irgendeinem geeigneten Expressionssystem exprimiert, einschließend beispielsweise bakterielle, Hefe-, Insekten-, Amphibien- und Säugetiersysteme. Geeignete Vektoren und Wirtszellen sind in US-Patent Nr. 5,654,173 beschrieben. In dem Expressionsvektor wird ein NKD-kodierendes Polynukleotid, beispielsweise wie in SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 dargestellt, operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft, die geeignet ist, die gewünschten Expressionseigenschaften zu erhalten. Diese können Promotoren (angebunden entweder an dem 5'-Ende des Sense-Stranges oder an dem 3'-Ende des Antisense-Stranges), Enhancer, Terminatoren, Operatoren, Repressoren und Induktoren einschließen. Die Promotoren können reguliert oder konstitutiv sein. In einigen Situationen kann es wünschenswert sein, konditioniert aktive Promotoren, wie z.B. gewebsspezifische oder Entwicklungsstadien-spezifische Promotoren zu verwenden. Diese werden an die gewünschte Nukleotidsequenz geknüpft unter Verwendung der Techniken beschrieben oben für die Verknüpfung an Vektoren. Irgendwelche Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, können verwendet werden. Mit anderen Worten wird der Expressionsvektor eine transkriptionelle und translatorische Initiationsregion, welche induzierbar oder konstitutiv sein kann, wo die kodierende Region operativ verknüpft unter der transkriptorischen Steuerung der transkriptorischen Initiationsregion ist, und eine transkriptionelle und translatorische Terminationsregion bereitstellen. Diese Steuerungsregionen können natürlich für das zentrale NKD-Gen sein, oder können aus exogenen Quellen abgeleitet sein.
  • Expressionsvektoren haben üblicherweise geeignete Restriktionsschnittstellen lokalisiert in der Nähe der Promotorsequenz, um die Insertion von Nukleinsäuresequenzen, die heterologe Proteine kodieren, zu ermöglichen. Ein selektierbarer Marker, der operativ in dem Expressionswirt ist, kann vorliegen und zwar zur Detektion von Wirtszellen, die den rekombinanten Vektor umfassen. Eine Vielzahl von Markern sind bekannt und können in dem Vektor vorliegen, wobei solche Marker diejenigen einschließen, die antibiotische Resistenz verleihen, beispielsweise Resistenz gegen Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Kanamycin, Neomycin; sowie Marker welche histochemische Detektion ermöglichen, etc. Expressionsvektoren können u.a. für die Produktion der zentralen Pro teine, der zentralen Fusionsproteine, wie oben beschrieben, und in Screening-Assays, wie oben beschrieben, verwendet werden.
  • Expressionskassetten können hergestellt werden, die eine Transkriptionsinitiationsregion umfassen, das Gen oder Fragment davon und eine transkriptionelle Terminationsregion. Von speziellem Interesse ist die Verwendung von Sequenzen, welche die Expression von funktionalen Epitopen oder Domänen ermöglichen, üblicherweise zumindest ungefähr 8 Aminosäuren lang, mehr üblicherweise zumindest ungefähr 15 Aminosäuren lang, bis ungefähr 25 Aminosäuren und bis zum vollständigen offenen Leserahmen des Gens. Nach dem Einbringen der DNA können die Zellen, die das Konstrukt enthalten, mit Hilfe eines selektierbaren Markers ausgewählt werden; die Zellen werden expandiert und dann zur Expression verwendet.
  • Die oben beschriebenen Expressionssysteme können eingesetzt werden mit Prokaryonten oder mit Eukaryonten in Übereinstimmung mit herkömmlichen Wegen, abhängig vom Zweck der Expression. Für die Produktion im großen Maßstab von Proteinen oder zur Verwendung in Screening-Assays, wie hier beschrieben, können ein unizellulärer Organismus, wie z.B. E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Insektenzellen in Kombination mit Baculovirusvektoren oder Zellen von höheren Organismen, wie z.B. Wirbeltieren, beispielsweise COS 7-Zellen, HEK 293, CHO, Xenopus Oocyten, Lepidoptera Sf-9- oder S-21-Zellen, Drosophila S2-Zellen, als Wirtszellen für die Expression verwendet werden. In einigen Situationen ist es wünschenswert das Gen in eukaryontischen Zellen zu exprimieren, wobei das Expressionsprotein von der natürlichen Faltung und posttranslatorischen Modifikationen profitieren wird. Kleine Peptide können auch im Labor synthetisiert werden. Polypeptide, welche Untergruppen der kompletten Proteinsequenz darstellen, können verwendet werden, um Teile des Proteins, die wichtig für die Funktion sind, zu identifizieren und zu untersuchen.
  • Spezielle Expressionssysteme von Interesse schließen von Bakterien, Hefen, Insektenzellen und Säugetierzellen abgeleitete Systeme ein. Repräsentative Systeme von jeder dieser Kategorien werden unten bereitgestellt:
    Bakterien. Expressionssysteme in Bakterien schließen diejenigen ein wie beschrieben in: Chang et al., Nature (1978) 275:615; Goeddel et al., Nature (1979) 281:544; Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057; EP 0 036,776 ; US-Patent Nr. 4,551,433; De-Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80:21–25; und Siebenlist et al., Cell (1980) 20:269.
  • Hefen. Expressionssysteme in Hefen schließen diejenigen ein wie beschrieben in: Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978) 75:1929; Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153:163; Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6:142; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25:141; Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 202:302; Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158:1165; De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154:737; Van den Berg et al., Bio/Technology (1990) 8:135; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25:141; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5:3376; US-Patent Nrn. 4,837,148 und 4,929,555; Beach and Nurse, Nature (1981) 300:706; Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10:380; Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10:49; Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112:284–289; Tilburn et al., Gene (1983) 26:205–221; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81:1470–1474; Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475479; EP 0 244,234 und WO 91/00357.
  • Insektenzellen. Expression von heterologen Genen in Insekten wird erreicht wie beschrieben in: US-Patent Nr. 4,745,051; Friesen et al., "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", in: The Molecular Biology Of Baculoviruses (1986) (W. Doerfler, ed.); EP 0 127,839 ; EP 0 155,476 ; and Vlak et al., J. Gen. Virol. (1988) 69:765–776; Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:177; Carbonell et al., Gene (1988) 73:409; Maeda et al., Nature (1985) 315:592–594; Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8:3129; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:8844; Miyajima et al., Gene (1987) 58:273; und Martin et al., DNA (1988) 7:99. Verschiedene baculovirale Stränge und Varianten und korrespondierende permissive Insektenwirtszellen von Wirten sind beschrieben in: Luckow et al., Bio/Technology (1988) 6:47–55, Miller et al., Generic Engineering (1986) 8:277–279 und Maeda et al., Nature (1985) 315:592–594. Verschiedene Insektenzellen, einschließend Lepidoptera Sf-9-Zellen und S-21-Zellen sowie Drosophila S2-Zellen, wurden ausführlich im Stand der Technik beschrieben. Siehe beispielsweise "Insect Cell Culture Engineering", Goosen, Daugulis und Faulkner, eds. (1993) Marcel Dekker.
  • Säugerzellen. Säugerexpression wird erreicht wie beschrieben in Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4:761, Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1982) 79:6777, Boshart et al., Cell (1985) 41:521 und US-Patent Nr. 4,399,216. Andere Merkmale von Säugerexpression werden realisiert wie beschrieben in Ham and Wallace, Meth. Enz. (1979) 58:44, Barnes and Sato, Anal. Biochem. (1980) 102:255, US-Patent Nrn. 4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655, WO 90/103430, WO 87/00195 und US RE 30,985.
  • Pflanzenzellen. Pflanzenzellkultur wurde klar beschrieben in verschiedenen Publikationen einschließlich beispielsweise Plant Cell Culture: A Practical Approach, (1995) R.A. Dixon und R. A. Gonzales, ed., IRL Press; und US-Patent Nr. 6,069,009.
  • Nach der Herstellung des Expressionsvektors wird der Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle zur Produktion des zentralen Polypeptides eingebracht, d.h. eine Wirtszelle wird transformiert mit dem Expressionsvektor. Das Einbringen des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle wird in irgendeiner günstigen Weise erzielt einschließend, jedoch nicht limitiert auf Calciumphosphatpräzipitation, Elektroporation, Mikroinjektion, die Verwendung von Lipiden (beispielsweise Lipofectin), Infektion und dergleichen.
  • Wenn irgendeine der obengenannten Wirtszellen oder andere geeignete Wirtszellen oder Organismen verwendet werden, um die Polynukleotide oder Nukleinsäuren der Erfindung zu replizieren und/oder exprimieren, liegt die resultierende und replizierte Nukleinsäure, RNA, das exprimierte Protein oder Polypeptid als ein Produkt der Wirtszelle oder des Organismus innerhalb des Umfangs der Erfindung. Das Produkt wird durch irgendein geeignetes Mittel, das im Stand der Technik bekannt ist, wiedergewonnen.
  • Die Erfindung stellt des Weiteren rekombinante Wirtszellen, wie oben beschrieben, zur Verfügung, welche einen zentralen rekombinanten Vektor umfassend ein zentrales NKD-Nukleinsäuremolekül enthalten, beispielsweise als Teil eines rekombinanten Vektors, entweder extrachromosomal oder integriert in das Genom der Wirtszelle. Rekombinante Wirtszellen werden im Allgemeinen isoliert, jedoch können sie auch Teil eines multizellulären Organismus sein, beispielsweise eines transgenen Tiers. Folglich stellt die Erfindung weiter des Weiteren transgene, nicht-menschliche Tiere, speziell Insekten bereit, welche ein zentrales NKD-Nukleinsäuremolekül umfassen.
  • Die zentralen Nukleinsäuremoleküle können verwendet werden, um transgene, nicht-menschliche Tiere oder Pflanzen zu erzeugen, oder ortsspezifische Genmodifikationen in Zelllinien. Transgene Tiere und Pflanzen können durch homologe Rekombination hergestellt werden, wo die endogene Stelle verändert wird. Alternativ wird ein Nukleinsäurekonstrukt zufällig ins Genom integriert. Vektoren zur stabilen Integration schließen Plasmide, Retroviren und andere Tierviren, YACs und dergleichen ein. Transgene Insekten sind bedeutsam für Screening-Assays, wie unten beschrieben wird. Die Transgenese von Insekten wurde beispielsweise beschrieben in "Insect Transgenesis: Methods and Applications" Handler and James, eds. (2000) CRC Press.
  • ISOLIERTE POLYPEPTIDE DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt des Weiteren isolierte Polypeptide bereit, die eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04 oder Fragmente, Varianten oder Derivate (beispielsweise Orthologe) davon umfassen bzw. daraus bestehen. Zusammensetzungen umfassend irgendeines dieser Proteine können essentiell aus einem zentralen Protein, Fragmenten oder Derivaten bestehen oder können weitere Komponenten umfassen (beispielsweise pharmazeutisch akzeptable Carrier oder Arzneistoffträger, Kulturmedien, Carrier verwendet in Pestizidformulierungen, etc.).
  • Ein Derivat eines zentralen Proteins teilt typischerweise einen speziellen Grad der Sequenzidentität oder Sequenzähnlichkeit mit SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04 oder einem Fragment davon. Wie hier verwendet ist die "Prozent (%) Aminosäure-Sequenz-Identität" im Hinblick auf eine zentrale Sequenz, oder einen speziellen Abschnitt einer zentralen Sequenz, definiert als die Prozentzahl von Aminosäuren in der Kandidaten-Derivat-Aminosäuresequenz, die identisch mit den Aminosäuren in der zentralen Sequenz (oder einem speziellen Abschnitt davon) ist, und zwar nach Abgleich der Sequenzen und Einfügen von Lücken, falls notwendig, um die maximale prozentuale Sequenzidentität zu erreichen, wie dies durch BLAST (Altschul et al., supra) unter Verwendung der gleichen Parameter wie oben diskutiert für Derivate von Nukleinsäuresequenzen erzeugt wird. Ein %-Wert für die Aminosäure-Sequenz-Identität wird bestimmt durch die Zahl der passenden identischen Aminosäuresequenzen dividiert durch die Sequenzlänge, für welche die prozentuale Identität angegeben wird.
  • "Prozent (%) Aminosäure-Sequenz-Ähnlichkeit" wird bestimmt durch Durchführung der gleichen Kalkulation wie für die Bestimmung der % Aminosäure-Sequenz-Identität, wobei aber konservative Aminosäuresubstitutionen zusätzlich zu den identischen Aminosäuren in der Berechnung eingeschlossen sind. Eine konservative Aminosäuresequenz ist eine, in welcher eine Aminosäuresequenz anstelle einer anderen Aminosäuresequenz substituiert wird, die ähnliche Eigenschaften aufweist, so dass das Falten oder die Aktivität des Proteins nicht signifikant verändert werden. Aromatische Aminosäuren, die einander substituieren können, sind Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin; austauschbare hydrophobe Aminosäuren sind Leucin, Isoleucin, Methionin und Valin; austauschbare polare Aminosäuren sind Glutamin und Asparagin; austauschbare basische Aminosäuren sind Arginin, Lysin und Histidin; austauschbare saure Aminosäuren sind Asparaginsäure und Glutaminsäure; und austauschbare kleine Aminosäuren sind Alanin, Serin, Threonin, Cystein und Glycin.
  • In einigen Ausführungsformen teilt eine zentrale Proteinvariante oder ein Derivat zumindest ungefähr 70 %, zumindest ungefähr 75 %, zumindest 80 % der Sequenzidentität oder Ähnlichkeit, zumindest 85 %, zumindest 90 %, zumindest ungefähr 95 %, zumindest ungefähr 97 %, zumindest ungefähr 98 % oder zumindest ungefähr 99 % Sequenzidentität oder Ähnlichkeit mit einem zusammenhängenden Abschnitt von zumindest 25 Aminosäuren, zumindest 50 Aminosäuren, zumindest 100 Aminosäuren, zumindest 200 Aminosäuren, zumindest 300 Aminosäuren, zumindest 350 Aminosäuren oder zumindest 375 Aminosäuren und in einigen Fällen mit der gesamten Länge von SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04. In einigen Ausführungsformen umfasst ein Polypeptid der Erfindung eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04 dargestellt.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst ein NKD-Polypeptid der Erfindung ein Fragment von zumindest ungefähr 6, zumindest ungefähr 10, zumindest ungefähr 15, zumindest ungefähr 20, zumindest ungefähr 25, zumindest ungefähr 30, zumindest ungefähr 40, zumindest ungefähr 50, zumindest ungefähr 75, zumindest ungefähr 100, zumindest ungefähr 125, zumindest ungefähr 150, zumindest ungefähr 175, zumindest ungefähr 200, zumindest ungefähr 225, zumindest ungefähr 250, zumindest ungefähr 275, zumindest ungefähr 300, zumindest ungefähr 350 oder zumindest ungefähr 375 zusam menhängenden Aminosäuren der Sequenz dargestellt in SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04, bis hin zur gesamten Länge der Sequenz dargestellt in SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04. In vielen Ausführungsformen weist das NKD-Polypeptid NKD-Calciumionenkanalaktivität auf.
  • Das Fragment oder Derivat eines zentralen Proteins ist vorzugsweise "funktionell aktiv", was bedeutet, dass das zentrale Proteinderivat oder Fragment eine oder mehrere funktionelle Aktivitäten assoziiert mit einem zentralen Volllängen-, Wildtyp-Protein zeigt, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04. Als ein Beispiel kann ein Fragment oder Derivat Antigenizität aufweisen, so dass es in Immunoassays, zur Immunisierung, zur Inhibition der Aktivität eines zentralen Proteins, etc. verwendet werden kann, wie weiter unten in Bezug auf die Erzeugung von Antikörpern gegen zentrale Proteine beschrieben wird. In vielen Ausführungsformen ist ein funktionell aktives Fragment oder Derivat eines zentralen Proteins eines, das eine oder mehrere biologische Aktivitäten assoziiert mit einem zentralen Protein aufzeigt, wie z.B. katalytische Aktivität. Für die hier vorliegenden Zwecke schließen funktionell aktive Fragmente auch diejenigen Fragmente ein, die eine oder mehrere strukturelle Merkmale eines zentralen Proteins zeigen, wie z.B. Transmembran- oder Calciumionenkanaldomänen. Proteindomänen können identifiziert werden unter Verwendung des PFAM-Programms (siehe beispielsweise Bateman A., et al., Nucleic Acids Res, 1999, 27:260–2; and the world wide web at pham.wustl.edu).
  • Die funktionelle Aktivität der zentralen Proteine, Derivate und Fragmente kann durch verschiedene Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, geprüft werden (Current Protocols in Protein Science (1998) Coligan et al., eds. John Wiley & Sons, Inc., Somerset, New Jersey). Enzymatische Assays, wie z.B. die Assays beschrieben in den Beispielen oder eine Variation davon, sind zur Verwendung geeignet. In dem Assay beschrieben in den Beispielen identifiziert der Assay Rezeptor-Antagonisten, welche durch die Abnahme der calciumsensitiven Aequorin-Lumineszenz stimuliert durch das insektische Tachykinin-Agonist-Ppeptid LTTK-II detektiert werden können (beispielsweise ein Peptid umfassend die Sequenz NH2-Gly-Pro-Ser-Gly-Phe-Tyr-Gly-Val-Arg-COOH (SEQ ID NO:05)).
  • Ein nicht-limitierendes Beispiel eines geeigneten Assays ist ein Assay, der auf der Aktivierung von endogenem Sf9 NKD durch ein insektisches Tachykininpeptid LTTK-II basiert, was zum Anstieg des intrazellulären Calciums führt, welches seinerseits an Aequorin bindet und Licht emittiert. Solch ein Assay würde in einigen Ausführungsformen einen primären Screen einschließen, gefolgt von einem validierenden Kontrollscreen-Assay.
  • Der primäre Screenassay involviert zuerst das Expandieren und Aufrechterhalten von Sf9-Zellen, die Neurokinin-Rezeptor und ein rekombinantes calciumsensitives Aequorin-Protein (Sf9AQ11-Zellen) in serumfreier Suspension exprimieren. Der Assay kann gestartet werden durch die Zugabe der Screeningverbindung gefolgt von LTTK-II. Als ein nicht-limitierendes Beispiel eines solchen primären Screenassays werden die folgenden Komponenten zugegeben und zwar in der folgenden Reihenfolge: a) 30 μl einer Lösung enthaltend SF9AQ11-Zellen resuspendiert in H1 (Grace's Medium mit 5 μM Coelenterazin und 30 μM Glutathion); und b) 10 μl einer Lösung enthaltend 80 μM Testverbindung aufgelöst in S5 (Grace's Medium mit 9 mM CaCl2 und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) (w/v)). Die resultierende Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur für 2–5 Minuten inkubiert und das Folgende wird dann zugegeben: 40 μl einer Lösung enthaltend 1X H3 (Grace's Medium mit 9 mM CaCl2, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) (w/v) und 200 nM LTTK-II). Nach einer Verzögerung von 5 Sekunden wird die Lumineszenz des Aequorinsignals für 1 Minuten ausgelesen.
  • Um die Kandidaten-Antagonisten, die in dem primären Screen identifiziert wurden, zu validieren, wird ein Kontrollscreen-Assay durchgeführt, welcher auf einem endogenen GPCR-signalgebenden Pfad in den Sf9AQ-Zellen basiert, die in dem primären Screen verwendet werden. Dieser GPCR-Pfad wird aktiviert durch den Insekten-Peptid-Liganden Crustaceankardioaktivpeptid (CCAP) und resultiert in der Lumineszenz von Aequorin. Als ein nicht-limitierendes Beispiel eines solchen kontrollierenden Screenassays werden die folgenden Komponenten zugegeben und zwar in der folgenden Reihenfolge: a) 30 μl einer Lösung enthaltend SF9AQ11-Zellen resuspendiert in H1 (Grace's Medium mit 5 μM Coelenterazin und 30 μM Glutathion); und b) 10 μl einer Lösung enthaltend 80 μM TESTVERBINDUNG aufgelöst in S5 (Grace's Medium mit 9 mM CaCl2 und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) (w/v)). Die resultierende Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur inkubiert für 2–5 Minuten und dann das Folgende zu gegeben: 40 μl einer Lösung enthaltend 1X H3 (Grace's Medium mit 9 mM CaCl2, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) (w/v) und 2 μM CCAP). Auf eine 5-sekündige Verzögerung wird die Lumineszenz des Aequorinsignals für 1 Minute ausgelesen.
  • Die zentralen Proteine und Polypeptide können aus natürlich vorkommenden Quellen erhalten werden oder synthetisch produziert werden. Beispielsweise können Wildtypproteine aus biologischen Quellen erhalten werden, welche die Proteine exprimieren, beispielsweise aus Heliothis oder Spodoptera. Die zentralen Proteine können auch aus synthetischen Mitteln gewonnen werden, beispielsweise durch Exprimieren eines rekombinanten Genes, das das Protein von Interesse in einem geeigneten Wirt wie oben beschrieben exprimiert. Jegliche geeignete Proteinaufreinigungsprozeduren können eingesetzt werden, wo geeignete Proteinaufreinigungsmethoden in den Richtlinien zur Proteinaufreinigung beschrieben werden (Deuthser ed.) (Academic Press, 1990). Beispielsweise kann ein Lysat aus der ursprünglichen Quelle präpariert werden und unter HPLC-Verwendung aufgereinigt werden, unter Ausschluss-Chromatographie, Gelelektrophorese, Affinitätschromatographie und dergleichen.
  • Ein Derivat eines zentralen Proteins kann durch verschiedene Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, produziert werden. Die Manipulationen, welche in ihrer Produktion resultieren, können auf der Ebene des Gens oder des Proteins erscheinen. Beispielsweise kann eine klonierte zentrale Gensequenz an geeigneten Stellen mit Restriktionsendonuklease(n) geschnitten werden (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA (1986) 317:415), gefolgt von weiterer enzymatischer Modifizierung, falls gewünscht, kann isoliert und in vitro ligiert werden, und exprimiert werden, um das gewünschte Derivat zu produzieren. Alternativ kann ein zentrales Gen in vitro oder in vivo mutiert werden, um Translations-, Initiations- und/oder Terminationssequenzen zu erzeugen und/oder zu zerstören, oder Variationen in kodierenden Regionen zu erzeugen und/oder neue Endonuklease-Restriktionsschnittstellen auszubilden oder vorher existierende zu zerstören, um weitere in vitro-Modifizierungen zu ermöglichen. Eine Vielzahl von Mutagenesetechniken sind im Stand der Technik bekannt, wie z.B. chemische Mutagenese, in vitro ortsgerichtete Mutagenese (Carter et al., Nucl. Acids Res. (1986) 13:4331), die Verwendung von TAB® Linkern (verfügbar von Pharmacia und Upjohn, Kalamazoo, MI), etc.
  • Auf der Proteinebene schließen Manipulationen posttranslatorische Modifizierung, beispielsweise Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Derivatisierung durch bekannte Schutz-/Blockierungs-Gruppen, proteolytisches Schneiden, Verknüpfung an Antikörpermoleküle oder andere zelluläre Liganden etc. ein. Irgendeine der vielen chemischen Modifizierungen kann durch bekannte Techniken durchgeführt werden (beispielsweise spezifisch chemisches Schneiden durch Cyanogenbromid, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, V8 Protease, NaBH4, Acetylierung, Formylation, Oxidation, Reduktion, metabolische Synthese in der Gegenwart von Tunicamycin, etc.). Derivatproteine können auch chemisch unter Verwendung eines Peptid-Syntheseautomaten synthetisiert werden, um beispielsweise nichtklassische Aminosäuren- oder chemische Aminosäurenanaloga als Substitutionen oder Additionen in die zentrale Proteinsequenz einzubringen.
  • Chimäre oder Fusionsproteine können hergestellt werden, die ein zentrales Protein oder ein Fragment davon (vorzugsweise umfassend eine oder mehrere strukturelle oder funktionelle Domänen des zentralen Proteins), gebunden an ihrem Amino- oder Carboxylterminus über eine Peptidbindung an eine Aminosequenz eines unterschiedlichen Proteins, umfassen. Chimäre Proteine können hergestellt werden durch irgendein bekanntes Verfahren einschließend: rekombinante Expression einer Nukleinsäure kodierend für das Protein (umfassend eine Aminosäuresequenz kodierend ein zentrales Protein verknüpft im Rahmen mit einer kodierenden Sequenz eines anderen Proteins); Ligieren der geeigneten Nukleinsäuresequenzen kodierend die gewünschten Aminosäuresequenzen aneinander in einen geeigneten kodierenden Rahmen, und Exprimieren des chimären Produktes; und Proteinsynthesetechniken, beispielsweise durch Verwendung eines Peptid-Synthese-Automaten.
  • GENREGULATORISCHE ELEMENTE DER ZENTRALEN NUKLEINSÄUREMOLEKÜLE
  • Die Erfindung umfasst des Weiteren genregulatorische DNA-Elemente, wie z.B. Enhancer oder Promotoren, welche die Transkription der zentralen Nukleinsäuremoleküle steuern. Solche regulatorische Elemente können verwendet werden, um Gewebe, Zellen, Gene und Faktoren, die spezifisch die Produktion eines zentralen Proteins steuern, zu identifizieren. Das Analysieren der Komponenten, die spezifisch für eine spezielle Proteinfunktion sind, kann zum Verständnis führen, wie diese regulatorischen Prozesse zu manipulieren sind, speziell für Pestizide und therapeutische Anwendung, wie auch zum Verständnis, wie Dysfunktion in diesen Verfahren zu diagnostizieren sind.
  • Genfusionen mit zentralen regulatorischen Elementen können realisiert werden. Für kompakte Gene, die relativ wenige und kleine dazwischenliegende Sequenzen aufweisen, wie z.B. die hier für Heliothis und Spodoptera beschriebenen, ist es typischerweise der Fall, dass die regulatorischen Elemente, welche räumliche und zeitliche Expressionsmuster steuern, in der DNA unmittelbar strangaufwärts zur kodierenden Region gefunden werden und sich in die äußerste Nähe des benachbarten Genes erstrecken. Regulatorische Regionen können verwendet werden, um Genfusionen zu konstruieren, wo die regulatorischen DNAs operativ an eine kodierende Region eines Reporterproteins fusioniert sind, dessen Expression einfach zu detektieren ist, und diese Konstrukte werden als Transgene in das Tier der Wahl eingebracht.
  • Eine vollständige regulatorische DNA-Region kann verwendet werden oder die regulatorische Region kann in kleinere Segmente unterteilt werden, um Subelemente zu identifizieren, die spezifisch zur Steuerung der Expression in einem gegebenen Zelltyp oder Stadium der Entwicklung sind. Reporterproteine, die zur Konstruktion dieser Genfusionen verwendet werden können, schließen E. coli beta-Galactosidase und grünfluoreszierendes Protein (GFP) ein. Diese können einfach in situ detektiert werden und sind folglich bedeutsam für histologische Untersuchungen und können verwendet werden, um Zellen zu sortieren, welche ein zentrales Protein exprimieren (O'Kane and Gehring PNAS (1987) 84(24):9123–9127; Chalfie et al., Science (1994) 263:802–805; and Cumberledge and Krasnow (1994) Methods in Cell Biology 44:143–159). Rekombinase Proteine, wie z.B. FLP oder CRE, können bei der Steuerung der Genexpression durch ortsspezifische Rekombination verwendet werden (Golic and Lindquist (1989) Cell 59(3):499–509; White et al., Science (1996) 271:805–807). Toxische Proteine, wie z.B. Reaper und Hid-Cell-Death Proteine, sind bedeutsam, um Zellen zu verstümmeln, die normalerweise ein zentrales Protein exprimieren, um die physiologische Funktion der Zellen zu bewerten (Kingston, In Current Protocols in Molecular Biology (1998) Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc. sections 12.0.3–12.10) oder irgendein anderes Protein, wo es gewünscht wird, die Funktion dieses speziellen Proteins speziell in Zellen, die ein zentrales Protein synthetisieren, zu untersuchen.
  • Alternativ kann ein binäres Reportersystem verwendet werden, ähnlich zu demjenigen beschrieben weiter unten, wo ein zentrales regulatorisches Element operativ an die kodierende Region eines exogenen transkriptionellen Aktivatorproteins fusioniert ist, wie z.B. die GAL4- oder tTA-Aktivatoren, die unten beschrieben werden, um ein zentrales regulatorisches Element ("Drivergen") zu erzeugen. Für die andere Hälfte des binären Systems steuert der exogene Aktivator ein separates "Targetgen", das eine kodierende Region eines Reporterproteins operativ fusioniert an ein verwandtes regulatorisches Element für das exogene Aktivatorprotein enthält, wie z.B. ein UASG bzw. tTA-Antwortelement. Ein Vorteil eines binären Systems ist, dass ein einzelnes Drivergen-Konstrukt verwendet werden kann, um die Transkription von vorkonstruierten Targetgenen, die verschiedene Reporterproteine kodieren, zu aktivieren, jedes mit seinen eigenen Verwendungen wie oben erläutert.
  • Zentrale regulatorische Element-Reportergen-Fusionierungen sind auch bedeutsam beim Testen von genetischen Wechselwirkungen, wo die Aufgabe ist, diejenigen Gene zu identifizieren, die eine spezielle Rolle in der Steuerung der Expression der zentralen Gene aufweisen, oder das Wachstum und die Differentiation der Gewebe, die ein zentrales Protein exprimieren, zu promoten. Zentrale genregulatorische DNA-Elemente sind auch bedeutsam in Protein-DNA-Bindungs-Assays, um genregulatorische Proteine zu identifizieren, die die Expression von zentralen Genen steuern. Die genregulatorischen Proteine können detektiert werden unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren, welche spezielle Protein-DNA-Wechselwirkungen untersuchen, die den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind (Kingston, supra), einschließend in vivo footprinting Assays, die auf dem Schutz von DNA-Sequenzen vor chemischen und enzymatischen Modifizierungen basieren, innerhalb lebender oder permeabilisierter Zellen; und in vitro footprinting Assays, die auf dem Schutz von DNA-Sequenzen vor chemischen oder enzymatischen Modifizierungen unter Verwendung von Proteinextrakten, Nitrocellulosefilterbindenden Assays und Gel-Elektrophorese-Mobilitätshift-Assays basieren unter Verwendung von radioaktiv gelabelten regulatorischen DNA-Elementen vermischt mit Proteinextrakten. Kandidatengene für regulatorische Proteine können gereinigt werden unter Verwendung einer Kombination von konventionellen und DNA-Affinitäts-Aufreinigungs-Techniken. Molekulare Klonierungsstrategien können auch verwendet werden, um die Proteine zu identifizieren, die spezifisch zentrale genregulatorische DNA-Elemente bin den. Beispielsweise kann eine Drosophila cDNA-Bibliothek in einem Expressionsvektor auf cDNAs gescreened werden, welche zentrale Genregulatorische-Element-DNA-bindende Aktivität kodieren. In ähnlicher Art und Weise kann das Hefe "Ein-Hybrid"-System verwendet werden (Li and Herskowitz, Science (1993) 262:1870–1874; Luo et al., Biotechniques (1996) 20(4):564–568; Vidal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93(19):10315–10320).
  • ANTIKÖRPER SPEZIFISCH FÜR ZENTRALE PROTEINE
  • Die vorliegende Erfindung stellt Antikörper bereit, die isolierte Antikörper sein können, die spezifisch an ein zentrales Protein binden. Die zentralen Proteine, Fragmente und Derivate davon können als ein Immunogen verwendet werden, um monoklonale oder polyklonale Antikörper und Antikörperfragmente oder Derivate zu erzeugen (beispielsweise chimäre, einsträngige, Fab-Fragmente). Wie hier verwendet schließt die Bezeichnung "Antikörper" Antikörper irgendeines Isotyps ein, Fragmente von Antikörpern, welche spezifische Bindung an Antigen aufrechterhalten, einschließend, jedoch nicht limitiert auf Fab-, Fv-, scFv- und Fd-Fragmente, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, einsträngige Antikörper und Fusionsproteine, die einen Antigen-bindenden Abschnitt eines Antikörpers und ein Nicht-Antikörper-Protein umfassen. Auch bereitgestellt werden "künstliche" Antikörper, beispielsweise Antikörper und Antikörper-Fragmente hergestellt und ausgewählt in vitro. In einigen Ausführungsformen werden solche Antikörper auf der Oberfläche eines Bakteriophagen oder anderer viraler Partikel dargeboten. In vielen Ausführungsformen sind solche künstlichen Antikörper als Fusionsproteine mit einem viralen oder bakteriophagen Strukturprotein vorhanden, einschließend, jedoch nicht limitiert auf das M13-Gen III-Protein. Verfahren zum Herstellen solcher künstlicher Antikörper sind im Stand der Technik wohlbekannt. Siehe beispielsweise US-Patent Nrn. 5,516,637; 5,223,409; 5,658,727; 5,667,988; 5,498,538; 5,403,484; 5,571,698 und 5,625,033.
  • Die Antikörper können detektierbar gelabelt sein, beispielsweise mit einem Radioisotop, einem Enzym, welches ein detektierbares Produkt erzeugt, einem grün fluoreszierenden Protein oder dergleichen. Die Antikörper können des Weiteren konjugiert sein mit anderen Gruppen, beispielsweise Mitgliedern von speziellen Bindungspaaren, beispielsweise Biotin (Mitglied des Biotin-Avidin-spezifischen Bindungspaares) und dergleichen. Die Antikörper können auch gebunden sein an eine feste Unterlage, einschließend, jedoch nicht limitiert auf Polystyrolplatten oder Beads und dergleichen. Beispielsweise werden Fragmente eines zentralen Proteins, beispielsweise diejenigen, die als hydrophil identifiziert wurden, als Immunogene zur Antikörperproduktion unter Verwendung von im Fachbereich bekannten Verfahren verwendet, wie z.B. durch Hybridomas; die Produktion von monoklonalen Antikörpern in keimfreien Tieren (PCT/US90/02545); die Verwendung von menschlichen Hybridomas (Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:2026–2030; Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985) Alan R. Liss. Seiten 77–96), und die Produktion von humanisierten Antikörpern (Jones et al., Nature (1986) 321:522–525; US-Patent 5,530,101). In einer besonderen Ausführungsform liefern zentrale Polypeptid-Fragmente spezifische Antigene und/oder Immunogene, speziell wenn sie an Carrier-Proteine gekoppelt sind. Beispielsweise werden Peptide kovalent an das Keyhole-Limpet-Antigen (KLH) gebunden und das Konjugat wird in Freund's komplettem Adjuvans emulgiert. Labortiere, beispielsweise Mäuse, Ratten oder Kaninchen werden immunisiert gemäß herkömmlichem Protokoll und Blut wird abgenommen. Das Vorliegen von spezifischen Antikörpern wird durch Festphasen-Immuno-Sorbent-Assays unter Verwendung von immobilisierten korrespondierenden Polypeptiden geprüft. Spezifische Aktivität oder Funktion der produzierten Antikörper kann durch konventionelle in vitro-, zellbasierte oder in vivo-Assays, beispielsweise in vitro-Bindungsassays, etc., bestimmt werden. Die Bindungsaffinität kann durch Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten von Antigen-Antikörper-Assoziationen geprüft werden (üblicherweise zumindest ungefähr 107 M–1, zumindest ungefähr 108 M–1 oder zumindest ungefähr 109 M–1).
  • SCREENINGVERFAHREN
  • Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren Verfahren zum Identifizieren von Agenzien bereit, welche eine Aktivität eines zentralen NKD-Polypeptids reduzieren, welche die Spiegel an NKD mRNA und/oder Polypeptidspiegel in einer Zelle, insbesondere einer Insektenzelle reduzieren. Die Erfindung stellt des Weiteren Verfahren zum Identifizieren von Molekülen bereit, die mit einer zentralen NKD interagieren.
  • Verfahren zum Identifizieren von Molekülen, welche mit einem zentralen Protein Wechselwirken
  • Eine Vielzahl von Verfahren kann verwendet werden, um Moleküle zu identifizieren oder zu screenen, wie z.B. Proteine oder andere Moleküle, die mit einem zentralen Protein wechselwirken oder Derivate der Fragmente davon. Die Assays können aufgereinigtes Protein oder Zelllinien oder Modellorganismen wie z.B. Heliothis, Drosophila und C. elegans einsetzen, welche genetisch manipuliert wurden, um ein zentrales Protein zu exprimieren. Geeignete Screening-Methodologien sind im Stand der Technik wohlbekannt, um Proteine oder andere Moleküle zu testen, welche mit einem zentralen Gen und Protein wechselwirken (siehe beispielsweise Internationale PCT Publikationsnr. WO 96/34099). Die neu identifizierten wechselwirkenden Moleküle können neue Targets für pharmazeutische oder pestizidale Agenzien bereitstellen. Irgendwelche der Vielzahl der exogenen Moleküle, die sowohl natürlich auftreten und/oder synthetisch sind (beispielsweise Bibliotheken von kleinen Molekülen oder Peptiden, oder Phagendisplay-Bibliotheken) können gescreened werden hinsichtlich der Bindungsaktivität. In einem typischen Bindungsexperiment wird ein zentrales Protein oder Fragment mit Kandidaten-Molekülen unter Bedingungen, die günstig für die Bindung sind, vermischt, und hinreichend Zeit wird zugestanden, damit jede Bindung auftreten kann, und Assays werden durchgeführt, um die gebundenen Komplexe zu testen.
  • Assays, um wechselwirkende Proteine zu finden, können durchgeführt werden durch irgendwelche bekannten Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, beispielsweise Immunopräzipitation mit einem Antikörper, welcher das Protein in einem Komplex bindet, gefolgt von Analyse durch Größenfraktionierung der immunopräzipitierten Proteine (beispielsweise denaturierende oder nichtdenaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese), Western-Blot-Analyse, nicht-denaturierende Gelelektrophorese, Zwei-Hybridsysteme (Fields and Song, Nature (1989) 340:245–246; US-Pat. Nr. 5,283,173; for review see Brent and Finley, Annu. Rev. Genet. (1977) 31:663–704), etc.
  • Immunoassays
  • Immunoassays können verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, die mit einem zentralen Protein wechselwirken oder an es binden. Verschiedene Assays sind verfügbar zum Testen der Fähigkeit eines Proteins, an ein zentrales Wildtyp-Protein zu binden oder mit der Bindung zu konkurrieren oder zum Binden an einen gegen das zentrale Protein gerichteten Antikörper. Geeignete Assays schließen Radioimmunoassays, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), immunoradiometrische Assays, Gel-Diffusions-Präzipitin-Reaktionen, Immunodiffusionsassays, in situ-Immunoassays (beispielsweise unter Verwendung von kolloidalem Gold, Enzym oder Radioisotoplabeln), Western-Blots, Präzipitationsreaktionen, Agglutinationsassays (beispielsweise Gelagglutinationsassays, Hämagglutinationsassays), Komplement-Fixierungsassays, Immuno-Fluoreszenz-Assays, Protein A-Assays, Immuno-Elektrophorese-Assays, etc. ein.
  • Eines oder mehrere der Moleküle in dem Immunoassay können an ein Label gebunden sein, wobei das Label direkt oder indirekt ein detektierbares Signal liefern kann. Verschiedene Label schließen Radioisotope, fluoreszierende, chemilumineszierende Substanzen, Enzyme, spezifisch bindende Moleküle, Partikel, beispielsweise magnetische Partikel und dergleichen ein. Spezifisch bindende Moleküle schließen Paare, wie z.B. Biotin und Streptavidin, Digoxin und Antidigoxin etc. ein. Für die spezifisch bindenden Mitglieder würden die komplementären Mitglieder normalerweise mit einem Molekül gelabelt werden, welches die Detektion in Übereinstimmung mit bekannten Prozeduren gewährleistet.
  • Identifizierung von möglichen Pestizid- oder Drug-Targets
  • Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren Verfahren zum Identifizieren von Agenzien bereit, welche eine Aktivität eines zentralen NKD-Polypeptids reduzieren, welche den Spiegel von NKD mRNA und/oder Polypeptid in einer Zelle reduzieren, speziell einer Insektenzelle.
  • Sobald neue Targetgene oder mit einem Target wechselwirkende Gene identifiziert werden, können sie als potenzielle Pestizid- oder Wirkstofftargets oder als Biopestizide bewertet werden. Des Weiteren können transgene Pflanzen, welche zentrale Proteine exprimieren, hinsichtlich ihrer Aktivität gegen Insektenschädlinge getestet werden (Estruch et al., Nat. Biotechnol (1997) 15(2):137–141).
  • Die zentralen Proteine sind validierte Pestizidtargets, da die Zerstörung der zentralen Gene in Drosophila tödlich endet, wenn sie homozygot sind. Die Mutation zur Lethalität dieser Gene deutet an, dass Wirkstoffe, welche als Agonisten oder Antagonisten auf das Genprodukt wirken, effektive pestizidale Agenzien sein können.
  • Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff "Pestizid" allgemein auf chemische, biologische Agenzien und andere Verbindungen, die in negativer Art und Weise die Insekten-Lebensfähigkeit beeinflussen, sie beispielsweise killen, paralysieren, sterilisieren oder anderweitig Schädlingsspezies im Gebiet des landwirtschaftlichen Pflanzenschutz bzw. der menschlichen und tierischen Gesundheit eindämmen. Beispielhafte Schädliinsspezies schließen Parasiten und Erkrankungsvektoren, wie z.B. Moskitos, Flöhe, Zecken, parasitäre Fadenwürmer, Sandflöhe, Milben etc., ein. Schädlingsspezies schließen auch diejenigen ein, die aus ästhetischen oder hygienischen Gründen ausgerottet werden (beispielsweise Ameisen, Schaben, Kleidungsmotten, Mehltau, etc.), aus Gründen der Heim- und Gartenanwendungen und zum Schutz von Strukturen (einschließend waldschädigende Schädlinge, wie z.B. Termiten, und oberflächenbewachsende Meeres-Organismen).
  • Pestizidale Verbindungen können traditionell kleine organische Molekülpestizide einschließen (typifiziert durch Verbindungsklassen, wie z.B. Organophosphate, Pyrethroide, Carbamate, und Organochlorverbindungen, Benzoylharnstoffe, etc.). Andere Pestizide schließen proteinartige Toxine wie z.B. Bacillus thuringiensis Crytoxine (Gill et al., Annu Rev Entomol (1992) 37:615–636) und Photorabdus luminescens Toxine (Bowden et al., Science (1998) 280:2129–2132); und Nukleinsäuren, wie z.B. zentrale dsRNA oder Antisense-Nukleinsäuren, die mit der Aktivität eines zentralen Nukleinsäuremoleküls Wechselwirken, ein.
  • Die Bezeichnungen "Kandidaten-Agens", "Agens", "Substanz" und "Verbindung" werden hier zueinander austauschbar verwendet. Kandidaten-Agenzien umfassen verschiedene chemische Klassen, typischerweise synthetische, semisynthetische oder natürlich vorkommende anorganische oder organische Moleküle. Kandidaten-Agenzien können klei ne organische Verbindungen sein, die ein Molekulargewicht von mehr als 50 und weniger als ungefähr 2500 Dalton aufweisen. Kandidaten-Agenzien können funktionelle Gruppen umfassen, die notwendig für die strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen sind, insbesondere Wasserstoff-Bindungen und können zumindest eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe einschließen und können zumindest zwei der funktionellen chemischen Gruppen enthalten. Das Kandidaten-Agens kann cyclische Kohlenwasserstoffe oder heterocyclische Strukturen umfassen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen substituiert mit einer oder mehreren der oben genannten funktionellen Gruppen. Kandidaten-Agenzien sind auch unter den Biomolekülen zu finden einschließend Peptide, Saccharide, Fettsäuren, Steroide, Purine, Pyrimidine, Derivate, Strukturanaloga oder Kombinationen davon.
  • Kandidaten-Agenzien werden von einer großen Vielzahl von Quellen erhalten, einschließend Bibliotheken von synthetischen oder natürlichen Verbindungen. Beispielsweise sind verschiedene Mittel verfügbar für zufällige oder gerichtete Synthesen einer großen Vielzahl von organischen Verbindungen und Biomolekülen einschließend die Expression von randomisierten Oligonukleotiden und Oligopeptiden. Alternativ sind Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in der Form von Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- und tierischen Extrakten verfügbar oder werden leicht produziert. Zusätzlich werden natürliche oder synthetisch produzierte Bibliotheken oder Verbindungen leicht modifiziert durch konventionelle chemische, physikalische und biochemische Mittel und können verwendet werden, um kombinatorische Bibliotheken zu erzeugen. Bekannte pharmakologische Agenzien können gerichteten oder zufälligen chemischen Modifikationen unterzogen werden, wie z.B. Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidierung, etc., um strukturelle Analoga zu produzieren.
  • Kandidaten-Agenzien, welche eine Aktivität (beispielsweise die Aktivität als ein Calciumionenkanal) eines zentralen Polypeptids reduzieren und/oder einen Spiegel von NKD mRNA und/oder Polypeptid reduzieren und zwar um zumindest ungefähr 10 %, zumindest ungefähr 15 %, zumindest ungefähr 20 %, zumindest ungefähr 25 %, zumindest ungefähr 30 %, zumindest ungefähr 35 %, zumindest ungefähr 40 %, zumindest ungefähr 45 %, zumindest ungefähr 50 %, zumindest ungefähr 55 %, zumindest ungefähr 60 %, zumindest ungefähr 65 %, zumindest ungefähr 70 %, zumindest ungefähr 75 %, zumindest ungefähr 80 %, zumindest ungefähr 85 %, zumindest ungefähr 90 %, zumindest ungefähr 95 % oder mehr, sind Kandidaten-Pestizide.
  • Kandidaten-Agenzien, die eine Aktivität eines zentralen NKDs reduzieren und/oder einen Spiegel von NKD mRNA und/oder Polypeptid reduzieren, werden darüber hinaus hinsichtlich Toxizität gegen Wirbeltierspezies getestet, wie z.B. Säugetierspezies, etc.; und hinsichtlich Bioverfügbarkeit.
  • Eine Vielzahl anderer Reagenzien kann in dem Screening-Assay eingeschlossen sein. Diese schließen Reagenzien, wie Salze, Neutralproteine, z.B. Albumin, Detergenzien etc., ein, die verwendet werden, um optimale Protein-Protein-Bindung zu ermöglichen und/oder nicht spezifische oder Hintergrund-Wechselwirkungen zu verringern. Reagenzien, welche die Effizienz des Assays verbessern, wie z.B. Proteaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren, antimikrobielle Agenzien etc., können verwendet werden. Die Komponenten werden in irgendeiner Reihenfolge zugegeben, die die benötigte Aktivität bereitstellt. Inkubationen werden bei irgendeiner geeigneten Temperatur durchgeführt, typischerweise zwischen 4°C und 40°C. Inkubationsperioden werden ausgewählt hinsichtlich optimaler Aktivität, können aber optimiert werden um schnelles High-Throughput Screening zu ermöglichen. Typischerweise wird eine Zeitspanne zwischen 0,1 und 1 Stunde ausreichend sein.
  • Assays von Verbindungen gegen Insekten
  • Potenzielle insektizidale Verbindungen können den Insekten in einer Vielzahl von Wegen verabreicht werden, einschließend oral (einschließlich der Zugabe zu einer synthetischen Diät, der Anwendung auf Pflanzen oder Beute, die von den Testorganismen konsumiert werden), topisch (einschließlich Sprühen, direkte Anwendung der Verbindung auf das Tier, Ermöglichen des Kontakts des Tiers mit einer behandelten Oberfläche) oder durch Injektion. Insektizide sind typischerweise sehr hydrophobe Moleküle und müssen gemeinhin in organischen Lösungsmitteln aufgelöst werden, welche man in dem Falle von Methanol oder Aceton verdampfen lässt, oder welche in niedrigen Konzentrationen enthalten sein können, um die Aufnahme zu erleichtern (Ethanol, Dimethylsulfoxid).
  • Der erste Schritt in einem Insektenassay ist üblicherweise die Bestimmung der minimalen lethalen Dosis (MLD, minimal lethal dose) des Insekts nach der chronischen Exposition gegen die Verbindung. Die Verbindungen werden üblicherweise in DMSO verdünnt und auf die Nahrungsoberfläche aufgebracht, die 0–48 Stunden alte Embryonen und Larven trägt. Zusätzlich zur Bestimmung der MLD erlaubt dieser Schritt die Bestimmung der Fraktion an sich entwickelnden Eiern, des Verhaltens der Larven, beispielsweise wie sie sich bewegen, fressen im Vergleich zu unbehandelten Larven, der Fraktion, die bis zum Verpuppen überlebt, und der Fraktion, die ausschlüpft (Überleben des erwachsenen Insektes aus dem Verpuppungsstadium). Basierend auf diesen Ergebnissen können detailliertere Assays mit kürzerer Expositionszeit konzipiert werden, und die Larven können seziert werden, um nach offensichtlichen morphologischen Defekten zu suchen. Sobald die MLD bestimmt wird, können spezifische akute und chronische Assays konzipiert werden.
  • In einem typisch akuten Assay werden die Verbindungen auf die Nahrungsoberfläche für Embryos, Larven oder Erwachsene appliziert, und die Tiere werden nach 2 Stunden und nach Inkubation über Nacht beobachtet. Für die Anwendung auf Embryos werden Defekte in der Entwicklung und der prozentuale Anteil, der bis zum Erwachsenwerden überlebt, bestimmt. Für Larven werden Defekte im Verhalten, der Beweglichkeit und dem Verpuppen beobachtet. Zur Anwendung auf Erwachsene werden Defekte in Spiegeln und/oder Calciumionenkanalaktivität beobachtet und die Effekte im Verhalten und/oder der Fertilität werden aufgezeichnet.
  • Für einen chronischen Expositions-Assay werden die Erwachsenen für 48 Stunden auf Phiolen platziert, die die Verbindung enthalten, dann auf einen sauberen Behälter überführt und hinsichtlich Fertilität, Defekte in Spiegeln und/oder Aktivität eines zentralen Polypeptids und auf Ableben hin beobachtet.
  • Assays von Verbindungen unter Verwendung von Zellkulturen
  • Verbindungen, die die Aktivität eines zentralen Proteins modulieren (z.B. blockieren oder verstärken) und/oder einen Spiegel von NKD mRNA oder Polypeptid modulieren, können auch unter Verwendung von Zellkulturen getestet werden. Exemplarische Zellen sind kultivierte Insektenzellen wie z.B. Drosophila S2-Zellen. In einigen Ausführungsfor men wird ein rekombinanter Vektor, der eine Sequenz enthält, die das gesamte oder einen Teil eines zentralen NKDs einschließt, in Zellen in einer in vitro-Kultur eingebracht und die resultierenden rekombinanten Wirtszellen werden verwendet, um Testagenzien zu screenen. Beispielsweise werden verschiedene Verbindungen zu Zellen zugegeben, die ein zentrales Protein exprimieren, und können auf ihre Fähigkeit hin gescreent werden, die Aktivität der zentralen Gene zu modulieren, basierend auf der Messung der biologischen Aktivität eines zentralen Proteins. Beispielsweise können Verbindungen gescreent werden auf ihre Fähigkeit, die Aktivität von NKD-Genen zu modulieren, basierend auf den Messungen der NKD-Aktivität, NKD mRNA-Spiegeln oder NKD-Polypeptid-Spiegeln.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Identifizieren von Agenzien bereit, welche eine Aktivität eines NKD-Polypeptids der Erfindung modulieren. Die Bezeichnung "modulieren" schließt den Anstieg oder die Verminderung bei der Messung der NKD-Aktivität ein, im Vergleich zu einem geeigneten Standard.
  • Das Verfahren umfasst im Allgemeinen: a) das Inkontaktbringen eines Testagens mit einer Probe enthaltend eine eukaryontische Zelle, die ein funktionelles NKD-Polypeptid synthetisiert; und b) Prüfen auf eine Aktivität des NKD-Polypeptids in der Gegenwart eines Testagens, wobei die Aktivität, auf die hin untersucht wird, die Funktion als Calciumionenkanal ist. Im Allgemeinen wird ein Anstieg der intrazellulären Calciumionen in der Gegenwart eines bekannten NKD-Agonisten in der Gegenwart und Abwesenheit eines Testagens gemessen. Ein Anstieg oder eine Verminderung in der NKD-Aktivität im Vergleich zur NKD-Aktivität in einem geeigneten Standard (beispielsweise einer Probe umfassend ein NKD-Polypeptid in der Abwesenheit eines zu testenden Agens) ist ein Hinweis darauf, dass das Agens eine Aktivität des NKD moduliert. Eine Veränderung in der intrazellulären Calciumkonzentration kann detektiert werden unter Verwendung einer eukaryontischen Zelle, die zusätzlich zu einem funktionellen NKD ein Apoaequorinprotein produziert. Zugabe von Coelenterazin zu der Zelle erzeugt ein Holoaequorinprotein, welches Licht nach Binden an Calciumionen emittiert.
  • Ein "Agens, das die NKD-Aktivität eines NKD-Polypeptids moduliert" wie es hier verwendet wird, beschreibt irgendeine Form eines Moleküls, beispielsweise eine synthetische oder natürliche organische oder anorganische Verbindung, ein Protein oder ein Pharmazeutikum mit der Fähigkeit, die NKD-Aktivität eines NKD-Polypeptids wie hierin beschrieben zu verändern. Im Allgemeinen wird eine Vielzahl von Assaymischungen gleichzeitig durchgeführt mit verschiedenen Konzentrationen an Agens, um eine differenzielle Antwort auf verschiedene Konzentrationen zu erhalten. Typischerweise dient eine dieser Konzentrationen als ein negativer Standard, d.h. als Nullkonzentration oder als Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze.
  • Assays zur Veränderung in einer biologischen Aktivität eines zentralen Proteins können auf kultivierten Zellen durchgeführt werden, welche das endogene normale oder mutierte zentrale Protein exprimieren. Solche Studien können auch durchgeführt werden auf Zellen, die mit Vektoren transfiziert sind, die in der Lage sind, das zentrale Protein zu exprimieren oder funktionelle Domänen eines der zentralen Proteine in normaler oder mutierter Form. Darüber hinaus können Zellen, um das gemessene Signal in solchen Assays zu verstärken, co-transfiziert werden mit Nukleinsäuremolekülen oder einem zentralen rekombinanten Vektor, die ein zentrales Protein kodieren.
  • Alternativ können Zellen, die ein zentrales Protein exprimieren, lysiert werden; das zentrale Protein kann aufgereinigt werden und in vitro unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, getestet werden (Kanemaki M., et al., J Biol Chem, (1999) 274:22437–22444).
  • Eine große Vielzahl von zellbasierten Assays kann verwendet werden, um Agenzien zu identifizieren, welche den Spiegel von NKD mRNA modulieren, zur Identifizierung von Agenzien, die den Spiegel von NKD Polypeptid modulieren und zum Identifizieren von Agenzien, die den Grad der NKD-Aktivität in einer eukaryontischen Zelle modulieren, beispielsweise unter Verwendung einer Insektenzelle (beispielsweise Drosophila S2-Zellen) transformiert mit einem Konstrukt, das eine NKD-kodierende cDNA umfasst, so dass die cDNA exprimiert wird oder, alternativ, eines Konstrukts, das einen NKD-Promotor umfasst, der operativ an ein Reportergen gebunden ist.
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Agens bereit, insbesondere eines biologisch aktiven Agens, welches den Spiegel der NKD-Expression in einer Zelle moduliert, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Kombinieren eines Kandidaten-Agens, das getestet werden soll, mit einer Zelle, die eine Nukleinsäure umfasst, welche ein NKD-Polypeptid kodiert; und Bestimmen des Effekts vom besagten Agens auf die NKD-Expression (beispielsweise Bestimmung des Effekts des Agens auf einen Spiegel von NKD mRNA, einen Spiegel von NKD-Polypeptid oder einen Grad der NKD-Aktivität in der Zelle).
  • Die "Modulation" von NKD-Expressions-Spiegeln schließt den Anstieg des Spiegels und die Verminderung des Spiegels von NKD mRNA und/oder NKD-Polypeptid kodiert durch das NKD-Polynukleotid und/oder des Grades der NKD-Aktivität im Vergleich zu einer Kontrollprobe, die das Agens, das es zu testen gilt, nicht aufweist, ein. Ein Anstieg oder eine Verminderung von ungefähr 1,25-fach, üblicherweise zumindest ungefähr 1,5-fach, üblicherweise zumindest ungefähr 2-fach, üblicherweise zumindest ungefähr 5-fach, üblicherweise zumindest ungefähr 10-fach oder mehr in dem Spiegel (d.h. einer Menge) von NKD mRNA und/oder Polypeptid und/oder NKD-Aktivität in der Folge des Kontakts der Zelle mit einem zu testenden Kandidatenagens, verglichen mit einer Kontrollprobe, zu der kein Agens hinzugefügt wird, ist ein Hinweis darauf, dass das Agens NKD den mRNA Spiegel moduliert, den NKD-Polypeptid-Spiegel oder den Grad NKD-Aktivität in der Zelle. Von speziellem Interesse in vielen Ausführungsformen sind Kandidaten-Agenzien, die einen Spiegel von NKD mRNA reduzieren und/oder einen Spiegel von NKD-Polypeptid reduzieren und/oder einen Grad der NKD-Aktivität in einer Insektenzelle reduzieren.
  • NKD mRNA und/oder Polypeptid, deren Spiegel oder Aktivität gemessen werden, können durch ein endogenes NKD-Polynukleotid kodiert werden, oder das NKD-Polynukleotid kann eines sein, das in einem rekombinanten Vektor umfasst ist und in die Zelle eingefügt ist, d.h. die NKD mRNA und/oder das Polypeptid können kodiert sein durch ein exogenes NKD-Polynukleotid. Beispielsweise kann ein rekombinanter Vektor eine isolierte NKD-transkriptionelle regulatorische Sequenz umfassen, wie z.B. eine Promotorsequenz, die operativ mit einem Reportergen verknüpft ist (beispielsweise β-Galaktosidase, CAT, Luciferase oder ein anderes Gen, dessen Produkt leicht geprüft werden kann). In diesen Ausführungsformen umfasst das Verfahren zum Identifizieren eines Agens, das einen Spiegel der NKD-Expression in einer Zelle moduliert, folgendes: Kombinieren eines Kandidaten-Agens, das getestet werden soll mit einer Zelle umfassend eine Nukleinsäure, welche ein transkriptionelles regulatorisches Element eines NKD-Gens umfasst, das an ein Reportergen operativ verknüpft ist; und Bestimmen des Effekts von besagtem Agens auf die Reporter-Gen-Expression.
  • Ein rekombinanter Vektor kann eine isolierte NKD-transkriptionelle regulatorische Sequenz umfassen, wie z.B. eine Promotorsequenz, operativ verknüpft an Sequenzen kodierend für ein NKD-Polypeptid; oder die transkriptionellen Kontrollsequenzen können operativ verknüpft sein mit kodierenden Sequenzen für ein NKD-Fusionsprotein umfassend ein NKD-Polypeptid fusioniert an ein Polypeptid, welches die Detektion ermöglicht. In diesen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Kombinieren eines Kandidaten-Agens, welches getestet werden soll, mit einer Zelle, die eine Nukleinsäure umfasst, welche ein transkriptionelles regulatorisches Element eines NKD-Gens umfasst, das operativ an die NKD-Polypeptid-kodierende Sequenz verknüpft ist; und das Bestimmen des Effekts von besagtem Agens auf die NKD-Expression, wobei die Bestimmung durchgeführt werden kann durch Messen einer Menge von NKD mRNA, NKD-Polypeptid, NKD-Fusionspolypeptid oder NKD-Aktivität erzeugt durch die Zelle.
  • Zellbasierte Assays umfassen im Allgemeinen die Schritte des Inkontaktbringens der Zelle mit einem Agens, das getestet werden soll, dadurch das Ausbilden einer Testprobe und nach geeigneter Zeit die Bewertung des Effekts des Agens auf NKD mRNA-Spiegel, NKD-Polypeptid Spiegel und/oder Aktivitäts-Grad. Eine Kontrollprobe umfasst die gleiche Zelle ohne das hinzugegebene Kandidatenagens. NKD-Expressions-Spiegel werden sowohl in der Testprobe als auch in der Kontrollprobe gemessen. Ein Vergleich zwischen dem NKD-Expressions-Spiegel in der Testprobe und in der Kontrollprobe wird durchgeführt. NKD-Expression kann unter Verwendung konventioneller Assays geprüft werden. Beispielsweise können, wenn eine Zelllinie mit einem Konstrukt transformiert wird, das in der Expression von NKD resultiert, NKD mRNA-Spiegel detektiert und gemessen werden, wie auch NKD-Polypeptid-Spiegel und/oder NKD-Aktivitäts-Grade können detektiert und gemessen werden. Ein geeigneter Zeitraum zum Inkontaktbringen des Agens kann empirisch bestimmt werden und ist im Allgemeinen eine Zeit, die ausreichend ist, um den Eintritt des Agens in die Zelle zu ermöglichen und zu erlauben, dass das Agens einen messbaren Effekt auf NKD mRNA- und/oder Polypeptid-Spiegel aufweist und/oder auf die Calcium-Ionenkanal-Aktivität. Im Allgemeinen ist eine geeignete Zeit zwischen 10 Minuten und 24 Stunden, mehr typischerweise ungefähr 1–8 Stunden.
  • Verfahren zum Messen von NKD mRNA-Spiegeln sind im Stand der Technik bekannt, einige davon wurden oben beschrieben, und jegliche dieser Verfahren können in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um ein Agens zu identifizieren, welches NKD mRNA Spiegel in einer Zelle moduliert, einschließend jedoch nicht limitiert auf eine PCR, wie z.B. eine PCR, die nachweisbar gelabelte Oligonukleotidprimer einsetzt, und irgendeinen der Vielzahl der Hybridisierungsassays. In ähnlicher Weise können NKD-Polypeptid-Spiegel gemessen werden unter Verwendung irgendeines Standardverfahrens, von denen hier einige beschrieben wurden, einschließend, jedoch nicht limitiert auf einen Immunoassay, wie z.B. einen ELISA, der einen nachweisbar gelabelten Antikörper, spezifisch für ein NKD-Polypeptid einsetzt. NKD-Aktivität kann wie oben beschrieben oder wie in den Beispielen beschrieben gemessen werden.
  • Verbindungen, die selektiv einen Spiegel eines zentralen NKD-kodierenden Nukleinsäuremoleküls modulieren, oder die selektiv einen Spiegel eines zentralen Proteins modulieren oder die selektiv einen Grad der NKD-Aktivität modulieren, werden als potenzielle Pestizid- und Wirkstoffkandidaten identifiziert, die Spezifizität für das zentrale Protein aufweisen. Ob eine Kandidaten-Verbindung selektiv einen Spiegel eines zentralen NKD-kodierenden Nukleinsäuremoleküls moduliert oder selektiv einen Spiegel eines zentralen Proteins moduliert oder selektiv den Grad der NKD-Aktivität moduliert, kann durch Messen des Spiegels einer mRNA oder eines Proteins, beispielsweise von GAPDH oder anderer geeigneter Kontrollproteine oder mRNAs bestimmt werden, wobei ein Kandidatenagens "selektiv" ist, wenn es nicht substanziell die Produktion oder die Aktivität irgendeines Proteins oder einer mRNA inhibiert, die verschieden von einem NKD-Protein oder einer NKD-kodierenden mRNA sind.
  • Die Identifizierung von kleinen Molekülen und Verbindungen als potenzielle Pestizide oder pharmazeutische Verbindungen von großen chemischen Bibliotheken benötigen High-Throughput Screening (HTS) Verfahren (Bolger, Drug Discovery Today (1999) 4:251–253). Einige der Assays, die hier verwendet werden, können sich selbst für solche Screening-Verfahren anbieten. Beispielsweise können Zellen oder Zelllinien, die das zentrale Wildtyp- oder mutierte Protein oder ein Fragment davon und ein Reportergen exprimieren, Verbindungen von Interesse ausgesetzt werden, und abhängig von dem Reportergenen können Wechselwirkungen gemessen werden unter der Verwendung einer Vielzahl von Verfahren, z.B. Farbnachweis, Fluoreszenzdetektion (beispielsweise GFP), Autoradiografie, Szintillationsanalyse etc.
  • Verbindungen identifiziert unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren sind bedeutsam, um Schädlinge zu einzudämmen, und sind beispielsweise verwendbar als Pestizide. Solche Verbindungen können Schädliche eindämmen, beispielsweise durch Vermindern des Wachstums der Schädlinge und/oder ihrer Fertilität und/oder ihrer Überlebensfähigkeit.
  • ZENTRALE NUKLEINSÄUREN ALS BIOPESTIZIDE
  • Zentrale Nukleinsäuren und Fragmente davon, wie z.B. Antisense-Sequenzen oder doppelsträngige RNA (dsRNA) können verwendet werden, um zentrale Nukleinsäuremoleküle in ihrer Funktion zu inhibieren und können folglich als Biopestizide verwendet werden. Verfahren zum Verwenden von dsRNA-Interferenz werden in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 99/32619 beschrieben. Biopestizide können die Nukleinsäuremoleküle selbst, ein Expressionskonstrukt, das in der Lage ist, die Nukleinsäure zu exprimieren, oder Organismen transfiziert mit dem Expressionskonstrukt umfassen. Die Biopestizide können direkt auf Pflanzenteile angewandt werden oder auf das Erdreich, das die Pflanzen umgibt (beispielsweise um Pflanzenteile zu erreichen, die unterhalb des Erdbodenlevels wachsen), oder direkt auf die Schädlinge.
  • Ein Ansatz, der im Stand der Technik wohlbekannt ist, ist short interfering RNA (siRNA) vermitteltes Gensilencing, wobei die Expressionsprodukte eines NKD-Gens durch spezifische doppelsträngige NKD-abgeleitete siRNA-Nukleotidsequenzen adressiert werden, die komplementär zu zumindest einem 19–25 Nukleotid langen Segment (beispielsweise einer 20–21 Nukleotid langen Sequenz) des NKD-Gentranskripts, einschließend die 5' nichttranslierte (UT, untranslated) Region, den ORF oder die 3' UT-Region, sind. In einigen Ausführungsformen sind short interfering RNAs ungefähr 19–25 Nukleotide lang. Siehe beispielsweise PCT-Anmeldungen WO 0/44895, WO 99/32619, WO 01/75164, WO 01/92513, WO 01/29058, WO 01/89304, WO 02/16620 und WO 02/29858 für Beschreibungen der siRNA-Technologie.
  • Biopestizide umfassend eine zentrale Nukleinsäure können hergestellt werden in irgendeinem geeigneten Vektor zur Einschleusung in eine Pflanze oder ein Tier. Um Pflanzen zu erzeugen, die die zentralen Nukleinsäuren exprimieren, schließen geeignete Vektoren Agrobacterium tumefaciens Ti Plasmid-basierte Vektoren (Horsch et al., Science (1984) 233:496–89; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:4803), und rekombinanten Cauliflower Mosaik Virus (Hohn et al., 1982, In Molecular Biology of Plant Tumors, Academic Press, New York, Seiten 549–560; US-Patent Nr. 4,407,956 to Howell) ein. Retrovirus-basierte Vektoren sind bedeutsam für das Einbringen von Genen in Wirbeltiere (Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:8033–37).
  • Transgene Insekten können erzeugt werden unter Verwendung eines Transgens umfassend ein zentrales Gen operativ fusioniert an einen geeigneten induzierbaren Promotor. Beispielsweise kann ein tTA-gesteuerter Promotor verwendet werden, um die Expression eines zentralen Proteins zu einer geeigneten Zeit in einem Lebenszyklus eines Insekts zu regulieren. Auf diese Weise kann die Testeffizienz als ein Insektizid beispielsweise in der Larvenphase des Lebenszyklusses getestet werden (d.h. wenn der Fraß den größten Schaden für die Ernte verursacht). Vektoren zum Einbringen von Genen in Insekten schließen P-Element (Rubin and Spradling, Science (1982) 218:348–53; US-Patent Nr. 4,670,388), "hermes" (O'Brochta et al., Genetics (1996) 142:907–914), "minos" (US-Patent Nr. 5,348,874), " mariner" (Robertson, Insect Physiol. (1995) 41:99–105) und "sleeping beauty" (Ivics et al., Cell (1997) 91(4):501–510), "piggyBac" (Thibault et al., Insect Mol Biol (1999) 8(1):119–23) und "hobo" (Atkinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1993) 90:9693–9697) ein. Rekombinante Virussysteme zur Expression von toxischen Proteinen in infizierten Insektenzellen sind wohlbekannt und schließen das Semliki Forest Virus ein (DiCiommo and Brenner, J. Biol. Chem. (1998) 273:18060–66), das rekombinante Sindbis Virus (Higgs et al., Insect Mol. Biol. (1995) 4:97–103; Seabaugh et al., Virology (1998) 243:99–112), das rekombinante Pantropic Retrovirus (Matsubara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:6181–85; Jordan et al., Insect Mol. Biol. (1998) 7:215–22) und das rekombinante Baculovirus (Cory and Bishop, Mol. Biotechnol. (1997) 7(3):303–13; US-Patent Nr. 5,470,735; US-Patent Nrn. 5,352,451; US-Patent Nr. 5,770,192; US-Patent Nr. 5,759,809; US-Patent Nr. 5,665,349; und US-Patent Nr. 5,554,592).
  • Die folgenden Beispiele werden dargestellt, um den Fachleuten auf dem Gebiet eine vollständige Offenbarung und Beschreibung zu liefern, wie die vorliegende Erfindung durchgeführt und verwendet werden soll, und sie sind nicht gedacht, den Umfang zu limitieren von dem, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten, noch ist beabsichtigt, dass die Experimente unten alle oder die einzigen Experimente, die durchgeführt wurden, repräsentieren. Bemühungen wurden angestellt, die Stimmigkeit in Hinblick auf die verwendeten Zahlen (beispielsweise Mengen, Temperatur, etc.) sicherzustellen, jedoch mit einigen experimentellen Fehler und Abweichungen sollte gerechnet werden. Solange nichts anderes angezeigt ist, sind Teile Gewichtsanteile, das Molekulargewicht ist das gewichtsgemittelte Molekulargewicht, die Temperatur wird in Grad Celsius angegeben und der Druck liegt bei oder in der Nähe von Atmosphärendruck. Standardabkürzungen können verwendet werden, beispielsweise bp für Basenpaar(e); kb für Kilobase(n); pl für Picoliter(n); s für Sekunde(n); min für Minute(n); hr für Stunde(n); aa für Aminosäure(n); kg für Kilobase(n); bp für Basenpaar(e); nt für Nukleotid(e); und dergleichen.
  • Beispiel 1: Klonierung einer cDNA kodierend für Heliothis NKD
  • Eine cDNA-kodierend für einen Volllängen-offenen-Leserahmen eines NKDs wurde amplifiziert aus einer Heliothis virescens cDNA-Bibliothek und zur Gänze sequenziert. Die Nukleotidsequenz wird in 1 dargestellt; die Aminosäuretranslation der kodierten NKD ist in 2 dargestellt.
  • Beispiel 2: Klonierung einer cDNA kodierend Spodopterane NKD
  • Eine cDNA kodierend einen Volllängen-offenen-Leserahmen eines NKDs wurde von einer Spodoptera frugiperda cDNA-Bibliothek amplifiziert und zur Gänze sequenziert. Die Nukleotidsequenz ist in 3 dargestellt; die Aminosäuretranslation des kodierten NKDs in 4 dargestellt.
  • Beispiel 3: Assay für NKD-Aktivität und High-Throughput Screening
  • Die Aktivierung von endogenem Sf9 NKD durch das insektische Tachykininpeptid LTTK-II führt zum Anstieg von intrazellulärem Calcium, welches seinerseits an Aequorin bindet und Licht emittiert. Der Assay identifiziert Rezeptorantagonisten, welche durch Abfall in der calciumsensitiven Aequorinlumineszenz, stimuliert durch den insektischen Tachykinin-Agonisten-Peptid LTTK-II, detektiert werden können. Der Assay involviert einen primär-Screen, gefolgt von einem validierenden Kontroll-Screen-Assay.
  • Der Primär-Screen-Aassay involviert zuerst das Expandieren und das Erhaltung von Sf9-Zellen, das Exprimieren des Neurokinin-Rezeptors und eines rekombinanten calciumsensitiven Aequorinproteins (Sf9AQ11-Zellen) in serumfreier Suspension. Die Zellen werden aus der serumfreien Suspensionskultur genommen, in einem Medium, welches Coelenterazin enthält, resuspendiert, auf 384-Well-Platten plattiert und über Nacht inkubiert. Auf die Inkubation werden zwei Zugaben zu den Zellen gemacht: 1) Verbindungen, die gescrenned werden sollen, werden in verdünnter Lösung dispergiert und 2) Signalentwicklung wird in dem Luminometer durch die Zugabe des Liganden LTTK-II ausgelöst. Alternativ können die Zellen in Abwesenheit von Coelenterazin plattiert werden und nach einer Inkubation über Nacht wird Coelenterazin eingebracht für eine 2–4-stündige Inkubation. Der Assay kann dann initiiert werden durch die Zugabe der zu screenenden Verbindung gefolgt von LTTK-II.
  • In einem typischen Primär-Screen-Assay werden die folgenden Komponentenzugegeben und zwar in der folgenden Reihenfolge:
    • a) 30 μl einer Lösung enthaltend SF9AQ11-Zellen resuspendiert in H1 (Grace's Medium mit 5 μM Coelenterazin und 30 μM Glutathion); und
    • b) 10 μl einer Lösung enthaltend 80 μM VERBINDUNG aufgelöst in S5 (Grace's Medium mit 9 mM CaCl2 und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA)(w/v)).
  • Die resultierende Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur für 2–5 Minuten inkubiert und dann wird das Folgende zugegeben:
    40 μl einer Lösung enthaltend 1X H3 (Grace's Medium mit 9 mM CaCl2, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) (w/v) und 200 nM LTTK-II).
  • Auf eine 5-sekündige Verzögerung wird die Lumineszenz des Aequorinsignals für 1 Minute ausgelesen.
  • Um die Kandidaten-Antagonisten zu validieren, die in dem Primärscreen identifiziert wurden, wird dann ein Kontrollassay durchgeführt, welcher auf einem endogenen GPCR-Signalpfad in den Sf9AQ11-Zellen basiert, die in dem Primärscreen verwendet werden. Dieser GPCR-Pfad wird aktiviert durch den insektischen Peptidliganden, Crustacean Cardioactive Peptide (CCAP) und resultiert in Aequorinlumineszenz. Das Verfahren zur Detektion des Assays ist die Messung eines Anstiegs in der Lumineszenzemission bei 466 nm in Sf9-Aequorinzellen. Der Anstieg resultiert aus der Aktivierung von endogenen NKD-Rezeptoren durch den Peptidagonisten LTTK-II, was zum Anstieg im intrazellulären Calcium detektiert durch calciumsensitives Aequorin führt. Rekombinantes Aequorin wird stabil in diesen Zellen exprimiert und ein aktives Holoprotein wird in der Gegenwart von molekularem Sauerstoff mit Apoaequorin und dessen Cofaktor, Coelenterazin, ausgebildet. Lumineszenz kann detektiert werden durch Fotomultiplier-Tubus- oder CCD-Kamera-basierte Luminometer, die auch programmierbare Flüssigkeits-Einspritz-Einheiten für das schnelle Mischen und das kinetische Aufzeichnen enthalten.
  • In einem typischen Kontroll-Screen-Assay werden die folgenden Komponenten zugegeben und zwar in der folgenden Reihenfolge:
    • a) 30 μl einer Lösung enthaltend SF9AQ11-Zellen resuspendiert in H1 (Grace's Medium mit 5 μM Coelenterazin und 30 μM Glutathion); und
    • b) 10 μl einer Lösung enthaltend 80 μM VERBINDUNG aufgelöst in S5 (Grace's Medium mit 9 mM CaCl2 und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA)(w/v)).
  • Die resultierende Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur für 2–5 Minuten inkubiert und dann wird das Folgende zugegeben:
    40 μl einer Lösung enthaltend 1X H3 (Grace's Medium mit 9 mM CaCl2, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) (w/v) und 2 μM CCAP).
  • Auf eine 5-sekündige Verzögerung wird die Lumineszenz des Aequorinsignals für 1 Minute ausgelesen.
  • Beispiel 4: Validierung
  • Zwei Drosophila Neurokinin-Rezeptor-verwandte Sequenzen, NKD und DTKR wurden identifiziert und vollständig als essenzielle Gene validiert. Die Entfernung von Transposons aus kodierenden Regionen von beiden Genen resultierten im Wiederauftreten der Lethalität. Beide Neurokinin-Rezeptoren werden in Kopf und Körper von Erwachsenen sowie in spätembryonischer ZNS exprimiert. Der endogene NKD-Rezeptor in Sf9-Zellen (Spodopterane NKD) wurde kloniert und teilt 98 % Aminosäure-Sequenz-Identität mit Heliothis NKD und 36 % bzw. 26 % Identität mit Drosophila NKD bzw. DTKR. Die genetische Validierung der Lethalität, das Timings und die Lokalisierung der NKD-Expression sowie der physiologischen Prozesse reguliert durch die insektischen Tachykinine deutet an, dass die Wirkstoffe, die in der Lage sind, die NKD-Aktivierung zu blockieren gute Insektizid-Kandidaten sein würden.
  • Während die vorliegende Erfindung unter Verweis auf spezielle Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte sich für den Fachmann verstehen, dass verschiedene Veränderungen erfolgen können und Äquivalente substituiert werden können, ohne vom richtigen Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Darüber hinaus können viele Modifikationen durchgeführt werden, um eine spezielle Situation, ein Material, eine Materiezusammensetzung, ein Verfahren, einen Verfahrensschritt oder Verfahrensschritte an die Aufgabe, den Geist und den Umfang der Erfindung anzupassen. Alle solchen Modifikationen sind als innerhalb des Umfangs der Ansprüche, die hier beigefügt sind, beabsichtigt.
    •
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (12)

  1. Ein isoliertes Polynukleotid umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04 umfasst.
  2. Ein isoliertes Polynukleotid umfassend eine Nukleotidsequenz, die zumindest ungefähr 75 % Nukleotidsequenzidentität mit der Nukleotidsequenz dargestellt in SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 aufweist.
  3. Ein isoliertes Polynukleotid umfassend eine Nukleotidsequenz, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das die Sequenz dargestellt in SEQ ID NO:01 oder SEQ ID NO:03 aufweist.
  4. Ein rekombinanter Vektor umfassend ein Polynukleotid gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3.
  5. Eine rekombinante Wirtszelle umfassend einen rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 4.
  6. Ein Verfahren zum Herstellen eines Insekten-Neurokinin-Rezeptors umfassend das Kultivieren der Wirtszelle von Anspruch 5 unter Bedingungen geeignet zur Expression von besagtem Protein und das Wiedergewinnen besagten Proteins.
  7. Ein aufgereinigtes Protein umfassend eine Aminosäuresequenz, die zumindest ungefähr 80 % Sequenzidentität mit der Sequenz dargestellt in SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04 aufweist.
  8. Ein Verfahren zum Detektieren eines Agens, welches die Calcium-Ionenkanal-Aktivität eines Insekten-Neurokinin-Rezeptors (NKD) reduziert, wobei besagtes Verfahren das Inkontaktbringen von besagtem NKD oder einem Fragment davon, die Calcium-Ionenkanal-Aktivität aufweisen, mit einem Testagens umfasst; und das Bestimmen des Effekts, falls einer auftritt, von besagtem Testagens auf die Calcium-Ionenkanal-Aktivität von besagtem NKD-Polypeptid oder Fragment; wobei die Aminosäuresequenz von besagtem NKD eine Aminosäuresequenz umfasst, die zumindest ungefähr 80 % identisch zur Sequenz dargestellt in SEQ ID NO:02 oder SEQ ID NO:04 ist.
  9. Das Verfahren von Anspruch 8, des Weiteren umfassend das Auswählen eines Testagens, welches die NKD-Calcium-Ionenkanal-Aktivität reduziert; die Bestimmung eines Effektes, falls einer vorliegt, des Testagens auf die Überlebensfähigkeit des Insekts, wobei ein Testagens, welche die Insektenlebensfähigkeit reduziert als ein pestizidales Agens identifiziert wird.
  10. Das Verfahren von Anspruch 8, wobei besagtes Inkontaktbringen das Verabreichen besagten Testagens an kultivierte Wirtszellen umfasst, die genetisch manipuliert wurden, um besagtes NKD zu produzieren.
  11. Ein Verfahren zum Eindämmen eines Schädlings, umfassend das Inkontaktbringen eines Schädlings mit einer Verbindung identifiziert durch ein Verfahren gemäß Anspruch 8.
  12. Ein isoliertes Agens, welches die Calcium-Ionenkanal-Aktivität eines Insekten-Neurokinin-Rezeptors reduziert.
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