DE102004056794A1 - Protein biochip for the validation of binders - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Anordnung von Proteinen, enthaltend mindestens eine cDNA-Expressionsbibliothek, und dessen Verwendung als Protein-Biochip, insbesondere zur Validierung von Bindern sowie Protein-Bindern, und Verfahren zur simultanen Bestimmung quantitativer Größen.The present invention relates to an array of proteins containing at least one cDNA expression library and its use as a protein biochip, in particular for the validation of binders and protein binders, and to methods for the simultaneous determination of quantitative quantities.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Anordnung von Proteinen enthaltend mindestens eine cDNA-Expressionsbibliothek und dessen Verwendung als Protein-Biochip, insbesondere zur Validierung von Bindern in Gegenwart von Protein-Bindern und Verfahren zur simultanen Bestimmung quantitativer Größen.The The present invention relates to an assembly of proteins at least one cDNA expression library and its use as a protein biochip, in particular for validation of binders in the presence of protein binders and simultaneous methods Determination of quantitative quantities.
Protein-Biochips gewinnen eine zunehmende industrielle Bedeutung in der Analytik und Diagnostik sowie in der Pharmaentwicklung.Protein biochips gain an increasing industrial importance in analytics and diagnostics as well as in pharmaceutical development.
Insbesondere konnten mit Hilfe von Protein-Biochips bei der Analyse des Genoms und der Genexpression ein großer Informationsgewinn geleistet werden. Hierbei wird die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Analysemoleküle in einem einzigen Experiment ermöglicht. Zur Herstellung von Protein-Biochips ist es erforderlich, die benötigten Proteine zur Verfügung zu haben. Hierzu haben sich Protein-Expressionsbibliotheken etabliert. Die Hochdurchsatz-Klonierung von definierten offenen Leserahmen ist eine Möglichkeit (Heyman, J.A., Cornthwaite, J., Foncerrada, L., Gilmore, J.R., Gontang, E., Hartman, K.J., Hernandez, C.L., Hood, R., Hull, H.M., Lee, W.Y., Marcil, R., Marsh, E.J., Mudd, K.M., Patino, M.J., Purcell, T.J., Rowland, J. J., Sindici, M.L. and Hoeffler, J.P. (1999) Genome-scale cloning and expression of individual open reading frames using topoisomerase I-mediated ligation. Genome Res, 9, 383–392; Kersten, B., Feilner, T., Kramer, A., Wehrmeyer, S., Possling, A., Witt, I., Zanor, M.I., Stracke, R., Lueking, A., Kreutzberger, J., Lehrach, H. and Cahill, D. J. (2003) Generation. of Arabidopsis protein chip for antibody and serum screening. Plant Molecular Biology, 52, 999–1010; Reboul, J., Vaglio, P., Rual, J. F., Lamesch, P., Martinez, M., Armstrong, C.M., Li, S., Jacotot, L., Bertin, N., Janky, R., Moore, T., Hudson, J.R., Jr., Hartley, J.L., Brasch, M.A., Vandenhaute, J., Boulton, S., Endress, G.A., Jenna, S., Chevet, E., Papasotiropoulos, V., Tolias, P.P., Ptacek, J., Snyder, M., Huang, R., Chance, M.R., Lee, H., Doucette-Stamm, L., Hill, D.E. and Vidal, M. (2003) C. elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet, 34, 35–41.; Walhout, A.J., Temple, G.F., Brasch, M.A., Hartley, J.L., Lorson, M.A., van den Heuvel, S. and Vidal, M. (2000) GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol, 328, 575–592). Allerdings hängt ein solcher Ansatz stark mit dem Fortschritt der Genom-Sequenzierungsprojekte und der Annotierung dieser Gensequenzen zusammen. Darüber hinaus ist die Bestimmung der exprimierten Sequenz aufgrund differenzieller Spleißvorgänge nicht immer eindeutig. Dieses Problem kann durch die Anwendung von cDNA- Expressionsbibliotheken umgangen werden (Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method for global protein expression and antibody screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids Research, 26, 5007–5008; Büssow, K., Nordhoff, E., Lübbert, C., Lehrach, H. and Walter, G. (2000) A human cDNA library for high-throughput protein expression screening. Genomics, 65, 1–8; Holz, C., Lueking, A., Bovekamp, L., Gutjahr, C., Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2001) A human cDNA expression library in yeast enriched for open reading frames. Genome Res, 11, 1730–1735; Lueking, A., Holz, C., Gotthold, C., Lehrach, H. and Cahill, D. (2000) A system for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia coli, Protein Expr. Purif., 20, 372–378). Hierbei wird die cDNA eines bestimmten Gewebes in einen bakteriellen oder einen Hefe-Expressionsvektor einkloniert. Die für die Expression verwendeten Vektoren zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass sie induzierbare Promotoren tragen, mit denen sich der Zeitpunkt der Proteinexpression steuern lässt. Darüber hinaus weisen Expressionsvektoren Sequenzen für sogenannte Affinitätsepitope oder -proteine auf, die zum einen den spezifischen Nachweis der rekombinanten Fusions-Proteine mittels eines gegen das Affinitätsepitop gerichteten Antikörpers erlauben, zum anderen wird die spezifische Aufreinigung über Affinitätschromatographie (IMAC) ermöglicht.Especially could with the help of protein biochips in the analysis of the genome and gene expression a big one Information gain be made. Here is the fast and highly parallel detection of a large number of specifically binding analysis molecules in one single experiment allows. To produce protein biochips it is necessary to obtain the required proteins to disposal to have. Protein expression libraries have been established for this purpose. The high-throughput cloning of defined open reading frames is a possibility (Heyman, J.A., Cornthwaite, J., Foncerrada, L., Gilmore, J.R., Gontang, E., Hartman, K.J., Hernandez, C.L., Hood, R., Hull, H.M., Lee, W.Y., Marcil, R., Marsh, E.J., Mudd, K.M., Patino, M.J., Purcell, T.J., Rowland, J.J., Sindici, M.L. and Hoeffler, J.P. (1999) Genome scale cloning and expression of individual open reading frames using topoisomerase I-mediated ligation. Genome Res, 9, 383-392; Kersten, B., Feilner, T., Kramer, A., Wehrmeyer, S., Possling, A., Witt, I., Zanor, M.I., Stracke, R., Lueking, A., Kreutzberger, J., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2003) Generation. of Arabidopsis protein chip for antibody and serum screening. Plant Molecular Biology, 52, 999-1010; Reboul, J., Vaglio, P., Rual, J.F., Lamesch, P., Martinez, M., Armstrong, C.M., Li, S., Jacotot, L., Bertin, N., Janky, R., Moore, T., Hudson, J.R., Jr., Hartley, J.L., Brasch, M.A., Vandenhaute, J., Boulton, S., Endress, G.A., Jenna, S., Chevet, E., Papasotiropoulos, V., Tolias, P.P., Ptacek, J., Snyder, M., Huang, R., Chance, M.R., Lee, H., Doucette strain, L., Hill, D.E. and Vidal, M. (2003) C. elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet, 34, 35-41 .; Walhout, A.J., Temple, G.F., Brasch, M.A., Hartley, J.L., Lorson, M.A., van den Heuvel, S. and Vidal, M. (2000) GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeoms. Methods Enzymol, 328, 575-592). However, one depends Such an approach strongly correlates with the progress of genome sequencing projects and the annotation of these gene sequences together. Furthermore is the determination of the expressed sequence due to differential Splicing operations are not always unique. This problem can be overcome by the application of cDNA expression libraries be bypassed (Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method for global protein expression and antibody screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids Research, 26, 5007-5008; Büssow, K., Nordhoff, E., Lübbert, C., Lehrach, H. and Walter, G. (2000) A human cDNA library for high-throughput protein expression screening. Genomics, 65, 1-8; Wood, C., Lueking, A., Bovekamp, L., Gutjahr, C., Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2001) A human cDNA expression library in yeast enriched for open reading frames. Genome Res, 11, 1730-1735; Lueking, A., Wood, C., Gotthold, C., Lehrach, H. and Cahill, D. (2000) A system for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia coli, protein Expr. Purif., 20, 372-378). In this case, the cDNA of a particular tissue in a bacterial or a yeast expression vector cloned. The expression The vectors used are generally characterized in that they carry inducible promoters that coincide with the timing controlling protein expression. About that In addition, expression vectors have sequences for so-called affinity epitopes or proteins, which on the one hand the specific proof of recombinant fusion proteins by means of one against the affinity epitope directed antibody secondly, the specific purification is via affinity chromatography (IMAC).
Beispielsweise wurden die Genprodukte einer cDNA-Expressionsbibliothek aus humanem fötalen Hirngewebe in dem bakteriellen Expressionssystem Escherichia coli im Hochdichte-Format auf einer Membran angeordnet und konnten erfolgreich mit unterschiedlichen Antikörpern gescreent werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an Volllänge-Proteinen bei mindestens 66% liegt. Die rekombinanten Proteine dieser Bibliothek konnten darüber hinaus im Hochdurchsatz exprimiert und aufgereinigt werden Braun P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, E. and LaBaer, J. (2002) Proteome scale purification of human proteins from bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 2654–2659; Büssow (2000) supra; Lueking, A., Horn, M., Eickhoff, H., Büssow, K., Lehrach, H. and Walter, G. (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody screening. Analytical Biochemistry, 270, 103–111. Solche Protein-Biochips auf der Basis von cDNA-Expressionsbibliotheken sind insbesondere Gegenstand der WO 99/57311 und WO 99/57312.For example were the gene products of a cDNA expression library from human fetal brain tissue in the bacterial expression system Escherichia coli in high-density format on a Membrane arranged and could successfully with different antibodies be screened. It could be shown that the proportion of full-length proteins is at least 66%. The recombinant proteins of this library could about it Be expressed in high throughput and purified brown P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, E. and LaBaer, J. (2002) Proteome scale purification of human proteins from bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 2654-2659; Büssow (2000) supra; Lueking, A., Horn, M., Eickhoff, H., Büssow, K., Lehrach, H. and Walter, G. (1999) Protein microarrays for genes expression and antibody screening. Analytical Biochemistry, 270, 103-111. Such protein biochips based on cDNA expression libraries are in particular Subject of WO 99/57311 and WO 99/57312.
Im Stand der Technik sind solche Anordnungen von Proteinen auf der Basis von cDNA-Expressionsbibliotheken hauptsächlich zur qualitativen Analyse eingesetzt worden. Es besteht jedoch ein hohes Bedürfnis solche Protein-Biochips auf der Basis von cDNA-Expressionsbibliotheken zur Validierung von Bindern an Protein-Bindern einzusetzen (z.B. Antikörper/Antigen).in the Prior art are such arrangements of proteins on the Base of cDNA expression libraries mainly for qualitative analysis been used. However, there is a great need for such Protein biochips based on cDNA expression libraries for the validation of binders on protein binders (e.g. Antibody / antigen).
Insbesondere sind für die Qualitätsbestimmung eines Binders an einen Protein-Binder quantitative Größen von Relevanz wie "Kreuzreaktivität", "Spezifität" oder "Sensitivität", "Dynamischer Bereich".Especially are for the quality determination a binder to a protein binder quantitative sizes of Relevance such as "cross-reactivity", "specificity" or "sensitivity", "dynamic range".
Im Stand der Technik werden solche quantitativen Größen nicht parallel oder gleichzeitig, sondern einzeln und zeitlich versetzt bevorzugt mit herkömmlichen Methoden, wie z.B. Dot-Blot, Western-Blot, ELISA, EIA oder RIA gemessen. Ebenfalls wurden neuerdings Protein-Arrays und Protein-Biochips eingesetzt. Beispielsweise konnte in Einzelmessung die Bindungsspezifität verschiedener monoklonaler Antikörper wie anti-HSP90β, anti-GAPDH oder anti-α-Tubulin auf einem Protein-Microarray, bestehend aus 96 humanen rekombinant exprimierten Proteinen analysiert werden (Lueking (1999) supra). Zudem konnte die Kreuzreaktivität zweier monoklonaler Antikörper gegen ungefähr 2500 unterschiedliche Proteine untersucht werden (Lueking, A., Possling, A., Huber, O., Beveridge, A., Horn, M., Eickhoff, H., Schuchardt, J., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2003) A Nonredundant Human Protein Chip for Antibody Screening and Serum Profiling. Mol Cell Proteomics, 2, 1342–1349).in the In the prior art, such quantitative quantities are not parallel or simultaneous, but individually and temporally offset preferably with conventional Methods, such as Dot blot, Western blot, ELISA, EIA or RIA. Also have been recently Protein arrays and protein biochips used. For example, could in single measurement the binding specificity of different monoclonal antibody like anti-HSP90β, anti-GAPDH or anti-α-tubulin on a protein microarray, consisting of 96 human recombinantly expressed proteins (Lueking (1999) supra). In addition, the cross-reactivity of two monoclonal antibody against about 2500 different proteins are investigated (Lueking, A., Possling, A., Huber, O., Beveridge, A., Horn, M., Eickhoff, H., Schuchardt, J., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2003) A Nonredundant Human Protein Chip for Antibody Screening and Serum Profiling. Mol Cell Proteomics, 2, 1342 to 1349).
Daher betrifft die Erfindung einen Protein-Biochip bzw. einen Protein-Microarray mit der Aufgabe mindestens zwei oder mehr quantitativen Größen parallel bzw. gleichzeitig oder simultan bestimmen zu können.Therefore The invention relates to a protein biochip or a protein microarray with the task at least two or more quantitative sizes in parallel or to be able to determine simultaneously or simultaneously.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass eine Anordnung von Protein-Bindern enthaltend mindestens eine cDNA-Expressionsbibliothek bereit gestellt wird, wobei ein erster Bereich der Anordnung eine Gesamtheit von Protein-Bindern, ggfs. samt Bindern repräsentiert, wobei in einem zweiten Bereich der Anordnung mindestens ein ausgewählter Protein-Binder aus der Gesamtheit von Protein-Bindern in unterschiedlichen Mengen bezogen auf eine Einheit repräsentiert ist.The Task is solved by that an array of protein binders containing at least one cDNA expression library is provided, wherein a first region of the arrangement a Totality of protein binders, if necessary represented together with binders, wherein in a second region of the array at least one selected protein binder from the totality of protein binders represented in different quantities relative to one unit is.
Der Begriff „Protein-Binder" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass ein Binder in Gegenwart eines Protein-Binders diesen kontaktiert oder an diesen bindet oder zumindest in Wechselwirkung tritt. Im weitesten Sinne ist der Binder an den Protein-Binder adressiert bzw. der Binder erkennt den Protein-Binder bzw. der Protein-Binder hat das Potential mit einem Binder in Wechselwirkung zu treten.Of the Term "protein binder" in the sense of this Invention means that a binder in the presence of a protein binder contacted or binds to this or at least in interaction occurs. In the broadest sense, the binder is addressed to the protein binder or the binder recognizes the protein binder or the protein binder has the Potential to interact with a binder.
Protein-Binder können Proteine, Peptide, modifizierte Proteine/Peptide, rekombinante Proteine/Peptide, Antikörper oder Antigene sein, oder sonstige Proteine die auf einem erfindungsgemäßen Proteinbiochip repräsentiert werden können. Idealer Weise werden die Protein-Binder aus der cDNA-Expressionsbibliothek erhalten und werden entsprechend immobilisiert. Ferner können die Protein-Binder chemisch oder physikalisch modifiziert sein, z.B. nicht abschließend: Biotinylierung, Phosphorylierung, denaturiert über Hitze oder denaturiert mittels 4-8 Molar Harnstoff, Mercaptoethanol-Behandlung zur Reduktion von Schwefelwasserstoffbrücken.Protein Binder can Proteins, peptides, modified proteins / peptides, recombinant proteins / peptides, antibody or antigens, or other proteins that represents a protein biochip according to the invention can be. Ideally, the protein binders are obtained from the cDNA expression library and are immobilized accordingly. Furthermore, the protein binders can be chemically or be physically modified, e.g. not conclusive: biotinylation, Phosphorylation, denatured via Heat or denatured by 4-8 molar urea, mercaptoethanol treatment for reduction of hydrogen sulfide bridges.
Geeignete Binder im Sinne dieser Erfindung können nicht abschließend sein: Proteine, Peptide, modifizierte Proteine/Peptide, rekombinante Proteine/Peptide, Antikörper oder Antigene sein, oder sonstige Proteine, Proteide, Hormone, Nicht-Proteine wie z.B. RNA, DNA oder Aptamere, chemische Sonden, chemische Moleküle, Substanzbibliotheken, Pharmazeutika etc.suitable Binders in the sense of this invention can not be conclusive: Proteins, peptides, modified proteins / peptides, recombinant proteins / peptides, antibody or antigens, or other proteins, proteids, hormones, non-proteins such as. RNA, DNA or aptamers, chemical probes, chemical molecules, substance libraries, Pharmaceuticals etc.
Die Binder können in (auf)gereinigter Form sowie gemischt oder gar in einer heterogenen Proteinmischung, wie ein Lysat oder Aufschluß (z.B. Bakterienlysat, Säugerzellysat) vorliegen. Dies spiegelt die Qualität des Binders in komplexen Gemischen, wie sie beispielsweise in der Immunohistochemie auftreten, wider.The Binder can in (on) purified form and mixed or even in a heterogeneous Protein mixture, such as a lysate or digest (e.g., bacterial lysate, mammalian cell lysate) available. This reflects the quality of the binder in complex Mixtures, such as occur in immunohistochemistry, contrary.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Binder ebenfalls in der Gesamtheit der Protein-Binder (erster Bereich der erfindungsgemäßen Anordnung) enthalten (z.B. immobilisiert). Besonders vorteilhaft kann die Quantifizierung spezifischer Signale, sowie von kreuzreagierenden Signalen durchgeführt werden. Dies ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen den Protein-Bindern. Insbesondere wird ein interner Standard ermöglicht.In a further embodiment In the invention, the binder is also in the entirety of the protein binders (first portion of the inventive arrangement) (e.g. immobilized). Particularly advantageous, the quantification of specific Signals, as well as cross-reacting signals are performed. this makes possible a direct comparison between the protein binders. Especially an internal standard is made possible.
Insbesondere
betrifft die Erfindung eine solche Anordnung von Protein-Bindern,
bei welcher der erste Bereich und der zweite Bereich eine Einheit
bilden, wobei diese Einheit mindestens einem Binder zugänglich ist.
Insbesondere ist diese Einheit eine physikalische und räumliche
Einheit. Eine mögliche
Ausführungsform zeigt
Besonders vorteilhaft können die erfindungsgemäßen Ausführungsformen zur Bestimmung von quantitativen Größen sein, solche wie „Kreuzreaktivität" und „Sensitivität" sowie des „dynamischen Bereiches" der Binder bzw. Protein-Binder.Especially can be advantageous the embodiments of the invention for the determination of quantitative quantities, such as "cross-reactivity" and "sensitivity" and "dynamic" Area "the binder or protein binders.
Im Sinne dieser Erfindung bedeutet „Kreuzreaktivität", die Eigenschaft der Protein-Binder, neben tatsächlichen Bindern auch an heterologe, ähnliche Strukturen (z.B. andere ähnliche Binder) zu binden oder zumindest mit diesen in Wechselwirkung zu treten. Für die Qualität eines Protein-Binders ist eine geringe Kreuzreaktivität maßgeblich entscheidend. In anderen Worten: je eindeutiger ein Binder für einen Protein-Binder erkennt oder adressiert ist, desto spezifischer und wertvoller ist der Binder.in the Meaning of this invention means "cross-reactivity", the property the protein binder, in addition to actual Bind also to heterologous, similar Structures (e.g., other similar ones Binder) bind or at least interact with them to step. For the quality a protein binder is a low cross-reactivity prevail crucial. In other words, the more clearly a binder for one Protein binder recognizes or is addressed, the more specific and more valuable is the binder.
Der „Grad der Kreuzreaktivität" und die „Spezifität" sind daher eng miteinander verknüpft. Binder, die einen hohen Grad an Kreuzreaktivität zeigen, werden als unspezifisch eingeordnet. Darüber hinaus kann die Spezifität eines Binders ebenfalls dadurch bestimmt werden, dass der Binder Isoformen oder prozessierte Formen (beispielsweise Phosphorilierung) von Protein-Bindern erkennen und/oder unterscheiden kann.The "degree of Cross-reactivity "and the" specificity "are therefore closely related connected. Binders that show a high degree of cross-reactivity are considered nonspecific classified. About that In addition, the specificity also be determined by the fact that the binder Isoforms or processed forms (for example phosphorylation) recognize and / or differentiate from protein binders.
Die „Sensitivität" eines Binders im
Sinne dieser Erfindung beschreibt die minimal erforderliche Konzentration
des Protein-Binders, welches mit diesem Binder noch detektiert werden
kann (siehe
Der „dynamische
Bereich" beschreibt
im Sinne dieser Erfindung den Bereich zwischen dem höchsten und
niedrigsten Detektionswert (Signalintensität) zwischen Binder/Protein-Binder, wobei ein
lineares Verhältnis
zwischen Signalintensität
und Konzentration des detektierten Protein-Binders zumeist besteht. Daher beschreibt
der dynamische Bereich, aufgetragen als Signalintensitäten gegen
Mengen pro Einheit, die Korrelation in dem der Binder an den Protein-Binder bindet (siehe
Daher betrifft eine solche Anordung von Protein-Bindern ebenfalls ein Diagnostikum oder einen Protein-Biochip bzw. Protein-Microarray. Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet „Anordnung" synonym „Array" und sofern dieser „Array" zur Identifizierung von Bindern bzw. Protein-Bindern verwendet wird, ist hierunter ein „Assay" zu verstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anordnung derart gestaltet, dass die auf der Anordung repräsentierten Protein-Binder in Form eines Gitters vorliegen. Ferner sind solche Anordnungen bevorzugt, die eine hochdichte (high-density) Anordnung von Protein-Bindern erlauben. Solche hochdichte Anordnungen sind beispielsweise in der WO 99/57311 und WO 99/57312 offenbart.Therefore also relates to such an arrangement of protein binders Diagnostic or a protein biochip or protein microarray. In the context of this invention, "arrangement" synonymously means "array" and if this "array" for the identification of binders or Protein binders is used, this is an "assay" to understand a preferred embodiment the arrangement is such that those represented on the arrangement Protein binder in Form of a grid. Furthermore, such arrangements are preferred a high-density array of protein binders allow. Such high-density arrangements are for example in the WO 99/57311 and WO 99/57312.
In einer besonderen Ausführungsform liegen die Protein-Binder als Clone, insbesondere im ersten Bereich der erfindungsgemäßen Anordnung, vor. Solche Clone können beispielsweise mittels einer erfindungsgemäßen cDNA-Expressionsbibliothek erhalten werden (Büssow et al. 1998 (supra)). In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche Expressionsbibliotheken enthaltend Clone mittels Expressionsvektoren aus einer exprimierenden cDNA Bibliothek erhalten. Dies Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise induzierbare Promotoren. Die Induktion der Expression kann z.B. mittels eines Induktors, solche wie IPTG, erfolgen. Geeignete Expressionsvektoren sind beschrieben in Terpe et al. (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan;60(5):523–33). Zusätzlich liegt das Expressionsprodukt bevorzugt in Form eines Fusionsproteins vor, welches beispielsweise mindestens ein Affinitätsepiptop oder "Tag" enthält. Der Tag kann ein solcher sein wie wie c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder Strep-Tag, HAT-tag, NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA, ein Fusionsprotein, vorzugsweise eine Cellulose-bindende Domäne, grünfluoreszierendes Protein, Maltose bindendes Protein, calmodulin-bindendes Protein, Glutathione S-transferase oder lacZ enthalten.In a particular embodiment the protein binders are clones, especially in the first region the arrangement according to the invention, in front. Such clones can be obtained for example by means of a cDNA expression library according to the invention (Buessow et al. 1998 (supra)). In a preferred embodiment, such expression libraries become containing clones by means of expression vectors from an expressing cDNA library obtained. These expression vectors preferably contain inducible promoters. Induction of expression may be e.g. by means of an inductor, such as IPTG. Suitable expression vectors are described in Terpe et al. (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan; 60 (5): 523-33). additionally the expression product is preferably in the form of a fusion protein which is, for example, at least one affinity epitope or "day" contains. Of the Day can be such as c-myc, His-tag, Arg-tag, FLAG, alkaline phosphatase, V5 tag, T7 tag or strep tag, HAT tag, NusA, S-tag, SBP tag, Thioredoxin, DsbA, a fusion protein, preferably a cellulose-binding one Domain, green fluorescent Protein, maltose binding protein, calmodulin binding protein, Glutathione S-transferase or lacZ included.
Expressionsbibliotheken sind dem Fachmann bekannt, diese können nach Standardwerken, wie Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York hergestellt werden. Weiterhin bevorzugt sind solche Expressionsbibliotheken, die gewebespezifisch sind (z.B. humanes Gewebe, insbesondere humane Organe). Ferner sind erfindungsgemäß ebenfalls solche Expressionsbibliotheken mit eingeschlossen, die mittels exontrapping erhalten werden können. Statt Expressionsbibliothek kann synonym von einer Expressionsbank gesprochen werden.expression libraries are known in the art, these can according to standard works, such as Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York. Further preferred are such expression libraries that are tissue specific (e.g. human tissue, in particular human organs). Furthermore, according to the invention also such expression libraries included by means of exontrapping can be obtained. Instead of expression library can be synonymous of an expression library to be spoken.
Weiterhin bevorzugt sind Protein-Biochips oder entsprechende Expressionsbibliotheken, die keine Redundanz aufweisen (sogenannte: Uniclone®-Bibliothek) und nach den Lehren der WO 99/57311 und WO 99/57312 beispielsweise hergestellt werden können. Diese bevorzugten Uniclone- Bibliotheken weisen eine hohen Anteil an nicht-fehlerhaften vollständig exprimierten Proteinen einer cDNA-Expressionsbibliothek auf.Also preferred are protein biochips or corresponding expression libraries that have no redundancy (called: UNIclone ® library) and can be prepared according to the teachings of WO 99/57311 and WO 99/57312, for example. These preferred Uniclone libraries have a high content of non-defective, fully expressed proteins of a cDNA expression library.
Im Rahmen dieser Erfindung können die Clone ebenfalls nicht abschließend solche sein, wie transformierte Bakterien, rekombinante Phagen oder transformierte Zellen von Säugern, Insekten, Pilzen, Hefen oder Pflanzen.in the Within the scope of this invention the clones, too, will not be as final as transformed Bacteria, recombinant phages or transformed cells of mammals, insects, Mushrooms, yeasts or plants.
Die Clone werden auf einen festen Träger fixiert oder immobilisiert.The Clones become a solid carrier fixed or immobilized.
Der Begriff "fester Träger" umfasst Ausführungen wie einen Filter, eine Membran, ein magnetisches Kügelchen, ein Silizium-Wafer, Glas, Metall, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix.Of the Term "solid Carrier "includes versions like a filter, a membrane, a magnetic bead, a silicon wafer, glass, metal, a chip, a mass spectrometric Target or a matrix.
Als Filter ist PVDF oder Nylon bevorzugt (Z.B. Hybond N+ Amersham).When Filter is PVDF or nylon preferred (e.g., Hybond N + Amersham).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (96 Wells, 384 Wells oder mehr), eines Silizium-Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt.In a further preferred embodiment the inventive arrangement This corresponds to a grid that the order of a microtiter plate (96 wells, 384 wells or more), a silicon wafer, a chip, a mass spectrometric target or a matrix.
Erfindungsgemäß erlaubt eine solche erfindungsgemäße Anordnung ein Screening von mindestens einem Bindern an den Protein-Bindern mit nachträglicher Auswertung.Allowed according to the invention Such an inventive arrangement a screening of at least one binder on the protein binders with a subsequent one Evaluation.
Nachdem der Binder einen Protein-Binder kontaktiert erfolgt die Auswertung, die beispielweise unter Verwendung mit handelsüblicher Image-Analyse Software (GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida (Raytest), ScanArray (Packard Bioscience) erfolgt.After this the binder contacts a protein binder, the evaluation takes place, for example, using commercially available image analysis software (GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida (Raytest), ScanArray (Packard Bioscience).
Zur Auswertung zwecks Bestimmung der Sensitivität und des dynamischen Bereiches werden die Signalintensitäten über die Konzentrationen aufgetragen.to Evaluation for the purpose of determining the sensitivity and the dynamic range are the signal intensities on the Applied concentrations.
Zur Bestimmung der Kreuzreaktivität wird die Signal-Intensität der spezifischen Protein-Binder (z.B. Antigen), gegen die die Binder gerichtet sind, auf 100% gesetzt. Die Signal-Intensitäten der kreuzreagierenden Protein-Binder werden hierzu ins Verhältnis gesetzt und zur Bewertung des Binders herangezogen.to Determination of cross-reactivity becomes the signal intensity the specific protein binder (e.g., antigen) against which the binders are set to 100%. The signal intensities of the cross-reacting protein binders be in proportion to this set and used to evaluate the binder.
Daher erlaubt die erfindungsgemäße Anordnung die simultane bzw. gleichzeitige Bestimmung quantitativer Größen.Therefore allows the arrangement according to the invention the simultaneous or simultaneous determination of quantitative quantities.
Dies ist insbesondere darin begründet, dass die Anordnung eine Probeninvidualisierung des Binders für den ersten und zweiten Bereich der erfindungsgemäßen Anordnung erlaubt. Der erste und zweite Bereich ist zugänglich einer Probe enthaltend mindestens einen Binder. Dies führt zu einer vorteilhaften hohen Reproduzierbarkeit und Standardisierung der Proben und erlaubt die High-throughput Anwendung dieser erfindungsgemäßen Anordnung.This is in particular justified in that that the assembly is a sample inividation of the binder for the first and second area of the arrangement according to the invention allowed. Of the first and second area is accessible a sample containing at least one binder. This leads to a advantageous high reproducibility and standardization of Samples and allows the high-throughput application of this arrangement according to the invention.
Die Visualisierung solcher Binder kann beispielsweise mittels Fluoresenzmarkierung, Biotiniylierung oder Radio-Isotopen-Markierung in üblicher Weise erfolgen. Ein Auslesung erfolgt z.B. mittels eines Microarray-Laserscanners.The Visualization of such binders can be carried out, for example, by means of fluorescence marking, Biotinization or radio-isotope labeling in the usual way. One Readout is e.g. by means of a microarray laser scanner.
Der Begriff „unterschiedliche Mengen bezogen auf eine (lokale) Einheit" bedeutet, dass z.B. unterschiedliche Konzentrationen (Gewicht/Flächeneinheit, Gewicht/Volumeneinheit, Mol (Teilchenzahl)/Flächeneinheit, Mol (Teilchenzahl)/Volumeneinheit) vorliegen. Insbesondere kann eine sogenannte lineare Konzentrationsreihe oder lineare Verdünnungsreihe vorliegen. Bevorzugte Reihen sind 1 μmol bis 0,1 amol, insbesondere 100 pmol bis 0,1 fmol, besonders bevorzugt 10 pmol bis 1 fmol auf einer Flächeneinheit oder Volumeneinheit bzw. pro Spot (zB. eines Mikroarray).Of the Term "different Quantities in terms of a (local) unit "means that, for example, different Concentrations (weight / unit area, Weight / volume unit, mol (particle number) / unit area, mol (particle number) / volume unit) available. In particular, a so-called linear concentration series or linear dilution series available. Preferred series are 1 μmol to 0.1 Amol, in particular 100 pmol to 0.1 fmol, more preferably 10 pmol to 1 fmol a unit area or volume unit or per spot (eg a microarray).
Eine „Gesamtheit von Proteinbindern" bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine genügende Zahl an verschiedenen Proteinbindern und ggfs. Bindern herangezogen werden können. Bevorzugt sind mindestens 96 bis 25000 (numerisch) oder mehr aus verschiedenen Protein-Bindern. Bevorzugt jedoch mehr als 2500, besonders bevorzugt 10.000 oder mehr Protein-Binder, die beispielsweise aus einer Expressionsbibliothek resultieren.A "whole of protein binders " in the sense of the invention that a sufficient number of different Protein binders and, if necessary, binders can be used. Prefers are at least 96 to 25000 (numerical) or more from different Protein binders. Preferably, however, more than 2500, more preferably 10,000 or more protein binders, for example, from an expression library result.
Ferner erlaubt die erfindungsgemäße Anordnung von Protein-Bindern die simultane/gleichzeitige Validierung von mehreren Bindern bzw. deren vergleichenden Analyse hinsichtlich quantitativer Größen.Further allows the arrangement according to the invention of protein binders the simultaneous / simultaneous validation of multiple binders or their comparative analysis in terms of quantitative sizes.
Daher betrifft die Erfindung ein Verfahren, wobei die Einheit aus dem ersten und zweiten Bereich mit mindestens einem Binder kontaktiert wird. Die Erfindung betrifft zudem ein Verfahren zum Vergleich von zwei oder mehr Bindern an Protein-Bindern, wobei eine erfindungsgemäße Anordnung von Protein-Bindern mit den zu vergleichenden Bindern in Kontakt gebracht wird und ausgewertet wird.Therefore, the invention relates to a method wherein the unit from the first and second region is contacted with at least one binder. The invention also relates to a method for comparing two or more binders to protein binders, wherein an inventive arrangement of protein binders is brought into contact with the binders to be compared and evaluated.
Für die Bewertung der Qualität (Validierung) des Protein-Binders wird die Signal-Intensität eines spezifischen Binders, gegen die die Binder gerichtet sind, auf 100 gesetzt. Die Signal Intensitäten der kreuzreagierenden Binder/Protein-Binder werden hierzu ins Verhältnis gesetzt und zur Bewertung des Binders herangezogen.For the rating the quality (Validation) of the protein binder becomes the signal intensity a specific binder against which the binders are directed, set to 100. The signal intensities of the cross-reacting binder / protein binders become this in proportion set and used to evaluate the binder.
Tabelle 1: Untersuchung der Kreuzreaktivität. Am Beispiel von drei Bindern (A, B, C) wird die unterschiedliche Kreuzreaktivität gezeigt. Table 1: Examination of cross-reactivity. The example of three binders (A, B, C) shows the different cross-reactivity.
Beispielsweise
zeigt die Analyse von drei verschiedenen Bindern (siehe
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.The The following examples serve to illustrate the invention without to limit the invention to these.
Durchführung:Execution:
Generierung der Proteine für Content 2-Feld:Generation of proteins for content 2 field:
Es erfolgt die Anzucht der Expressionsklone aus einer cDNA Expressionsbibliothek (Büssow (1998) supra) im Hochdurchsatzformat (96er Mikrotiterplatte) über Nacht. Die Proteinexpression der Klone wirden am nächsten Tag induziert, gefolgt von der Proteinaufreinigung im Hochdurchsatzformat. Dieser gesamte Prozess ist beschrieben in den folgenden Publikationen: (Büssow (2000) supra, Lueking (1999) supra, Lueking (2003) supra). Die aufgereinigten Proteine werden einer Qualitätskontrolle über SDS-PAGE unterzogen.It the culture of the expression clones is carried out from a cDNA expression library (Buessow (1998) supra) in high-throughput format (96-well microtiter plate) overnight. Protein expression of the clones is induced the next day, followed from protein purification in high throughput format. This entire Process is described in the following publications: (Büssow (2000) supra, Lueking (1999) supra, Lueking (2003) supra). The cleaned up Proteins will be quality-controlled via SDS-PAGE subjected.
Stammen Proteine des Content 1-Feldes ebenfalls einer cDNA Expressionsbibliothek wie sie unter Büssow et al., 1998 (supra) beschrieben ist, können diese analog exprimiert und aufgereinigt werden. Ansonsten können diese Proteine auch einen anderen Ursprung haben (z.B. kommerziell erhältlich).Come Proteins of the Content 1 field also a cDNA expression library as she did under Büssow et al., 1998 (supra), they can be expressed analogously and purified. Otherwise, these proteins can also have a other origin (e.g., commercially available).
Generierung des „Binder Validation Chip":Generation of the "binder Validation Chip ":
Zunächst wird ein geeigneter Träger ausgewählt. Dieses können verschieden beschichtete Mikroskop Objektträger sein, welche von verschiedenen kommerziellen Anbietern erhältlich sind (zB. Schleicher und Schüll, Menzel, Sigma etc.). Sowohl zwei- als auch dreidimensionale Oberflächen lassen sich gut verwenden. Danach werden die Konzentrationen der spezifischen Antigene/Proteine bestimmt und auf die Molarität bezogen, so dass eine Angabe von „x" pmol/μl pro Antigen getroffen werden kann. Basierend auf diesem Wert werden diese spezifischen Antigene/Proteine in definierten Konzentrationen (von hoch nach niedrig im Bereich von 10 pmol/μl zu 1 fmol/μl) verdünnt. Die Proteine von Content 1 und 2 und ihre Verdünnungen werden in einer 384-er Mikrotiterplatte abgelegt und mittels eines Standard- Spotting Robots (wie er auch für die Herstelleung von DNA Chips verwendet wird) auf die ausgewählte Oberfläche übertragen (z.B. beschrieben in Lueking 2003 (supra)).First, a suitable carrier is selected. This may be different coated microscope slides, which are available from various commercial suppliers (eg, Schleicher and Schuell, Menzel, Sigma, etc.). Both two- and three-dimensional surfaces can be used well. Thereafter, the concentrations of the specific antigens / proteins are determined and related to the molarity so that an indication of "x" pmol / μl per antigen can be made, based on which these specific antigens / proteins are expressed in defined concentrations (from high to low in the range of 10 pmol / μl to 1 fmol / μl). The proteins of Content 1 and 2 and their dilutions are stored in a 384 microtiter plate and transferred to the selected surface using a standard spotting robot (as used for the production of DNA chips) (eg described in Lueking 2003 (supra)).
Danach sind die beladenen Protein Biochips für die geplanten Inkubationen bereit.After that are the loaded protein biochips for the planned incubations ready.
Inkubation:incubation:
Zur Visualisierung werden floureszenz-markierte Sekundär-Antikörper gegen den Binder einegsetzt, bzw. der Binder liegt bereits floureszenz-markiert vor.to Visualization will be against fluorescence-labeled secondary antibodies the binder eingsetzt, or the binder is already floureszenz-marked in front.
Die üblichen Schritte sind in Lueking et al. 1999 (supra), Lueking et al. 2003 (supra)) beschrieben, die spezifischen Inkubationsbedingungen (Blocking Puffer, Waschpuffer, sekundärer Antikörper, Inkubationszeiten) werden üblicher Weise durch den Binder vorgegeben.The usual Steps are in Lueking et al. 1999 (supra), Lueking et al. 2003 (supra)), the specific incubation conditions (Blocking Buffer, wash buffer, secondary Antibody, Incubation times) become more common Way given by the binder.
Visualisierung:visualization:
Mit handelüblichen Microarray-Laserscannern (ScanArray 4000 (Packard Bioscience)).With commercial Microarray laser scanners (ScanArray 4000 (Packard Bioscience)).
Image-Analyse:Image analysis:
Mit handelüblicher Image-Analyse-Software GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida (Raytest), ScanArray (Packard Bioscience).With commercial Image analysis software GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida (Raytest), ScanArray (Packard Bioscience).
Auswertung:Evaluation:
Auswertung erfolgt z.B. mittels Excel (Microsoft), wobei für die Bestimmung der Sensitivität und des dynamischen Bereiches die Signal-Intensitäten über die Konzentration aufgetragen werden.evaluation occurs e.g. using Excel (Microsoft), whereby for the determination of the sensitivity and the dynamic Range the signal intensities over the Concentration are applied.
Zur Bestimmung der Kreuzreaktivität wird die Signal-Intensität der spezifischen Antigene, gegen die die Binder gerichtet sind, auf 100% gesetzt. Die Signal-Intensitäten der kreuzreagierenden Antigene/Proteine werden hierzu ins Verhältnis gesetzt und zur Bewertung des Binders herangezogen.to Determination of cross-reactivity becomes the signal intensity the specific antigens against which the binders are directed, set to 100%. The signal intensities of the cross-reacting antigens / proteins become in relation to this set and used to evaluate the binder.
Beschreibung der Figuren:Description of the figures:
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