DE102004027364A1 - Porous, locally-transparent, treated substrate used to detect biochemical binding reactions, includes compartments surrounded by walls with metallic modification - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft poröse, bereichsweise transparente Substrate, die sich als Basis für ein "BioChip-Grundmodul" in Verfahren zum Nachweis biochemischer (Bindungs)Reaktionen sowie hierfür insbesondere zur Untersuchung von enzymatischen Reaktionen, Nukleinsäure-Hybridisierungen, Protein-Protein-Wechselwirkungen und anderer Bindungsreaktionen im Bereich der Genom-, Proteom- oder Wirkstoff-Forschung in Biologie und Medizin, eignen, wobei in dem porösen Substrat optische Barrieren durch lokales, gezieltes Auffüllen von Poren mit optisch nicht-transparentem Material oder durch entsprechende Modifizierung von Porenwänden mit Metall vorgesehen werden.The The present invention relates to porous, partially transparent Substrates that are used as a basis for a "basic BioChip module" in methods of detection biochemical (binding) reactions and in particular for the investigation of enzymatic reactions, nucleic acid hybridizations, protein-protein interactions and other binding reactions in the field of genome, proteome or Drug research in biology and medicine, being in the porous Substrate optical barriers by local, targeted filling of Pores with optically non-transparent material or by appropriate Modification of pore walls be provided with metal.
In der Molekularbiologie finden heute in zunehmendem Maße Biochips Verwendung, mit denen auf schnelle Art und Weise Erkenntnisse über Organismen und Gewebe gewonnen werden. Für die Biowissenschaften und die medizinische Diagnostik ist die Detektion (bio)chemischer Reaktionen, d.h. die Detektion biologisch relevanter Moleküle in definiertem Untersuchungsmaterial von herausragender Bedeutung. In diesem Rahmen wird die Entwicklung von sogenannten Biochips stetig vorangetrieben. Bei derartigen Biochips handelt es sich üblicherweise um miniaturisierte hybride Funktionselemente mit biologischen und technischen Komponenten, insbesondere auf einer Oberfläche eines BioChip-Grundmoduls immobilisierten Biomolekülen, die als spezifische Interaktionspartner dienen. Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf. Man spricht dann von sogenannten „Mikroarrays". Da tausende von biologischen bzw. biochemischen Funktionselementen auf einem Chip angeordnet sein können, werden diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt.In Molecular biology is increasingly finding biochips today Use, with which in a fast way knowledge about organisms and tissues are recovered. For the life sciences and medical diagnostics is the detection (bio) chemical reactions, i. the detection of biologically relevant molecules in defined research material of outstanding importance. In this framework, the development of so-called biochips is steadily promoted. Such biochips are usually to miniaturized hybrid functional elements with biological and technical components, in particular on a surface of a BioChip's basic module immobilized biomolecules serving as specific interaction partners serve. Often has the structure of these functional elements rows and columns. you then speaks of so-called "microarrays." Thousands of biological or biochemical functional elements on a chip can be arranged These are usually made with microtechnical methods.
Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten können z.B. Einzelstränge wie Oligonukleotide, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide, Peptide, Proteine (z.B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren), Derivate der kombinatorischen Chemie (z.B. organische Moleküle), Zellbestandteile (z.B. Organellen), einzelne Zellen, mehrzellige Organismen sowie Zellverbände in Frage.When biological and biochemical functional elements come in particular DNA, RNA, PNA, (for nucleic acids and their chemical derivatives e.g. single strands such as oligonucleotides, triplex structures or combinations thereof saccharides, peptides, proteins (e.g., antibodies, antigens, Receptors), combinatorial chemistry (e.g., organic Molecules), Cell components (e.g., organelles), single cells, multicellular Organisms and cell aggregates in question.
Die am weitesten verbreitete Variante von Biochips sind die sogenannten Microarrays. Dies sind kleine Plättchen ("Chips") aus beispielsweise Glas, Gold, Kunstoff oder Silizium. Zum Nachweis entsprechender biologischer oder biochemischer (Bindungs)Reaktionen werden beispielsweise kleine Mengen an solubilisierten unterschiedlichen Fängermolekülen, z.B. eine bekannte Nukleinsäuresequenz, in Form von kleinsten Tröpfchen punktförmig und matrizenartig, sogenannte Dots, auf der Oberfläche des BioChip-Grundmoduls fixiert.The The most common variant of biochips are the so-called Microarrays. These are little tiles ("Chips") for example Glass, gold, plastic or silicon. To prove such For example, biological or biochemical (binding) reactions small amounts of solubilized different capture molecules, e.g. a known nucleic acid sequence, in the form of the smallest droplets punctiform and matrix-like, so-called dots, on the surface of the BioChip basic module fixed.
In der Praxis werden einige hundert bis einige tausend Tröpfchen pro Chip verwendet. Anschließend wird ein zu untersuchender Analyt, der beispielsweise fluoreszenzmarkierte Zielmoleküle enthalten kann, über diese Oberfläche gepumpt. Dabei kommt es im allgemeinen zu unterschiedlichen chemischen (Bindungs)Reaktionen zwischen den im Analyt enthaltenen Zielmolekülen und den fixierten bzw. immobilisierten Fängermolekülen. Wie bereits angeführt, werden zur Beobachtung dieser Reaktionen oder Bindungen die Zielmoleküle mit Farbstoffmolekülbausteinen, üblicherweise Fluorochromen markiert. Das Vorhandensein und die Intensität von Licht, das von den Fluorochromen emittiert wird, gibt Aufschluß über den Verlauf der Reaktion oder Bindung in den einzelnen Tröpfchen auf dem Substrat, so daß Rückschlüsse auf das Vorhandensein und/oder die Eigenschaft der Zielmoleküle und/oder Fängermoleküle gezogen werden können. Wenn sich die entsprechenden fluoreszenzmarkierten Zielmoleküle des Analyten mit bzw. an den an der Oberfläche des Trägersubstrats immobilisierten Fängermolekülen umsetzen bzw. binden, kann durch optische Anregung mit einem Laser und Messung des entsprechenden Fluoreszenzsignals diese Reaktion bzw. Bindung nachgewiesen werden.In In practice, a few hundred to several thousand droplets per Chip used. Subsequently becomes an analyte to be examined which, for example, fluorescently labeled targets can contain, about this surface pumped. It generally comes to different chemical (Binding) reactions between the target molecules contained in the analyte and the fixed or immobilized capture molecules. As already stated, will be to observe these reactions or bonds, the target molecules with dye molecule building blocks, usually Marked fluorochromes. The presence and intensity of light, which is emitted by the fluorochromes, provides information about the course the reaction or binding in the individual droplets on the substrate, so that conclusions on the presence and / or the property of the target molecules and / or catcher molecules is drawn can be. When the corresponding fluorescence-labeled target molecules of the analyte with or on the surface of the carrier substrate Reactivate immobilized capture molecules or bind, can by optical excitation with a laser and measurement the corresponding fluorescence signal this reaction or binding be detected.
Substrate mit hoher, aber definierter Porosität weisen als Basis für derartige Biochips mehrere Vorteile gegenüber planaren Substraten auf. Auf der stark vergrößerten Oberfläche können mehr Nachweisreaktionen stattfinden. Dadurch steigt die Nachweisempfindlichkeit für biologische Assays. Durch Pumpen der im Analyt gelösten Zielmoleküle durch die Kanäle zwischen Vorder- und Rückseite des porösen Substrates werden diese in nahen räumlichen Kontakt mit der Oberfläche des Substrates gebracht (< 10 μm). Auf dieser Größenskala ist die Diffusion ein sehr effektiver Transportprozess, der innerhalb kurzer Zeit die Distanzen zwischen nachzuweisendem Zielmolekül und dem auf der Oberfläche immobilisierten Fängermolekül überbrückt. Die Geschwindigkeit der Bindungsreaktion kann dadurch erhöht und damit die Dauer des Nachweisverfahrens deutlich verkürzt werden. Poröse Substrate eignen sich somit aufgrund ihrer vorteilhaften fluidischen Eigenschaften sehr gut als Substrat für derartige DNA- und Protein-Microarrays.substrates with high, but defined porosity are the basis for such Biochips face several advantages planar substrates. On the greatly enlarged surface can do more Detection reactions take place. This increases the detection sensitivity for biological Assays. By pumping the target molecules dissolved in the analyte through the channels between front and back of the porous one Substrates will be in close spatial contact with the surface of the substrate Substrate brought (<10 microns). On this size scale Diffusion is a very effective transportation process that takes place within a short time Time the distances between the target molecule to be detected and the on the surface bridged immobilized capture molecule. The Speed of the binding reaction can thereby be increased and thus the duration of the detection procedure will be significantly shortened. Porous substrates are thus suitable due to their advantageous fluidic properties very good as a substrate for such DNA and protein microarrays.
Ein großer Teil der heute verwendeten analytischen Methoden in der Wirkstoff-Forschung und klinischen Diagnostik setzt optische Verfahren zum Nachweis von Bindungsereignissen zwischen nachzuweisender Substanz und Fängermolekülen ein (z.B.One greater Part of today's analytical methods in drug discovery and clinical diagnostics uses optical methods for detection of binding events between substance to be detected and capture molecules (e.g.
DNA-Hybridisierungen, Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen und Protein-Wechselwirkungen). Die nachzuweisende Substanz wird hierbei mit einem Marker versehen, der nach Anregung mit Licht geeigneter Wellenlänge fluoresziert (Fluoreszenzverfahren) oder der eine chemische Reaktion auslöst, die wiederum Licht erzeugt (Chemilumineszenzverfahren). Bindet die nachzuweisende Substanz, d.h. das Zielmolekül, mit dem immobilisierten Fängermolekül auf der Oberfläche, so kann dies optisch, z.B. über Lumineszenz, nachgewiesen werden. Unter dem Begriff "Lumineszenz" wird hierbei die spontane Emission von Photonen im ultravioletten bis infraroten Spektralbereich bezeichnet. Anregungsmechanismen der Lumineszenz können optischer oder nicht-optischer Natur sein, beispielsweise elektrische, chemische, biochemische und/oder thermische Anregungsprozesse. Somit sollen insbesondere Chemi-, Bio- und Elektrolumineszenz sowie Fluoreszenz und Phosphoreszenz unter den Begriff "Lumineszenz" im Sinne dieser Erfindung fallen.DNA hybridizations Antibody-antigen interactions and protein interactions). The substance to be detected becomes in this case provided with a marker, which is more suitable after excitation with light wavelength fluoresces (fluorescence) or a chemical reaction triggers that in turn generates light (chemiluminescence method). Bind the demonstrable Substance, i. the target molecule, with the immobilized capture molecule on the Surface, this can be done optically, e.g. above Luminescence, be detected. The term "luminescence" here is the spontaneous emission of photons in the ultraviolet to infrared Spectral range called. Excitation mechanisms of luminescence can optical or non-optical nature, for example electrical, chemical, biochemical and / or thermal excitation processes. Consequently In particular, chemical, bio and electroluminescence and fluorescence and phosphorescence under the term "luminescence" within the meaning of this invention.
Ein Nachteil von porösen, transparenten Substraten ist jedoch das Übersprechen der Lumineszenzsignale von benachbarten Spots. Das heißt, Signale, die von einem Spot herrühren, strahlen auch in angrenzende Spotbereiche und können dadurch die Signalintensitäten der benachbarten Spots verfälschen.One Disadvantage of porous, transparent substrates, however, is the crosstalk of the luminescence signals from neighboring spots. That is, signals, that come from a spot, They also radiate into adjacent spot areas and can therefore increase the signal intensities of the falsify neighboring spots.
Zur Überwindung dieses Problems wird bislang die Oberfläche abgerastert und nur Teile des Spots beleuchtet und ausgewertet. Dies erfordert jedoch den Einsatz komplexer und teuerer Detektionsgeräte. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Spots räumlich sehr weit zu trennen. Dies führt jedoch zu einer geringen Spottdichte, die für viele Anwendungen dann jedoch nicht mehr ausreichend hoch ist. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, transparente poröse Bereiche durch nicht-transparente Barrieren optisch voneinander abzutrennen. So wird in WO03/089925 eine 3D-Wellenleiterstruktur vorgestellt, welche lokal transparente Bereiche aus SiO2 aufweist, wobei diese transparenten Bereiche wiederum von einem reflektierenden Rahmen aus Wänden mit Siliziumkern umgeben sind, wodurch das optische Übersprechen des in der Struktur erzeugten Lumineszenzlichts zwischen den Kompartments durch die reflektierenden Wände aus im wesentlichen Silizium unterbunden werden kann. Die in WO03/089925 vorgestellte Vorrichtung zeigt im Rahmen von Analyseverfahren auf Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Basis Chemilumineszenz-Basis zwar eine verbesserte absolute Signalausbeute bei verbessertem Signal-Rausch-Verhältnis. Jedoch ist die Herstellung der in WO03/089925 vorgestellten 3D-Wellenleiterstruktur nur schwer zu kontrollieren, da während der thermischen Oxidation des makroporösen Siliziums durch die Volumenverdopplung beim Übergang von Silizium zu Siliziumdioxid starke Spannungen innerhalb der Struktur entstehen. Im ungünstigsten Fall führt dies zu einer Verbiegung und Verzerrung der Struktur. Für Biochips sind solche nicht-planaren Substrate aber ungeeignet. Ein Nachteil derartiger Substrate ist daher deren aufwendige Herstellung.To overcome this problem so far the surface is scanned and illuminated only parts of the spot and evaluated. However, this requires the use of complex and expensive detection devices. Another possibility is to separate the spots spatially very far. However, this leads to a low mica density, which is then no longer sufficiently high for many applications. Another possibility is to optically separate transparent porous areas from one another by non-transparent barriers. Thus WO03 / 089925 presents a 3D waveguide structure which has locally transparent regions of SiO 2 , these transparent regions in turn being surrounded by a reflective frame of walls with silicon core, whereby the optical crosstalk of the luminescence light generated in the structure between the compartments can be prevented by the reflective walls of substantially silicon. The device presented in WO03 / 089925 shows an improved absolute signal yield with an improved signal-to-noise ratio in the context of chemiluminescence-based analysis methods based on fluorescence or chemiluminescence. However, the fabrication of the 3D waveguide structure presented in WO03 / 089925 is difficult to control because of the strong thermal stress of the macroporous silicon due to the volume doubling in the transition from silicon to silicon dioxide. In the worst case, this leads to bending and distortion of the structure. For biochips, however, such non-planar substrates are unsuitable. A disadvantage of such substrates is therefore their complicated production.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung bzw. ein "Biochip-Grundmodul" zum Nachweis biochemischer Reaktionen und/oder Bindungen bereitzustellen, die bzw. das im Rahmen von Analyseverfahren auf Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Basis eine im Vergleich zu der in WO03/089925 vorgestellten Vorrichtung vergleichbar günstige absolute Signalausbeute bei vergleichbarem Signal-Rausch-Verhältnis liefern soll, um so die Nachweisempfindlichkeit von mit dem fertigen Biochip durchzuführenden Tests zu steigern, deren bzw. dessen Herstellung jedoch nicht die vorstehend angeführten Probleme der in WO03/089925 vorgestellten Vorrichtung zeigt, sondern relativ unaufwendig ist.Of the The present invention is therefore based on the object, a device or a "biochip basic module" for the detection of biochemical Provide reactions and / or bindings under the of fluorescence or chemiluminescence-based analysis methods, a Comparable to the device presented in WO03 / 089925 favorable provide absolute signal yield with a comparable signal-to-noise ratio, so as to be carried out the detection sensitivity of the finished biochip Tests to increase, but whose production is not the mentioned above Problems of the device presented in WO03 / 089925 shows, but relatively inexpensive.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.These The object is achieved by the embodiments characterized in the claims solved.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Vorrichtungen bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in einem porösen Substrat optische Barrieren durch lokal gezieltes Auffüllen von Poren mit optisch nicht-transparentem Material oder durch das Modifizieren bzw. Beschichten von entsprechenden Porenwänden mit Metall vorgesehen werden, so daß Lumineszenzsignale (z.B. aus Fluoreszenz, Chemilumineszenz usw.) nicht über die optischen Barrieren im Substrat in benachbarte poröse Bereiche übersprechen können.According to the present The invention provides devices characterized are that in a porous one Substrate optical barriers by locally targeted filling of Pores with optically non-transparent material or by modifying or coating of corresponding pore walls with metal, so that luminescence signals (e.g., from fluorescence, chemiluminescence, etc.) not via the crosstalk optical barriers in the substrate into adjacent porous regions can.
Gemäß einer
ersten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung bereitgestellt,
umfassend ein flächig
ausgebildetes makroporöses
Trägermaterial
(
Das makroporöse Trägermaterial bzw. Substrat unterliegt keiner Beschränkung, so lange es aus transparentem Material ist. Üblicherweise ist das makroporöse Trägermaterial aus Siliziumdioxid, Glas oder Aluminiumoxid ausgewählt.The macroporous support material or substrate is subject to no restriction, as long as it is made of transparent Material is. Usually is the macroporous support material selected from silica, glass or alumina.
Das
optisch nicht-transparente Material, mit welchem die Kompartmenteinfassung
bzw. die den Rahmen (
Üblicherweise ist das optisch nicht-transparente Material aus einem organischen Polymer ausgewählt, in welchem Pigmente und/oder Metallkügelchen bzw. Metallplättchen dispergiert sind. Als organisches Polymer können beispielhaft hier Poly(meth)acrylate, Polysiloxane, Polyurethane, Polyaddukte von Bisphenol-A und Epichlorhydrin, Polyolefine wie z.B. Vinylchlorid-Copolymerisate, Polyepoxidharze, Harnstoff-, Melamin- und Phenolharze genannt werden. Beispielhaft können hier Vinnol®-Lackharze der Firma Wacker Chemie, Burghausen, angeführt werden. Die Auswahl der Farben unterliegt keiner Beschränkung, solange die wesentlichen Anforderungen wie Lichtundurchlässigkeit, Verarbeitbarkeit mit gängigen Druckverfahren, keine Eigenfluoreszenz, Biokompatibilität und möglichst inerte Oberfläche zur Vermeidung unspezifischer Bindungen beachtet werden. So können sowohl organische als auch anoganische Pigmente eingesetzt werden. Als Beispiele für solche Pigmente können Pigment Black 7, Pigment Blue 15.3, Pigment Green 7 und Pigment Red 122 genannt werden. Es können aber auch anorganische Pigmente wie Kupferoxide, Eisenoxide, Chromoxide und deren Gemische, etc., vorgesehen werden. Als Metallkügelchen bzw. -plättchen können beispielsweise Silber-, Goldkügelchen oder Aluminiumflakes in einem solchen organischen Polymer dispergiert werden.Usually, the optically non-transparent material is selected from an organic polymer in which pigments and / or metal beads or metal flakes are dispersed. As an organic polymer, poly (meth) acrylates, polysiloxanes, polyurethanes, polyadducts of bisphenol A and epichlorohydrin, polyolefins such as vinyl chloride copolymers, polyepoxide resins, urea, melamine and phenolic resins can be exemplified here. By way of example here Vinnol ® -Lackharze Wacker Chemie, Burghausen, can be given. The choice of colors is not limited, as long as the essential requirements such as opacity, processability with common printing processes, no intrinsic fluorescence, biocompatibility and inert surface as possible to avoid non-specific bonds are observed. Thus, both organic and anoganic pigments can be used. Examples of such pigments include Pigment Black 7, Pigment Blue 15.3, Pigment Green 7 and Pigment Red 122. However, it is also possible to provide inorganic pigments such as copper oxides, iron oxides, chromium oxides and mixtures thereof, etc. As metal spheres or platelets, for example, silver, gold spheres or aluminum flakes can be dispersed in such an organic polymer.
Es
können
nahezu alle strukturierenden Verfahren wie Mikrowetprinting, Lift-Off
Verfahren, Stempelverfahren, Lithographieverfahren, Plasma Printing,
Siebdruckverfahren angewendet werden, um die Poren, welche den Rahmen
(
Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
weist dabei lokal Bereiche bzw. Kompartments auf, die zwei oder
mehrere Poren aufweisen. Diese Bereiche sind wiederum von einer
kastenartigen bzw. rahmenartigen Überstruktur umgeben bzw. umschlossen,
die durch die mit optisch nicht-transparentem Material gefüllten Poren
erzeugt wird, die unmittelbar an die zwei oder mehrere Poren aufweisende
Bereiche bzw. Kompartments angrenzen. Dadurch wird ein zu den Oberflächen (
Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist vorzugsweise jeder einzelne Rahmen (
Der
aus mit optisch nicht-transparentem Material gefüllten Poren gebildete Rahmen
bzw. Kasten (
Gemäß einer
zweiten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung bereitgestellt,
umfassend ein flächig
ausgebildetes makroporöses
Trägermaterial
(
Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
weist dabei wiederum lokal Bereiche bzw. Kompartments auf, die zwei
oder mehrere Poren aufweisen. Diese Bereiche sind wiederum von einer
kastenartigen bzw. rahmenartigen Überstruktur umgeben bzw. umschlossen,
die durch die mit einer Metallschicht modifizierten Poren bzw. Porenwände (
Bezüglich dieser
zweiten Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise wieder jeder einzelne Rahmen
(
Der
aus der mit einer Metallschicht modifizierten Poren gebildete Rahmen
bzw. Kasten (
Die porösen transparenten Substrate mit einer Dicke zwischen 200 μm und 1 mm und Porendurchmesser zwischen 1 μm und 50 μm werden lokal mit Metall bzw. Metallionen maskiert, um die Kompartments auszubilden. Die Metallschicht kann somit auf Basis von elementaren Metall oder einer Metallverbindung wie insbesondere deren Chalkogenide sein, insoweit sie in das Trägermaterial diffundieren und die optischen Eigenschaften ändern können. Hierzu werden diese Materialien auf Metall-Basis üblicherweise zunächst in entsprechenden Lackharzen, wie z.B.The porous transparent substrates with a thickness between 200 microns and 1 mm and pore diameter between 1 micron and 50 μm are locally masked with metal or metal ions around the compartments train. The metal layer can thus be based on elementary Metal or a metal compound, in particular its chalcogenides, insofar as they are in the carrier material diffuse and change the optical properties. These are these materials on a metal basis usually first in corresponding lacquer resins, e.g.
Vinnol®-Lackharze der Firma Wacker Chemie, Burghausen, dispergiert. Die Metalle bzw. deren Chalkogenide wie Oxide und Sulfide (z.B. FeS, FeO, Fe3O4, CuO, Cr2O3, Pb3O4, TiO2, etc. ) können insofern auch in Form von deren im Handel erhältlichen Emailfarben eingesetzt werden. Es können auch Schwarzlot (Kupfer-Eisenoxidgemisch) und Silbergelb (beim Einbrennen von Silbernitrat entsteht durch kolloidal verteiltes, elementares Silber eine gelbe Farbe) vorgesehen werden. Es sind auch metallische Nanopartikel aus z.B. Kupfer, Silber oder Gold einsetzbar. Anschließend werden mit Hilfe eines Temperprozesses bzw. Einbrennprozesses Teile des sich auf der Oberfläche befindlichen Metalls bzw. der Metallverbindung in die Porenwände des Trägermaterials getrieben, um die optischen Eigenschaften in den Porenwänden bzw. Stegen gezielt zu verändern. Die Eindringtiefe des Metalls in das Material der Porenwände des Trägermaterials wird über die Temperatur und Zeit gesteuert. Die Poren mit der Metallschicht an den Wänden und deren optisch modifizierte Stege bzw. Porenwände bilden dann ein Kompartment. Licht, das von einem Kompartment in die Stege gebrochen wird, kann durch die modifizierten Stege größtenteils absorbiert oder reflektiert werden.Vinnol ® -Lackharze Wacker Chemie, Burghausen, dispersed. The metals or their chalcogenides such as oxides and sulfides (eg FeS, FeO, Fe 3 O 4 , CuO, Cr 2 O 3 , Pb 3 O 4 , TiO 2 , etc.) can also be used in the form of their commercially available enamel paints be used. It is also possible to provide black solder (copper-iron oxide mixture) and silver yellow (when burning in silver nitrate, a colloidal, elemental silver forms a yellow color). It is also possible to use metallic nanoparticles of, for example, copper, silver or gold. Subsequently, with the aid of an annealing process or baking process, parts of the metal or metal compound present on the surface are driven into the pore walls of the carrier material in order to specifically change the optical properties in the pore walls or webs. The penetration depth of the metal into the material of the pore walls of the support material is controlled by temperature and time. The pores with the metal layer on the walls and their optically modified ridges or pore walls then form a compartment. Light that is broken into the lands by a compartment may be largely absorbed or reflected by the modified lands.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können die Kompartmentrahmen der vorstehenden beiden Ausführungsformen ein Aspektverhältnis von etwa 1:1:100 bis 1:1:1 (Höhe × Breite × Tiefe) aufweisen.in the Within the scope of the present invention, the compartment frames the above two embodiments an aspect ratio from about 1: 1: 100 to 1: 1: 1 (height × width × depth) exhibit.
In
den erfindungsgemäßen Vorrichtungen
ist über
mindestens einen Oberflächenbereich
des flächig
ausgebildeten makroporösen
Trägermaterials (
Das eingesetzte makroporöse Trägermaterial weist vorzugsweise einen Porendurchmesser von 1 μm bis 100 μm, mehr bevorzugt 1 bis 20 μm auf. Die Dicke des makroporösen Trägermaterials beträgt üblicherweise 100 bis 1.000 μm, vorzugsweise 250 bis 450 μm. Der Abstand von Porenmitte zu Porenmitte (Pitch), d.h. zweier zueinander benachbarter bzw. angrenzender Poren beträgt üblicherweise 1 bis 100 μm, vorzugsweise 2 bis 12 μm. Die Porendichte liegt üblicherweise im Bereich von 104 bis 108/cm2.The macroporous support material used preferably has a pore diameter of 1 μm to 100 μm, more preferably 1 to 20 μm. The thickness of the macroporous support material is usually 100 to 1,000 .mu.m, preferably 250 to 450 .mu.m. The distance from the center of the pore to the center of the pore (pitch), ie, two adjacent or adjacent pores, is usually 1 to 100 μm, preferably 2 to 12 μm. The pore density is usually in the range of 10 4 to 10 8 / cm 2 .
Die
Poren (
Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist bezüglich
beider Ausführungsformen,
wie vorstehend beschrieben, auch eine Vorrichtung mit sogenannter Hybridstruktur
eingeschlossen, die aus zusammenhängenden Kompartments und nicht-zusammenhängenden
Kompartments aufgebaut ist. Diesbezüglich wird in vollem Umfang
auf die deutsche Patentanmeldung
Zur Fertigung eines Biochips bezüglich beider Ausführungsformen, wie vorstehend beschrieben, kann dann beispielsweise das Anbringen bzw. Binden von Linkermolekülen an die Porenoberflächen erfolgen. Solche Linkermoleküle unterliegen keiner spezifischen Beschränkung, solange sie befähigt sind, an beispielsweise die auf der Oberfläche eines porösen Trägermaterials aus Glas, SiO2 oder Al2O3 vorliegenden OH-Gruppen kovalent zu binden und weiter eine funktionelle Gruppe aufweisen, die zur kovalenten Bindung mit als Sonden in biologisch-chemischen Reaktionen einsetzbaren Fängermolekülen befähigt ist. Solche Linkermoleküle sind üblicherweise auf der Basis einer Silizium-organischen Verbindung. Derartige bifunktionelle Silizium-organische Verbindungen können beispielsweise Alkoxysilan-Verbindungen mit einer oder mehreren terminalen funktionalen Gruppen, ausgewählt aus Epoxy, Glycidyl, Chlor, Mercapto oder Amino, sein. Vorzugsweise ist die Alkoxysilan-Verbindung ein Glycidoxyalkylalkoxysilan, wie z.B. 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan, ein Mercaptoalkylalkoxysilan, wie z.B. γ- Mercaptopropyltrimethoxysilan, oder ein Aminoalkylalkoxysilan, wie z.B. N-β-(aminoethyl) γ-aminopropyltrimethoxysilan. Die Länge der als Spacer zwischen der funktionellen Gruppe, wie z.B. Epoxy bzw. Glycidoxy, welche mit dem Fängermolekül bzw. der Sonde bindet, und der Trialkoxysilangruppe wirkenden Alkylenreste unterliegt dabei keiner Beschränkung. Derartige Spacer können auch Polyethylenglykolreste sein.For the production of a biochip with respect to both embodiments, as described above, then, for example, the attachment or binding of linker molecules to the pore surfaces can take place. Such linker molecules are not specifically limited as long as they are capable of covalently bonding to, for example, the OH groups present on the surface of a porous glass, SiO 2 or Al 2 O 3 support material and further having a functional group capable of covalent bonding with as probes in biochemical reactions usable catcher molecules is capable. Such linker molecules are usually based on a silicon-organic compound. Such bifunctional organosilicon compounds may be, for example, alkoxysilane compounds having one or more terminal functional groups selected from epoxy, glycidyl, chloro, mercapto or amino. Preferably, the alkoxysilane compound is a glycidoxyalkylalkoxysilane such as 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane, a mercaptoalkylalkoxysilane such as γ-mercaptopropyltrimethoxysilane, or an aminoalkylalkoxysilane such as N-β- (aminoethyl) γ-aminopropyltrimethoxysilane. The length of the spacer as a spacer between the functional group, such as epoxy or glycidoxy, which binds with the capture molecule or the probe, and the Trialkoxysilangruppe acting alkylene is subject to no restriction. Such spacers may also be polyethylene glycol radicals.
Zur Endfertigung eines Biochips kann dann das Anbinden bzw. Koppeln von Fängermolekülen wie beispielsweise Oligonukleotiden bzw. DNA-Molekülen an das Trägermaterial über die Linkermoleküle nach den im Stand der Technik üblichen Verfahren erfolgen, beispielsweise mittels Behandeln des porösen Trägermaterials bei Verwendung von Epoxysilanen als Linkermoleküle durch anschließende Reaktion der terminalen Epoxidgruppen mit terminalen primären Aminogruppen oder Thiolgruppen von Oligonukleotiden bzw. DNA-Molekülen, die in entsprechenden Analyseverfahren als immobilisierte bzw. fixierte Fängermoleküle für die im zu untersuchenden Analyten vorliegenden Zielmoleküle fungieren. Dabei können beispielsweise die als Fängermoleküle verwendbaren Oligonukleotide unter Verwendung der Synthesestrategie, wie in Tet. Let. 22, 1981, Seiten 1859 bis 1862, beschrieben, hergestellt werden. Die Oligonukleotide können dabei während des Herstellungsverfahrens entweder an der 5-oder der 3-Endstellung mit terminalen Aminogruppen derivatisiert werden. Eine weitere Möglichkeit der Anbindung solcher Fängermoleküle an die Innenwandoberflächen der Poren kann durchgeführt werden, indem das Substrat zunächst mit einer Chlorquelle, wie Cl2, SOCl2, COCl2 oder (COCl)2, gegebenfalls unter Verwendung eines Radikalinitiators wie Peroxide, Azoverbindungen oder Bu3SnH, behandelt wird und anschließend mit einer entsprechenden nucleophilen Verbindung, wie insbesondere mit Oligonukleotiden bzw. DNA-Molekülen, die terminale primäre Aminogruppen oder Thiolgruppen oder andere entsprechende funktionale Gruppen aufweisen, umgesetzt werden (siehe WO 00/33976).For the final production of a biochip then the binding or coupling of capture molecules such as oligonucleotides or DNA molecules to the support material via the linker molecules according to the conventional methods, for example by treating the porous support material using epoxysilanes as linker molecules by subsequent reaction of the terminal epoxide groups with terminal primary amino groups or thiol groups of oligonucleotides or DNA molecules which function in corresponding analysis methods as immobilized or fixed capture molecules for the target molecules present in the analyte to be investigated. In this case, for example, the oligonucleotides which can be used as catcher molecules can be synthesized using the synthesis strategy as described in Tet. Let. 22, 1981, pages 1859-1862. The oligonucleotides can be derivatized during the preparation process either at the 5 or the 3-terminal position with terminal amino groups. Another way of attaching such capture molecules to the interior wall surfaces of the pores can be accomplished by first exposing the substrate to a source of chlorine such as Cl 2 , SOCl 2 , COCl 2 or (COCl) 2 , optionally using a free radical initiator such as peroxides, azo compounds or Bu 3 SnH, and then with a corresponding nucleophilic compound, in particular with oligonucleotides or DNA molecules having terminal primary amino groups or thiol groups or other corresponding functional groups are reacted (see WO 00/33976).
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen eignen sich insbesondere auch für die örtlich begrenzte, lichtgesteuerte Synthese von Molekülen an den Porenwänden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Steuern chemischer bzw. biochemischer Reaktionen bzw. Synthesen die Schritte:
- – Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. BioChips;
- – Einleiten einer Synthesesubstanz in zumindest eine der Poren des Trägermaterials;
- – Einkoppeln von Licht in die Pore zum optischen Anregen zumindest der Synthesesubstanz.
- Providing a device according to the invention or biochips;
- Introducing a synthetic substance into at least one of the pores of the carrier material;
- - Coupling of light into the pore for the optical excitation of at least the synthesis substance.
Für planare
Substrate ist das Verfahren der lichtgesteuerten Synthese beispielsweise
in
Optisches Übersprechen zwischen den einzelnen Poren oder Bereichen/Kompartments wird durch die reflektierenden Wände aus mit optisch nicht transparentem Material gefüllten Poren unterbunden. Damit wird ein Hauptproblem bei der lichtgesteuerten Synthese auf planaren Substraten gelöst.Optical crosstalk between the individual pores or areas / compartments is through the reflective walls prevented from pores filled with optically non-transparent material. In order to becomes a major problem in planar synthesis in light-directed synthesis Substrates solved.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren beispielhaft beschrieben. Es zeigt:The The present invention will be described below with reference to FIGS Figures described by way of example. It shows:
- 1010
- makroporöses Trägermaterialmacroporous carrier material
- 10A, 10B10A, 10B
- TrägermaterialoberflächenSubstrate surfaces
- 1111
- Porepore
- 11A11A
- Kompartmentcompartment
- 11B11B
- Porenwände bzw. Stege innerhalb eines KompartmentsPore walls or Footbridges within a compartment
- 11C11C
- modifizierte Porenwändemodified pore walls
- 1212
- Rahmenframe
Claims (16)
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-
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- 2004-06-04 DE DE200410027364 patent/DE102004027364A1/en not_active Ceased
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