DE102004038163A1 - Fluorescence-based assays for the rapid, quantitative analysis of biomolecules (proteins and nucleic acids) by enriching for cells or beads - Google Patents

Fluorescence-based assays for the rapid, quantitative analysis of biomolecules (proteins and nucleic acids) by enriching for cells or beads

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DE102004038163A1 DE200410038163 DE102004038163A DE102004038163A1 DE 102004038163 A1 DE102004038163 A1 DE 102004038163A1 DE 200410038163 DE200410038163 DE 200410038163 DE 102004038163 A DE102004038163 A DE 102004038163A DE 102004038163 A1 DE102004038163 A1 DE 102004038163A1
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DIACDEM CHIP TECHNOLOGIES GMBH
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion mindestens eines Moleküls (212) in einer Lösung in einem Reaktionsreservoir eines Mikrofluidik-Chips mit einem Boden, wobei The present invention relates to a method for detecting at least one molecule (212) in a solution in a reaction reservoir of a microfluidic chip with a bottom, wherein
a) das zu detektierende Molekül mit mit geeigneten Antikörpern beschichteten Kügelchen (210) und mit farbstoffmarkierten Sekundärantikörpern (214) in Kontakt gebracht wird, a) the molecule to be detected (with coated with appropriate antibodies beads 210) and (with dye-labeled secondary antibodies 214) is brought into contact,
b) wobei sich das zu detektierende Molekül mit den genannten Substanzen bindet, b) wherein the molecule to be detected binds to the said substances,
c) wobei sich ein Komplex (216) aus zu detektierendem Molekül, Kügelchen und farbstoffmarkierten Sekundärantikörpern bildet und c) wherein a complex (216) is to be detected molecule beads and dye-labeled secondary antibodies and
d) wobei dieser Komplex sedimentiert und am Boden nachgewiesen wird. d) said complex sedimented and is detected on the ground.

Description

  • Gebiet der Erfindung Field of the Invention
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen, quantitativen Detektion mindestens eines Moleküls, insbesondere eines Biomoleküls, in Lösung, wobei das Molekül mit mindestens zwei weiteren modifizierten Substanzen in Kontakt gebracht wird und der sich daraus bildende Komplex durch Anreicherung auf Zellen oder Beads nachgewiesen wird. The present invention relates to a method for the rapid, quantitative detection of at least one molecule, particularly a biomolecule in solution, wherein the molecule is brought into contact with at least two further modified substances and the forming complex is detected by enriching for cells or beads thereof.
  • Zum Nachweis bestimmter Antigene oder Antikörper wird hauptsächlich der ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) eingesetzt. For the detection of specific antigens or antibodies of the ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) is mainly used. Hierbei wird im allgemeinen ein Fängermolekül (Antigen oder Antikörper) unspezifisch am Boden einer Mikrotiterplatte immobilisiert (meist Adsorption auf Glassoberflächen). Here, a capture molecule (antigen or antibody) is generally non-specific in the bottom of a microtiter plate immobilized (usually adsorption on glass surfaces). Nach Zugabe der zu untersuchenden Probe (Inkubationszeit bis zu Stunden) wird die Oberfläche mindestens einmal gewaschen um unspezifisch adsorbierte Moleküle zu entfernen. After addition of the sample to be examined (incubation up to hours), the surface is washed at least once to remove nonspecifically adsorbed molecules. Im nächsten Schritt folgt die Inkubation mit einem sogenannten „Detektormolekül" (üblicherweise Sekundärantikörper, die mit einem Enzym, z. B. Meerrettichperoxidase, markiert sind), das ebenso spezifisch an das gesuchte Molekül in einer Sandwich-Konfiguration bindet. Nach weiteren Waschschritten wird die Probe mit einer farbgebenden Substanz inkubiert. Diese Substanz wird durch das Enzym am Detektormolekül z. B. durch Oxidation in eine farbige Verbindung überführt. Letztendlich wird die Farbigkeit im Überstand der Probe gemessen, die direkt mit der Gegenwart der nachzuweisenden Substanz korreliert ist. Aufgrund des Amplifizierungsschrittes (jedes Enzym bildet viele farbige Moleküle) erreichen ELISA's eine hohe Empfindlichkeit im Bereich von 10 -9 bis 10 -11 M Zielmolekül. Nachteile sind die vielen Waschschritte, die lange Dauer (mehrere Stunden) und die unspezifische Adsorption an den Glassoberflächen. In the next step, the incubation follows (usually secondary antibodies which are labeled with an enzyme, eg., Horseradish peroxidase,) which also binds specifically to the searched molecule in a sandwich configuration with a so-called "detector molecule". After further washing steps, the sample incubated with a color-imparting substance. This substance is such by the enzyme at the detector molecule. B. converted by oxidation into a colored compound. Finally, the color is measured in the supernatant of the sample, which is directly correlated with the presence of the substance to be detected. Because of the amplification step (each enzyme forms many colored molecules) reach ELISA's a high sensitivity in the range of 10 -9 to 10 -11 M target molecule. disadvantages are the many washing steps, the long duration (several hours) and the non-specific adsorption on the glass surfaces.
  • Zum Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen gibt es verschiedene Standardverfahren, die alle auf der Hybridisierung eines komplementären, farbstoffmarkierten Oligonukleotids beruhen. For the detection of specific DNA sequences, there are various standard methods, which are all based on the hybridization of a complementary, dye-labeled oligonucleotide. Bei DNA-Chips wird die Probe in der Regel ebenfalls mehrmals gewaschen, um unspezifisch adsorbierte Nukleinsäuren und den Überschuss an farbstoffmarkiertem Oligonukleotid zu entfernen. In the DNA chip, the sample is also usually washed several times to remove nonspecifically adsorbed nucleic acids and the excess of dye-labeled oligonucleotide.
  • Die bisher eingesetzten Verfahren sind somit nicht für einen Einsatz bspw. in einem Mikrofluidik-Chip geeignet, bei dem Waschschritte nur schwer zu realisieren sind. The methods used so far are therefore not for use eg. In a microfluidic chip suitable are difficult to achieve in the washing steps.
  • Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein Verfahren zur Detektion von mindestens einem Molekül bereitzustellen, was spezifisch und sensitiv genug ist, einen schnellen, quantitati ven Nachweis des Moleküls auf unterschiedlichsten Trägerflächen zu gewährleisten. The invention therefore has as its object to provide a method for the detection of at least one molecule, which is specific and sensitive enough to ensure a fast, quantitati ven detection of the molecule on a variety of support surfaces.
  • Lösung solution
  • Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. This object is achieved by the inventions with the features of the independent claims. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Advantageous developments of the inventions are characterized in the subclaims. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. The wording of all claims is hereby incorporated by reference into this specification.
  • Die spezifische Erkennung und Aktivität von Biomolekülen (Nukleinsäuren, Antikörpern, Enzyme etc.) kann gekoppelt werden mit der Aufkonzentrierung der nachzuweisenden Moleküle auf z. The specific recognition and activity of biomolecules (nucleic acids, antibodies, enzymes, etc.) can be coupled to the concentration of the molecules to be detected to z. B. Kügelchen in einem Beobachtungsvolumen, und dass diese Koppelung eine schnelle, quantitative Analyse eines z. B. beads in a volume of observation, and that this coupling a rapid, quantitative analysis of a z. B. positiven Fluoreszenzsignals ermöglicht. B. positive fluorescent signal allows.
  • Im folgenden werden einzelne Verfahrensschritte näher beschrieben. In the following individual process steps are described in more detail. Die Schritte müssen nicht notwendigerweise in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden, und das zu schildernde Verfahren kann auch weitere, nicht genannte Schritte aufweisen. The steps need not necessarily be performed in the order listed, and the method to be described can also have further unspecified steps.
  • Es wird ein Verfahren zur Detektion mindestens eines Moleküls in einer Lösung in einem Gefäß mit einem Boden vorgeschlagen. It is proposed a method for detecting at least one molecule in a solution in a vessel having a bottom. Dazu wird das zu detektierende Molekül mit mindestens einer modifizierten ersten Substanz und mindestens einer farbstoffmarkierten zweiten Substanz in Kontakt gebracht. For this, the molecule to be detected is brought into contact with at least one modified first substance and at least one dye-labeled second substance. Das zu detektierende Molekül bindet an der modifizierten ersten Substanz und der farbstoffmarkierten zweiten Substanz. The molecule to be detected binds to the modified first substance and the dye-labeled second substance. Dadurch entsteht ein Komplex aus zu detektierendem Molekül, modifizierter erster Substanz und farbstoffmarkierter zweiter Substanz. This creates a complex of the molecule to be detected, modified first substance and dye-labeled second substance. Dieser Kom plex sedimentiert mindestens zum Teil und kann am Boden nachgewiesen werden. This com plex sedimented at least partly and can be detected on the ground.
  • Dieses Verfahren eignet sich beispielsweise für den Einsatz in einem Mikrofluidik-Chip, der die zu analysierende Lösung (z. B. Blutserum, Sekret, etc.) mittels Kapillarkräften aufsaugt und in eine variable Anzahl von Reaktionsgefäße bzw. Reaktionsreservoirs (z. B. 96), in denen die spezifischen Nachweisreaktionen ablaufen, überführt. This method is suitable for example for use in a microfluidic chip that absorbs the solution to be analyzed (eg., Blood serum, secretions, etc.) by means of capillary forces, and in a variable number of reaction vessels or reaction reservoir (z. B. 96 ) in which run the specific detection reactions transferred. In den Reaktionsreservoirs befinden sich bereits vor dem Eintritt der zu analysierenden Lösung die modifizierte erste Substanz und die farbstoffmarkierte zweite Substanz, die das Vorhandensein des zu detektierenden Moleküls durch beispielsweise einen deutlichen Fluoreszenzanstieg anzeigen. In the reaction reservoirs are already before entering the solution to be analyzed, the modified first substance and the dye-labeled second substance that indicates the presence of the molecule to be detected by, for example, a significant increase in fluorescence. Diese Substanzen liegen in der Regel getrocknet am Boden der Reaktionsreservoirs. These substances are usually dried at the bottom of the reaction reservoir. Durch der Eintritt der zu untersuchenden Lösung werden sie von Boden gelöst. By the admission of the test solution to be detached from the ground.
  • Im Gegensatz zu den meisten bisher eingesetzten Mikrotiterplatten finden die spezifischen Nachweisreaktionen in Lösung, ohne Einsatz jeglicher Waschschritte, statt. Unlike most previously used microplates find the specific detection reactions in solution, without the use of any washing steps instead. Die Nachweisempfindlichkeiten des Verfahrens liegen in Abhängigkeit vom jeweiligen Assay im mikro- (10 -6 M) bis pikomolaren (10 -12 M) Bereich. The detection sensitivities of the process are a function of the particular assay in the micromolar (10 -6 M) to picomolar (10 -12 M) range.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindungen handelt es sich bei dem zu detektierenden Molekül um ein Biomolekül, insbesondere um eine Nukleinsäure, ein Antigen, einen Antikörper und/oder ein Enzym. According to a preferred embodiment of the inventions are to be detected in the molecule is a biomolecule, in particular a nucleic acid, an antigen, an antibody and / or an enzyme. Weitere Biomoleküle, die unter Inanspruchnahme des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen werden können, sind dem Fachmann geläufig, und sie können beispielsweise die Gruppe der Peptide, Proteine, Kohlenhydrate etc., aber auch komplexere Strukturen wie Viren, Viroide, Prionen etc. umfassen. Other biomolecules which can be detected by use of the procedure according to the invention, are familiar to the skilled person, and may for example comprise the group of peptides, proteins, carbohydrates etc., but also more complex structures such as viruses, viroids, prions etc..
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der modifizierten ersten Substanz um Kügelchen mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm. In a further preferred embodiment, in the modified first substance to beads having a diameter of about 50 nm to 50 microns, preferably about 1 to 10 microns, particularly about 2 to 3 microns. Diese Kügelchen können aus sämtlichen, für den Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens vorteilhaften Materialien bestehen, sofern sie sich gemäß Ihrem geplanten Einsatzgebiet modifizieren lassen. These beads can be made of all advantageous for the use of the inventive materials, provided they can be modified according to your planned application. Als besonders vorteilhaft haben sich Kügelchen aus Polystyrol erwiesen, die zusätzlich auch einen Eisenkern aufweisen können. Be particularly advantageous beads have proven of polystyrene, which can additionally have an iron core. Durch Einsatz solcher Kügelchen mit einem z. By use of such beads with a z. B. Eisenoxidkern können zusätzliche Aufkonzentriereffekte am Boden des Reservoirs vorgenommen werden, beispielsweise durch Zuhilfenahme eines Magneten. Example iron core can be made additional Aufkonzentriereffekte at the bottom of the reservoir, for example by the aid of a magnet.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Oberfläche der modifizierten ersten Substanz mit spezifischen Ankermolekülen modifiziert durch Beschichtung. In a further preferred embodiment, the surface of the modified first substance with specific anchoring molecules modified by coating. Bei den spezifischen Ankermolekülen handelt es sich gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform um Antikörper, Antigene, Peptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und/oder Zellen. In the specific anchor molecules are, according to a further preferred embodiment, antibodies, antigens, peptides, carbohydrates, nucleic acids and / or cells. Dies stellt keine abschließende Auflistung der möglichen Ankermoleküle dar und weitere, dem erfindungsgemäßen Verfahren zugängliche Ankermoleküle (z. B. Viren, Viroide, Prionen etc.) sind dem Fachmann geläufig und werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst. This is not an exhaustive list of potential anchor molecules is, and further, accessible to the process according to the invention, anchor molecules (eg. As viruses, viroids, prions, etc.) are known to the skilled person and are also encompassed by the present invention.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der farbstoffmarkierten zweiten Substanz um farbstoffmarkierte Sekundärantikörper, Substanzen, die durch die Bindung an das zu detektierende Molekül fluoreszenzfähig werden, z. In a particularly preferred embodiment, in the dye-labeled second substance to dye-labeled secondary antibodies, substances which are capable of fluorescence through binding to the molecule to be detected, eg. B. konformaktiv flexible smart probes, und/oder komplementäre Oligonukleotide. B. compliant active flexible smart probes, and / or complementary oligonucleotides. Die konformativ flexiblen, sogenannten „Smart Probes" (siehe z. B. WO 01/36668 A1) erhöhen das Signal zu Hintergrund Verhältnis und können beispielsweise als fluoreszenzmarkierte Sonden eingesetzt werden, die durch Anbinden an das Zielmolekül ihre Fluoreszenzintensität drastisch erhöhen. Damit lassen sich höhere Sonden-Konzentrationen, ohne Erhöhung der Hintergrundfluoreszenz, erzielen. Die bisher erfolgreich entwickelten „Smart Probes" erlauben die Detektion bestimmter DNA-Zielsequenzen und bestimmter tumorassoziierter Antikörper direkt in beispielsweise Blutproben von Patienten. The conformationally flexible, so-called "smart probes" (see, eg., WO 01/36668 A1) increase the signal to background ratio and can be used which increase by binding to the target molecule their fluorescence intensity dramatically example, as a fluorescent-labeled probes. This can be higher probe concentrations, with no increase in background fluorescence achieve. the previously successfully developed the "Smart probes" allow the detection of specific target DNA sequences and specific tumor-associated antibodies directly into, for example, blood samples from patients.
  • Dabei können gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verschiedene zu detektierende Moleküle mit verschiedenen farbstoffmarkierten Substanzen interagieren, vorzugsweise spezifisch mit diesen binden. In this case, can interact different molecules to be detected with different dye-labeled substances according to a further preferred embodiment, preferably specifically bind therewith. Diese spezifische Interaktion kann dann zu mindestens zwei, vorzugsweise mehrerer Farbreaktionen führen, wobei diese dann nach Art der Farbe getrennt erfasst und ausgewertet werden können. This specific interaction may lead to at least two, preferably a plurality of color reactions which can be detected then separated on the type of color and evaluated.
  • Es können für die Detektion unterschiedlicher zu detektierender Moleküle auch unterschiedliche, jeweils spezifisch bindende Substanzen verwendet werden, wobei die Substanzen jeweils mit spektroskopisch unterscheidbaren Farbstoffen markierten werden. It can be used for the detection of different molecules to be detected also different, each specifically binding substances, wherein the substances are labeled each with spectroscopically distinguishable dyes. Vorteilhafterweise handelt es sich bei den Farbstoffen um Fluoreszenzfarbstoffe, die spektroskopisch unterscheidbar sind. Advantageously, it concerns with the dyes to fluorescent dyes that are spectroscopically distinguishable. Spektroskopisch unterschieden werden können Farbstoffe beispielsweise aufgrund des Absorptionsspektrums, des Emissionsspektrums, der Fluoreszenz-Lebensdauer, der Triplett-Lebensdauer, etc. can be distinguished spectroscopically dyes, for example, due to the absorption spectrum, emission spectrum, fluorescence lifetime, the triplet lifetime, etc.
  • Die Effizienz dieser Technik kann durch die Optimierung der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe noch weiter gesteigert werden. The efficiency of this technique can be further increased by optimizing the fluorescent dyes used. So ist es zum Beispiel möglich, mit Hilfe von verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen beispielsweise Prionen und Viren auf oder in Zellen nachzuweisen. So it is for example possible to detect using different fluorescent dyes, for example, prions and viruses on or in cells. Man kann ferner bei dieser Möglichkeit auch durch Nutzung von Fluoreszenzfarbstoffen mit unterschiedlichen Absorptionswellenlängen Mehrfachmarkierungen durchführen. One can also carry out in this way by use of fluorescent dyes with different absorption wavelengths multiple selections. Zur Lösung des gestellten Problems kann ein gemischt homogen/heterogen basiertes Verfahren eingesetzt werden. To solve the problem posed a mixed homogeneous / heterogeneous based method can be used.
  • Für den Nachweis bestimmter proteolytischer Enzyme (Proteasen) können mit einem Tryptophanrest modifizierte und farbstoffmarkierte Protease-Substrate (kurze Peptide) auf den Kügelchen immobilisiert werden. For the detection of certain proteolytic enzymes (proteases) can (short peptides) are immobilized on the beads with a modified tryptophan residue and dye-labeled protease substrates. Hierbei wird die Farbstofffluoreszenz durch die räumliche Nähe zum Tryptophanrestes effizient gelöscht. Here, the dye fluorescence is quenched efficiently by the spatial proximity to the tryptophan residue. In Gegenwart der Protease wird die Aminosäurensequenz zwischen Farbstoff und Tryptophanrest hydrolisiert (geschnitten), wodurch die räumliche Nähe aufgehoben ist und ein starker Fluoreszenzanstieg resultiert. In the presence of the protease the amino acid sequence is hydrolyzed between the dye and tryptophan residue (cut), whereby the spatial proximity is removed and a strong increase in fluorescence results. Bleibt derjenige Teil des Protease-Substrats, der den Farbstoff trägt, nach der Hydrolyse auf dem Kügelchen immobilisiert, so kann durch quantitatives Auslesen der Fluoreszenz auf der Kugeloberfläche die Proteasekonzentration bestimmt werden. Is that part of the protease substrate that supports the dye is immobilized on the bead after the hydrolysis, the protease concentration can be determined by quantitative readout of fluorescence on the spherical surface.
  • Ähnliche farbstoffmarkierte Peptide können ebenso für den spezifischen Nachweis bestimmter Antikörper direkt im Blutserum eingesetzt werden. Similar dye-labeled peptides can be used directly in the blood serum, as well for the specific detection of certain antibodies. Hierbei wird der fluoreszenzlöschende Einfluss des Tryptophanrestes, der durch Kontaktbildung zum Farbstoff ausgelöst wird, durch das Binden des Peptids an den Antikörper und der damit verbunden Konformationsänderung im Peptid verhindert, wodurch es zu einem Fluoreszenzanstieg kommt (siehe z. B WO 1003/014742 A2). Here, the fluorescence-quenching effect is triggered by contact formation to the dye of the tryptophan residue, is prevented by the binding of the peptide to the antibody and the associated conformational change in the peptide, resulting in an increase in fluorescence (see, eg. B WO 1003/014742 A2) , Durch Bindung des geeigneten, farbstoffmarkierten Peptids auf der Oberfläche der Kügelchen kann der Antikörper durch einen Anstieg des Fluoreszenzsignals auf dem Kügelchen nachgewiesen werden. By binding of the appropriate dye-labeled peptide on the surface of the beads, the antibody may be detected by an increase of the fluorescent signal on the beads.
  • Bestimmte Nukleinsäureabschnitte (die spezifisch für eine Antibiotikaresistenz oder eine virale Erkrankung sind) können im gleichen Assay-Format durch den Einsatz von DNA-Hairpins („Smart Probes", siehe z. B. WO 01/36668 A1) nachgewiesen wer den. Hierbei wird die zu untersuchende Probe mit Hilfe der PCR und einem biotinylierten Primer amplifiziert. Im Reaktionsreservoir befinden sich mit Streptavidin gecoatete Kügelchen und für die jeweilige DNA-Sequenz spezifische DNA-Hairpins. DNA-Hairpins sind einzelsträngige Oligonukleotide, die aufgrund der Komplementarität der DNA-Bausteine an beiden Enden eine Stamm/Schleife-Struktur einnehmen. Bei den zur Verwendung kommenden DNA-Hairpins wird ein geeigneter Fluoreszenzfarbstoff an einem Ende des Oligonukleotids angebracht, der durch Guanosin im komplementären anderen Ende im geschlossenen Zustand des DNA-Hairpins gelöscht wird. Findet der DNA-Hairpin die seiner Schleife komplementäre DNA-Sequenz auf dem Kügelchen, hybridisiert er Certain nucleic acid segments (specifically for antibiotic resistance or a viral illness are) can in the same assay format through the use of DNA hairpins ( "smart probes". See, for example, WO 01/36668 A1) proved who the. Here, to test sample using PCR and a biotinylated primer amplified. In the reaction reservoir located with streptavidin coated beads and specific for the respective DNA sequence DNA hairpins. DNA hairpins are single-stranded oligonucleotides to due to the complementarity of the DNA building blocks both ends assume a stem / loop structure. in the next for use DNA hairpins, a suitable fluorescent dye is attached to one end of the oligonucleotide, which is cleared by guanosine in the complementary other end in the closed state of the DNA hairpins. Finding the DNA Hairpin the complementary loop of its DNA sequence on the beads, it hybridizes spontan unter Ausbildung des thermodynamisch günstigeren Doppelstranges. spontaneously to form the more thermodynamically favorable double strand. Hierdurch wird die Stamm/Schleife-Struktur zerstört und gleichzeitig die durch den Kontakt mit dem Guanosinrest induzierte Fluoreszenzlöschung des Farbstoffs aufgehoben. Thereby, the stem / loop structure is destroyed and removed simultaneously induced by the contact with the guanosine residue fluorescence quenching of the dye.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, dass für den Nachweis des zu detektierenden Moleküls der Fluoreszenzfarbstoff mittels Laser und/oder Leuchtdioden mindestens einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird. According to a further preferred embodiment, the inventive method is characterized in that for the detection of the molecule to be detected, the fluorescent dye laser and / or light-emitting diodes is stimulated at least a suitable wavelength. Das quantitative Auslesen der Fluoreszenzsignale kann dabei nach homogener Anregung der einzelnen Reaktionsgefäße erfolgen. The quantitative readout of fluorescence signals can be carried out by homogeneous excitation of the individual reaction vessels. Dabei kann eine räumlich begrenzte Anregungen des Fluoreszenzfarbstoffes in z-Richtung erfolgen, also in einer Richtung senkrecht zum Boden des Gefäßes, auf dem die Bindungskomplexe sedimentieren. In this case, can take place in a spatially restricted suggestions of the fluorescent dye in the z-direction, ie in a direction perpendicular to the bottom of the vessel on which the binding complexes sedimented. Durch die zusätzliche räumlich begrenzte Anregung der Reaktionsgefäße in z-Richtung kann spezifisch nur die Fluoreszenz am Boden der Reaktionsreservoirs ausgelesen und damit eine noch bessere Diskriminierung erreicht werden. The additional spatially limited excitation of the reaction vessels in the z direction only, the fluorescence at the bottom of the reaction reservoir can specifically read and thus a better discrimination can be achieved.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Nachweis des zu detektierenden Moleküls unter Einsatz einer CCD-Kamera und/oder einer optischen Pinzette erbracht. In a preferred embodiment, the detection of the molecule to be detected is provided using a CCD camera and / or an optical tweezer. Dabei kann es sich bei der optischen Pinzette um einen gepulsten Infrarot-Laser handeln. It may be in optical tweezers a pulsed infrared laser. Es ist möglich, die Kügelchen mit einer optischen Pinzette aufgrund des Strahlungsdrucks im Laserfokus zu fangen und selektiv nur die Fluoreszenz auf der Kugeloberfläche auszulesen. It is possible to catch the beads with an optical tweezer because the radiation pressure in the laser focus and selectively read only the fluorescence on the spherical surface. Dies kann durch die Verwendung eines gepulsten Infrarot-Lasers (mit einer Wellenlänge zwischen ca. 800 und ca. 1100 nm) realisiert werden, der einerseits die Kügelchen fängt und gleichzeitig die Fluoreszenz der Farbstoffe durch Zwei-Photonen-Anregung generiert. This can be realized (with a wavelength between about 800 and about 1100 nm) by using a pulsed infrared laser, on the one hand catches the beads and at the same time generates the fluorescence of the dyes by two-photon excitation. Die verwendete Optik wird durch die komplementäre Einsatzmöglichkeit der Ein- und Zwei-Photonen-Mikroskopie nicht beeinträchtigt. The optics used is not affected by the complementary use of the possibility of one- and two-photon microscopy.
  • Zur Parallelisierung der Technik können neue Multistrahlsysteme mit bspw. 8 × 8 Laserstrahlen vorteilhaft eingesetzt werden. To parallelize the art new multi-beam systems with, for example, 8 x 8 laser beams can be used to advantage. Hierbei wird der Anregungslaserstrahl durch eine Kombination von Strahlteilern und Spiegeln in 64 Strahlen zerlegt. Here, the excitation laser beam is broken by a combination of beam splitters and mirrors in 64 beams. Die Strahlen können dann entweder mit Hilfe eines Piezo-Scanner-Spiegels schnell (dh im Bereich von Millisekunden) über den Boden des Reservoirs gescannt und ein fluoreszenzmikroskopisches Bild auf dem CCD-Chip erzeugt, oder stationär zum Einfangen von Kügelchen mit gleichzeitiger Auslesung der Fluoreszenz verwendet werden. The radiation can be scanned rapidly (ie in the millisecond range) on the bottom of the reservoir and produces a fluorescence microscopic image onto the CCD chip then either by means of a piezo-scanner mirror, or stationary used to capture beads with simultaneous readout of the fluorescence become.
  • Das Detektionsprinzip erlaubt ebenso den Einsatz verschiedener Anregungswellenlängen zur simultanen Bestimmung verschiedener Zielmoleküle pro Reservoir („Multiplexing"). Hierbei können beispielhaft die Sonden mit zwei spektral unterschiedlichen Farbstoffen und die Kügelchen mit verschiedenen Fängermolekülen modifiziert werden. Bei gleichzeitiger Anregung mit zwei Laserwellenlängen für den Fall der Ein-Photonen-Anregung können die Signale der beiden Farbstoffe spektral separiert durch einen dichroitischen Strahlteiler gleichzeitig auf verschiedenen Bereichen des CCD-Chips ausgelesen werden. Für den Fall der Zwei-Photonen-Anregung können Farbstoffe selektiert werden, die mit der gleichen Laserwellenlänge effizient angeregt werden können, sich aber in ihrem Emissionsspektrum eindeutig unterscheiden. Der Einsatz der Ein- oder Zwei-Photonen-Anregung wird letztendlich durch die Anzahl der parallel nachzuweisenden Zielmoleküle und die dafür zur Verfügung stehenden Kosten kon The detection principle also allows the use of different excitation wavelengths for the simultaneous determination of different target molecules per reservoir ( "multiplexing"). Here, the probes may be modified with two spectrally different dyes and the beads with different catcher molecules of example. With simultaneous excitation with two laser wavelengths in the case of one-photon excitation can spectrally separated are read out simultaneously on different areas of the CCD chip through a dichroic beam splitter, the signals of the two dyes. For the case of two-photon excitation of dyes can be selected that are efficiently excited by the same laser wavelength can, but clearly differ in their emission spectrum. the use of one- or two-photon excitation is kon ultimately by the number of parallel detected targets and the available for it costs trolliert. trolled.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis des zu detektierenden Moleküls im roten Spektralbereich. In a particularly preferred embodiment, the detection of the molecule to be detected in the red spectral done. Im roten Spektralbereich gibt es kaum natürliche Stoffe oder Moleküle, die Licht noch effizient absorbieren und auch noch fluoreszieren, so dass zur Reduzierung der Autofluoreszenz in biologischen Proben die Fluoreszenzanregung der Probe vorzugsweise im diesem Spektralbereich erfolgt. In the red spectral there are few natural substances or molecules, nor absorb light efficiently and also fluoresce so that the fluorescence excitation of the sample is preferably carried out to reduce the autofluorescence in biological samples in this spectral range.
  • Das geschilderte Verfahren lässt sich wie folgt charakterisieren: The described method can be characterized as follows:
    • (1) In der ersten Variante befinden sich bestimmte nicht fluoreszenzmarkierte Fängermoleküle auf den Kügelchen. (1) are located in the first variant, certain non-fluorescently labeled capture molecules on the beads. Fängermoleküle sind Antikörper, Antigene, Peptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren etc. Alternativ können aber auch Zellen, die bestimmte antigene Oberflächenstrukturen besitzen, z. Capture molecules are antibodies, antigens, peptides, carbohydrates, nucleic acids, etc. Alternatively, however, can also cells having certain antigenic surface structures such. B. Erythrozyten zur Bestimmung der Blutgruppen, eingesetzt werden. B. erythrocytes are used to determine the blood groups. Wichtig ist nur, dass die Kügelchen, bzw. Zellen, so groß sind, dass sie schnell (Sekunden bis Minuten) sedimentieren. It is only important that the beads or cells are so large that they settle rapidly (seconds to minutes). Bei Verwendung von Polystyrolkügelchen kann zusätzlich ein Eisenkern verwendet werden, damit die Kügelchen mit magnetischen Kräften manipuliert werden können. When using polystyrene beads, an iron core may be additionally used, so that the beads can be manipulated by magnetic forces. Andererseits können die Kügelchen oder Zellen mittels optischen Kräften gefangen und bewegt werden. On the other hand, the beads or cells can be trapped by means of optical forces and moved. Zusätzlich werden Detektormoleküle (farbstoffmarkierte Sekundärantikörper oder komplementäre Oligonukleotide) benötigt, die ebenfalls bei Vorhandensein an die Zielmoleküle binden. In addition, detector molecules are needed (dye-labeled secondary antibodies or complementary oligonucleotides) which also bind in the presence of the target molecules. Durch die Aufkonzentrierung des Fluoreszenzsignals auf der Kügelchenoberfläche und Sedimentation der Kügelchen kann eine einfache und quantitative Detektion bestimmter Zielmoleküle erreicht werden. By concentrating the fluorescent signal on the bead surface and sedimentation of the beads a simple and quantitative detection of specific target molecules can be achieved. Das Verfahren kann ohne große Umstände direkt für die meisten gängigen ELISA's und jede nachzuweisende DNA-Sequenz sofort eingesetzt werden. The method can be used immediately without further ado directly for most common ELISAs and each detected DNA sequence.
    • (2) In der zweiten Variante können farbstoffgelöschte Proteasesubstrate oder Peptid-Epitope oder DNA-Hairpins auf der Kügelchenoberfläche immobilisiert werden. (2) In the second variant dye deleted protease substrates or peptide epitopes or DNA hairpins can be immobilized on the bead surface. In Gegenwart des Zielmoleküls kommt es zur Anbindung an die Oberfläche und zu einem Signalanstieg, der quantitativ ausgelesen werden kann. In the presence of the target molecule occurs for connecting to the surface and to a signal increase that can be read quantitatively.
    • (3) In der dritten Variante kann für den Nachweis bestimmter DNA-Sequenzen die vorher immer durchgeführte PCR-Amplifizierung bspw. mit einem biotinylierten Primer durchgeführt werden. (3) In the third variant of the previously always performed PCR amplification can be performed for the detection of specific DNA sequences, for example. With a biotinylated primer. Nach Denaturierung der PCR-Produkte werden sie zu mit Streptavidin beschichteten Kügelchen und DNA-Hairpins (Smart Probes, Gen-Pins, siehe oben) oder normalen farbstoffmarkierten Oligonukleotiden gegeben. After denaturation of the PCR products they are to streptavidin coated beads and DNA hairpin (smart probes, gene pins, see above) or normal dye-labeled oligonucleotides given. Die PCR-Produkte binden auf der Oberfläche der Kügelchen und die Sonden hybridisieren in Gegenwart der komplementären Zielsequenz. The PCR products bind to the surface of the beads and the probes hybridize in the presence of the complementary target sequence. Somit kommt es ebenso zu einer Anreicherung der Fluoreszenzsignals auf der Oberfläche, die nach Sedimentation der Kügelchen leicht quantitativ ausgelesen werden kann. Thus, there is also an accumulation of the fluorescent signal on the surface, which can be read easily quantitatively after sedimentation of the beads.
  • Für die Detektion mindestens eines Moleküls in einer Lösung eignet sich ein Kit mit Kügelchen mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, deren Oberfläche mit spezifischen Ankermolekülen für das zu detektierende Molekül modifiziert wurde. For the detection of at least one molecule in a solution, a kit is suitable with beads having a diameter of about 50 nm to 50 microns, preferably about 1 to 10 microns, particularly about 2 to 3 microns, the surface with specific anchor molecules for the modified molecule to be detected. Ferner enthält der Kit In addition, the kit contains
    • a) farbstoffmarkierten Sekundärantikörper, und/oder a) dye-labeled secondary antibodies, and / or
    • b) Substanzen, die durch die Bindung an das zu detektierende Molekül fluoreszenzfähig werden. b) substances capable of fluorescence through binding to the molecule to be detected.
  • Für die Detektion kann ein Mikrofluidik-Chip mit Reaktionsreservoirs verwendet werden, die folgendes enthalten: Kügelchen mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, deren Oberfläche mit spezifischen Ankermolekülen für das zu detektierende Molekül modifiziert wurde. For the detection, a microfluidic chip can be used with reaction reservoirs containing: beads having a diameter of about 50 nm to 50 microns, preferably about 1 to 10 microns, particularly about 2 to 3 microns, the surface with specific anchor molecules has been modified for the molecule to be detected. Ferner enthalten die Reaktionsreservoirs Furthermore, the reaction reservoir included
    • a) farbstoffmarkierte Sekundärantikörper, die das zu detektierende Molekül binden können; a) dye-labeled secondary antibodies that can bind to the molecule to be detected; und/oder and or
    • b) Substanzen, die durch die Bindung an das zu detektierende Molekül fluoreszenzfähig werden. b) substances capable of fluorescence through binding to the molecule to be detected.
  • Potentielle Anwendungsfelder sind z. Potential fields of application are, for example. B.: B .:
    • (1) Immunhämatologie (z. B. Blutgruppenbestimmung) (1) immunohematology (z. B. Blood grouping)
    • (2) Nachweis von Tumormarkern (Proteasen, p53, Antikörper) (2) the detection of tumor markers (proteases, p53, antibodies)
    • (3) Bestimmung genetischer Dispositionen (Antibiotika-Resistenz, HIV, HCV) (3) Determination of genetic dispositions (antibiotic resistance, HIV, HCV)
    • (4) Bestimmung von Blutgerinnung und Kardiakmarkern. (4) Determination of blood clotting and Kardiakmarkern.
  • Weitere Einzelheiten und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens und von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Further details and features of the invention will become apparent from the following description of the representation of the method according to the invention and of preferred embodiments taken in conjunction with the subclaims. Hierbei können die je weiligen Merkmale für sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein. Here, depending weiligen features on their own or in groups can be implemented in combination.
  • In den Abbildungen zeigt: In the figures show:
  • 1 1 eine schematische Darstellung des Mikrofluidik-Chips; a schematic representation of the microfluidic chip;
  • 2 2 eine schematische Darstellung des Detektionsverfahrens; a schematic representation of the detection method;
  • 3 3 ein beispielhaftes Messergebnis für die Detektion von Anti-Heparin/PF4-Antikörpern in Blutseren; an exemplary measurement result for the detection of anti-heparin / PF4 antibody in blood sera; und and
  • 4 4 eine schematische Darstellung eines farbstoffmarkierten Peptids mit Tryptophanrest; a schematic diagram of a dye-labeled peptide with tryptophan residue; und and
  • 5 5 eine schematische Darstellung des Nachweises einer Protease. a schematic representation of the detection of a protease.
  • Beispiel 1 example 1
  • Das grundlegende Prinzip des Nachweisverfahrens ist in der The basic principle of the detection method is 1 1 für den Nachweis bestimmter Antigene in einem Mikrofluidik-Chip for the detection of certain antigens in a microfluidic chip 110 110 schematisch zusammengefasst. schematically summarized.
  • In den Reaktionsreservoirs In the reaction reservoir 112 112 befinden sich (getrocknet) Kügelchen are (dried) beads 210 210 (siehe (please refer 2 2 ) mit einem Durchmesser von 2-3 μm, deren Oberfläche mit spezifischen Ankermolekülen (z. B. Antikörper) so modifiziert wurde, dass die Zielmoleküle ) With a diameter of 2-3 microns, the surface of which was treated with specific anchoring molecules (eg., Antibody) modified such that the target molecules 212 212 (Antigene) bei Vorhandensein spezifisch binden. (Antigens) bind specifically at presence. Zusätzlich befinden sich farbstoffmarkierte Sonden In addition, there are dye-labeled probes 214 214 (z. B. Sekundärantikörper) in jedem Reaktionsreservoir (Z. B. secondary antibodies) in each reaction reservoir 112 112 , die ebenfalls spezifisch an die Zielmoleküle Which also specific to the target molecules 212 212 binden. tie.
  • Die Mikrofluidik-Chips The microfluidic chips 110 110 weisen Befüllreservoirs have Befüllreservoirs 114 114 auf, in die die Probe bzw. zu untersuchende Lösung, z. , into which the sample or solution to be examined, for. B. Blutserum, getropft wird. As blood serum is dropped. Von den Befüllreservoirs Of the Befüllreservoirs 114 114 wird die Probe durch Kapillarkräfte durch Befüllungskapillaren the sample is by capillary forces through Befüllungskapillaren 116 116 zu den Reaktionsreservoirs the reaction reservoir 112 112 geleitet. directed. Die Luft im Reaktionsreservoirs The air in the reaction reservoir 112 112 entweicht durch Entlüftungskapillare escapes through vent capillary 118 118 . , Der Mikrofluidik-Chip ist durch eine Folie The microfluidic chip is formed by a foil 120 120 abgedeckt. covered.
  • Beim Befüllen der Reaktionsreservoirs When filling the reaction reservoir 112 112 mit der Probe kommt es zu einer starken Durchmischung der Probe mit den vorgelegten Kügelchen with the sample, there is a strong mixing of the sample with the supplied beads 210 210 und Sonden and probes 214 214 und bei Vorhandensein der Zielmoleküle and in the presence of the target molecules 212 212 zur Anbindung an die Sonden for connection to the probes 214 214 und die Kügelchen and the beads 210 210 . , Es bildet sich ein „Sandwich"-Komplex It forms a "sandwich" complex 216 216 aus. out.
  • Die Kügelchen the beads 210 210 ebenso wie der Komplex as well as the complex 216 216 sedimentieren innerhalb weniger Minuten quantitativ auf den Boden des Reaktionsreservoirs, wo sie fluoreszenzmikroskopisch leicht abgebildet werden können (siehe sediment within minutes quantitatively on the bottom of the reaction reservoir, where it can be displayed easily by fluorescence microscopy (see 3 3 linke Hälfte). left half). Bei einer negativen Probe (siehe In a negative sample (see 3 3 rechte Hälfte) zeigen die sedimentierten Kügelchen right half) showing the sedimented beads 210 210 keine Fluoreszenz. no fluorescence. Die aufgrund der farbstoffmarkierten Sonden The result of the dye-labeled probes 214 214 resultierende Hintergrundfluoreszenz ist bei fluoreszenzmikroskopischer Abbildung der Bodenoberfläche des Reservoirs resulting background fluorescence is in fluorescent microscopic image of the bottom surface of the reservoir 112 112 sehr gering. very low.
  • Das Verfahren nutzt The method uses
    • (a) die Sedimentation der Kügelchen, dh die Möglichkeit der lokalen mikroskopischen Abbildung der Oberfläche und (A) the sedimentation of the beads, ie the possibility of local microscopic image of the surface and
    • (b) die Aufkonzentrierung des Fluoreszenzsignals auf der Kugeloberfläche zur eindeutigen Diskriminierung vom Hintergrundsignal. (B) the concentration of the fluorescent signal on the sphere for clear discrimination from the background signal.
  • 3 3 zeigt als Beispiel das Fluoreszenzbild für die Detektion von Anti-Heparin/PF4-Antikörpern in Blutseren. shows an example of the fluorescence image for the detection of anti-heparin / PF4 antibody in blood sera. Hierzu wurde Heparin/PF4 auf 2.7 μm großen Polystyrolkügelchen immobilisiert und ein Sekundärantikörper (goat-anti-human) mit einem im roten Spektralbereich absorbierender Farbstoff (Alexa 633) markiert. For this purpose, heparin / immobilized on 2.7 micron sized polystyrene beads PF4 and a secondary antibody (goat-anti-human) with an absorbing in the red spectral dye (Alexa 633) marked.
  • Der Sekundärantikörper und die modifizierten Kügelchen wurden anschließend mit verschiedenen Blutseren gemischt und schließlich ein Tropfen der Mischung auf ein Mikroskop-Abdeckgläschen gegeben und mit Hilfe eines Standard-Fluoreszenzmikroskops – mit einer Quecksilber-Lampe als Anregungsquelle – mit einem geeigneten Filtersatz und einer CCD-Kamera die Fluoreszenz am Boden des Abdeckgläschens ohne Waschschritte ausgelesen. The secondary antibody and the modified beads were then mixed with various blood serum, and finally optionally a drop of the mixture on a microscope cover slip and by using a standard fluorescence microscope - with a suitable filter set and a CCD camera - having a mercury lamp as an excitation source fluorescence is read at the bottom of Abdeckgläschens without washing steps. In In 3 3 links ist das positiv Ergebnis gezeigt. Left is a positive result shown. Die rechte Hälfte von The right half of 3 3 zeigt eine negative Testlösung. shows a negative test solution. Die Fluoreszenz der farbstoffmarkierten Sekundärantikörper im Überstand stört die Detektion nur geringfügig, da es zu einer Aufkonzentrierung des Signals an der Oberfläche der Kügelchen kommt und die Kügelchen in wenigen Minuten quantitativ auf den Boden des Abdeckgläschens fallen. The fluorescence of the dye-labeled secondary antibodies in the supernatant interfere with the detection only slightly, since there is a concentration of the signal on the surface of the beads and the beads fall within a few minutes quantitatively to the bottom of Abdeckgläschens. Das Signal/Hintergrund-Verhältnis kann zudem leicht durch den Einsatz der bildgebenden (dh Scanning) konfokalen Fluoreszenzmikroskopie, die eine bessere z-Schärfe besitzt erhöht werden. The signal / background ratio can also be easily increased through the use of imaging (ie, scanning) confocal fluorescence microscopy, which has a better z-sharpness. Die gleichen Tests wurden ebenso erfolgreich für die Bestimmung von Blutgruppen und anderen Antigenen eingesetzt. The same tests were also successfully used for the determination of blood groups and other antigens.
  • Beispiel 2 example 2
  • Unter den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren gibt es ähnlich wie bei den DNA-Basen nur eine Aminosäure, nämlich Tryptophan, die die Fluoreszenz ausgewählter Farbstoffe selektiv löscht. Among the 20 naturally occurring amino acids, there are similar to the DNA bases only one amino acid, namely tryptophan, which selectively quenches the fluorescence of selected dyes. Dieses Löschprinzip kann ebenso zur Entwicklung von Sonden auf Peptidbasis zur Detektion von Antikörpern ausgenutzt werden. This extinguishing principle can also be exploited for the development of probes based on peptides for the detection of antibodies.
  • Im folgenden wird auf The following is on 4 4 Bezug genommen. Reference is made. 4 4 zeigt im oberen Bereich eine Gleichgewichtsreaktion zwischen zwei Konformationen eines Peptids. shows in the upper part an equilibrium reaction between two conformations of a peptide. Das Peptid hat einen ersten fluores zenzmarkierten Teilstrang The peptide has a first partial strand fluores zenzmarkierten 412 412 und einen zweiten Teilstrang and a second sub-branch 414 414 , der einen Tryptophanrest enthält. Which contains a tryptophan residue.
  • Bedingt durch die konformative Flexibilität des Peptides Due to the conformational flexibility of the peptide 410 410 kann der Tryptophanrest in Kontakt mit dem Farbstoff kommen. the tryptophan residue may come into contact with the dye. Dies ist die in This is in 4 4 rechts oben gezeigte Konformation. Conformation shown top right. In dieser Konformation ist die Fluoreszenzintensität der Peptid-Sonde In this conformation, the fluorescence intensity of the peptide probe 410 410 stark verringert. greatly reduced.
  • Wenn die Aminosäurensequenz zwischen Farbstoff und Tryptophanrest ein Epitop für einen Antikörper darstellt, wird durch Anbindung des Antikörpers die konformative Flexibilität des Peptids When the amino acid sequence between the dye and tryptophan residue represents an epitope for an antibody is by binding of the antibody, the conformational flexibility of the peptide 410 410 so stark eingeschränkt, dass es zu keiner Kontaktbildung zwischen Farbstoff und Tryptophan mehr kommt, dh die Anwesenheit des Antikörpers resultiert in einem Fluoreszenzanstieg. so severely limited that there is no contact formation between the dye and tryptophan more, that is, the presence of the antibody results in an increase in fluorescence. Diese Technik wurde erfolgreich zur Detektion von p53-Autoantikörpern, ein universeller Tumormarker, direkt in Patientenseren eingesetzt (siehe z. B. WO 2003/014742 A2). This technique was successfully used for detection of p53 autoantibodies, a universal tumor marker directly in patient sera (see, eg., WO 2003/014742 A2). Werden die farbstoffmarkierten Epitope auf Kügelchen immobilisiert, resultiert das Anbinden der Antikörper an den Peptiden auf der Kügelchenoberfläche in einem starken Fluoreszenzanstieg, der für den Nachweis der Antikörper genutzt werden kann. When the dye-labeled epitopes immobilized on beads, the binding of the antibodies to the peptides on the bead surface in a strong increase in fluorescence, which can be used for the detection of the antibodies results.
  • Beispiel 3 example 3
  • Die selektive Fluoreszenzlöschung einiger Farbstoffe in tryptophanhaltigen Peptiden The selective fluorescence quenching of some dyes in tryptophan-containing peptides 410 410 kann ebenso erfolgreich zur Detektion verschiedener Proteasen, z. can just as successful for the detection of various proteases such. B. tumorassoziierter Proteasen, eingesetzt werden, wenn die Aminosäurensequenz zwischen Farbstoff B. tumor-associated proteases, are used when the amino acid sequence between the dye 412 412 und Tryptophanrest and tryptophan residue 414 414 eine Erkennungssequenz für die Protease enthält, die es der Protease ermöglicht, an dieser Erkennungssequenz das Peptid "durchzutrennen", also zu hydrolisieren. contains a recognition sequence for the protease, "sever" at this recognition sequence, the peptide, that is to hydrolyse which allows the protease. Dies ist in This is in 5 5 verdeutlicht. clarified.
  • Experimente in homogener Lösung (siehe z. B. WO 02/081509 A2) erlauben die sichere Detektion geringster Proteasekonzentrationen (10 -12 – 10 -15 M) durch einfaches Auslesen der Fluoreszenzintensität. Experiments in homogeneous solution (See, e.g. WO 02/081509 A2) allow the reliable detection of the lowest protease concentrations (10 -12 - 10 -15 M) by simply reading the fluorescence intensity.
  • In der für das hier vorgestellte Verfahren relevanten Variante werden die Peptide In relevant to the method presented here variant peptides are 410 410 so auf der Kugeloberfläche immobilisiert, dass nach dem Schnitt durch die Protease der den Farbstoff tragende Peptidrest so immobilized on the ball surface, that after the cut by the protease of the dye-bearing peptide residue 412 412 auf der Oberfläche verbleibt und somit die Kügelchen nach Sedimentation eine vergleichsweise starke Fluoreszenzintensität aufweisen. remains on the surface and thus, the beads have a relatively strong fluorescence intensity after sedimentation.
  • 110 110
    Mikrofluidik-Chip Microfluidic chip
    112 112
    Reaktionsreservoirs reaction reservoir
    114 114
    Befüllreservoir Befüllreservoir
    116 116
    Befüllungskapillare Befüllungskapillare
    118 118
    Entlüftungskapillare deaerating
    120 120
    Folie foil
    210 210
    Kügelchen globule
    212 212
    Zielmoleküle targets
    214 214
    farbstoffmarkierte Sonde dye-labeled probe
    216 216
    „Sandwich"-Komplex "Sandwich" complex
    410 410
    fluoreszenzmarkiertes Peptid fluorescently labeled peptide
    412 412
    erster fluoreszenzmarkierten Teilstrang des fluoreszenz the first part of fluorescently labeled strand of fluorescence
    markierten Peptids labeled peptide 410 410
    414 414
    zweiter Teilstrang des fluoreszenzmarkierten Peptids second partial strand of the fluorescently labeled peptide 410 410 , .
    der einen Tryptophanrest enthält contains a tryptophan residue

Claims (22)

  1. Verfahren zur Detektion mindestens eines Moleküls ( A method for detecting at least one molecule ( 212 212 ) in einer Lösung in einem Gefäß ( ) (In a solution in a vessel 112 112 ) mit einem Boden, a) wobei das zu detektierende Molekül ( ) With a bottom, a) wherein the molecule to be detected ( 212 212 ) mit mindestens einer modifizierten ersten Substanz ( ) (With at least one modified first substance 210 210 ) und mindestens einer farbstoffmarkierten zweiten Substanz ( ) And at least one dye-labeled second substance ( 214 214 ) in Kontakt gebracht wird; ) Is brought into contact; b) wobei das zu detektierende Molekül ( b) wherein the molecule to be detected ( 212 212 ) an der modifizierten ersten Substanz ( ) (On the modified first substance 210 210 ) und der farbstoffmarkierten zweiten Substanz ( ) And the dye-labeled second substance ( 214 214 ) bindet; ) Binds; c) wobei sich ein Komplex ( c) wherein a complex ( 216 216 ) aus zu detektierendem Molekül ( ) (From molecule to be detected 212 212 ), modifizierter erster Substanz ( ), Modified first substance ( 210 210 ) und farbstoffmarkierter zweiter Substanz ( ) And dye-labeled second substance ( 214 214 ) bildet; ) Forms; und d) wobei dieser Komplex ( and d) said complex ( 216 216 ) mindestens zum Teil sedimentiert und am Boden nachgewiesen wird. ) At least partially sedimented and is detected on the ground.
  2. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem zu detektierenden Molekül ( Method according to the preceding claim, characterized in that it is in the (molecule to be detected 212 212 ) um ein Biomolekül, insbesondere um eine Nukleinsäure, ein Antigen, einen Antikörper und/oder ein Enzym handelt. ) Is a biomolecule, in particular a nucleic acid, an antigen, an antibody and / or an enzyme.
  3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der modifizierten ersten Substanz um Kügelchen ( Method according to one of the preceding claims, characterized in that it is (in the modified first substance to beads 210 210 ) mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, handelt. ) With a diameter of about 50 nm to 50 microns, preferably about 1 to 10 microns, particularly about 2 to 3 microns is.
  4. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Kügelchen ( Method according to the preceding claim, characterized in that it is (in the beads 210 210 ) um Polystyrolkügelchen handelt. ) Is polystyrene beads.
  5. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Polystyrolkügelchen ( Method according to the preceding claim, characterized in that the polystyrene beads ( 210 210 ) einen Eisenkern aufweisen. ) Have an iron core.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche der modifizierten ersten Substanz ( Method according to one of the preceding claims, characterized in that the surface of the modified first substance ( 210 210 ) mit spezifischen Ankermolekülen modifiziert wurde. ) Was modified with specific anchoring molecules.
  7. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den spezifischen Ankermolekülen um Antikörper, Antigene, Peptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und/oder Zellen handelt. Method according to the preceding claim, characterized in that it is in the specific anchor molecules to antibodies, antigens, peptides, carbohydrates, nucleic acids and / or cells.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der farbstoffmarkierten zweiten Substanz ( Method according to one of the preceding claims, characterized in that it is (in the case of the dye-labeled second substance 214 214 ) um a) farbstoffmarkierte Sekundärantikörper, und/oder b) um Substanzen, die durch die Bindung an das zu detektierende Molekül fluoreszenzfähig werden, und/oder c) komplementäre Oligonukleotide handelt. ) To a) dye-labeled secondary antibodies, and / or b) substances which are represented by the binding to the molecule to be detected capable of fluorescence, and / or c are) complementary oligonucleotides.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die Detektion unterschiedlicher zu detektierender Moleküle unterschiedliche, jeweils spezifisch bindende Substan zen verwendet werden, wobei die Substanzen jeweils mit spektroskopisch unterscheidbaren Farbstoffen markierten werden. Method according to one of the preceding claims, characterized in that for the detection of different molecules to be detected different, each specific binding Substan be used wherein the substances are labeled each with spectroscopically distinguishable dyes zen.
  10. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifischen Interaktionen zu mindestens zwei, vorzugsweise mehreren Farbreaktionen führt und diese nach Art der Farbe getrennt erfasst und ausgewertet werden. Method according to the preceding claim, characterized in that the specific interactions of at least two, preferably several color reactions results and these are recorded separately on the type of color and evaluated.
  11. Verfahren nach einem der 3 vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Farbstoff um einen Fluoreszenzfarbstoff handelt; Method according to one of the preceding claims 3, characterized in that it is the dye is a fluorescent dye; dass für den Nachweis des zu detektierenden Moleküls der Fluoreszenzfarbstoff mittels Laser und/oder Leuchtdioden mindestens einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird; that is stimulated at least a suitable wavelength for the detection of the molecule to be detected, the fluorescent dye laser and / or light emitting diodes; und dass eine räumlich begrenzte Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes in Richtung senkrecht zum Boden erfolgt. and that a spatially limited excitation of the fluorescent dye occurs in the direction perpendicular to the ground.
  12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des zu detektierenden Moleküls unter Einsatz einer CCD-Kamera und/oder einer optischen Pinzette erfolgt. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the detection of the molecule to be detected is carried out using a CCD camera and / or an optical tweezer.
  13. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der optischen Pinzette um einen gepulsten Infrarot-Laser handelt. Method according to the preceding claim, characterized in that it concerns with the optical tweezers to a pulsed infrared laser.
  14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des zu detektierenden Moleküls im roten Spektralbereich erfolgt. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the detection of the molecule to be detected occurs in the red spectral region.
  15. Kit für die Detektion mindestens eines Moleküls ( Kit for the detection of at least one molecule ( 212 212 ) in einer Lösung mit Kügelchen ( ) (In a solution containing beads 210 210 ) mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, deren Oberfläche mit spezifischen Ankermolekülen für das zu detektierende Molekül modifiziert wurde; ) With a diameter of about 50 nm to 50 microns, preferably about 1 to 10 microns, particularly about 2 to 3 microns, the surface of which has been modified with specific anchoring molecules to the molecule to be detected; und mit a) farbstoffmarkierten Sekundärantikörper ( and (with a) dye-labeled secondary antibodies 214 214 ), und/oder mit b) Substanzen, die durch die Bindung an das zu detektierende Molekül fluoreszenzfähig werden. ), And / or b) substances capable of fluorescence through binding to the molecule to be detected.
  16. Mikrofluidik-Chip ( Microfluidic chip ( 110 110 ) mit Reaktionsreservoirs ( ) (Reaction with reservoir 112 112 ), die folgendes enthalten: Kügelchen ( Containing the following elements) beads ( 210 210 ) mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, deren Oberfläche mit spezifischen Ankermolekülen für das zu detektierende Molekül modifiziert wurde; ) With a diameter of about 50 nm to 50 microns, preferably about 1 to 10 microns, particularly about 2 to 3 microns, the surface of which has been modified with specific anchoring molecules to the molecule to be detected; und a) farbstoffmarkierten Sekundärantikörper ( and a) dye-labeled secondary antibodies ( 214 214 ), die das zu detektierende Molekül binden können, und/oder b) Substanzen, die durch die Bindung an das zu detektierende Molekül fluoreszenzfähig werden. ) That can bind to the molecule to be detected, and / or b) substances capable of fluorescence through binding to the molecule to be detected.
  17. Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers in einer Lösung, in einem Gefäß ( A method of detecting an antibody in a solution (in a vessel 112 112 ) mit einem Boden, a) wobei mindestens ein Epitop eines Antigens derart gewählt wird, dass der nachzuweisende Antikörper und das Epitop aneinander binden können; ) With a bottom, a) wherein at least one epitope of an antigen is selected such that the antibody to be detected and the epitope may bind to each other; b) wobei das Epitop und ein Fluorophor derart gewählt werden, dass das Epitop mindestens einen Tryptophanrest (Quencher) aufweist, der die Lumineszenz des Fluorophors bei hinreichender räumlicher Nähe zwischen dem Fluorophor und dem Tryptophanrest quenchen kann; b) wherein said epitope and a fluorophore are chosen such that the epitope includes at least one tryptophan residue (quencher) capable of quenching the luminescence of the fluorophore with sufficient spatial proximity between the fluorophore and the tryptophan residue; c) wobei das Epitop mit dem Fluorophor markiert wird; c) wherein the epitope is labeled with the fluorophore; d) wobei das Epitop auf einer ersten Substanz immobilisiert wird; d) wherein said epitope is immobilized on a first substance; e) wobei der Antikörper und das an die erste Substanz gebundene, markierte Epitop in der Lösung in Kontakt gebracht werden; e) wherein the antibody and bound to the first substance labeled epitope are contacted in the solution; f) wobei der zu detektierende Antikörper an das Epitop bindet; f) wherein the object to be detected antibody binds to the epitope; g) wobei sich ein Komplex aus zu detektierendem Antikörper, der erster Substanz und dem farbstoffmarkierten Epitop bildet; g) wherein a complex is formed from antibody to be detected, the first substance and the dye-labeled epitope; h) wobei dieser Komplex mindestens zum Teil sedimentiert und am Boden nachgewiesen wird. h) said complex is sedimented at least partly and detected on the ground.
  18. Kit für die Detektion mindestens eines Antikörpers mit a) mindestens einem Epitop eines Antigens, das derart gewählt ist, dass der nachzuweisende Antikörper und das Epitop aneinander binden können; Kit for the detection of at least one antibody with a) at least one epitope of an antigen that is selected such that the antibody to be detected and the epitope may bind to each other; b) einem Fluorophor, wobei das Epitop und der Fluorophor derart gewählt sind, dass das Epitop mindestens einen Tryptophanrest (Quencher) aufweist, der die Lumineszenz des Fluorophors bei hinreichender räumlicher Nähe zwischen dem Fluorophor und dem Tryptophanrest quenchen kann, wobei das Epitop mit dem Fluorophor markiert wird; b) a fluorophore, wherein the epitope and the fluorophore are chosen such that the epitope includes at least one tryptophan residue (quencher) capable of quenching the luminescence of the fluorophore with sufficient spatial proximity between the fluorophore and the tryptophan residue, which epitope with the fluorophore is marked; und mit c) Kügelchen mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, deren Oberfläche mit dem farbstoffmarkierten Epitop modifiziert wurde. and c) beads having a diameter of about 50 nm to 50 microns, preferably about 1 to 10 microns, particularly about 2 to 3 microns, the surface of which has been modified with the dye-labeled epitope.
  19. Mikrofluidik-Chip ( Microfluidic chip ( 110 110 ) für die Detektion mindestens eines Antikörpers mit Reaktionsreservoirs ( ) (For the detection of at least one antibody with the reaction reservoir 112 112 ), die den Kit gemäß dem vorhergehenden Anspruch enthalten. ) That contain the kit according to the preceding claim.
  20. Kit für die Detektion einer Endopeptidase (Enzym) mit I) einem farbstoffmarkierten Peptid mit den folgenden Eigenschaften: a) das Peptid enthält eine Erkennungssequenz der Endopeptidase (Enzym) und kann daher für das Enzym als Substrat fungieren, wobei sich eine Schnittstelle zwischen zwei Aminosäuren bei der Erkennungssequenz im Peptid ergibt; Kit for the detection of an endopeptidase (enzyme) with I) a dye-labeled peptide having the following characteristics: a) the peptide contains an identification sequence of the endopeptidase (enzyme) and can therefore serve for the enzyme as a substrate, wherein an interface between two amino acids in the recognition sequence in the peptide results; b) das Peptid enthält mindestens einen Quencher und mindestens einen Fluorophor; b) the peptide contains at least one quencher and at least one fluorophore; c) der Quencher ist die Aminosäure Tryptophan; c) the quencher is the amino acid tryptophan; d) der Fluorophor ist ein Fluoreszenzfarbstoff; d) the fluorophore is a fluorescent dye; e) der Fluoreszenzfarbstoff ist an Peptide oder Proteine kovalent koppelbar; e) the fluorescent dye is covalently coupled to peptides or proteins; f) die Fluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoffs kann durch Tryptophan gelöscht werden; f) the fluorescence of the fluorescent dye can be quenched by tryptophan; g) die Sequenz des Peptids ist wie folgt ausgebildet: h) der Quencher ist auf einer Seite der Schnittstelle angeordnet; g) the sequence of the peptide is formed as follows: h) the quencher is arranged on one side of the interface; i) der Fluorophor ist auf der anderen Seite der Schnittstelle angeordnet; i) the fluorophore is arranged on the other side of the interface; j) eine hinreichende räumliche Nähe zwischen Quencher und Fluorophor ist gegeben, solange das Substrat noch nicht durch das Enzym an der Schnittstelle zwischen Quencher und Fluorophor geschnitten wurde, um die Möglichkeit einer mindestens teilweisen Löschung der Emission des Fluorophors zu gewährleisten; j) a sufficient spatial proximity between the quencher and fluorophore is given as long as the substrate has not been cut by the enzyme at the cleavage site between quencher and fluorophore, to ensure the possibility of an at least partial quenching of the emission of the fluorophore; k) nach dem Schneiden des Substrats durch das Enzym an der Schnittstelle zwischen Quencher und Fluorophor ist ein deutlicher Anstieg der Emission des Fluorophors möglich; k) after cutting the substrate by the enzyme at the cleavage site between quencher and fluorophore, a significant increase of the emission of the fluorophore is possible; und mit II) Kügelchen mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, auf deren Oberfläche das Peptid derart immobilisiert ist, dass der Fluorophor nach einem Schnitt durch das nachzuweisende Enzym auf der Oberfläche immobilisiert bleibt, während der Quencher nicht mehr auf der Oberfläche immobilisiert ist. and II) beads having a diameter of about 50 nm to 50 microns, preferably about 1 to 10 microns, particularly about 2 to 3 micrometers on the surface of the peptide is immobilized such that the fluorophore for a section through the enzyme to be detected is immobilized on the surface, while the quencher is no longer immobilized on the surface.
  21. Mikrofluidik-Chip ( Microfluidic chip ( 110 110 ) für die Detektion einer Endopeptidase mit Reaktionsreservoirs ( ) (For the detection of an endopeptidase with the reaction reservoir 112 112 ), die den Kit gemäß dem vorhergehenden Anspruch enthalten. ) That contain the kit according to the preceding claim.
  22. Verfahren zum Nachweis einer Endopeptidase (Enzym) mit folgenden Schritten: mische den Kit nach Anspruch 20 und das nachzuweisende Enzym in einer Lösung, wobei die Kügelchen mindestens zum Teil sedimentieren und die Stärke des Fluoreszenzsignals auf der Oberfläche der sedimentierten Kügelchen nachgewiesen wird. A method for the detection of an endopeptidase (enzyme) with the following steps: mix the kit according to claim 20 and the enzyme to be detected in a solution, wherein the beads to sediment at least in part and the strength of the fluorescent signal is detected on the surface of the sedimented beads.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1977829A1 (en) * 2007-03-29 2008-10-08 Boehringer Mannheim Gmbh Device for performing multiple analyses in parallel

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4486530A (en) * 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4731337A (en) * 1984-07-26 1988-03-15 Labsystems Oy Fluorimetric immunological assay with magnetic particles
US4859612A (en) * 1987-10-07 1989-08-22 Hygeia Sciences, Inc. Metal sol capture immunoassay procedure, kit for use therewith and captured metal containing composite
WO1999046045A1 (en) * 1998-03-11 1999-09-16 MICROPARTS GESELLSCHAFT FüR MIKROSTRUKTURTECHNIK MBH Sample support
WO2001036668A1 (en) * 1999-11-16 2001-05-25 Atto-Tec Gmbh Colour labelled oligonucleotide for labelling a nucleic acid molecule
WO2002081509A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 WOLFRUM, Jürgen Specific detection of proteolytic enzymes using a hybrid protein
WO2003014742A2 (en) * 2001-08-01 2003-02-20 Wolfrum Juergen Identification of human auto-antibodies

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0834575T3 (en) * 1990-12-06 2002-04-02 Affymetrix Inc A Delaware Corp Identification of nucleic acids in samples
US6136543A (en) * 1997-01-31 2000-10-24 Hitachi, Ltd. Method for determining nucleic acids base sequence and apparatus therefor
EP2264189B1 (en) * 1999-04-20 2014-11-05 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
JP2005508493A (en) * 2001-06-28 2005-03-31 アドヴァンスト リサーチ アンド テクノロジー インスティテュート、インコーポレイティッド Method for producing a multi-color quantum dots labeled beads and conjugates thereof
WO2004066210A1 (en) * 2003-01-22 2004-08-05 Cyvera Corporation Hybrid random bead/chip based microarray

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4486530A (en) * 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4731337A (en) * 1984-07-26 1988-03-15 Labsystems Oy Fluorimetric immunological assay with magnetic particles
US4859612A (en) * 1987-10-07 1989-08-22 Hygeia Sciences, Inc. Metal sol capture immunoassay procedure, kit for use therewith and captured metal containing composite
WO1999046045A1 (en) * 1998-03-11 1999-09-16 MICROPARTS GESELLSCHAFT FüR MIKROSTRUKTURTECHNIK MBH Sample support
WO2001036668A1 (en) * 1999-11-16 2001-05-25 Atto-Tec Gmbh Colour labelled oligonucleotide for labelling a nucleic acid molecule
WO2002081509A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 WOLFRUM, Jürgen Specific detection of proteolytic enzymes using a hybrid protein
WO2003014742A2 (en) * 2001-08-01 2003-02-20 Wolfrum Juergen Identification of human auto-antibodies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hemmilä, Ilkka A.: Applications of flourescence in immunoassays. Chemical Analysis, Vol. 117, John Wiley & Sons, Inc. 1991, ISBN: 0-471-51091-2 *

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