DE102004007084A1 - Method for detecting tissue from central nervous system, especially brain and spinal cord tissue, in foods and pharmaceuticals or on contaminated surfaces uses specific antibodies to determine amount of neurofilament present - Google Patents

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Chrstine Dr. Gaunitz
Johannes Prof. Dr. Seeger
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Abstract

Method for detecting tissue from the central nervous system, especially brain and spinal cord tissue, in foods and pharmaceuticals or on contaminated surfaces uses specific antibodies to determine the amount of neurofilament present. Independent claims are included for: (1) test kits for detecting tissue from the central nervous system, especially brain and spinal cord tissue, in foods and pharmaceuticals or on contaminated surfaces which contain one or more specific monoclonal antibodies against neurofilament proteins; and (2) use of specific monoclonal antibodies against neurofilament proteins to detect tissue from the central nervous system, especially brain and spinal cord tissue, in foods and pharmaceuticals or on contaminated surfaces.

Description

Die Erfindung betrifft ein qualitatives und quantitatives Nachweissystem von spezifiziertem Risikomaterial (SRM), insbesondere zentralnervösem Gewebe, vor allem Gehirn und Rückenmark, in Erzeugnissen, insbesondere Lebensmitteln und Produkten der pharmazeutischen Industrie, und auf kontaminierten Oberflächen. Weiterhin wird ein Testkit unter Verwendung des Nachweisverfahrens dargestellt.The The invention relates to a qualitative and quantitative detection system specified risk material (SRM), in particular central nervous tissue, especially brain and spinal cord, in products, in particular food and pharmaceutical products Industry, and on contaminated surfaces. Furthermore, a test kit is under Use of the detection method shown.

In den Jahren 1920 und 1921 haben Creutzfeldt [Über eine eigenartige herdförmige spongiforme Erkrankung des Zentralnervensystems, Z. Ges. Neurol. Psychat, 57:1-20 (1920) Creutzfeldt, HG.] und Jakob [Über eigenartige Erkrankungen des Zentralnervensystems mit bemerkenswerten anatomischen Befunden, Z. Ges. Neurol. Psychat, 64:147–228 (1921) Jakob, A.] die ersten Fälle einer bislang noch nicht klassifizierten Erkrankung des Zentralnervensystems beschrieben. Im Folgejahr wurde für diese Erkrankung der Begriff Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJK) eingeführt [Die histopathologische Forschung in der Psychiatrie, Klinische Wochenschrift, 2: 175–177 (1922) Spielmeyer, W.]. Im Jahre 1968 wurde der Nachweis der Übertragbarkeit der CJK bei Primaten erbracht [Creutzfeldt-Jakob-Disease (spongiforme encephalopathy): transmission to the chimpanzee, Science, 161:388–389 (1968), Gibbs, CJ, DC Gajdusek, DM Asher, MP Alpers, E Beck, PM Daniel, et al.].In The years 1920 and 1921 have Creutzfeldt [About a peculiar herd-shaped spongiform disease of the central nervous system, Z. Ges. Neurol. Psychat, 57: 1-20 (1920) Creutzfeldt, HG.] And Jacob [About peculiar diseases of the central nervous system with remarkable anatomical findings, Z. Ges. Neurol. Psychat, 64: 147-228 (1921) Jacob, A.] the first cases an as yet unclassified central nervous system disorder. The following year was for this disease introduced the term Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD) [Die histopathological research in psychiatry, Clinical Weekly, 2: 175-177 (1922) Spielmeyer, W.]. In 1968, the proof of transferability the CJD in primates [Creutzfeldt-Jakob disease (spongiform encephalopathy): transmission to the chimpanzee, Science, 161: 388-389 (1968), Gibbs, CJ, DC Gajdusek, DM Asher, MP Alpers, E Beck, PM Daniel, et al.].

In den 90er Jahren traten vermehrt sporadische Fälle von CJK bei Jugendlichen in Großbritannien und Frankreich auf [Sporadic Creutzfeldt-Jakob-Disease in a 16-year old in UK, Lancet, 146:1155 (1995) Britton, TC, S Al-Sarraj, C Shaw, T Campbell, J Collinge]. Diese waren charakterisiert durch bislang bei CJK nicht vorgefundene histopathologische Veränderungen und gelten deshalb als neue Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (nvCJK) [A new variant of Creutzfeldt-Jakob disease in the UK, Lancet, 347:921–925 (1996) Will RG, JW Ironside, M Zeidler, SN Cousens, K Estibeiro, A Alperovitch, S Poser, M Pocchiari, A Hofman, PG Smith].In In the 1990s, sporadic cases of CJD in adolescents increased in Great Britain and France on [Sporadic Creutzfeldt-Jakob Disease in a 16-year Old in UK, Lancet, 146: 1155 (1995) Britton, TC, S Al-Sarraj, C Shaw, T Campbell, J Collinge]. These were characterized by so far at CJK not found histopathological changes and therefore apply as a new variant of Creutzfeldt-Jakob Disease (nvCJK) [A new variant of Creutzfeldt-Jakob disease in the UK, Lancet, 347: 921-925 (1996) Will RG, JW Ironside, M Zeidler, SN Cousens, K Estibeiro, A Alperovitch, S Poser, M Pocchiari, A Hofman, PG Smith].

Im Jahr 1985 wurde erstmals eine neuartige spongiforme Hirnerkrankung bei Rindern – die Bovine Spongiforme Encephalitis (BSE) – beschrieben [A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle, Vet Rec, 121:419–420 (1987) GAH Wells, AC Scott, CT Johnson, RF Gunning, RD Hancock, M Jeffrey, M Dawson, R Bradley]. Insbesondere das räumliche und zeitliche Aufeinandertreffen der beschriebenen sporadischen Fälle der nvCJK bei Jugendlichen und der BSE in Großbritannien und der übertragbare Charakter der beiden Erkrankungen [Transmission of bovine spongiform encephalopathy in mice, Vet Rec, 123:472 (1988) Fraser, H, I McConnell, GAH Wells, M Dawson] führten zu der Erkenntnis, dass die nCJK durch den BSE-Erreger hervorgerufen wird.in the 1985 was the first time a novel spongiform brain disease in cattle - the Bovine spongiform encephalitis (BSE) - described [A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle, Vet Rec, 121: 419-420 (1987) GAH Wells, AC Scott, CT Johnson, RF Gunning, RD Hancock, M Jeffrey, M Dawson, R Bradley]. In particular, the spatial and temporal clash the described sporadic cases the nvCJK in adolescents and BSE in the UK and the transferable character of the two diseases [Transmission of bovine spongiform encephalopathy in mice, Vet Rec, 123: 472 (1988) Fraser, H, I McConnell, GAH Wells, M Dawson] to the realization that the nCJK is caused by the BSE agent.

Als wahrscheinlichste Ursache für die Ausprägung von übertragbaren spongiformen Erkrankungen des Zentralnervensystems gelten heute bestimmte „infektiöse" Proteine, die als Prionenproteine bezeichnet werden [Novel proteinaceous infectious particles causes scrapie, Science, 216:136–144 (1982) Prusiner SB; Identification of prion amyloid filaments in scrapie-infected brain, Cell, 41:221–235 (1985) DeArmond, SJ, MP McKinley, RA Barry, MB Braunfeld, JR McColloch, SB Prusiner]. Auf Grund der hohen Konzentration von Prionenproteinen in Gehirn, Rückenmark und Nerven stellen diese Gewebe ein hohes Infektionsrisiko dar und werden üblicherweise neben lymphatischem Gewebe zum „spezifizierten Risikomaterial" (SRM) gerechnet.When most likely cause of the expression of transferable Spongiform diseases of the central nervous system are considered today certain "infectious" proteins called as Prion proteins are called [Novel proteinaceous infectious particles causes scrapie, Science, 216: 136-144 (1982) Prusiner SB; Identification of prion amyloid filaments in scrapie-contaminated brain, Cell, 41: 221-235 (1985) DeArmond, SJ, MP McKinley, RA Barry, MB Braunfeld, JR McColloch, SB Prusiner]. Due to the high concentration of prion proteins in brain, spinal cord and nerves, these tissues pose a high risk of infection and become common in addition to lymphatic tissue to the "specified risk material" (SRM).

Deshalb regeln Rechtsvorschriften wie die Verordnung (EG) 1326/2001 vom 29.06.2001 die Entfernung und gesonderte Beseitigung der SRM. Derartige Rechtsvorschriften regeln außerdem technologische Veränderungen des Schlachtprozesses, die eine Kontamination des Fleisches mit SRM verhindern sollen.Therefore regulate legislation such as Regulation (EC) 1326/2001 of 29.06.2001 the removal and separate removal of the SRM. such Legislation also regulates technological changes of the slaughter process involving contamination of the meat Prevent SRM.

Diese gesetzlich vorgeschriebenen Verbraucherschutzmaßnahmen führen europaweit zu Mehrkosten bei der Fleischverarbeitung in Höhe von mehreren Milliarden Euro. Zudem bietet der Zusatz von Hirnmaterial bei der Verarbeitung von Fleischerzeugnissen technologische Vorteile, wie bessere Emulgierbarkeit bei Koch- und Brühwürsten und erhöhte Stabilität bei Hackfleischerzeugnissen. Zum Schutz des Verbrauchers ist es daher notwendig, Qualitätssicherungssysteme innerhalb der Produktion einzuführen, die sich spezifischer Nachweissysteme zur Detektion von Risikomaterial bedienen, um die Einhaltung der Verwendungsverbote zu kontrollieren.These legally prescribed consumer protection measures lead to additional costs throughout Europe in meat processing in height of several billion euros. In addition, the addition of brain material offers technological advantages in the processing of meat products, such as better emulsifiability in cooked and boiled sausages and increased stability in minced meat products. To protect the consumer it is therefore necessary to have quality assurance systems to introduce within production, the specific detection systems for the detection of risk material to control compliance with the bans on use.

Für die Detektion von zentralnervösem Gewebe sind zahlreiche Untersuchungsverfahren bekannt, deren Nachteile jedoch in ihrer fehlenden Sensitivität, Spezifität oder einer aufwendigen Probenvorbereitung bzw. Untersuchungsmethodik liegen.For the detection of central nervous Tissues are known for numerous examination methods, their disadvantages however, in their lack of sensitivity, specificity or elaborate sample preparation or investigation methodology.

Es handelt sich hierbei um lichtmikroskopische, enzymatische und immunologische Verfahren. Insbesondere bei der Verwendung von 10 μm Kryostat-Schnitten bzw. Ultradünnschnitten und deren Färbung mit üblicherweise durchgeführten histologischen Färbetechniken (Picroindigokarmin/Karmalaun, Hämatoxylin/Eosin) können zentralnervöse Gewebebestandteile auf Grund der strukturellen Denaturierung oft nicht erfasst werden.It this is light microscopic, enzymatic and immunological Method. Especially when using 10 μm cryostat sections or ultrathin sections and their coloring with usually conducted histological staining techniques (Picroindigo carmine / Karmalaun, Hematoxylin / Eosin) can Central nervous tissue components due to structural denaturation often can not be detected.

Eine ähnliche Unsicherheit liegt dem enzymatisch – photometrischen Verfahren zum Nachweis des Cholesteringehaltes zugrunde, welches auch den Cholesteringehalt anderer nicht verbotener Zusatzstoffe wie Eigelb, Leber oder pflanzlicher 3-β-Hydroxysterine erfasst [Verfahren zum Nachweis von im Hinblick auf die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) unerwünschten Zutaten in Fleischerzeugnisse-1. Enzymatische Cholesterinbestimmung als Schnellverfahren zur Erfassung von Hirngewebe. Fleischwirtschaft, 77(9):836–840 (1997) Lücker E, M Bülte].A similar uncertainty lies with the enzy based on systematic - photometric methods for the detection of cholesterol content, which also covers the cholesterol content of other non-prohibited additives such as egg yolks, liver or herbal 3-β-hydroxysterins [Method for the detection of bovine spongiform encephalopathy (BSE) undesirable ingredients in meat products] 1. Enzymatic cholesterol determination as a rapid method for detecting brain tissue. Fleischwirtschaft, 77 (9): 836-840 (1997) Lücker E, M Bülte].

Neben den genannten Verfahren existiert eine gaschromatographische und massenspektrometrische Analysemethode, die das hirnspezifische Fettsäureprofil für den Nachweis von zentralem Nervengewebe heranzieht [Niederer und Bollhaber identification of species specific central nervous system tissue by gaschromatography – mass spectometry (GC-MS) – a possible method for supervision of meat products and cosmetics (2001) Mitt. Lebensmi. Hyg. 92:133–144]. Diese sehr sensitive Methode (0,01 % Nachweisgrenze) ist jedoch nur in Speziallabors durchführbar und als Routinemethode nicht einsetzbar.Next The said method exists a gas chromatographic and Mass spectrometric analysis method that analyzes the brain-specific fatty acid profile for the Detection of central nervous tissue [Niederer and Bollhaber Identification of species specific central nervous system tissue by gas chromatography - mass spectometry (GC-MS) - a possible method for supervision of meat products and cosmetics (2001) Mitt. Hyg. 92: 133-144]. However, this very sensitive method (0.01% detection limit) is only possible in special laboratories and can not be used as a routine method.

Die derzeit sicherste Routinemethode zum Nachweis von Bestandteilen des Nervensystems sind immunologische Methoden unter Verwendung von Antikörpern gegen γ,γ-Enolase [Patentschrift DE 198 04 216 C2 ] und gegen das saure Gliafaserprotein (GFAP) [Patentschrift DE 198 14 088 C1 ] . Deren Nachweisgrenze liegt in Abhängigkeit vom untersuchten Material (Brühwurst oder Kochwurst) bei 0,25% Anteil Hirngewebe.The currently safest routine method for the detection of components of the nervous system are immunological methods using antibodies against γ, γ-enolase [patent DE 198 04 216 C2 ] and against the acid glial fiber protein (GFAP) [patent DE 198 14 088 C1 ]. Their detection limit is 0.25% proportion of brain tissue, depending on the material investigated (scalded sausage or boiled sausage).

Derzeit existieren zwei kommerziell erhältliche Testsysteme unter Verwendung von γ,γ-Enolase-Antikörpern (BrainosticTM, ScheBo®-Biotech AG) und GFAP-Antikörpern (Ridascreen® Risk Material, R-Biopharm). Beim Brainostic-Test handelt es sich um einen Westernblot-Testkit und beim Ridascreen-Test um ein ELISA-Verfahren. Beide Kits wurden im Rahmen einer internationalen Studie validiert. Mit dem Ridascreenverfahren war sicher eine Beimengung von 0,5% Nervengewebe sowohl in unerhitzten, moderat erhitzten und stark erhitzten Proben nachweisbar. Während in unerhitzten und moderat erhitzten Proben der Brainostic-Test genauso sensitiv war, lag die sichere Nachweisgrenze in stark erhitzten Proben bei diesem Testkit bei 2% zugefügtem Nervengewebe [Agazzi et al. Performance comparison of two analytical methods for the detection of the central nervous system in sausages: results of an interlaboratory study (2002) Eur Food Res Technol 215:334–339].Currently, two commercially available test systems using γ, γ-enolase antibodies (Brainostic TM, ScheBo -Biotech ® AG) and GFAP antibodies (Ridascreen ® Risk material R-Biopharm) exist. The Brainostic test is a Westernblot test kit and the Ridascreen test is an ELISA procedure. Both kits were validated in an international study. With the ridascreen method, an admixture of 0.5% nerve tissue was certainly detectable in unheated, moderately heated and strongly heated samples. While the Brainostic test was just as sensitive in unheated and moderately heated samples, the safe detection limit in highly heated samples in this kit was 2% of added nerve tissue [Agazzi et al. Results of an interlaboratory study (2002) Eur Food Res Technol 215: 334-339].

Ein Nachteil der gewählten Antigene (welche mit Hilfe der Antikörper gegen GFAP und γ,γ-Enolase nachgewiesen werden) ist die Expression dieser Antigene in nicht zentralnervösem Gewebe (Leber, Niere, Lunge und Muskulatur).One Disadvantage of the chosen Antigens (detected by antibodies to GFAP and γ, γ-enolase ) is the expression of these antigens in non-central nervous tissue (Liver, kidneys, lungs and muscles).

So ist die γ,γ-Enolase ein typisches Enzym für Nervenzellen, aber auch für neuroendokrine Zellen, die insbesondere in der Darmwand [Lundgvist M et al. Neuronspecific enolase in mucosal endocrine cells and carcinoid tumours of the small intestine: a comparative study with neuron-specific enolase immunocytochemistry and silver stains (1985) Histochem J 17(3):323–331], in der Lunge [Balaguer,L and Romano, J Solitary neuroendocrine cells and neuroepithelial bodies in the lower airways of embryonic, fetal, and postnatal sheep (1991) Anat.Rec. 231/3:333–338], im Thymus [Brelinska R et al. Subtypes of thymic epithelial cells defined by neuroendocrine markers Histochem Cell Biol (2000) Sep; 114(3):239–244], in der Niere und glatter Muskulatur [Haimoto H et al. Immunohistochemical localization of gamma-enolase in normal human tissues other than nervous and neuroendocrine tissues (1985) Lab Invest 52(3):257–263] und endokrinen Drüsen, wie Pankreas, Schilddrüse und in der Nebenniere vorkommen [Marangos PJ et al. The existence and neurobiological significance of neuronal and glial forms of the glycolytic enzyme enolase (1979) Biol Psychiatry 14(4):563–579].So is the γ, γ-enolase a typical enzyme for Nerve cells, but also for neuroendocrine cells, especially in the intestinal wall [Lundgvist M et al. Neuronspecific enolase in mucosal endocrine cells and carcinoid tumors of the small intestine: a comparative study with neuron-specific enolase immunocytochemistry and silver stains (1985) Histochem J 17 (3): 323-331], in the lungs [Balaguer, L and Romano, J. Solitary neuroendocrine cells and neuroepithelial bodies in the lower airways of embryonic, fetal, and postnatal sheep (1991) Anat. 231/3: 333-338], in the thymus [Brelinska R et al. Subtypes of thymic epithelial cells defined by neuroendocrine markers Histochem Cell Biol (2000) Sep; 114 (3): 239-244], in kidney and smooth muscle [Haimoto H et al. immunohistochemical localization of gamma-enolase in normal human tissues other than nervous and neuroendocrine tissues (1985) Lab Invest 52 (3): 257-263] and endocrine glands, like pancreas, thyroid and in the adrenal gland [Marangos PJ et al. The existence and neurobiological significance of neuronal and glial forms of the glycolytic enzyme enolase (1979) Biol Psychiatry 14 (4): 563-579].

Das Intermediärfilament GFAP ist zum einem typisch für Gliazellen des Nervensystems, wird aber auch in Sternzellen der Leber [Gard AL et al. Extra-neural glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunoreactivity in perisinusoidal stellate cells of rat liver (1985) J. Neuroimmunol. 8(4-6):359–375], Myofibroblasten von Milch- und Speicheldrüsen [Viale,G et al. Glial fibrillary acidic protein immunoreactivity in normal and diseased human breast(1991) Virchows Arch.A Pathol.Anat.Histopathol. 418/4: 339–348)], Podozyten und Mesangiumzellen der Niere [Buniatian G et al. The immunoreactivity of glial fibrillary acidic protein in mesangial cells and podocytes of the glomeruli of rat kidney in vivo and in culture. (1998) Biol. Cell 90/1:53–61)] exprimiert.The intermediate filament GFAP is typical for one Glial cells of the nervous system, but also in stellate cells of the Liver [Gard AL et al. Extra-neural glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunoreactivity in perisinusoidal stellate cells of rat liver (1985) J. Neuroimmunol. 8 (4-6): 359-375], myofibroblasts of Milk and salivary glands [Viale, G et al. Glial fibrillary acidic protein immunoreactivity in normal and diseased human breast (1991) Virchows Arch.A Pathol.Anat.Histopathol. 418/4: 339-348)], podocytes and renal mesangial cells [Buniatian G et al. The immunoreactivity of glial fibrillary acidic protein in mesangial cells and podocytes of the glomeruli of rat kidney in vivo and in culture. (1998) Biol. Cell 90/1: 53-61)] expressed.

Eine Beimengung derartiger Gewebe in zu untersuchenden Proben kann somit zu positiven Testergebnissen führen, obwohl keine SRM enthalten waren. Neurofilament (NF)-Proteine hingegen gelten als besonders spezifische Marker für Nervenzellen des zentralen und peripheren Nervensystems, ihre Fortsätze und Sinneszellen. Damit erlaubt ein Verfahren unter Verwendung des Nachweises von NF-Protein einen sensitiveren Nachweis von Nervengewebe, weil die NF-Expression in anderem Gewebe nicht als Hintergrund berücksichtigt werden muss.A Addition of such tissues in samples to be examined can thus lead to positive test results, although no SRM was included. Neurofilament (NF) proteins, on the other hand are considered to be particularly specific markers for nerve cells of the central and peripheral nervous system, their processes and sensory cells. In order to allows a procedure using the detection of NF protein a more sensitive detection of nerve tissue because of NF expression should not be considered as a background in other tissues.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verbesserte Methoden für den immunologischen Nachweis von zentralnervösem Gewebe, insbesondere Gehirn und Rückenmark, in Erzeugnissen und auf Oberflächen bereitzustellen und diesen in Form eines Testkits, welcher schnell automatisierbar durchführbar ist, anzubieten.The invention is based on the object, improved methods for the immunological To provide evidence of central nervous tissue, in particular brain and spinal cord, in articles and on surfaces and to offer them in the form of a test kit which is rapidly automatable to carry out.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch das im Anspruch 1 beschriebene Verfahren und den im Anspruch 3 beschriebenen Testkit gelöst. Verfahren und Testkit werden in weiteren Ansprüchen vorteilhaft ausgestaltet.According to the invention Object by the method described in claim 1 and in the Claim 3 described test kit solved. Procedure and test kit will be in further claims designed advantageous.

Wesentliches Merkmal der erfindungsgemäßen Lösung ist die Verwendung von Antikörpern gegen NF-Proteine zum Nachweis zentralnervösem Gewebes, insbesondere Gehirn und Rückenmark.essential Feature of the inventive solution the use of antibodies against NF proteins for the detection of central nervous tissue, especially brain and spinal cord.

NF-Proteine sind die hauptsächlichen strukturellen Bestandteile neuronaler Axone und Dendriten [Reactivity of a panel of neurofilament antibodies on phosphorylated and dephosphorylated neurofilaments. E J Cell Biology, 41:1–9 (1986), Shaw G, M Osborne K Weber].NF proteins are the main ones structural components of neuronal axons and dendrites [Reactivity of a panel of neurofilament antibodies phosphorylated and dephosphorylated neurofilaments. E J Cell Biology, 41: 1-9 (1986), Shaw G, M Osborne K Weber].

Sie sind aufgebaut aus drei Untereinheiten mit Molekulargewichten von 70kD, 160kD und 200kD und konnten in Neuronen des Zentralnervensystems, peripheren Nerven und Ganglionzellen nachgewiesen werden.she are composed of three subunits with molecular weights of 70kD, 160kD and 200kD and could be located in neurons of the central nervous system, peripheral Nerves and ganglion cells are detected.

Vorzugsweise wird der Nachweis mit monoklonalen Antikörpern gegen NF 70kD, insbesondere mit monoklonalen Antikörpern der Klone DP52.73, DA2 und NR4 durchgeführt.Preferably the detection with monoclonal antibodies to NF 70kD, in particular with monoclonal antibodies clones DP52.73, DA2 and NR4.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Antikörper sind handelsüblich. Dabei werden native NF-Proteine aus Hirngewebe des Rindes (Klon DP 52.73) oder des Schweins (Klon DA2, Klon NR4) isoliert. Nach Standardverfahren wie bei Köhler und Milstein beschrieben werden BALB/C-Mäuse immunisiert, deren Milzzellen isoliert und mit Myeloma-Zellen fusioniert. Die entstandenen Hybridoma-Zellen bilden die Antikörper unter geeigneten Bedingungen. Derartige Antikörper werden beispielsweise von den Firmen Chemikon (USA) und Novocastra (UK) vertrieben. Überraschenderweise wurde gefunden, dass sich NF-Protein sehr sensitiv in Nervengewebe nachweisen lässt, jedoch keinerlei Nachweis in anderen Organen von Rind und Schwein (Herz- und Skelettmuskulatur, Lunge, Leber, Niere und Milz) unter Verwendung von NF-Antikörpern gelang. Unter den gewählten Bedingungen lag die Nachweisgrenze bei 200 ng Gesamtprotein Nervengewebe des Rindes.The to be used according to the invention antibody are commercially available. Native NF proteins from bovine brain tissue (clone DP 52.73) or of the pig (clone DA2, clone NR4). To Standard procedure as with Köhler and Milstein are BALB / C mice immunized, their spleen cells isolated and fused with myeloma cells. The resulting hybridoma cells form the antibodies under suitable conditions. Such antibodies are for example sold by the companies Chemikon (USA) and Novocastra (UK). Surprisingly NF-protein was found to be very sensitive in nerve tissue can be detected however, no evidence in other organs of beef and pork (Heart and skeletal muscle, lung, liver, kidney and spleen) under Use of NF antibodies succeeded. Among the elected Conditions, the detection limit was 200 ng total protein nerve tissue of the bovine.

Weiterhin wurde auch gefunden, dass sich mit Antikörpern gegen NF der Nachweis von zentralnervösem Gewebe, insbesondere von Gehirn und Rückenmark, in Erzeugnissen mit Zusatz von Nervengewebe durchführen lässt. Überraschend wurde festgestellt, dass sich trotz einer bei der Herstellung von Vollkonserven vollzogenen Proteindenaturierung (Fc-Wert=3,3) der Zusatz von zentralnervösem Gewebe, insbesondere Gehirn und Rückenmark mit NF-Antikörpern nachweisen lässt.Farther was also found to be resistant to antibodies to NF of central nervous Tissues, in particular of the brain and spinal cord, in articles with Add extra nerve tissue leaves. Surprised was found to be in spite of one in the production of Vollkonserven completed protein denaturation (Fc value = 3.3) of Addition of central nervous Tissue, especially brain and spinal cord with NF antibodies detect leaves.

Als Untersuchungsmaterial wurde nach Standardrezepturen von der Bundesanstalt für Fleischforschung (BAFF) hergestellte Kochwurst und Vollkonserve (Fc-Wert=3,3) mit unterschiedlichen Anteilen an Hirngewebe des Schweins verwendet. Überraschenderweise wurde auch festgestellt, dass der Nachweis von Nervengewebe auch ohne zusätzliche Fettextraktion über standardisierte Phasentrennung, Idealerweise durch Zentrifugation nach Erhitzung der Probe, durchführbar ist. Nach Zentrifugation konnte die klare Phase abgenommen und für die Untersuchung eingesetzt werden.When Examination material was prepared according to standard recipes from the Federal Institute for meat research (BAFF) produced cooked sausage and full preserve (Fc value = 3.3) with used different proportions of brain tissue of the pig. Surprisingly It was also found that the detection of nerve tissue as well without additional Fat extraction via standardized phase separation, ideally by centrifugation after heating the sample, feasible is. After centrifugation, the clear phase was removed and allowed for examination be used.

Auf diese Weise ist es möglich Anteile von Hirngewebe in Kochwurst und in Vollkonserven (Fc-Wert=3,3) nachzuweisen. Erfindungsgemäß ist dabei die Menge des nachgewiesenen Neurofilament-Proteins proportional der Menge des zugefügten Hirngewebes in der untersuchten Probe.On this way it is possible Proportion of brain tissue in cooked sausage and in full preserves (Fc value = 3.3) demonstrated. According to the invention is the amount of the detected neurofilament protein proportional the amount of added Brain tissue in the examined sample.

Anhand nachfolgender Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert:Based following embodiments the invention will be closer explains:

Ausführungsbeispiel 1Embodiment 1

Nachweis der Organspezifität für Nervengewebe der verwendeten NF-Antikörper Klon DP52-73 und Klon DA2Detection of organ specificity for nerve tissue the used NF-antibodies Clone DP52-73 and clone DA2

Für die Untersuchung wurden Homogenate von Hirngewebe und weiteren Organen (Herz- und Skelettmuskulatur, Lunge, Leber, Niere und Milz) in Homogenisationspuffer (0,05M Tris, 10mM EDTA, 10mM Dithiothreitol, 0,2mM Phenylmethylsulfonylfluorid) hergestellt. Es wurden sowohl Gewebe vom Rind als auch vom Schwein verwendet. Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte vorzugsweise mittels der Methode nach Lowry unter Verwendung eines kommerziellen Testsystems (z.B. D.C. Proteinassay; BioRad). Den Organhomogenaten (1–30 μg Gesamtprotein) wurde Probenpuffer zugesetzt. Nach einer kurzen Denaturierung (95°C, 3 min) wurden die Organhomogenate mittels SDS-Elektrophorese im 12-prozentigen Polyakrylamid-Gel (PAGE) (Laemmli, Nature 1970) aufgetrennt. Als Molekulargewichtsstandard diente Roti-Mark/prestained® (Roth).Homogenates of brain tissue and other organs (heart and skeletal muscle, lung, liver, kidney and spleen) in homogenization buffer (0.05M Tris, 10 mM EDTA, 10 mM dithiothreitol, 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride) were prepared for the study. Both bovine and porcine tissues were used. The protein concentration was preferably determined by the method of Lowry using a commercial assay system (eg, DC protein assay; BioRad). The organ homogenates (1-30 μg total protein) were added to sample buffer. After a brief denaturation (95 ° C, 3 min), the organ homogenates were separated by SDS electrophoresis in 12% polyacrylamide gel (PAGE) (Laemmli, Nature 1970). As molecular weight standard prestained served Roti-Mark / ® (Roth).

Nach der elektrophoretischen Auftrennung wurden die Organhomogenate im Tankblotverfahren (BioRad) auf Nitrozellulose-Membranen (0,45 μm, Schleicher&Schüll) oder auf PVDF-Membranen (0,45 μm, Schleicher&Schüll) übertragen. An das auf der Membran immobilisierte NF-Protein wurden gegen NF gerichtete Antikörper (primärer Antikörper) gebunden. Als primäre Antikörper wurden vorzugsweise monoklonale Antikörper gegen die 70kD-Form (Klon DP52.73, Klon DA2, beide Chemicon, Klon NR4, Novocastra) verwendet. An die Primärantikörper wurden gegen derartige Primärantikörper gerichtete Sekundärantikörper gebunden. Die an den Sekundärantikörper gebundenen Enzyme Meerettichperoxidase oder Alkalische Phosphatase setzen in einer Farbreaktion das farblose Chromogen 3,3,'-Diaminobenzidintetrahydrochloridhydrat in einem braunen Farbstoff oder Tetranitrozoliumtetrablau in einen blauen Farbstoff um.After electrophoretic separation, the organ homogenates were tank-blotted (BioRad) on nitrocellulose membranes (0.45 μm, Schleicher & Schull) or on PVDF membranes (0.45 μm, Schleicher & Schuell). Antibody-immobilized antibodies (primary antibody) were bound to the NF protein immobilized on the membrane. Monoclonal antibodies to the 70kD form (clone DP52.73, clone DA2, both chemicon, clone NR4, novocastra) were preferably used as primary antibodies. Secondary antibodies directed against such primary antibodies were bound to the primary antibodies. The horseradish peroxidase or alkaline phosphatase enzymes bound to the secondary antibody convert the colorless chromogen 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate in a brown dye or tetranitrozolium tetra blue to a blue dye in a color reaction.

Die 1 zeigt einen repräsentativen Westernblot zur Testung von NF-Antikörper Klon DP52-73 in Organhomogenaten vom Rind. Aufgetragen wurden jeweils 30 μg Homogenat von Herzmuskulatur (Hz), Skelettmuskulatur (Mu), Lunge (Lu) und Leber (Le) des Rindes, als Positivkontrolle 10 μg Rinderhirnhomogenat (HiRi).The 1 shows a representative Western blot for testing NF antibody clone DP52-73 in bovine organomogenates. In each case, 30 μg homogenate of heart muscle (Hz), skeletal muscle (Mu), lung (Lu) and liver (Le) of bovine were applied, as positive control 10 μg bovine brain homogenate (HiRi).

Die 2 zeigt einen repräsentativen Westernblot zur Testung des Anti-NF-Antikörpers Klon DA2 in Homogenaten von Geweben des Rindes. Aufgetragen wurden 30 μg Homogenat Herzmuskulatur (Hz), Skelettmuskulatur (Mu), Lunge (Lu) und Leber (Le) des Rindes, als Positivkontrolle je 5 μg Homogenat Rinderhirn (HiRi) und Schweinehirn (HiS) (M-Molekulargewichtsstandard) Mit beiden NF-Antikörpern (Klon DP52.73 und DA2) wurde bei den getesteten Rinderorganen kein spezifisches Signal detektiert.The 2 shows a representative Western blot for testing the anti-NF antibody clone DA2 in homogenates of bovine tissues. 30 μg of homogenate heart muscle (Hz), skeletal muscle (Mu), lung (Lu) and liver (Le) of bovine were applied as positive control per 5 μg homogenate bovine brain (HiRi) and pig brain (HiS) (M-molecular weight standard) with both NF Antibodies (clones DP52.73 and DA2) no specific signal was detected in the tested bovine organs.

Die 3 zeigt einen repräsentativen Westernblot zur Testung von Anti-NF-Antikörper Klon DA2 in Organhomogenaten vom Schwein. Aufgetragen wurden jeweils 30 μg Homogenat Milz (Mi), Lunge (Lu), Skelettmuskel (Mu), Leber (Le) und Niere (Ni) des Schweins, als Positivkontrolle 1 μg Rinder- und Schweinehirnhomogenat (HiS, HiRi) (M-Molekulargewichtsstandard).The 3 shows a representative Western blot for testing anti-NF antibody clone DA2 in porcine organomogenates. 30 μg of homogenate spleen (Mi), lung (Lu), skeletal muscle (Mu), liver (Le) and kidney (Ni) of the pig were applied as positive control 1 μg bovine and porcine brain homogenate (HiS, HiRi) (M molecular weight standard ).

Nur in den Hirnhomogenaten zeigten sich die für den NF-Antikörper DA2 typischen Signale. Bei den getesteten Schweineorganen waren keinerlei spezifische Signale nachzuweisen.Just in the brain homogenates were those for the NF-antibody DA2 typical signals. The porcine organs tested were not specific Prove signals.

Mit NF-Antikörper Klon DA2 konnte Hirngewebe des Rindes wesentlich sensitiver nachgewiesen werden als Hirngewebe des Schweins (2 und 3).With NF-antibody clone DA2, bovine brain tissue could be detected much more sensitively than porcine brain tissue ( 2 and 3 ).

Ausführungsbeispiel 2Embodiment 2

Verfahren unter Verwendung von Anti-NF-Antikörpern zur Detektion von zentralnervösem Gewebe insbesondere in Frischwurstmethod using anti-NF antibodies for the detection of central nervous tissue especially in fresh sausage

Für den Nachweis wurden die monoklonalen Antikörper gegen die 70 kD NF-Einheit 70 Klon DP52-73 (Chemicon) und Klon DA2 (Chemicon) ausgewählt und mit Hilfe der Westernblot-Technik getestet.For the proof were the monoclonal antibodies against the 70 kD NF unit 70 clone DP52-73 (Chemicon) and clone DA2 (Chemicon) and tested with the help of the Westernblot technique.

Von der Bundesforschungsanstalt für Fleischforschung in Kulmbach (BAFF) wurde Referenzmaterial in Form von Kochwurst mit definierten Zusätzen (0 %, 0,5 %, 5 %, 10 %) an Hirngewebe vom Schwein hergestellt. Dabei handelte es sich um handelsübliche Frischware.From the Federal Research Center for Meat Research in Kulmbach (BAFF) became reference material in the form of cooked sausage with defined additives (0%, 0.5%, 5%, 10%) of porcine brain tissue. there it was commercial Fresh produce.

Von den Proben wurde ein Gramm in ein Zentrifugengefäß (15 ml, Greiner) eingewogen, mit 5 ml Extraktionspuffer (5 % Natriumdodecylsulfat/SDS, 50 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, 10 mM EDTA) versetzt und gut gemischt. Danach wurde die Probe 15 min bei 100 °C im Wasserbad gekocht und nach dem Abkühlen nochmals gut gemischt. Anschließend wurde das Homogenat bei 10 °C für 10 min zentrifugiert. Unter der entstandenen Fettschicht wurde das klare Homogenat abgenommen. In den gewonnenen Extrakten wurde die Proteinkonzentration mit einem handelsüblichen Proteinassay der Firma BioRad (D.C.2 Proteinassay) basierend auf der Methode nach Lowry bestimmt. Definierte Proteinmengen (10–60 μg) wurden entsprechend Ausführungsbeispiel 1 elektrophoretisch aufgetrennt und auf Membranen übertragen. Neben den Probenextrakten wurde gleichartig aufgearbeitetes Hirngewebe als Positivkontrolle verwendet.From One gram of the samples was weighed into a centrifuge tube (15 ml, Greiner). with 5 ml of extraction buffer (5% sodium dodecyl sulfate / SDS, 50 mM Tris (hydroxymethyl) -aminomethane, 10 mM EDTA) and mixed well. Thereafter, the sample was boiled for 15 min at 100 ° C in a water bath and after cooling again mixed well. Subsequently the homogenate was at 10 ° C for 10 min centrifuged. The resulting fat layer became clear Homogenate removed. In the extracted extracts, the protein concentration became with a commercial Protein assay of the company BioRad (D.C.2 protein assay) based on determined by Lowry's method. Defined protein levels (10-60 μg) were added according to the embodiment 1 electrophoretically separated and transferred to membranes. In addition to the sample extracts was similarly processed brain tissue used as a positive control.

An das auf der Membran immobilisierte NF-Protein wurden vorzugsweise die gegen NF gerichteten Antikörper Klon DP52-73 und Klon DA2 (primäre Antikörper) gebunden, welche entsprechend Ausführungsbeispiel 1 nachgewiesen wurden.At the NF protein immobilized on the membrane was preferably the antibodies directed against NF Clone DP52-73 and clone DA2 (primary Antibody) bound, which proved according to Embodiment 1 were.

Die 4 zeigt den Nachweis von Hirngewebezusatz in Frischwurst unter Verwendung des NF-Antikörpers Klon DP52-73. Aufgetragen wurden Extrakte von Kochwurstproben mit einer definierten Beimengung von Hirngewebe (Angaben in Prozent) und jeweils 5 μg Gesamtprotein Hirngewebe des Rindes (HiRi) und des Schweins (HiS).The 4 shows evidence of brain tissue supplementation in fresh sausage using the NF antibody clone DP52-73. Extracts of cooked sausage samples with a defined admixture of brain tissue (percentages) and 5 μg total protein of bovine brain (HiRi) and pig (HiS) were applied.

Die 5 zeigt den Nachweis von Hirngewebezusatz in Frischwurst unter Verwendung des Anti-NF-Antikörpers Klon DA2. Aufgetragen wurden Extrakte von Kochwurstproben mit einer definierten Beimengung von Hirngewebe (Angaben in Prozent) und jeweils 5 μg Gesamtprotein Hirngewebe des Rindes (HiRi) und des Schweins (HiS).The 5 shows evidence of brain tissue supplementation in fresh sausage using the anti-NF antibody clone DA2. Extracts of cooked sausage samples with a defined admixture of brain tissue (percentages) and 5 μg total protein of bovine brain (HiRi) and pig (HiS) were applied.

Mit Hilfe von NF-Antikörpern konnte eine Beimengung von bis zu 0,6 % Hirngewebe des Schweins in den untersuchten Frischwurstproben nachgewiesen werden. Aufgrund der geringeren Sensitivität des Antikörpers (Klon DA2) gegenüber Hirngewebe des Schweins im Vergleich zu Hirngewebe des Rindes (Faktor 3, Ausführungsbeispiel 1) liegt unter den verwendeten Bedingungen die rechnerische Nachweisgrenze bei einer Zugabe von 0,2 % Rinderhirngewebe.With Help of NF-antibodies could be an admixture of up to 0.6% brain tissue of the pig be detected in the examined fresh sausage samples. by virtue of the lower sensitivity of the antibody (Clone DA2) to brain tissue of the pig compared to brain tissue of bovine (factor 3, embodiment 1), the calculated detection limit is under the conditions used with an addition of 0.2% bovine brain tissue.

Claims (9)

Verfahren zum Nachweis von zentralnervösem Gewebe, insbesondere Gehirn und Rückenmark, in Erzeugnissen und auf Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass man zugesetztes Gehirn und/oder Rückenmark oder Kontaminationen von Oberflächen mit zentralnervösem Gewebe durch deren Gehalt an Neurofilament (NF) mittels spezifischer Antikörper bestimmt.Method for detecting central nervous tissue, in particular brain and spinal cord, in articles and on surfaces, characterized in that added brain and / or spinal cord or contamination of surfaces with central nervous tissue by their content of neurofilament (NF) determined by means of specific antibodies. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Antikörper zwei Anti-NF-Antikörper verwendet werden.Method according to claim 1, characterized in that that as an antibody two anti-NF antibodies be used. Testkit zum Nachweis von zentralnervösem Gewebe in Erzeugnissen und auf Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen spezifischen monoklonalen Antikörper gegen NF-Proteine enthält.Test kit for the detection of central nervous tissue in articles and on surfaces, characterized in that it comprises at least one specific monoclonal antibody against NF proteins. Testkit nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein Anti-NF-Antikörper ist.Test kit according to claim 3, characterized that the antibody is an anti-NF antibody. Testkit nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens einen an einer Festphase gebundenen spezifischen Antikörper gegen Neurofilament-Proteine enthält.Test kit according to claims 3 and 4, characterized that he has at least one specific bound to a solid phase antibody against neurofilament proteins. Testkit nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass er einen ELISA-Test enthält.Test kit according to one of Claims 3 to 5, characterized that he contains an ELISA test. Testkit nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass er für die analytische Qualitätssicherung lyophilisiertes Hirngewebe in unterschiedlichen Konzentrationen als Referenzmaterial enthält.Test kit according to one of Claims 3 to 6, characterized that he is for the analytical quality assurance Lyophilized brain tissue in different concentrations as reference material. Testkit nach Anspruch 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass er aus den folgenden Bestandteilen besteht: – Antikörperbeschichtete Mikrotiterplatte (96 Kavitäten) – 90 ml SRM-Puffer (0,1 M Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit 0,05% Tween20), 10fach konzentriert, konserviert mit Thiomersal – 12 ml Tetramethylbenzidin-Substratlösung, gebrauchsfertig – 12 ml Stopplösung – 1 M Salzsäure, gebrauchsfertig – 450 ml Antikörper-Konjugat, Peroxidase-konjugierter Antikörper, in Puffer mit Proteinstabilisatoren – Standard 1 (=Nullkontrolle) – Standards 2–4, lyophilisiertTest kit according to claim 3 to 7, characterized that it consists of the following components: - antibody coated Microtiter plate (96 wells) - 90 ml SRM buffer (0.1 M phosphate buffered saline with 0.05% Tween20), 10-fold concentrated, preserved with thiomersal - 12 ml tetramethylbenzidine substrate solution, ready for use - 12 ml Stop solution - 1 M hydrochloric acid, ready for use - 450 ml Antibody conjugate, Peroxidase-conjugated antibody, in buffer with protein stabilizers - standard 1 (= zero control) - standards 2-4, lyophilized Verwendung mindestens eines spezifischen Antikörpers gegen NF-Proteine zum Nachweis von zentralnervösem Gewebe, insbesondere Gehirn und Rückenmark, in Erzeugnissen und auf Oberflächen.Use of at least one specific antibody against NF proteins for detection of central nervous tissue, especially brain and spinal cord, in articles and on surfaces.
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