DE10159404A1 - Verfahren zur Analyse von Gewebeproben - Google Patents
Verfahren zur Analyse von GewebeprobenInfo
- Publication number
- DE10159404A1 DE10159404A1 DE10159404A DE10159404A DE10159404A1 DE 10159404 A1 DE10159404 A1 DE 10159404A1 DE 10159404 A DE10159404 A DE 10159404A DE 10159404 A DE10159404 A DE 10159404A DE 10159404 A1 DE10159404 A1 DE 10159404A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cells
- sample
- expression
- gene
- tissue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Gewebeproben wie beispielsweise bioptisches Material, basierend auf der Zusammenstellung von Genen, die in Zellen definierten Zelltyps wie Epithelzellen, Mesothelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten, endometrialen Stromazellen, Muskelzellen und hämatopoetischer Zellen spezifisch exprimiert sind, und dem Nachweis der entsprechenden mRNA durch korrespondierende cDNA-Sonden. Dieses Verfahren kann zur Ermittlung der zellulären Zusammensetzung, zur Analyse und Klassifizierung von Genexpressionsdaten als auch zur Erteilung von biotopischem Material beispielsweise von eutopem oder ektopem Endometrium bzw. Endometrium-ähnlichem Gewebes verwendet werden.
Description
- Die vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Gewebeproben wie beispielsweise bioptisches Material, basierend auf der Zusammenstellung von Genen die in Zellen definierten Zelltyps wie Epithelzellen, Mesothelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten, endometrialen Stromazellen, Muskelzellen und Hämatopoetischer Zellen spezifisch exprimiert sind, und dem Nachweis der entsprechenden mRNA durch korrespondierende cDNA-Sonden. Dieses Verfahren kann zur Ermittlung der zellulären Zusammensetzung, zur Analyse und Klassifizierung von Genexpressionsdaten als auch zur Einteilung von bioptischem Material beispielsweise von eutopem oder ektopem Endometrium bzw. Endometrium-ähnlichem Gewebes verwendet werden.
- Die Erstellung von Genexpressionsprofilen (Genexpressionsprofiling) hat sich mit der Etablierung der Mikroarray-Technologie zu einem wichtigen Werkzeug in den biomedizinischen Wissenschaften etabliert. Beispiele für Anwendungsbereiche von Genexpressionsprofilen sind die Diagnostik und Prognostik von Krankheiten, die Nachsorgeanalyse von Therapien, die Analyse genetischer Prädispositionen, die Untersuchung pharmakologischer Wirkmechanismen oder die qualitative und quantitative Untersuchung von Wachstums- und Differenzierungsprozessen von Zellen und Geweben.
- Ein gebräuchliches Verfahren zur Auswertung von Genexpressionsdaten stellt die Differenz- Analyse dar, mit der sowohl die Expression bekannter Gene untersucht wird als auch der Nachweis unbekannter Gene erfolgen kann. Bei diesen Verfahren werden die Expressionsdaten der zu untersuchenden Probe mit dem Genexpressionsmuster von Referenzproben oder auch mit den Expressionsdaten ausgewählter Gene abgeglichen bzw. verglichen. Im Fall der Untersuchung der Expression von pathophysiologisch relevanten Genen werden beispielsweise die Expressionsdaten von gesundem Gewebe (Referenzprobe) mit den Expressionsdaten von erkranktem Gewebe (Messprobe) wie z. B. Tumorgewebe verglichen. Basierend auf diesem Vergleich lassen sich Aussagen zur qualitativen (Ja/Nein-Anwort) oder zur quantitativen Expression (Erhöhung oder Verringerung der Expression) ausgewählter Gene treffen und diese wiederum einem bestimmten Zustand, beispielsweise einem pathologischen Zustand, zuzuordnen. Ein Beispiel zur Anwendung von Genexpressionsprofilen zur Charakterisierung funktioneller Prozesse ist u. a. in der Internationalen Patentanmeldung WO 01/32927 beschrieben, in dem ein Verfahren zur Untersuchung der Differenzierung embryonaler Stammzellen durch Messung von Expressionsprofilen ausgewählter Gene unter Anwendung der Mikroarray-Technologie dargestellt ist.
- Die Aussagekraft der durch Differenzverfahren erhaltenen Daten von Genexpressionsprofilen hängt in bedeutendem Maße von der Definition des Referenzprobe, aber auch von der Art der zu untersuchenden Gewebeproben ab. Es ist bekannt, daß Gewebeproben von großer Heterogenität sein können. Diese Tatsache ergibt sich zum einen daraus, das deren zelluläre Komposition sich grundsätzlich aus vier verschiedenen Grundgewebetypen, dem Epithel-, Binde-, Muskel- und Nervengewebe herleiten. Von diesen leiten sich wiederum eine Komplexität verschiedenster differenzierter Zelltypen ab, deren Gesamtzahl und stöchiometrische Zusammensetzung durch den jeweiligen Zustand des Gewebes determiniert wird und unter pathologischen Bedingungen starke Änderungen erfahren kann. Ferner ist zu berücksichtigen, daß die spezifische zelluläre Zusammensetzung einer Gewebeprobe durch besondere Parameter im Kontext von dessen Umgebung (Organ, Individuum) determiniert ist. Außerdem gilt zu berücksichtigen, daß Gewebeveränderungen im weitesten Sinne, darunter auch Ansammlungen von pathologischem Gewebe, gegenüber dem Normalgewebe gewöhnlich durch eine veränderte Anzahl infiltrierender Zellen wie Lymphozyten, Makrophagen oder Fibroblasten ausgezeichnet sind. Das bedeutet, daß je ähnlicher die Referenzprobe der Messprobe ist, desto aussagekräftiger sich Daten von Genexpressionsprofilen bewerten lassen. Demgegenüber sind Unterschiede in Genexpressionsprofilen umso mehr Proben-abhängig und nicht mit einer spezifischen Indikation in Zusammenhang zu bringen, je heterogener die Referenzprobe im Vergleich zur Messprobe zusammengesetzt ist.
- Das Beispiel der Endometriose, dem Vorkommen von Endometrium außerhalb des Uterus (ektopes Endometrium), verdeutlicht die Wichtigkeit der Berücksichtigung der Komplexität von Gewebeproben bei der Erstellung von Genexpressionsprofilen. Ektopes Endometrium kann aus Epithel, Mesothel, Stroma und Endothel unterschiedlicher Differenzierungsstadien aufgebaut sein. Es zeigt sowohl typische morphologische Eigenschaften in Abhängigkeit vom Stadium der Endometriose als auch morphologische Unterschiede zum Endometrium des Uterus (eutopes Endometrium). Die erwartungsgemäße Heterogenität von bioptischen Materials im allgemeinen und von ektopen Endometrium gegenüber eutopen Endometrium im besonderen bedeutet darum für die Analyse von Genexpressionsprofilen, daß gemessene Unterschiede der Expression einzelner Gene solange nicht eindeutig zu erklären sind, wenn die qualitative zelluläre Zusammensetzung des zu untersuchenden Materials an sich wie auch im Vergleich zur Referenzprobe unbekannt ist.
- Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das durch die Zusammenstellung zellspezifischer Gene sowie von RNA-Referenzproben aus Zellinien definierten Phänotyps gekennzeichnet ist und beim Genexpressionsprofiling von Gewebeproben - beispielsweise durch die Mikroarray-Technologie - anwendbar ist.
- Diese Aufgabe der Erfindung wird in einem ersten Aspekt durch ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Gewebeproben gelöst, das die folgenden Verfahrensschritte umfaßt: zur Verfügung stellen einer zu untersuchenden Gewebeprobe, Analyse der Expression von mindestens einem Gen in der zu untersuchenden Gewebeprobe, zur Verfügung stellen von einzelnen Zellen eines definierten Zelltyps oder stöchiometrischen Mischungen von Zellen eines definierten Zelltyps, Analyse der Expression von mindestens einem Gen, das in den Zellen definierten Zelltyps zelltypspezifisch exprimiert wird, Definieren einer Referenzprobe auf Basis der Analyse der Expression, wobei (i) das Genexpressionsmuster der Referenzprobe für einen bestimmten Zelltyp charakteristisch ist, und (ii) das Genexpressionsmuster der Referenzprobe für die definierte Zusammensetzung von Zellen eines definierten Zelltyps charakteristisch ist, und Abgleich der Expressionsdaten der zu untersuchenden Gewebeprobe mit den Expressionsdaten der Referenzprobe.
- Der Einsatz dieses Verfahrens ermöglicht die qualitative und quantitative Erfassung der zellulären Zusammensetzung von Gewebeproben sowie die Analyse und Bewertung der durch Genexpressionsprofiling gewonnenen Daten beispielsweise bei der vergleichenden Untersuchung von bioptischen Materials wie beispielsweise des eutopen und ektopen Endometriums oder Endometrium-ähnlichen Gewebes.
- Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die zu untersuchende Gewebeprobe Material aus einer Biopsieprobe, insbesondere von eutopem und ektopem Endometrium, mit dem Endometrium-ähnlichem Gewebe oder Tumorgewebe umfaßt. Die Biopsie ist aufgrund ihrer sehr wenig invasiven Art bevorzugt, es kann jedoch auch jede andere Art der Gewebeentnahme, zum Beispiel im Rahmen einer Operation, angewendet werden. Unter "dem Endometrium-ähnlichem Gewebe" wird im Sinne der vorliegenden Erfindung Gewebe verstanden, das biochemische, zelluläre und/oder molekulare Charakteristika ähnlich dem von eutopem Endometrium aufweist, z. B. Hormonsensitivität oder histologische Parameter.
- Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, bei dem die Zellen des definierten Zelltyps ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Epithelzellen, Mesothelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten/Stromazellen, Muskelzellen und Hämatopoetischen Zellen. Beispiele für erfindungsgemäß bevorzugt einsetzbare Zellinien definierten Ursprungs sind in Tabelle 1 aufgelistet, wobei ein besonders bevorzugtes Verfahren gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet ist, daß die Zellinien ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den humanen Zellinien 11E, EEC145, 12Z, 49Z, 50Z, 11Z, 23Z, Ishikawa, MFE296, MFE280, Bristol8, MCF-7, RT112, MDCK, ESS-1, BEL-1, MBN2, PFE, THP-1, NIH:OVCAR-3, HUV-EC-C, MES-SA, MSTO-211H, und UtSMC.
- Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, bei dem die untersuchten zellspezifisch exprimierten Gene in Epithelzellen Keratin 18; Cytokeratin 8; E- Cadherin; Matrix-Metalloproteinase 7 (MMP-7); Tumorassoziierter Kalzium-Signal Transducer (TACSTD1); in Mesothelzellen Calbindin 2 (CALB2); Calbindin 3 (CALB3); Mesothelin; in Endothelzellen Rezeptor für vaskularen endothelialen Wachstumsfaktor (Flt1); Nitritoxid Synthetase; Prä-Pro-von Willebrand Faktor; Gerinnungsfaktor 8; in Fibroblasten/Stromazellen Prolyl 4-Hydroxylase beta; Fibroblasten-aktivierendes Protein (FAP); Morphogenetischer Protein Rezeptor des Knochens (BMPR2); Frizzle related Protein (frpHE); Vimentin; in Muskelzellen Alpha Aktin; Calponin; Desmin; 20-kDa Myosin leichte Kette 2 Glatte Muskel Isoform; Myosin schwere Kette Glatte Muskel Isoform; und in Hämatopoetischen Zellen CD 14; CD16; CD69 sind. Diese Beispiele für erfindungsgemäß bevorzugt anwendbare Gene sind auch in Tabelle 2 unter Angabe der Datenbank-Nummern aus der öffentlich zugänglichen GenBank aufgelistet.
- Ein noch weiter bevorzugtes Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse der Expression der oben genannten zellspezifisch exprimierten Gene die Isolierung der mRNA und den Nachweis der entsprechenden mRNA mittels korrespondierender cDNA-Sonden oder RT-PCR umfaßt. Beide Verfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäure- und Expressionsanalyse gut bekannt. Weiterhin kann die Analyse der Expression unter Verwendung eines DNA-Chip-Arrays erfolgen, auf dem z. B. 70mere als Oligonukleotide angebracht sind. Bei dieser Technik ist es bevorzugt, daß die cDNA Sonden markiert sind, insbesondere Cy3- bzw. Cy5-markiert sind. Natürlich können die Oligomere auch kürzere geeignete Längen aufweisen und die Sonden mit anderen geeigneten Markern, z. B. spezifischen Massen oder Radionukliden markiert sein.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren, das einen Abgleich in Form einer Normalisierung der Expressionsdaten umfaßt.
- Ein weiterer Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft dessen Anwendung zur Ermittlung der zellulären Zusammensetzung, der Klassifizierung und/oder der Evaluierung der Genexpression von Gewebeproben. Aus den einzelnen Zellinien oder stöchiometrischen Mischungen der jeweiligen Zellinien wird dabei z. B. die RNA extrahiert, deren Zusammensetzung das jeweilige Genexpressionsmuster der eingesetzten Zellen wiederspiegelt. Dieses wird auf Expression zellspezifisch-exprimierter Gene wie sie in Tabelle 2 beispielhaft aufgelistet sind, untersucht. Auf Grundlage dieser Methodik werden Referenzproben definiert, (i) deren Genexpressionsmuster für eine bestimmte Zellpopulation charakteristisch sind und (ii) die eine definierte zelluläre Komposition aufweisen. Anhand dieser Standardproben läßt sich die qualitative und quantitative zelluläre Zusammensetzung von Gewebeproben (bioptisches Material) wie beispielsweise von eutopem und ektopem Endometrium oder Endometrium- ähnlichem Gewebes über die Messung der Expression Zelltyp-spezifischer Gene ermitteln.
- Diese Daten werden wiederum zur Normalisierung der z. B. durch Mikroarray-Analysen erstellten Genexpressionprofile eingesetzt, um qualitative und quantitative Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung der Meßproben herauszufiltern, um beispielsweise Endometriose-assoziierte Änderungen des Genexpressionprofils in der Meßprobe nachzuweisen. Darüber hinaus ermöglicht die Messung der Expression zelltyp-spezifischer Gene die Klassifizierung von Gewebeproben beispielsweise von eutopem und ektopem Endometrium oder Endometrium-ähnlichem Gewebe hinsichtlich des Vorhandenseins von Drüsenepithel oder Stromagewebe.
- Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der beigefügten Beispiele weiter verdeutlicht werden ohne darauf beschränkt zu sein:
- SV40 transformierte humane Endometriosezelllinien der Spezifikation EEC145, 11E, 11Z, 12Z, 23Z, 45Z, 49Z und 50Z werden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco) mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum (FKS), 100 U/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin kultiviert; Ishikawa Zellen in Minimum Essential Medium (MEM) mit 15% (v/v) FKS, 10 mM Glutamax (Gibco), 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 1% (w/v) nicht-essentielle Aminosäuren; Bristol 8 Zellen in RPMI mit 10% (v/v) FKS, 2 mM Glutamax, 100 U/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin; MCF7, RT112 Zellen in MEM mit 10% (v/v) FKS, 2 mM Glutamax, 0,1 mg/ml Streptomycin und 1% (w/v) nicht-essentielle Aminosäuren; MDCK Zellen in MEM mit 10% (v/v) FKS, 2 mM Glutamax, 1,5 g/l Natriumbikarbonat, 0,1% mM nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat; ESS-1 Zellen in RPMI 1640 mit 20% (v/v) FKS, 2 mM Glutamax, THP-1 Zellen in RPMI 1640 mit 10% (v/v) FKS, 2 mM Glutamax, 1,5 g/l Natriumbikarbonat, 10 mM Hepes (Gibco), 1 mM Natriumpyruvat, 0,05 mM 2-Mercaptoethanol (Gibco); NIH:VCAR-3 Zellen in RPMI 1640 mit 2% (v/v) FKS, 2 mM Glutamax, 10 mM Hepes (Gibco), 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mg/l Rinder- (Sigma); HUV-EC-C Zellen in Ham's F12K Medium (Gibco) mit 10% (v/v) FKS, 2 mM Glutamax, 0,1 mg/ml Heparin (Sigma), 0,03 mg/ml Endothel-Wachstum-Supplement (Sigma); MES-SA Zellinien in Mc Coy's 5a Medium (Gibco) mit 10% (v/v) FKS, 2 mM Glutamax; MSTO-211H-Zellen in RPMI 1640 mit 10% (v/v) FKS, 2 mM Glutamax; UtSMC- Zellen in Smooth-Muscle-Cell Medium (Clontec).
- Zellpellets mit stöchiometrisch definierter zellulärer Zusammensetzung aus ausgewählten Zellinien der in Tabelle 1 gelisteten Zellen, bestehend aus insgesamt ca. 107 Zellen, werden in 1 ml Trizol®-Lösung (GibcoBRL) lysiert. Aus den Trizol®-Lysaten wird nach Standardvorschrift die RNA extrahiert, präzipitiert und in einem Endvolumen von 50 µl mit Aq. bidest gelöst. In dieser Probe wird der RNA-Gehalt bestimmt, bevor die Probe mit RNAse-freier DNAse (Promega) behandelt wird. Diesem Schritt folgt die Aufreinigung der gewonnenen RNA durch das RNeasy®-Verfahren (Qiagen) mit anschließender Bestimmung des Gehaltes an RNA.
- Maximal 100 mg gefrorenes durch Laparoskopie gewonnenes bioptisches Material wird in einem 2 mL Reaktionsgefäß mit 1 mL Trizol®-Lösung und einer 5 mm Stahlkugel (Retsch, Deutschland) durch hochfrequentes Schütteln bei 30 Hz für 2 min (Mixer Mill 300, Retsch) homogenisiert. Anschließend werden unlösliche Bestandteile der Probe durch Zentrifugation bei 12.000 g für 10 min bei 4°C pelletiert. Aus dem abgenommenen Trizol®-Überstand wird, wie in Beispiel 2 beschrieben, die RNA extrahiert.
- Zur cDNA-Herstellung und Markierung wird eine Zwei-Schritt-Methode, bestehend aus der Synthese von Aminoallyl-modifizierter cDNA unter Anwendung des FairPlay®-Microarray- Labelling-Kit (Stratagene) und nachfolgender kovalenter Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen Cy3 bzw. Cy5 (Amersham-Pharmacia) eingesetzt. Dazu werden jeweils 20 µg von totaler mRNA, gewonnen aus Zellen nach Beispiel 2 oder bioptischen Material nach Beispiel 3 nach dem Standardprotokoll des FairPlay®-Microarray-Labelling-Kit (Stratagene) in cDNA umgeschrieben und mit Cy3- bzw. Cy5-Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Die Reinigung der Cy3- bzw. Cy5-markierten cDNA erfolgt unter Anwendung des MinElute® Reaction Cleanup Kit (Qiagen) nach dem Standardprotokoll in ein Probenendvolumen von 10 µl.
- Hybridisierung, Detektion und Auswertung von Microarrays
- Zur Genexpressionsanalyse werden Microarrays (Operon) eingesetzt, die 70mer Oligonukleotide, spezifisch für die in Tabelle 2 gelisteten zellspezifischen Gene, sowie 70mer Oligonukleotide weiterer Gene tragen. Vor Durchführung der Hybridisierung werden die in Beispiel 4 hergestellten, Cy3- bzw. Cy5-markierten cDNA-Sonden in 20 µl Hybridierungsmischung enthaltend 2,6fache 20 × SSC, 0,67 mg/ml Poly dA, 0,67 mg/ml Cotl (Sigma) und 0,2% (w/v) SDS aufgenommen und für 2 min bei 95°C denaturiert. Nach Dispensierung der Hybridisierungsmischung unter das Deckglas, das sich auf dem Mikroarray-Objektträger befindet, werden die Objektträger in eine Hybridisierungskammer unter feuchter Atmosphäre gebracht und für 6-12 Stunden bei 67°C inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen der Objektträger in 1 × SSC, 0,03% (w/v) SDS, 0,2 × SSC und 0,05 × SSC werden die Objektträger getrocknet und mit einem Mikroarray-Reader (GenePix® 4000B, Axon Instruments) gemessen. Die Datenerfassung erfolgt mit der Software GenePix® Pro 3.0, die vergleichende Analyse der Daten zur Genexpression erfolgt nach Normalisierung der jeweiligen Messwerte für die einzelnen Gene bezüglich der Expressionsdaten der zellspezifischen Gene, wie sie in Tabelle 2 aufgelistet sind. Die statistische Auswertung der Genexpressionsdaten erfolgt nach bekannten Verfahren wie beispielsweise dem ANOVA-Algorithmus. Tabelle 1 Zellinien ausgewählter Spezifität ATCC, American Type Culture Collection (Manessas, VA); ECACC, European Collection of Cell Cultures (Salisbury, UK); DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, D), Clonetics (Cambex Corp., North Brunswick, NJ)
Tabelle 2 Liste der zellspezifisch exprimierten Gene
Claims (10)
1. Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Gewebeproben, umfassend
zur Verfügung stellen einer zu untersuchenden Gewebeprobe,
Analyse der Expression von mindestens einem Gen in der zu untersuchenden Gewebeprobe,
zur Verfügung stellen von einzelnen Zellen eines definierten Zelltyps oder stöchiometrischen Mischungen von Zellen eines definierten Zelltyps,
Analyse der Expression von mindestens einem Gen, das in den Zellen definierten Zelltyps zelltypspezifisch exprimiert wird,
Definieren einer Referenzprobe auf Basis der Analyse der Expression, wobei
Abgleich der Expressionsdaten der zu untersuchenden Gewebeprobe mit den
Expressionsdaten der Referenzprobe.
Analyse der Expression von mindestens einem Gen in der zu untersuchenden Gewebeprobe,
zur Verfügung stellen von einzelnen Zellen eines definierten Zelltyps oder stöchiometrischen Mischungen von Zellen eines definierten Zelltyps,
Analyse der Expression von mindestens einem Gen, das in den Zellen definierten Zelltyps zelltypspezifisch exprimiert wird,
Definieren einer Referenzprobe auf Basis der Analyse der Expression, wobei
a) das Genexpressionsmuster der Referenzprobe für Zellen eines definierten
Zelltyps charakteristisch ist, und
b) das Genexpressionsmuster der Referenzprobe für die definierte
Zusammensetzung von Zellen eines definierten Zelltyps charakteristisch ist, und
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende
Gewebeprobe Material aus einer Biopsieprobe, insbesondere von eutopem und ektopem
Endometrium, mit dem Endometrium-ähnlichem Gewebe oder Tumorgewebe umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen eines
definierten Zelltyps ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Epithelzellen,
Mesothelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten/Stromazellen, Muskelzellen und Hämatopoetischen
Zellen.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen eines definierten
Zelltyps ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den humanen Zellinien 11E,
EEC145, 12Z, 49Z, 50Z, 11Z, 23Z, Ishikawa, MFE296, MFE280, Bristol8, MCF-7,
RT112, MDCK, ESS-1, BEL-1, MBN2, PFE, THP-1, NIH:OVCAR-3, HUV-EC-C,
MES-SA, MSTO-211H, und UtSMC.
5. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die
zellspezifisch exprimierten Gene
in Epithelzellen Keratin 18 (M26326); Cytokeratin 8 (M34225); E-Cadherin (XM_007840); Matrix-Metalloproteinase 7 (MMP-7, BC003635) und/oder Tumorassoziierter Kalzium-Signal Transducer (TACSTD1, NM_002354);
in Mesothelzellen Calbindin 2 (CALB2, NM_007088); Calbindin 3 (CALB3, NM_004057) und/oder Mesothelin (U40434);
in Endothelzellen Rezeptor für vaskularen endothelialen Wachstumsfaktor (Flt1, AF063657); Nitritoxid Synthetase (M93718); Prä-Pro-von Willebrand Faktor (X04385) und/oder Gerinnungsfaktor 8 (M14113);
in Fibroblasten/Stromazellen Fibroblasten-aktivierendes Protein (FAP, XM_002209); Morphogenetischer Protein Rezeptor des Knochens (BMPR2, NM_001204); Frizzle related Protein (frpH) E (AF026692); Vimentin (XM_005833) und/oder Prolyl 4- Hydroxylase beta (J02783);
in Muskelzellen Alpha Aktin (X13839); Calponin (U37019); Desmin (NM_001927); 20-kDa Myosin leichte Kette 2 Glatte Muskel Isoform (J02854) und/oder Myosin schwere Kette Glatte Muskel Isoform (S67247); und
in Hämatopoetischen Zellen CD14 (M86511); CD16 (M24854) und/oder CD69 (L07555) sind.
in Epithelzellen Keratin 18 (M26326); Cytokeratin 8 (M34225); E-Cadherin (XM_007840); Matrix-Metalloproteinase 7 (MMP-7, BC003635) und/oder Tumorassoziierter Kalzium-Signal Transducer (TACSTD1, NM_002354);
in Mesothelzellen Calbindin 2 (CALB2, NM_007088); Calbindin 3 (CALB3, NM_004057) und/oder Mesothelin (U40434);
in Endothelzellen Rezeptor für vaskularen endothelialen Wachstumsfaktor (Flt1, AF063657); Nitritoxid Synthetase (M93718); Prä-Pro-von Willebrand Faktor (X04385) und/oder Gerinnungsfaktor 8 (M14113);
in Fibroblasten/Stromazellen Fibroblasten-aktivierendes Protein (FAP, XM_002209); Morphogenetischer Protein Rezeptor des Knochens (BMPR2, NM_001204); Frizzle related Protein (frpH) E (AF026692); Vimentin (XM_005833) und/oder Prolyl 4- Hydroxylase beta (J02783);
in Muskelzellen Alpha Aktin (X13839); Calponin (U37019); Desmin (NM_001927); 20-kDa Myosin leichte Kette 2 Glatte Muskel Isoform (J02854) und/oder Myosin schwere Kette Glatte Muskel Isoform (S67247); und
in Hämatopoetischen Zellen CD14 (M86511); CD16 (M24854) und/oder CD69 (L07555) sind.
6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die
Analyse der Expression die Isolierung der mRNA und den Nachweis der
entsprechenden mRNA mittels korrespondierender cDNA-Sonden oder RT-PCR umfaßt.
7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die
Analyse der Expression unter Verwendung eines DNA-Chip-Arrays erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA Sonden
markiert sind, insbesondere Cy3- bzw. Cy5-markiert sind.
9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der
Abgleich eine Normalisierung der Expressionsdaten umfaßt.
10. Verwendung des Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Ermittlung
der zellulären Zusammensetzung, der Klassifizierung und/oder der Evaluierung der
Genexpression von Gewebeproben.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10159404A DE10159404A1 (de) | 2001-12-04 | 2001-12-04 | Verfahren zur Analyse von Gewebeproben |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10159404A DE10159404A1 (de) | 2001-12-04 | 2001-12-04 | Verfahren zur Analyse von Gewebeproben |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10159404A1 true DE10159404A1 (de) | 2003-06-26 |
Family
ID=7707908
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE10159404A Withdrawn DE10159404A1 (de) | 2001-12-04 | 2001-12-04 | Verfahren zur Analyse von Gewebeproben |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE10159404A1 (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005028677A2 (en) * | 2003-05-07 | 2005-03-31 | Agilent Technologies, Inc. | Systems and methods for determining cell type composition of mixed cell populations using gene expression signatures |
WO2005068664A2 (en) * | 2004-01-09 | 2005-07-28 | The Regents Of The University Of California | Cell-type-specific patterns of gene expression |
WO2005095644A2 (de) * | 2004-04-04 | 2005-10-13 | Oligene Gmbh | Verfahren zur erkennung von signaturen in komplexen genexpressionsprofilen |
-
2001
- 2001-12-04 DE DE10159404A patent/DE10159404A1/de not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. EISEN, M.B. u.a., Proc. Natl.Acad. Sci. USA (1998)95, 14863-14868 * |
Functional genomics and expression profiling. ALBELDA, S.M. & SHEPPARD, D., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (2000)23, 265-269 * |
Fundamental patterns underlying gene expression profiles: Simplicity from complexity. HOLTER, N.S.u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000)97 (15) 8409-8414 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005028677A2 (en) * | 2003-05-07 | 2005-03-31 | Agilent Technologies, Inc. | Systems and methods for determining cell type composition of mixed cell populations using gene expression signatures |
WO2005028677A3 (en) * | 2003-05-07 | 2005-07-14 | Agilent Technologies Inc | Systems and methods for determining cell type composition of mixed cell populations using gene expression signatures |
WO2005068664A2 (en) * | 2004-01-09 | 2005-07-28 | The Regents Of The University Of California | Cell-type-specific patterns of gene expression |
WO2005068664A3 (en) * | 2004-01-09 | 2006-04-27 | Univ California | Cell-type-specific patterns of gene expression |
JP2008504803A (ja) * | 2004-01-09 | 2008-02-21 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 遺伝子発現の細胞型特異的パターン |
US8781750B2 (en) | 2004-01-09 | 2014-07-15 | The Regents Of The University Of California | Cell-type-specific patterns of gene expression |
WO2005095644A2 (de) * | 2004-04-04 | 2005-10-13 | Oligene Gmbh | Verfahren zur erkennung von signaturen in komplexen genexpressionsprofilen |
WO2005095644A3 (de) * | 2004-04-04 | 2006-04-13 | Oligene Gmbh | Verfahren zur erkennung von signaturen in komplexen genexpressionsprofilen |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Beyer et al. | Ribonucleoprotein structure in nascent hnRNA is nonrandom and sequence-dependent | |
DE69835010T2 (de) | Feststellung von endometriumkrebs | |
Rønn et al. | A simple procedure for quantification of neurite outgrowth based on stereological principles | |
Marshall et al. | Accumulation of collagen and altered fiber‐type ratios as indicators of abnormal muscle gene expression in the mdx dystrophic mouse | |
DE69907156T2 (de) | Krebsbehandlung | |
DE102010041912B3 (de) | Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen durch Analyse der mechanischen Eigenschaften von Tumorzellen | |
EP1786929B1 (de) | Verfahren zur diagnose von eierstockkrebs | |
DE69934096T2 (de) | Zusammensetzungen und methoden zur wundheilung | |
DE10159404A1 (de) | Verfahren zur Analyse von Gewebeproben | |
Langvatn | Analysis of ovaries in studies of reproduction in red deer (Cervus elaphus, L.): Application and limitations | |
Hokoç et al. | Quantitative analysis of the opossum's optic nerve: An electron microscope study | |
DE102017119427A1 (de) | Bestimmung des Alters eines menschlichen Individuums | |
WO2008061527A2 (de) | Prognostische marker für die klassifizierung von kolorektalen karzinomen basierend auf expressionsprofilen von biologischen proben | |
Heddle et al. | Concurrent detection of gene mutations and chromosomal aberrations induced in vivo in somatic cells | |
Reagan et al. | Morphology of the malignant squamous cell: A study of six thousand cells derived from squamous cell carcinomas of the uterine cervix | |
EP1510219A1 (de) | Verfahren zur Identifikation mindestens eines Aminopeptidasen-Inhibitors | |
WO2021018800A1 (de) | Verfahren zur klassifizierung des risikos für die entwicklung einer zervikalen intraepithelialen neoplasie | |
Winfield | The synaptic organization of glomeruli in the magnocellular and parvocellular laminae of the lateral geniculate nucleus in the monkey | |
Morgan et al. | Spontaneous and 3-aminobenzamide-induced sister-chromatid exchange frequencies estimated by ring chromosome analysis | |
DE102006032394A1 (de) | Verfahren zur Diagnose und Differenzierung von Prostatakrebs | |
Burr et al. | En bloc staining of bone under load does not improve dye diffusion into microcracks | |
EP0832195B1 (de) | Verfahren zur osteoporosediagnose und zur testung potentieller osteoporose-therapeutika unter verwendung von standardisierten, primären osteoblastenzellkulturen aus osteoporotischen patienten | |
EP2059804A1 (de) | Verfahren zur molekularen charakterisierung von altershaar | |
DE102012024203A1 (de) | Verfahren zur Ermittlung der Sequenz von Biopolymeren | |
Kronqvist et al. | The fraction of fields showing neoplastic tubules: a practical estimate of tubular differentiation in breast cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |