DE10158147A1

DE10158147A1 - Determining autoantibodies against oxidized low-density lipoprotein, useful for diagnosis of e.g. arteriosclerosis, without interference from antibodies against native lipoprotein

Info

Publication number: DE10158147A1
Application number: DE10158147A
Authority: DE
Inventors: Werner Schoesler; Christian Hentschel; Eberhard Wieland
Original assignee: Imtec Immundiagnostika GmbH
Current assignee: Human Gesellschaft fur Biochemica und Diagnos De
Priority date: 2001-07-20
Filing date: 2001-11-28
Publication date: 2003-01-30
Also published as: DE10158147A8

Abstract

Determining autoantibodies (AAb) against oxidized low-density lipoprotein (oxLDL) in physiological fluids with simultaneous subtraction of interfering antibodies directed against native LDL or other lipids or phospholipids with similar properties, is new. Determining autoantibodies (AAb) against oxidized low-density lipoprotein (oxLDL) in physiological fluids with simultaneous subtraction of interfering antibodies directed against native LDL or other lipids or phospholipids with similar properties. First oxLDL is fixed, covalently or by adsorption, to the surface of a carrier, while native LDL (or other (phospho)lipid) is fixed similarly to a geometrically complementary carrier. The two carriers are simultaneously contacted with test fluid, e.g. serum, and then detection made by standard immunological methods, preferably by optical, electrochemical or fluorimetric measurement. Independent claims are also included for: (1) test kit for detecting AAb; and (2) microtiter plate coated with oxLDL and a complementary pin cover coated with native LDL.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Testkit zur Bestimmung von Autoantikörpern gegen oxidierte low density Lipoproteine (oxLDL) in physiologischen Flüssigkeiten. The invention relates to methods and test kit for the determination of autoantibodies against oxidized low density lipoproteins (oxLDL) in physiological fluids.

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind nach wie vor die führende Todesursache in den entwickelten Industrieländern. Der Zusammenhang zwischen erhöhten Cholesterolkonzentrationen im Blut und der Entwicklung von Gefäßerkrankungen (Arteriosklerose) ist seit langem bekannt. Man unterscheidet zwischen Lipoproteinen, die die Arteriosklerose fördern und solchen, die ihr entgegenwirken. Low density Lipoproteine (LDL) gehören zu den proarteriogenen Lipoproteinen. In ihrer nativen Form sind sie allerdings nicht in der Lage, die Entzündungsreaktion in den Gefäßen zu stimulieren. Es konnten aber beim Menschen chemische Modifikationen der LDL gefunden werden, die für die proarteriogenen Eigenschaften verantwortlich sind. Es handelt sich dabei vor allem um oxidative Prozesse, bei denen unter anderem Aldehyde (z. B. Malondialdehyd (MDA)) aus Lipiden gebildet werden, die ihrerseits mit den LDL reagieren können (oxLDL und MDA- LDL). Cardiovascular diseases are still the leading cause of death in the United States developed industrialized countries. The relationship between elevated Cholesterol levels in the blood and the development of vascular diseases (Arteriosclerosis) has been known for a long time. A distinction is made between lipoproteins, which Promote arteriosclerosis and those that counteract it. Low density lipoproteins (LDL) belong to the proarteriogenic lipoproteins. They are in their native form however unable to stimulate the inflammatory response in the vessels. It However, chemical modifications of the LDL could be found in humans which are suitable for the proarteriogenic properties are responsible. It is mainly about oxidative processes in which, among other things, aldehydes (e.g. malondialdehyde (MDA)) are formed Lipids are formed, which in turn can react with the LDL (oxLDL and MDA- LDL).

Autoantikörper gegen oxLDL bzw. MDA-LDL werden als Marker einer Arteriosklerose, von Gefäßerkrankungen sowie eines Myokardinfarktes angesehen und sind im Serum nachweisbar (2). In den letzten Jahren konnten in zahlreichen klinischen Studien folgende Zusammenhänge aufgezeigt werden: Anti-oxLDL-Antikörper korrelieren mit der Schwere der Arteriosklerose (3), desweiteren sind oxLDL/anti-oxLDL-Immunkomplexe in Arteriosklerotischen Plaques nachweisbar (3). Außerdem läßt sich die Arteriogenese durch eine antioxidative Therapie/-Diät reduzieren (1). Autoantibodies against oxLDL or MDA-LDL are used as markers of arteriosclerosis, of vascular diseases and a myocardial infarction and are in the serum detectable (2). In recent years, numerous clinical studies have been able to: Connections are shown: Anti-oxLDL antibodies correlate with the severity arteriosclerosis (3), furthermore oxLDL / anti-oxLDL immune complexes are in Arteriosclerotic plaques detectable (3). Arteriogenesis can also be performed reduce antioxidant therapy / diet (1).

Erhöhte Konzentrationen an anti-oxLDL-Antikörpern wurden auch bei Arteriosklerose, Myokardinfarkt, Hypertonie, Diabetes, Nierenversagen/Dialyse, SLE, Präeklampsie, Endometriose und bei Zigarettenrauchern gefunden (I). Increased levels of anti-oxLDL antibodies have also been reported in atherosclerosis, Myocardial infarction, hypertension, diabetes, kidney failure / dialysis, SLE, preeclampsia, Endometriosis and found in cigarette smokers (I).

Anti-oxLDL-Autoantikörper können vom IgG-, IgM- und IgA-Isotyp sein, wobei den erstgenannten die größte Bedeutung zugemessen wird. Anti-oxLDL autoantibodies can be of the IgG, IgM and IgA isotype, the the former is of the greatest importance.

Der Nachweis von anti-oxLDL-Antikörpern erfolgt nach dem Stand der Technik mit Enzymimmunoassays (EIA) oder Radioimmunoassays (RIA). Die EIA basieren auf dem Prinzip des enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Diese Testsysteme sind jedoch unzureichend standardisiert und wenig praktikabel, da die zu untersuchenden Seren sowohl gegen oxLDL als auch gegen natives LDL bestimmt werden müssen und das spezifische Meßsignal durch Subtraktion der Extinktion des LDL von der des oxLDL erhalten wird. Somit müssen alle Seren doppelt bestimmt werden. Weiterhin sind diese Teste mit zum Teil erheblichen qualitativen Mängeln (unspezifische Bindung) und der Praktikabilität abträglichen Merkmalen (lange Inkubationszeiten, Testdurchführung in der Kälte) behaftet. The detection of anti-oxLDL antibodies is carried out according to the state of the art Enzyme immunoassays (EIA) or radioimmunoassays (RIA). The EIA are based on the Principle of the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). However, these test systems are insufficiently standardized and not very practical because the sera to be examined are both against oxLDL as well as against native LDL and the specific Measurement signal is obtained by subtracting the extinction of the LDL from that of the oxLDL. All sera must therefore be determined twice. Furthermore, these tests are partly considerable qualitative defects (non-specific binding) and practicability detrimental features (long incubation times, testing in the cold).

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein reproduzierbares und möglichst praktikables Verfahren als ELISA zur Bestimmung von oxLDL-Antikörpern zu entwickeln, bei dem die Reaktivität störender Autoantikörper gegen natives LDL nicht gesondert bestimmt werden muß. The invention was therefore based on the object of being reproducible and as possible to develop a practical method as an ELISA for the determination of oxLDL antibodies, in which the reactivity of interfering autoantibodies to native LDL is not separately must be determined.

Überraschenderweise zeigte sich, daß durch die gleichzeitige Inkubation der physiologischen Flüssigkeit, vorzugsweise Serum, in einer mit oxLDL beschichteten Mikrotiterplatte und einem dazu geometrisch komplementären LDL- oder Lipid- oder Phospholipid-beschichteten Pin-Deckel kreuzreagierende Antikörper gegen natives LDL an die Pins gebunden und somit aus der Probe entfernt werden (s. Abb. 1). Dabei ist jeweils ein Pin in einer Vertiefung (weil) der Mikrotiterplatte positioniert. Dadurch entfällt die sonst notwendige zusätzliche Bestimmung der gegen natives LDL gerichteten Antikörper und damit auch die aufwendige subtraktive Auswertung des eigentlichen Meßsignals (Meßsignal anti-oxLDL-Antikörper minus Meßsignal anti-natLDL-Antikörper). Surprisingly, it was found that the simultaneous incubation of the physiological liquid, preferably serum, in a microtiter plate coated with oxLDL and a geometrically complementary LDL or lipid or phospholipid-coated pin cover bound cross-reactive antibodies against native LDL to the pins and thus removed from the sample (see Fig. 1). One pin is positioned in a recess (because) of the microtiter plate. This eliminates the otherwise necessary additional determination of the antibodies directed against native LDL and thus also the expensive subtractive evaluation of the actual measurement signal (measurement signal anti-oxLDL antibody minus measurement signal anti-natLDL antibody).

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß oxLDL und natLDL oder anderer Lipide oder Phospholipide mit den gleichen Eigenschaften, an die Oberflächen geeigneter Trägermaterialien, insbesondere Kunststoff, vorzugsweise Polystyren, adsorptiv oder kovalent gebunden werden. Die Träger sind dabei geometrisch komplementär. Sie können eine unterschiedliche räumliche Form besitzen, vorzugsweise eckig, kugelförmig, planar. The method according to the invention is characterized in that oxLDL and natLDL or other lipids or phospholipids with the same properties, on the surfaces suitable carrier materials, in particular plastic, preferably polystyrene, adsorptive or bound covalently. The carriers are geometrically complementary. she can have a different spatial shape, preferably angular, spherical, planar.

In einer bevorzugten Ausführungsvariante wird eine Mikrotiterplatte, vorzugsweise 96 Well oder 384 Well, mit oxLDL und ein komplementärer Pin-Deckel mit natLDL beschichtet, vgl. Abb. 1. In a preferred embodiment, a microtiter plate, preferably 96 well or 384 well, is coated with oxLDL and a complementary pin cover with natLDL, cf. Fig. 1.

Die Bestimmung der anti-oxLDL-Antikörper erfolgt in der Weise, daß die physiologische Flüssigkeit (z. B. Serum) gleichzeitig mit den beiden Proteinen, das heißt z. B. dem beschichteten Pin-Deckel und der beschichteten Mikrotiterplatte, in Kontakt kommt. The anti-oxLDL antibodies are determined in such a way that the physiological Liquid (e.g. serum) simultaneously with the two proteins, e.g. B. the coated pin cover and the coated microtiter plate, comes into contact.

Der Nachweis der Antikörper erfolgt nach an sich üblichen immunologischen Verfahren mittels optischem, elektrochemischen oder fluorimetrischem Nachweis unter Verwendung entsprechend markierter anti-species-Immunglobulin-Antikörper, vorzugsweise gegen die Subklassen IgG und IgM gerichtet, sowie einem markerspezifischen Nachweissystem, vorzugsweise mit einem Enzymsubstrat. The antibodies are detected using immunological methods which are customary per se by means of optical, electrochemical or fluorometric detection using appropriately labeled anti-species immunoglobulin antibodies, preferably against IgG and IgM subclasses, and a marker-specific detection system, preferably with an enzyme substrate.

Desweiteren betrifft die Erfindung einen Testkit zur Bestimmung von Autoantikörpern gegen oxidierte low density Lipoproteine (oxLDL) in physiologischen Flüssigkeiten, bevorzugt Serum, der umfaßt:

- zwei feste, geometrisch komplementäre Träger, vorzugsweise aus Polystyren, wobei ein Träger mit oxLDL, der andere mit natLDL bzw. Lipiden oder Phospholipiden, die die gleichen Eigenschaften besitzen, beladen ist,
- Waschlösung,
- Verdünnungspuffer,
- einen markierten anti-species-Immunglobulin-Antikörper, vorzugsweise gegen die Subklassen IgG und IgM,
- Konjugatpuffer,
- ein markerspezifisches Nachweissystem, vorzugsweise ein Enzymsubstrat.

Furthermore, the invention relates to a test kit for the determination of autoantibodies against oxidized low density lipoproteins (oxLDL) in physiological liquids, preferably serum, which comprises:

two solid, geometrically complementary carriers, preferably made of polystyrene, one carrier being loaded with oxLDL, the other with natLDL or lipids or phospholipids, which have the same properties,
- washing solution,
- dilution buffer,
a labeled anti-species immunoglobulin antibody, preferably against the IgG and IgM subclasses,
- conjugate buffer,
a marker-specific detection system, preferably an enzyme substrate.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet den reproduzierbaren und standardisierbaren Nachweis von Autoantikörpern der Subklassen IgG und IgM gegen oxLDL aus dem Serum ohne ein aufwendiges Procedere, indem die zu bestimmenden Seren gleichzeitig sowohl mit oxLDL als auch mit nativem LDL in Kontakt gebracht werden, so daß die bisher notwendige zweifache Bestimmung der Probe und die subtraktive Auswertung entfällt. Das ermöglicht, verglichen mit bisher üblichen Verfahren, die doppelte Anzahl an Bestimmungen mit wesentlich geringerem Zeitaufwand und leistet somit einen wichtigen Beitrag zur nicht invasiven Diagnostik der Arteriosklerose. Literatur 1. Craig WY: Autoantibodies Against Oxidised Low Density Lipoprotein: A Review of Clinical Findings and Assay Methodology. J Clin Lab Analysis 9: 70-74, 1995
2. Vaarala: Antiphospholipid antibodies and myocardial infarction. Lupus 7 (suppl 2), s132-s134, 1998
3. Frostegard J: Autoantibodies to Endothelial Cells and Oxidized LDL in Shoenfeld Y, Harats D and Wick G (eds): Arteriosclerosis and Autoimmunity. Elsevier Science B.V.2001). The method according to the invention permits the reproducible and standardizable detection of autoantibodies of the subclasses IgG and IgM against oxLDL from the serum without a complex procedure by simultaneously bringing the sera to be determined into contact with both oxLDL and with native LDL, so that the previously required duplicate determination of the sample and the subtractive evaluation is omitted. This enables twice the number of determinations to be compared to conventional methods and takes significantly less time, making an important contribution to the non-invasive diagnosis of arteriosclerosis. Literature 1. Craig WY: Autoantibodies Against Oxidized Low Density Lipoprotein: A Review of Clinical Findings and Assay Methodology. J Clin Lab Analysis 9: 70-74, 1995
2. Vaarala: Antiphospholipid antibodies and myocardial infarction. Lupus 7 (suppl 2), s132-s134, 1998
3. Frostegard J: Autoantibodies to Endothelial Cells and Oxidized LDL in Shoenfeld Y, Harats D and Wick G (eds): Arteriosclerosis and Autoimmunity. Elsevier Science BV2001).

embodiment A) Isolation of LDL

Ein humanes Plasma wird mit Kaliumbromid bis zu einer Dichte von 1,020 g/ml eingestellt, mit 1 mM EDTA versetzt und bei 4°C bei 48 000 U/min für 20 Stunden in einer Ultrazentrifuge zentrifugiert. Dadurch wird VLDL abgetrennt (obere Zone verwerfen). Die untere Zone, bestehend aus HDL und LDL, wird mit demselben Volumen dest. Wasser versetzt und die Dichte auf 1,063 g/ml mit Kaliumbromid eingestellt und die Lösung mit 1 mM EDTA versetzt. Es wird wie oben beschrieben zentrifugiert. Die obere Zone, die das LDL enthält, wird separiert und nochmals bei einer Dichte von 1,063 g/ml ultrazentrifugiert. A human plasma is mixed with potassium bromide to a density of 1.020 g / ml adjusted, mixed with 1 mM EDTA and in at 4 ° C. at 48,000 rpm for 20 hours centrifuged in an ultracentrifuge. This separates VLDL (upper zone discard). The lower zone, consisting of HDL and LDL, is of the same volume least. Water was added and the density was adjusted to 1.063 g / ml with potassium bromide and the Solution mixed with 1 mM EDTA. It is centrifuged as described above. The upper Zone containing the LDL is separated and again at a density of 1.063 g / ml ultracentrifugation.

Das LDL wird 48 Stunden gegen 2mal 5 l PBS-Puffer, pH = 7,4 unter Zusatz von 0,01% EDTA dialysiert und anschließend sterilfiltriert. The LDL is 48 hours against 2 times 5 l PBS buffer, pH = 7.4 with the addition of 0.01% EDTA dialyzed and then sterile filtered.

B) Modification of LDL

LDL (0,2 g Protein/l) wird zur Entfernung von EDTA gegen 150 mM NaCl dialysiert und in Gegenwart von 20 µM Cu (II) für 24 h bei 37°C oxidiert. LDL (0.2 g protein / l) is dialyzed against 150 mM NaCl to remove EDTA and oxidized in the presence of 20 µM Cu (II) for 24 h at 37 ° C.

Zur Herstellung von Malondialdehyd werden 165 µl 1,1,3,3-Tetramethoxypropan- Malondialdehyd-bis-dimethylacetal mit 200 µl 37%iger Salzsäure 1 h bei 37°C inkubiert, danach mit 4,8 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH = 6,4 versetzt und der pH mit 10 M Natronlauge auf 6,4 eingestellt. Diese Lösung wird mit 5,16 ml LDL (Proteingehalt ca. 5 g/l) gemischt und 6 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wird der Reaktionsansatz gegen 2mal 5 l PBS-Puffer, pH = 7,4 unter Zusatz von 0,01% EDTA dialysiert. To prepare malondialdehyde, 165 µl 1,1,3,3-tetramethoxypropane Incubated malondialdehyde-bis-dimethylacetal with 200 µl 37% hydrochloric acid for 1 h at 37 ° C, then mixed with 4.8 ml of 0.1 M phosphate buffer, pH = 6.4 and the pH with 10 M Sodium hydroxide solution set to 6.4. This solution is mixed with 5.16 ml LDL (protein content approx. 5 g / l) mixed and incubated at 37 ° C for 6 h. Then the reaction mixture against 2 times 5 l PBS buffer, pH = 7.4 dialyzed with the addition of 0.01% EDTA.

C) Enzyme Immunoassay Coating of the microtiter plates with modified LDL

Modifiziertes LDL wird in einer Konzentration von 5 mg/l in PBS (100 µl/well) adsorptiv für 16 h bei 4°C an Polystyren-Mikrotiterplatten gebunden und danach abgesaugt. Nach einmaligem Waschen mit 300 µl/well PBS wird 2 h bei Raumtemperatur mit 150 µl/well Blockierungslösung (5% Fötales Kälberserum in PBS) geblockt und dreimal mit 300 µl/well PBS gewaschen. Die Platten werden anschließend mit 200 µl Konservierungslösung (2% Saccharose, 0,1% Rinderserumalbumin (RSA) in PBS) für 10 min inkubiert, entleert und an der Luft getrocknet. Modified LDL becomes adsorptive in a concentration of 5 mg / l in PBS (100 µl / well) bound to polystyrene microtiter plates for 16 h at 4 ° C. and then aspirated. To washing once with 300 µl / well PBS is carried out at room temperature with 150 µl / well for 2 h Blocking solution (5% fetal calf serum in PBS) blocked and three times with 300 µl / well PBS washed. The plates are then covered with 200 µl preservation solution (2% sucrose, 0.1% bovine serum albumin (RSA) in PBS) incubated for 10 min, emptied and air dried.

Coating the pin cover with LDL

LDL wird in einer Konzentration von 5 mg/l in PBS unter Zusatz von 0,01% EDTA (100 µl/well) in eine Mikrotiterplatte pipettiert und ein Pin-Deckel aus Polystyren aufgesetzt. Die Beladung erfolgt adsorptiv für 16 h bei 4°C. Nach einmaligem Waschen der Pins mit 300 µl/well PBS werden diese 2 h bei Raumtemperatur mit 150 µl/well Blockierungslösung (5% Fötales Kälberserum in PBS) in einer Mikrotiterplatte geblockt und dreimal mit 300 µl/well PBS gewaschen. Der Pin-Deckel wird anschließend mit 200 µl Konservierungslösung (2% Saccharose, 0,1% Rinderserumalbumin in PBS) für 10 min inkubiert und an der Luft getrocknet. LDL is at a concentration of 5 mg / l in PBS with the addition of 0.01% EDTA (100 µl / well) pipetted into a microtiter plate and a pin cover made of polystyrene attached. The Loading takes place adsorptively for 16 h at 4 ° C. After washing the pins once with 300 µl / well PBS these 2 h at room temperature with 150 µl / well blocking solution (5% fetal calf serum in PBS) blocked in a microtiter plate and three times with 300 µl / well PBS washed. The pin lid is then filled with 200 µl Preservation solution (2% sucrose, 0.1% bovine serum albumin in PBS) for 10 min incubated and air dried.

Test procedure

100 µl der zu testenden Serumprobe (1 : 100 in Verdünnungspuffer (PBS, 2% Fötales Kälberserum, 0,1% Tween 20, 0,01% Thiomersal)) werden in die MDA-LDL- Mikrotiterplatte pipettiert und durch Aufsetzen des LDL-beladenen Pin-Deckels 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die Mikrotiterplatte dreimal mit 300 µl/well Waschpuffer (PBS, 0,1% Tween 20, 0,01% Thimerosal) gewaschen und mit 100 µl anti-human-Immunglobulin G+M-Peroxidase-Konjugat in Verdünnungspuffer 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und abermals wie oben gewaschen. Danach wird 10 min mit 100 µl einer gebrauchsfertigen Substratlösung (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) pro Vertiefung inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 100 µl/well 0,5 M Schwefelsäure gestoppt. Die Auswertung erfolgt bei 450 nm in einem Mikrotiterplatten- Reader. 100 µl of the serum sample to be tested (1: 100 in dilution buffer (PBS, 2% fetal Calf serum, 0.1% Tween 20, 0.01% thiomersal)) are added to the MDA-LDL Pipette the microtiter plate and add the LDL-loaded pin lid for 1 h Incubated at room temperature. Then the microtiter plate is used three times 300 µl / well wash buffer (PBS, 0.1% Tween 20, 0.01% thimerosal) and washed with 100 µl anti-human immunoglobulin G + M peroxidase conjugate in dilution buffer 30 min incubated at room temperature and washed again as above. Then 10 min with 100 µl of a ready-to-use substrate solution (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine) incubated per well and the reaction by adding 100 µl / well 0.5 M Sulfuric acid stopped. The evaluation takes place at 450 nm in a microtiter plate Reader.

Claims

1. Method for the determination of autoantibodies against oxidized low density lipoproteins (oxLDL) in physiological liquids,
characterized in that
the determination of these antibodies with synchronous subtraction of interfering autoantibodies against native low density lipoproteins (LDL) or other lipids or phospholipids which have the same properties is carried out by

a) oxLDL are adsorptively or covalently bonded to the surface of suitable carrier materials,

b) natLDL or other lipids or phospholipids, which have the same properties, are adsorptively or covalently bound to geometrically complementary supports,

c) both carriers with the biological liquids to be examined, such as. B. Serum are brought into contact simultaneously and

d) the determination is carried out according to conventional immunological methods, preferably by means of optical, electrochemical or fluorometric detection.

2. The method according to claim 1, characterized in that the carriers for oxLDL and LDL or for other lipids or phospholipids Spatially supplement the biological fluid to be examined at the same time can come into contact with both autoantigens.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the straps have a different spatial shape and are angular, spherical or can be planar.

4. The method according to any one of claims 1-3, characterized in that the carrier made of plastic, preferably polystyrene.

5. The method according to claim 3 or 4, characterized in that the support for oxLDL is a microtiter plate and the support for LDL or for others Lipids or phospholipids is a pin plate.

6. The method according to any one of claims 1-5, characterized in that the biological fluid to be examined in the wells of the microtiter plate, which is loaded with the oxLDL, is filled and on this a pin plate which is filled with LDL was loaded, positioned such that one pin each in a recess of the Microtiter plate protrudes and thus the liquid to be examined contacts at the same time with both antigens, so that existing antibodies against LDL on the pins be bound.

7. Test kit for the determination of autoantibodies against oxidized low density lipoproteins (oxLDL) in physiological fluids comprising
two solid supports of the same geometric shape, which complement each other, preferably made of polystyrene, one support having oxLDL fixed to the surface and the other support natLDL or other lipids or phospholipids which have the same properties,
Wash solution,
Diluent
a labeled anti-species immunoglobulin antibody,
conjugate,
a marker-specific detection system, preferably an enzyme substrate.

8. Test kit according to claim 7, characterized in that a solid carrier as such Usual microtiter plate functions, which is coated with oxLDL and a itself usual pin lid complementary to the microtiter plate, coated with natLDL is.

9. microtiter plate, coated with oxLDL, and complementary pin cover, coated with natLDL, for the real determination of autoantibodies against oxidized low density lipoproteins in biological fluids.