DE10155053A1

DE10155053A1 - Reversible binding of a fluorophore to a surface for the detection of ligate-ligand association events by fluorescence quenching

Info

Publication number: DE10155053A1
Application number: DE2001155053
Authority: DE
Inventors: Gerhard Hartwich; Thomas Kratzmueller; Herbert Wieder
Original assignee: Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Current assignee: FRIZ BIOCHEM GESELLSCHAFT FUER BIOANALYTIK MBH, 814
Priority date: 2001-11-09
Filing date: 2001-11-09
Publication date: 2003-08-14
Anticipated expiration: 2021-11-10
Also published as: AU2002363452A1; DE10155053B4; WO2003040679A3; WO2003040679A2

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen, das als ersten Schritt das Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche umfasst. Die Modifikation der Oberfläche besteht dabei in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten 201, wobei die Ligaten 201 durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor 102 modifiziert sind, wobei der Fluorophor 102 mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht. Die weiteren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Bereitstellen einer Probe mit Liganden, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors und Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensität mit Referenzwerten.A method is described for the detection of ligate-ligand association events by fluorescence quenching, which comprises providing a modified surface as a first step. The modification of the surface consists in the attachment of at least one type of modified ligate 201, the ligates 201 being modified by attachment of at least one type of fluorophore 102, the fluorophore 102 entering into a reversible bond with the modified surface. The further steps of the method according to the invention are providing a sample with ligands, bringing the sample into contact with the modified surface, detection of the fluorescence of the fluorophore and comparison of the detected fluorescence intensity with reference values.

Description

Technical field

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand- Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen. The present invention relates to a method for the detection of ligate ligand Association events by fluorescence quenching.

State of the art

In der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor werden Immunoassays und zunehmend auch die Sequenzanalyse von DNA und RNA eingesetzt. Neben den bekannten seriellen Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion finden zunehmend parallele Detektionsverfahren mittels Array- Technologie, sogenannten DNA- oder Protein-Chips, Verwendung. Auch bei diesen parallelen Verfahren beruht die Detektion auf optischen, radiographischen, massenspektrometrischen oder elektrochemischen Methoden. In disease diagnosis, in toxicological test procedures, in genetic Research and development, as well as in the agricultural and pharmaceutical sector become immunoassays and increasingly also the sequence analysis of DNA and RNA used. In addition to the known serial procedures with autoradiographic or optical detection increasingly find parallel detection methods using array Technology, so-called DNA or protein chips, use. Even with these parallel methods the detection is based on optical, radiographic, mass spectrometric or electrochemical methods.

Zur Genanalyse auf einem Chip wird auf einer Oberfläche eine Bibliothek bekannter DNA-Sequenzen ("Sonden-Oligonukleotide") in einem geordneten Raster fixiert, so dass die Position jeder individuellen DNA-Sequenz bekannt ist. In der Untersuchungslösung anwesende Fragmente aktiver Gene ("Target-Oligonukleotide"), deren Sequenzen zu bestimmten Sonden-Oligonukleotiden auf dem Chip komplementär sind, können durch Nachweis der entsprechenden Hybridisierungsereignisse auf dem Chip identifiziert werden. Im Allgemeinen erfolgt die Analyse über optische (oder autoradiographische) Detektionsverfahren unter Verwendung von Target-Oligonukleotiden, die mit einem Radiolabel (z. B. ³²P) oder einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Fluorescein, Cy3 oder Cy5) markiert sind. Die Verwendung von Fluoreszenzlabel und entsprechenden Fluoreszenz-Scannern überwiegt dabei zunehmend die Anwendung von Radiolabel. Die zur Zeit auf dem Markt erhältlichen Fluoreszenz-Scanner ermöglichen den Nachweis von Fluorophoren im Subattomol-Bereich. For gene analysis on a chip, a library of known DNA sequences ("probe oligonucleotides") is fixed in an ordered grid on a surface, so that the position of each individual DNA sequence is known. Fragments of active genes ("target oligonucleotides") present in the test solution, the sequences of which are complementary to certain probe oligonucleotides on the chip, can be identified by detecting the corresponding hybridization events on the chip. In general, the analysis is carried out via optical (or autoradiographic) detection methods using target oligonucleotides which are labeled with a radio label (e.g. ³² P) or a fluorescent dye (e.g. fluorescein, Cy3 or Cy5). The use of fluorescent labels and corresponding fluorescence scanners is increasingly prevalent over the use of radio labels. The fluorescence scanners currently available on the market enable the detection of fluorophores in the subattomole range.

Die Verwendung von markierten Targets zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen beinhaltet jedoch einige Nachteile. Zum einen muss die Markierung vor der eigentlichen Messung erfolgen, was einen zusätzlichen Syntheseschritt und damit zusätzlichen Arbeitsaufwand bedeutet. Zudem ist es schwierig, eine homogene Markierung des Probenmaterials zu gewährleisten. Außerdem sind stringente Waschbedingungen notwendig, um im Anschluss an eine Hybridisierung nicht oder unspezifisch gebundenes Material zu entfernen. The use of labeled targets for the detection of hybridization events however has some drawbacks. On the one hand, the marking must be in front of the actual one Measurement take place, which is an additional synthesis step and thus additional Workload means. It is also difficult to make a homogeneous marking of the Ensure sample material. There are also stringent washing conditions necessary to be non-specific or non-specific following a hybridization remove bound material.

Sowohl für die Protein- als auch für die DNA-Analyse ist es daher wünschenswert und für den Anwender vorteilhaft, wenn die Targets (Antikörper bzw. Antigen oder DNA- Fragment) nicht mit einem Detektionslabel modifiziert werden müssen und nach der Hybridisierung keine komplizierten Waschschritte notwendig sind. It is therefore desirable for both protein and DNA analysis advantageous for the user if the targets (antibodies or antigen or DNA Fragment) do not have to be modified with a detection label and according to the Hybridization does not require complicated washing steps.

Die Nachteile der Markierung des Probenmaterials mit radioaktiven Elementen oder Fluoreszenzfarbstoffen können umgangen werden, wenn an Stelle der Targets die Sondenmoleküle mit entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Nach diesem Prinzip funktionieren die sogenannten molekularen Leuchten (molecular beacons). Diese einsträngigen Oligonukleotide weisen eine Haarnadelstruktur (hairpin, stem-and-loop) auf und tragen am einen Ende der Sequenz einen Fluorophor (z. B. Fluorescein, TexasRed®) und am anderen Ende der Sequenz einen geeigneten Fluoreszenzlöscher (z. B. DABCYL). Durch die spezielle geometrische Anordnung befinden sich die fluoreszierende Gruppe und die Einheit, die zur Löschung der Fluoreszenz führt, in räumlicher Nähe zueinander. Daher zeigen die Sonden nur eine äußerst geringe Fluoreszenz. In Gegenwart der entsprechenden zur Sequenz der Schlinge (loop) komplementären Sequenz (Target) erfolgt die Hybridisierung in diesem Bereich. Dies führt zu einer Änderung der Konformation und zur Trennung von Fluorophor und Quencher, was als starke Zunahme der Fluoreszenz beobachtet werden kann. The disadvantages of labeling the sample material with radioactive elements or Fluorescent dyes can be avoided if instead of the targets Probe molecules are labeled with appropriate fluorescent dyes. To The so-called molecular lights (molecular beacons). These single-stranded oligonucleotides have a hairpin structure (hairpin, stem-and-loop) and carry a fluorophore at one end of the sequence (e.g. Fluorescein, TexasRed®) and a suitable one at the other end of the sequence Fluorescence quencher (e.g. DABCYL). Due to the special geometric arrangement are the fluorescent group and the unit that is used to extinguish the Fluorescence results in close proximity to one another. Therefore, the probes only show one extremely low fluorescence. In the presence of the corresponding to the sequence of Hybridization takes place in this loop complementary sequence (target) Area. This leads to a change in the conformation and the separation of Fluorophore and Quencher, which is observed as a sharp increase in fluorescence can be.

Neben organischen Molekülen (wie DABCYL) werden auch Gold-Nanopartikel als effiziente Quencher eingesetzt (vgl. Nature Biotech. Vol. 19, 2001, Seite 365). Das Quenchen der Fluoreszenz durch Metalle beruht primär auf einem strahlungslosen Energietransfer vom Farbstoffmolekül zum Metall. Durch die Verwendung von Gold- Nanopartikeln wird eine größere Sensitivität beobachtet als bei organischen Quenchern. Außerdem werden Farbstoffe bis in den nahen Infrarot-Bereich effizient gequencht. Ein Nachteil dieser Methode liegt allerdings darin, dass Gold-Nanopartikel bei Temperaturen über 50°C nicht mehr stabil sind. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass diese Methode auf die Untersuchung von Lösungen beschränkt ist und daher nur wenige Sequenzen zur gleichen Zeit untersucht werden können, der Parallelisierungsgrad dieses Ansatzes also gering ist. In addition to organic molecules (such as DABCYL), gold nanoparticles are also considered efficient quenchers are used (cf. Nature Biotech. Vol. 19, 2001, page 365). The Quenching the fluorescence through metals is based primarily on a radiationless one Energy transfer from the dye molecule to the metal. By using gold A greater sensitivity is observed for nanoparticles than for organic quenchers. In addition, dyes are efficiently quenched into the near infrared range. On However, the disadvantage of this method is that gold nanoparticles are included Temperatures above 50 ° C are no longer stable. Another disadvantage is that this method is limited to examining solutions and therefore only few sequences can be examined at the same time that The degree of parallelization of this approach is therefore low.

Obwohl es also viele Detektionsmöglichkeiten für Ligat-Ligand-Assoziate gibt, ist der Bedarf an einfachen, kostengünstigen, problemlos durchzuführenden und verlässlichen Detektionsprinzipien vor allem im Bereich der weniger dichten Array-Technologien (DNA- und Protein-Chips mit wenigen einzelnen bzw. bis zu mehreren hunderttausend Test-sites pro cm² z. B. für sogenannte POC (Point of Care)-Systeme bzw. für high throughput screening - HTS-Systeme) hoch. So although there are many detection options for ligate-ligand associates, the need for simple, inexpensive, easy-to-use and reliable detection principles is especially in the area of less dense array technologies (DNA and protein chips with a few individual or up to several hundred thousand test sites per cm ^2, e.g. for so-called POC (Point of Care) systems or for high throughput screening (HTS systems).

Presentation of the invention

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen zu schaffen, welches die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist. The object of the present invention is therefore to provide a method for the detection of Create ligate-ligand association events by fluorescence quenching, which does not have the disadvantages of the prior art.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren gemäß unabhängigem Patentanspruch 1, durch die Verwendung gemäß unabhängigem Patentanspruch 26 und den Kit gemäß unabhängigem Patentanspruch 27 gelöst. This object is achieved by the method according to independent Claim 1, by use according to independent claim 26 and solved the kit according to independent claim 27.

Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen. Further advantageous details, aspects and refinements of the present invention result from the dependent claims, the description, the figures and the Examples.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt: Genetik DNA: Desoxyribonukleinsäure
RNA: Ribonukleinsäure
PNA: Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat Einheit durch die -NH-(CH₂)₂- N(COCH₂-Base)-CH₂CO- Einheit hybridisiert PNA mit DNA.)
A: Adenin
G: Guanin
C: Cytosin
T: Thymin
U: Uracil
Base: A, G, T, C oder U
Bp: Basenpaar
Nukleinsäure: wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit zur sequenzspezifischen Bindung natürlich vorkommender cDNA oder RNA.
nt: Nukleotid
Nukleinsäure-Oligomer: Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nukleinsäure-Oktamer: Eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei dem 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind)
ns-Oligomer: Nukleinsäure-Oligomer
Oligomer: Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer
Oligonukleotid: Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge
Oligo: Abkürzung für Oligonukleotid
Mismatch: Zur Ausbildung der Watson Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet
ss: single strand (Einzelstrang)
ds: double strand (Doppelstrang) Substanzen Fluorophor: chemische Verbindung (chemische Substanz), die in der Lage ist, bei Anregung mit Licht ein längerwelliges (rotverschobenes) Fluoreszenzlicht abzugeben. Fluorophore (Fluoreszenzfarbstoffe) können Licht in einem Wellenlängenbereich vom ultravioletten (UV) über den sichtbaren (VIS) bis hin zum infraroten (IR) Bereich absorbieren. Die Absorptions- und Emissionsmaxima sind um 15 bis 40 nm verschoben (Stokes- Shift)
FP: Fluorophor
Cy3™: 5,5'-disulfo-1,1'di(-carbopentenyl)-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanin
(Fluoreszenzfarbstoff der Firma Amersham Life Science, Inc.)
Cy5™: 5,5',7,7'-tetrasulfo-1,1'di(-carbopentenyl)-3,3,3',3'- tetramethylbenzindodicarbocyanin (Fluoreszenzfarbstoff der Firma Amersham Life Science, Inc.)
Fluorescein: Resorcinphtalein (Fluoreszenzfarbstoff)
Rhodamin 6G: Basic Red 1 (Fluoreszenzfarbstoff)
Texas Red®: Fluoreszenzfarbstoff der Firma Molecular Probes, Inc.
DABCYL: 4-((4'-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure
Fluoreszenzlöschung: strahlungsloser Energietransfer
Fluoreszenz-Quenchen: Fluoreszenzlöschung
Quench-Oberfläche: leitende (Metall)-Oberfläche, die durch einen Energietransfer Fluoreszenz löschen können (insbesondere Gold-, Silber-, Kupfer-Oberflächen usw.)
EDTA: Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz)
Ligand: Bezeichnung für Moleküle, die von Ligaten spezifisch gebunden werden; Beispiele von Liganden im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Ligand eines Antigens), Antigene (als Ligand eines Antikörpers), Rezeptoren (als Ligand eines Hormons), Hormone (als Ligand eines Rezeptors) oder Nukleinsäure-Oligomere (als Ligand des komplementären Nukleinsäure-Oligomers
Ligat: Bezeichnung für (Makro-) Molekül, an dem sich spezifische Erkennungs- und Bindungsstellen für die Ausbildung eines Komplexes mit einem Liganden befinden (Template)
Linker: molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero- Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit dem entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, einem Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt
Spacer: Linker, der über die reaktiven Gruppen an eine oder beide der zu verbindenden Strukturen (siehe Linker) kovalent angebunden ist. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt The following abbreviations and terms are used in the context of the present invention: Genetics DNA: deoxyribonucleic acid
RNA: ribonucleic acid
PNA: peptide nucleic acid (synthetic DNA or RNA in which the sugar-phosphate unit is replaced by an amino acid. When the sugar-phosphate unit is replaced by the -NH- (CH ₂ ) ₂ - N (COCH ₂ base) -CH ₂ CO unit hybridizes PNA with DNA.)
A: Adenine
G: Guanine
C: Cytosine
T: thymine
U: uracil
Base: A, G, T, C or U
Bp: base pair
Nucleic acid: at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g. adenine or guanine). The term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, such as. B. on the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analogous structures (e.g. phosphoramide, thio-phosphate or dithio-phosphate backbone). An essential feature of a nucleic acid in the sense of the present invention is the ability for sequence-specific binding of naturally occurring cDNA or RNA.
nt: nucleotide
Nucleic acid oligomer: Nucleic acid of unspecified base length (e.g. nucleic acid octamer: A nucleic acid with any backbone in which 8 pyrimidine or purine bases are covalently bound to one another)
ns oligomer: nucleic acid oligomer
Oligomer: Equivalent to nucleic acid oligomer
Oligonucleotide: Equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer. B. a DNA, PNA or RNA fragment unspecified base length
Oligo: Abbreviation for oligonucleotide
Mismatch: To form the Watson Crick structure of double-stranded oligonucleotides, the two single strands hybridize in such a way that base A (or C) of one strand forms hydrogen bonds with base T (or G) of the other strand (in RNA, T is replaced by uracil ). Any other base pairing does not form hydrogen bonds, distorts the structure and is referred to as a "mismatch"
ss: single strand
ds: double strand (double strand) substances fluorophore: chemical compound (chemical substance) that is able to emit a longer-wave (red-shifted) fluorescent light when excited with light. Fluorophores (fluorescent dyes) can absorb light in a wavelength range from ultraviolet (UV) to the visible (VIS) to the infrared (IR) range. The absorption and emission maxima are shifted by 15 to 40 nm (Stokes shift)
FP: fluorophore
Cy3 ™: 5,5'-disulfo-1,1'di (-carbopentenyl) -3,3,3 ', 3'-tetramethylindodicarbocyanine
(Fluorescent dye from Amersham Life Science, Inc.)
Cy5 ™: 5,5 ', 7,7'-tetrasulfo-1,1'di (-carbopentenyl) -3,3,3', 3'-tetramethylbenzindodicarbocyanine (fluorescent dye from Amersham Life Science, Inc.)
Fluorescein: resorcin phthalein (fluorescent dye)
Rhodamine 6G: Basic Red 1 (fluorescent dye)
Texas Red®: fluorescent dye from Molecular Probes, Inc.
DABCYL: 4 - ((4 '- (Dimethylamino) phenyl) azo) benzoic acid
Fluorescence quenching: radiation-free energy transfer
Fluorescence quenching: quenching of fluorescence
Quench surface: conductive (metal) surface that can quench fluorescence through an energy transfer (especially gold, silver, copper surfaces etc.)
EDTA: ethylenediamine tetraacetate (sodium salt)
Ligand: term for molecules that are specifically bound by ligates; Examples of ligands in the context of the present invention are substrates, cofactors or coenzymes of a protein (enzyme), antibodies (as ligand of an antigen), antigens (as ligand of an antibody), receptors (as ligand of a hormone), hormones (as ligand of a receptor) ) or nucleic acid oligomers (as ligand of the complementary nucleic acid oligomer
Ligate: Term for (macro) molecule with specific recognition and binding sites for the formation of a complex with a ligand (template)
Linker: molecular connection between two molecules or between a surface atom, surface molecule or a surface molecule group and another molecule. As a rule, linkers are commercially available as alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl chains, the chain being derivatized at two points with (identical or different) reactive groups. These groups form a covalent chemical bond in simple / known chemical reactions with the corresponding reaction partner. The reactive groups can also be photoactivatable, ie the reactive groups are only activated by light of certain or any wavelength. Preferred linkers are those of chain length 1-20, in particular chain length 1-14, the chain length here being the shortest continuous connection between the structures to be connected, that is to say between the two molecules or between a surface atom, a surface molecule or a surface molecule group and another Molecule
Spacer: Linker that is covalently attached to one or both of the structures to be connected (see linker) via the reactive groups. Preferred spacers are those of chain length 1-20, in particular chain length 1-14, the chain length being the shortest continuous connection between the structures to be connected

Modified surfaces / electrodes

Au-S-(CH₂)₂-ss-oligo-FP: Gold-Oberfläche mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus derivatisiertem Einzelstrang-Oligonukleotid. Hierbei ist die endständige Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3' Ende mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂S-S-(CH₂)₂-OH verestert, wobei die S-S Bindung homolytisch gespalten wird und je eine Au-S-R Bindung bewirkt. Am freien Ende trägt das Sonden-Oligonukleotid einen kovalent angebunden Fluorophor (FP) wie z. B. Cy3™, Cy5™, Texas Red®, Rhodamin 6 G, Fluorescein etc.
Au-S-(CH₂)₂-oligo-FP: Au-S-(CH₂)₂-ss-oligo-FP hybridisiert mit dem zu ss-oligo komplementären Oligonukleotid. Au-S- (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-FP: gold surface with covalently applied monolayer made of derivatized single-strand oligonucleotide. The terminal phosphate group of the oligonucleotide at the 3 'end is esterified with (HO- (CH ₂ ) ₂ -S) ₂ to PO- (CH ₂ ) ₂ SS- (CH ₂ ) ₂ -OH, the SS bond being cleaved homolytically and each causes an Au-SR bond. At the free end, the probe oligonucleotide carries a covalently linked fluorophore (FP) such as e.g. B. Cy3 ™, Cy5 ™, Texas Red®, Rhodamine 6 G, Fluorescein etc.
Au-S- (CH ₂ ) ₂ -oligo-FP: Au-S- (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-FP hybridizes with the oligonucleotide complementary to ss-oligo.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand- Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen, das als ersten Schritt das Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche umfasst. Die Modifikation der Oberfläche besteht dabei in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten, wobei die Ligaten durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind, wobei der Fluorophor mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht. Die weiteren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Bereitstellen einer Probe mit Liganden, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors und Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensität mit Referenzwerten. The present invention relates to a method for the detection of ligate ligand Association events by fluorescence quenching, the first step being the Providing a modified surface includes. Modification of the surface consists in the connection of at least one type of modified ligate, where the ligates are modified by binding at least one type of fluorophore, the fluorophore forms a reversible bond with the modified surface. The further steps of the method according to the invention are providing a sample with ligands, contacting the sample with the modified surface, detection the fluorescence of the fluorophore and comparison of the detected fluorescence intensity with reference values.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung von Substraten, Cofaktoren, Coenzymen, Proteinen, Enzymen, Antikörpern, Antigenen, Rezeptoren, Hormonen und Nukleinsäure-Oligomeren als Ligaten und/oder Liganden in einem Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz- Quenchen. The present invention also relates to the use of substrates, Cofactors, coenzymes, proteins, enzymes, antibodies, antigens, receptors, Hormones and nucleic acid oligomers as ligates and / or ligands in one Method for the detection of ligate-ligand association events by fluorescence Quenching.

Daneben umfasst die vorliegende Erfindung auch einen Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz- Quenchen. Der Kit umfasst eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten besteht, wobei die Ligaten durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind und wobei der Fluorophor durch Anbindung wenigstens einer chemischen Gruppe modifiziert ist, die mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht. In addition, the present invention also includes a kit for carrying out a Method for the detection of ligate-ligand association events by fluorescence Quenching. The kit includes a modified surface, the modification in the Connection of at least one type of modified ligate exists, the ligates are modified by binding at least one type of fluorophore and wherein the Fluorophore is modified by attachment of at least one chemical group which a reversible bond is formed with the modified surface.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensität mit Referenzwerten erforderlich. Diese Referenzwerte können aus vorangegangenen Messungen bereits vorliegen und brauchen daher im allgemeinsten Fall nicht im Laufe des erfindungsgemäßen Verfahrens detektiert werden. Da die Referenzwerte aber im Idealfall unter exakt den gleichen äußeren Bedingungen bestimmt werden sollen wie die eigentlichen Messwerte der Fluoreszenzintensitäten, wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nach dem Anlegen eines elektrischen Feldes und Einstellen einer definierten Stärke des elektrischen Feldes am Ort der modifizierten Ligaten und vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche eine erste Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors durchgeführt. Die so erhaltenen Werte werden dann als Referenzwerte verwendet. In the method according to the invention there is a comparison of the detected Fluorescence intensity with reference values required. These reference values can from previous measurements are already available and therefore need in most general case not detected in the course of the method according to the invention become. Ideally, however, since the reference values are under exactly the same external ones Conditions should be determined like the actual measured values of the Fluorescence intensities, according to a preferred embodiment of the present invention after applying an electric field and adjusting a defined strength of the electric field at the location of the modified ligates and a first before contacting the sample with the modified surface Detection of the fluorescence of the fluorophore was carried out. The values thus obtained are then used as reference values.

Alternativ können die Referenzwerte auch gleichzeitig mit den Messwerten der Fluoreszenzintensität bestimmt werden, also nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche. Dies kann auf zwei verschiedene Arten erfolgen. Alternatively, the reference values can also be measured at the same time as the Fluorescence intensity can be determined, i.e. after the sample has been brought into contact with the modified surface. This can be done in two different ways.

Entweder ist ein Bereich der modifizierten Oberfläche bekannt, der im wesentlichen keine Liganden trägt, oder es ist ein Bereich der modifizierten Oberfläche bekannt, der im wesentlichen ausschließlich Ligand/Ligat-Assoziate trägt. Es muss also im ersten Fall sichergestellt sein, dass in der Probe keinerlei Liganden anwesend sind, die mit den in dem besagten Bereich der modifizierten Oberfläche anwesenden Ligaten Ligat/Ligand-Assoziate ausbilden können. Im zweiten Fall muss umgekehrt sichergestellt sein, dass in der Probe eine ausreichende Menge an Liganden vorhanden sind, die mit im wesentlichen der ganzen Menge an in dem definierten Bereich anwesenden Ligaten Ligand/Ligat-Assoziate ausbilden. Die auf diese beiden Arten bestimmten Referenzwerte spiegeln die Fluoreszenzintensität bei 0% Assoziatbildung bzw. bei 100% Assoziatbildung wieder und können zur quantitativen Bestimmung der Assoziatbildung in den anderen Bereichen der modifizierten Oberfläche dienen. Either an area of the modified surface is known which is essentially does not carry any ligands, or a region of the modified surface is known which essentially only carries ligand / ligate associates. So it must be in the first If this is the case, ensure that no ligands are present in the sample that are associated with the ligates present in said area of the modified surface Can form ligate / ligand associates. In the second case, the other way round ensure that there is a sufficient amount of ligand in the sample that are with essentially all of the amount in the defined range the ligates / ligate associations present. That in these two ways certain reference values reflect the fluorescence intensity with 0% association formation or with 100% association formation again and can be used for the quantitative determination of the Association formation in the other areas of the modified surface serve.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die beiden beschriebenen Referenzmessungen durchgeführt. Es wird also nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche sowohl die Fluoreszenzintensität in einem Bereich der modifizierten Oberfläche bestimmt, der im wesentlichen keine Liganden trägt, als auch in einem Bereich der modifizierten Oberfläche, der im wesentlichen ausschließlich Ligand/Ligat-Assoziate trägt. Durch die Bestimmung der beiden Extremwerte ist eine quantitative Detektion mit höherer Genauigkeit erforderlich. Es versteht sich, dass in diesem Fall sich die Ligaten des ersten Bereiches von den Ligaten des zweiten Bereiches unterscheiden müssen. According to a particularly preferred embodiment of the present invention the two reference measurements described are carried out. So it gets after contacting the sample with the modified surface, both the Fluorescence intensity determined in a region of the modified surface, which in the carries essentially no ligands, as well as in a range of modified Surface which essentially only carries ligand / ligate associates. Through the The determination of the two extreme values is a quantitative detection with a higher one Accuracy required. It is understood that in this case the ligates of the must distinguish the first region from the ligates of the second region.

Sind an dem Fluorophor in seiner unmodifizierten Form keine Gruppen vorhanden, die mit der modifizierten Oberfläche eine ausreichende Bindungsfähigkeit aufweisen, so können auch modifizierte Fluorophore in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden also Fluorophore verwendet, die durch Anbindung wenigstens einer chemischen Gruppe modifiziert sind, wobei die chemische Gruppe mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht. If there are no groups on the fluorophore in its unmodified form, the have sufficient binding ability with the modified surface, so modified fluorophores can also be used in the process according to the invention become. According to a preferred embodiment, fluorophores used that are modified by linking at least one chemical group, where the chemical group with the modified surface is a reversible bond received.

Eine chemische Gruppe, die mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht, kann nicht nur direkt an den Fluorophor angebunden werden, sondern auch an den Ligaten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Ligaten verwendet, die zusätzlich durch Anbindung wenigstens einer chemischen Gruppe modifiziert sind, wobei die chemische Gruppe mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht. Besonders günstige Bedingungen zur Detektion der Differenz der Fluoreszenzintensität von Ligand/Ligat-Assoziaten und Ligaten bestehen dann, wenn der Fluorophor sich möglichst nahe an der modifizierten Oberfläche befindet. Diese Bedingung ist insbesondere dann erfüllt, wenn Ligaten verwendet werden, die zusätzlich durch Anbindung wenigstens einer chemische Gruppe modifiziert sind, wobei die chemische Gruppe mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht und die chemische Gruppe maximal durch 10 chemische Bindungen von dem Fluorophor getrennt ist. In diesem Fall befindet sich die chemische Gruppe also in räumlicher Nähe zu dem Fluorophor, womit sich wiederum nach Ausbildung der reversiblen Bindung zwischen chemischer Gruppe und modifizierter Oberfläche der Fluorophor in räumlicher Nähe zu der modifizierten Oberfläche befindet. A chemical group that has a reversible bond with the modified surface not only can be attached directly to the fluorophore, but also to the ligates. According to a preferred embodiment of the present invention ligates are used which are additionally linked by binding at least one chemical group are modified, the chemical group with the modified Reversible bond surface. Particularly favorable conditions for Detection of the difference in fluorescence intensity of ligand / ligate associates and Ligates exist when the fluorophore is as close as possible to the modified one Surface. This condition is especially true when ligates are used, which are additionally connected by linking at least one chemical Group are modified, the chemical group with the modified surface a reversible bond is formed and the chemical group by a maximum of 10 chemical bonds are separated from the fluorophore. In this case there is chemical group in close proximity to the fluorophore, which in turn after formation of the reversible bond between chemical group and modified surface of the fluorophore in close proximity to the modified Surface.

Besonders günstige Bedingungen sind dann zu erwarten, wenn die modifizierte Oberfläche zusätzlich durch Anbindung von chemischen Gruppen modifiziert ist und zugleich die Ligaten mit chemischen Gruppen modifiziert sind, weil dann die an die Oberfläche gebundenen chemischen Gruppen mit den an den Ligaten angebundenen chemischen Gruppen eine reversible Bindung eingehen können. Particularly favorable conditions can be expected if the modified Surface is additionally modified by linking chemical groups and at the same time the ligates are modified with chemical groups, because then those to the Surface bound chemical groups with those bound to the ligates chemical groups can form a reversible bond.

The quench surface

Mit dem Begriff "Oberfläche" wird jedes Trägermaterial bezeichnet, das geeignet ist, direkt oder nach entsprechender chemischer Modifizierung Fluorophor-derivatisierte Ligaten zu tragen, die kovalent an der Oberfläche immobilisiert sind und deren Fluoreszenz nahe an der Oberfläche (in ca. 1 bis 50 Angstrom Abstand zur Oberfläche) durch Fluoreszenzlöschung (strahlungsloser Energietransfer zwischen dem Fluorophor als Emitter und der Oberfläche als Absorber) signifikant (> 10% der erwarteten Fluoreszenzintensität des Fluorophors in Abwesenheit der Oberfläche bei ansonsten gleichen Bedingungen) reduziert wird. Insbesondere sind Gold und Silber als Quench- Oberflächenmaterial geeignet. Die Bezeichnung Oberfläche ist unabhängig von den räumlichen Dimensionen der Oberfläche und beinhaltet auch Nanopartikel (Partikel oder Cluster aus wenigen einzelnen bis mehreren hunderttausend Oberflächen-Atomen oder -Molekülen). Die Oberfläche kann zusätzlich an einen festen Träger wie z. B. Glas, Metall oder Plastik gebunden vorliegen. The term “surface” denotes any carrier material that is suitable fluorophore-derivatized directly or after appropriate chemical modification To wear ligates that are covalently immobilized on the surface and their Fluorescence close to the surface (approx. 1 to 50 angstroms from the surface) by quenching fluorescence (radiation-free energy transfer between the fluorophore as emitter and the surface as absorber) significantly (> 10% of the expected Fluorescence intensity of the fluorophore in the absence of the surface otherwise same conditions) is reduced. In particular, gold and silver are quenched Suitable surface material. The designation is independent of the surface spatial dimensions of the surface and also includes nanoparticles (particles or clusters of a few single to several hundred thousand surface atoms or molecules). The surface can also be attached to a solid support such. B. glass, Metal or plastic bound.

Binding of the ligate to the surface

Verfahren zur Immobilisierung von Ligat-Molekülen, insbesondere Biopolymeren wie Nukleinsäure-Oligomeren oder Antigenen bzw. Antikörpern an einer Oberfläche sind dem Fachmann bekannt. Die Immobilisierung kann z. B. kovalent über Hydroxyl-, Epoxid-, Amino-, oder Carboxygruppen des Trägermaterials mit natürlicherweise am Ligat vorhandenen oder durch Derivatisierung am Ligat angebrachten Thiol-, Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppen erfolgen. Der Ligat kann direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche verbunden werden. Daneben kann der Ligat durch die bei Immunoassays üblichen Methoden verankert werden wie z. B. durch Verwendung von biotinylierten Ligaten zur nichtkovalenten Immobilisierung an Avidin oder Streptavidin-modifizierten Oberflächen. Bei Verwendung von Nukleinsäure-Oligomeren als Ligaten kann die chemische Modifikation der Sonden-Nukleinsäure-Oligomere mit einer Oberflächen-Ankergruppe bereits im Verlauf der automatisierten Festphasensynthese oder aber in gesonderten Reaktionsschritten eingeführt werden. Dabei wird auch das Nukleinsäure-Oligomer direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf verschiedene, aus dem Stand der Technik bekannten Arten durchgeführt werden (vgl. z. B. Hartwich, G.: ELEKTROCHEMISCHE DETEKTION VON SEQUENZSPEZIFISCHEN NUKLEINSÄUREOLIGOMERHYBRIDISIERUNGSEREIGNISSEN (1999), WO 00/42217). Process for immobilizing ligate molecules, especially biopolymers such as Nucleic acid oligomers or antigens or antibodies are on a surface known to the expert. The immobilization can e.g. B. covalently via hydroxyl, Epoxy, amino, or carboxy groups of the carrier material with naturally on Ligate present or attached to the ligate by derivatization of thiol, hydroxy, Amino or carboxyl groups take place. The ligate can be directly or via a Linker / spacer connected to the surface atoms or molecules of a surface become. In addition, the ligate can be made using the methods customary in immunoassays be anchored such as B. by using biotinylated ligates noncovalent immobilization on avidin or streptavidin-modified surfaces. at Use of nucleic acid oligomers as ligates can modify the chemical of the probe nucleic acid oligomers with a surface anchor group already in the Course of automated solid phase synthesis or in separate Reaction steps are introduced. It also becomes the nucleic acid oligomer directly or via a linker / spacer with the surface atoms or molecules of one Surface of the type described above linked. This bond can be on various types known from the prior art are carried out (cf. z. B. Hartwich, G .: ELECTROCHEMICAL DETECTION OF SEQUENCE-SPECIFIC NUCLEIC ACID OLIGOMER HYBRIDIZATION EVENTS (1999), WO 00/42217).

Ligands (targets)

Als Liganden werden Moleküle bezeichnet, die spezifisch mit dem an einer Oberfläche immobilisierten Ligaten (Sonde) unter Ausbildung eines Komplexes wechselwirken. Beispiele von Liganden im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme als Komplexbindungspartner eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Komplexbindungspartner eines Antigens), Antigene (als Komplexbindungspartner eines Antikörpers), Rezeptoren (als Komplexbindungspartner eines Hormons), Hormone (als Komplexbindungspartner eines Rezeptors) oder Nukleinsäure-Oligomere (als Komplexbindungspartner des komplementären Nukleinsäure-Oligomers). Molecules are referred to as ligands that are specific to those on a surface immobilized ligates (probe) interact to form a complex. Examples of ligands in the sense of the present invention are substrates, cofactors or coenzymes as complex binding partners of a protein (enzyme), antibodies (as Complex binding partner of an antigen), antigens (as complex binding partner of an Antibody), receptors (as a complex binding partner of a hormone), hormones (as Complex binding partner of a receptor) or nucleic acid oligomers (as Complex binding partner of the complementary nucleic acid oligomer).

fluorophores

Als Fluorophore werden kommerziell erhältliche Fluoreszenzfarbstoffe wie z. B. Texas Red®, Rhodamin-Farbstoffe, Cyaninfarbstoffe wie z. B. Cy3™, Cy5™, Fluorescein etc. (vgl. Fluka, Amersham und Molecular Probes Katalog) verwendet. As fluorophores, commercially available fluorescent dyes such. B. Texas Red®, rhodamine dyes, cyanine dyes such as B. Cy3 ™, Cy5 ™, Fluorescein etc. (see Fluka, Amersham and Molecular Probes catalog).

fluorescence quenching

Mit Fluoreszenzlöschung wird die Deaktivierung einer elektronisch angeregten Spezies über einen strahlungslosen Prozess bezeichnet. Die Deaktivierung kann durch Stöße oder auch durch strahlungslose Energieübertragung auf Metalle erfolgen. Die freiwerdende Energie wird als thermische Energie dissipiert. Gold ist ein Beispiel für ein Metall, das die Fähigkeit zur Fluoreszenzlöschung besitzt. Die Löschung weist eine starke Abhängigkeit vom Abstand des Fluorophors von der als Fluoreszenzlöscher fungierenden Oberfläche auf (umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Abstands). Der Effekt der Fluoreszenzlöschung ist daher nur bei Abständen kleiner 100 bis 200 Å messbar. Im Bereich größer als ca. 200 Å führen weitere Abstandsänderungen nicht mehr zu einer messbaren Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Fluorescence quenching is the deactivation of an electronically excited species referred to as a radiationless process. Deactivation can be caused by bumps or also by radiation-free energy transfer to metals. The released energy is dissipated as thermal energy. Gold is an example of one Metal that has the ability to quench fluorescence. The deletion has one strong dependence on the distance of the fluorophore from that as a fluorescence quencher acting surface (inversely proportional to the sixth power of the Distance). The effect of fluorescence quenching is therefore only at distances less than 100 measurable up to 200 Å. In the area larger than approx. 200 Å there are others Distance changes no longer lead to a measurable increase in Fluorescence intensity.

Brief description of the drawings

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen In the following, the invention will be described in connection with exemplary embodiments are explained in more detail with the drawings. Show it

Fig. 1 eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen mittels "Molecular Beacons"; Fig. 1 is a schematic representation of the detection of nucleic acid oligomer hybridization events by means of "molecular beacons";

Fig. 2 eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch spezifische Wechselwirkungen zwischen Gruppen am Fluorophor und der modifizierten Oberfläche. Bezugszeichenliste 101 Sonde in Form einer Haarnadel ("hairpin")
102 Fluorophor
103 Fluoreszenz-Löscher
104 Target
105 Fluoreszenzlöschung
106 Fluoreszenz
201 einsträngige Oligomer-Sonde
202 Sonde hybridisiert mit Target
203 Oberfläche (z. B. Gold)
204 Abstand des Fluorophor zur Goldoberfläche vor der Hybridisierung
205 Abstand des Fluorophor zur Goldoberfläche nach der Hybridisierung
206 Molekülgruppe am Fluorophor, die spezifische Wechselwirkungen mit entsprechenden Gruppen an der Oberfläche eingeht
207 Molekülgruppe an der Oberfläche, die spezifische Wechselwirkungen mit entsprechenden Gruppen am Fluorophor eingeht

Fig. 2 is a schematic representation of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by specific interactions between groups on the fluorophore and the modified surface. Reference Signs List 101 probe in the form of a hairpin ( "hairpin")
102 fluorophore
103 fluorescence quencher
104 target
105 fluorescence quenching
106 fluorescence
201 single-stranded oligomer probe
202 probe hybridizes to target
203 surface (e.g. gold)
204 Distance of the fluorophore to the gold surface before hybridization
205 Distance of the fluorophore to the gold surface after hybridization
206 molecular group on the fluorophore, which interacts specifically with corresponding groups on the surface
207 surface molecular group that interacts specifically with corresponding groups on the fluorophore

Die Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der aus dem Stand der Technik bekannten Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen mittels "Molecular Beacons". Die einsträngigen Oligonukleotide weisen eine Haarnadelstruktur 101 (hairpin, stem-and-loop) auf, tragen am einen Ende der Sequenz einen Fluorophor 102 (z. B. Fluorescein, TexasRed®) und am anderen Ende der Sequenz einen geeigneten Fluoreszenzlöscher 103 (z. B. DABCYL). Durch die spezielle geometrische Anordnung befinden sich die fluoreszierende Gruppe und die Einheit, die zur Löschung der Fluoreszenz führt, in räumlicher Nähe zueinander. Daher zeigen die Sonden nur eine äußerst geringe Fluoreszenz. In Gegenwart der entsprechenden zur Sequenz der Schlinge (loop) komplementären Sequenz 104 (Target) erfolgt die Hybridisierung in diesem Bereich. Dies führt zu einer Änderung der Konformation und zur Trennung von Fluorophor und Quencher, was als starke Zunahme der Fluoreszenz 106 beobachtet werden kann. Fig. 1 shows a schematic representation of the known prior art detecting nucleic acid oligomer hybridization events by means of "molecular beacons". The single-stranded oligonucleotides have a hairpin structure 101 (hairpin, stem-and-loop) to bear at one end of the sequence a fluorophore 102 (eg., Fluorescein, TexasRed®) and for a suitable quencher 103 (at the other end of the sequence. B. DABCYL). Due to the special geometric arrangement, the fluorescent group and the unit that leads to the quenching of the fluorescence are located in close proximity to one another. Therefore the probes show only an extremely low fluorescence. In the presence of the corresponding sequence 104 (target) complementary to the sequence of the loop, the hybridization takes place in this area. This leads to a change in the conformation and the separation of fluorophore and quencher, which can be observed as a strong increase in fluorescence 106 .

Die Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure- Oligomer-Hybridisierungsereignissen durch spezifische Wechselwirkungen zwischen Gruppen 206 am Fluorophor 102 und der modifizierten Oberfläche. Durch spezifische Wechslwirkungen zwischen Gruppen 206 am Fluorophor 102 und entsprechenden Gruppen 207 an der Oberfläche 203 liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure- Oligomer 201 in einer komprimierten Form vor. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) vergrößert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül 102 und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche 203. Dadurch kommt es zu einer starken Zunahme der Fluoreszenzintensität (siehe Balkendiagramm der Fig. 2). FIG. 2 shows a schematic illustration of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by specific interactions between groups 206 on the fluorophore 102 and the modified surface. Due to specific interactions between groups 206 on fluorophore 102 and corresponding groups 207 on surface 203 , single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is in a compressed form. The hybridization with the complementary nucleic acid oligomer strand 202 (target) increases the distance 205 between the fluorescent dye molecule 102 and the metal surface 203 functioning as a quencher. This leads to a strong increase in the fluorescence intensity (see bar diagram in FIG. 2).

Ways of Carrying Out the Invention

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion von Ligat/Ligand Assoziaten am Beispiel der Nukleinsäure-Hybridisierung (Ligat: Sonden-Oligonukleotid, Ligand: zum Sonden-Oligonukleotid komplementäres DNA-Teilstück) erläutert. Das geschilderte Verfahren ist für den Fachmann ohne weiteres auf die Detektion anderer Ligat/Ligand-Assoziate, wie sie im Abschnitt "Liganden/Signal-Liganden" erwähnt wurden, zu übertragen. The following is the method according to the invention for the detection of ligate / ligand Associates using the example of nucleic acid hybridization (ligate: probe oligonucleotide, Ligand: DNA section complementary to the probe oligonucleotide explained. The For the person skilled in the art, the described method is readily based on the detection of others Ligate / ligand associates as mentioned in the section "Ligands / Signal Ligands" were transferred.

Um die Vorteile der DNA-Chip-Technologie auf die Detektion von Nukleinsäure- Oligomer-Hybriden durch Modulation des Fluoreszenzquenchens anzuwenden, werden verschiedene modifizierte Nukleinsäure-Oligomer-Sonden unterschiedlicher Sequenz mit den oben beschriebenen Immobilisierungstechniken an einen Träger gebunden. Mit der Anordnung der Nukleinsäure-Oligomer-Sonden bekannter Sequenz an jeder Position der Oberfläche, einem DNA-Array, soll das Hybridisierungsereignis eines beliebigen Target-Nukleinsäure-Oligomers oder einer (fragmentierten) Target-DNA detektiert werden, um z. B. Mutationen im Target aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer Oberfläche die Oberflächenatome oder -moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-/RNA-/PNA- Nukleinsäure-Oligomeren bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. In einer allgemeinsten Ausführungsform kann der DNA-Chip auch mit einem einzigen Sonden-Oligonukleotid derivatisiert werden. Als Sonden-Nukleinsäure- Oligomere werden Nukleinsäure-Oligomere (z. B. DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 50, bevorzugt der Länge 5 bis 40, besonders bevorzugt der Länge 12 bis 30 verwendet. To reap the benefits of DNA chip technology on the detection of nucleic acid Apply oligomeric hybrids by modulating fluorescence quenching various modified nucleic acid oligomer probes of different sequences bound to a support using the immobilization techniques described above. With the arrangement of the nucleic acid oligomer probes of known sequence on each Position of the surface, a DNA array, is said to be the hybridization event of a any target nucleic acid oligomer or a (fragmented) target DNA be detected in order to e.g. B. to detect mutations in the target and sequence-specific demonstrated. For this purpose, the surface atoms or -molecules of a defined area (a test site) with DNA- / RNA- / PNA- Nucleic acid oligomers of known but any sequence, as described above, connected. In a most general embodiment, the DNA chip can also be used with a single probe oligonucleotide can be derivatized. As probe nucleic acid Oligomers become nucleic acid oligomers (e.g. DNA, RNA or PNA fragments) the base length 3 to 50, preferably the length 5 to 40, particularly preferably the length 12 to 30 used.

An den so bereitgestellten Oberflächen mit immobilisierten und Fluorophor-markierten Sonden-Oligonukleotiden wird in einer Referenzmessung, z. B. mit einem Fluoreszenz- Scanner, die Fluoreszenzintensität der Fluorophor-markierten Sonden-Oligonukleotide im einsträngigen Zustand bestimmt. On the surfaces thus provided with immobilized and fluorophore-labeled Probe oligonucleotides are measured in a reference measurement, e.g. B. with a fluorescent Scanner, the fluorescence intensity of the fluorophore-labeled probe oligonucleotides determined in the single-stranded state.

Im nächsten Schritt wird die (möglichst konzentrierte) Untersuchungslösung mit Target- Oligonukleotid(en) zur Oberfläche mit immobilisierten Sonden-Oligonukleotiden gegeben. Dabei kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Target-Nukleinsäure-Oligomer-Stränge enthält, die zu den an die Oberfläche gebundenen Sonden-Nukleinsäure-Oligomeren komplementär oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind. In the next step, the (as concentrated as possible) test solution with target Oligonucleotide (s) to the surface with immobilized probe oligonucleotides given. Hybridization only occurs in the case where the solution Contains target nucleic acid oligomer strands leading to the surface bound probe nucleic acid oligomers complementary or at least in wide Areas are complementary.

Nach der Hybridisierung zwischen Sonde und Target wird in einer zweiten Fluoreszenzmessung die Fluoreszenzintensität im hybridisierten, doppelsträngigen Zustand bestimmt. After the hybridization between probe and target is carried out in a second Fluorescence measurement the fluorescence intensity in the hybridized, double-stranded Condition determined.

Aufgrund der Hybridisierung von Sonden-Nukleinsäure-Oligomer und dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang (Target) verändert sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Aufgrund des veränderten Abstandes erfährt auch das Ausmaß des Quench-Vorgangs und damit die Intensität der Fluoreszenz eine starke Änderung. Somit kann ein sequenzspezifisches Hybridisierungsereignis durch fluoreszenzbasierte Verfahren wie z. B. Fluoreszenzmikroskopie oder Messungen mit Fluoreszenz-Scanner detektiert werden. Because of the hybridization of probe nucleic acid oligomer and the related complementary nucleic acid oligomer strand (target) changes the distance between the fluorescent dye molecule and the one that acts as a quencher Metal surface. Due to the changed distance, the extent of the Quench process and thus the intensity of the fluorescence a major change. Thus, a sequence-specific hybridization event by fluorescence-based Methods such as B. fluorescence microscopy or measurements with fluorescence scanner can be detected.

Die Differenz aus Referenzmessung und zweiter Messung je Test-Site ist proportional zur Anzahl der ursprünglich in der Untersuchungslösung für das jeweilige Test-Site vorhandenen komplementären (bzw. in weiten Bereichen komplementären) Target- Oligonukleotide. The difference between the reference measurement and the second measurement per test site is proportional the number of originally in the test solution for the respective test site existing complementary (or in many areas complementary) target Oligonucleotides.

Gemäß einem alternativen Verfahren kann die Referenzmessung weggelassen werden, wenn die Größe des Referenzsignals vorher (z. B. durch vorausgegangene Messungen etc.) hinlänglich genau bekannt ist. According to an alternative method, the reference measurement can be omitted, if the size of the reference signal has been measured beforehand (e.g. by previous measurements etc.) is sufficiently well known.

Durch spezifische Wechselwirkungen zwischen Gruppen am Farbstoff, die natürlicherweise bereits am Farbstoff vorhanden sind oder die durch eine chemische Modifikation eingeführt werden, und der (gegebenenfalls modifizierten) Oberfläche kann eine bestimmte geometrische Anordnung des Sonden-Nukleinsäure-Oligomers relativ zur modifizierten Oberfläche erreicht werden. Durch das Anbringen von geeigneten Molekülgruppen am Farbstoff (z. B. komplexierende Gruppen wie Bipyridyl-Gruppen oder Diamino-Gruppen), die eine unter geeigneten Bedingung stabile spezifische Wechselwirkung (z. B. Komplexbildung) mit entsprechenden Gruppen an der Oberfläche eingehen können, lässt sich eine geometrische Anordnung realisieren, bei der der Fluorophor im nichthybridisierten Zustand nahe an der Oberfläche vorliegt. Vor der Hybridisierung liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer also in einer Form vor, die durch einen geringen Abstand von Fluorophor und quenchender Metalloberfläche charakterisiert ist (geringe Fluoreszenzintensität). Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang (Target) verändert sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche dahingehend, dass es durch die Vergrößerung des Abstands zu einer Verringerung des Quenchen kommt und eine höhere Intensität der Fluoreszenz nach der Hybridisierung beobachtet werden kann (siehe Fig. 2). A specific geometric arrangement of the probe nucleic acid oligomer relative to the modified surface can be achieved through specific interactions between groups on the dye which are naturally already present on the dye or which are introduced by chemical modification and the (optionally modified) surface. By attaching suitable molecular groups to the dye (e.g. complexing groups such as bipyridyl groups or diamino groups), which can enter into a specific interaction that is stable under suitable conditions (e.g. complex formation) with corresponding groups on the surface a geometric arrangement is realized in which the fluorophore is present in the non-hybridized state close to the surface. Before hybridization, the single-stranded probe nucleic acid oligomer is therefore in a form which is characterized by a small distance between the fluorophore and the quenching metal surface (low fluorescence intensity). Through the hybridization with the complementary nucleic acid oligomer strand (target), the distance between the fluorescent dye molecule and the metal surface acting as quencher changes in such a way that the increase in the distance leads to a reduction in quenching and a higher intensity of the fluorescence can be observed after hybridization (see FIG. 2).

embodiments

Die n Nukleotide (nt) lange Nukleinsäure-Sonde (DNA, RNA oder PNA, z. B. ein 20 Nukleotide langes Oligo) ist in der Nähe eines ihrer Enden (3'- oder 5'-Ende) direkt oder über einen (beliebigen) Spacer mit einer reaktiven Gruppe zur kovalenten Verankerung an der Oberfläche versehen, z. B. als 3'-Thiol-modifiziertes Sonden-Oligonukleotid, bei dem die endständige Thiolmodifikation als reaktive Gruppe zur Anbindung an Gold dient. Weitere kovalente Verankerungsmöglichkeiten ergeben sich z. B. aus aminmodifiziertem Ligat-Oligonukleotid, das zur Verankerung an oberflächlich gebundene Carbonsäurefunktionen (z. B. über säurefunktionalisierte Thiole wie Mercaptopropionsäure und eine Aktivierung z. B. als Aktivester) verwendet wird. In der Nähe des anderen Terminus des Sondenoligonukleotids ist ein Fluorophor kovalent angebunden (vgl. Beispiel 1), der mit einer funktionellen Gruppe (z. B. einer Fettsäure, einer Bipyridyl-Gruppe oder einer Diamino-Gruppe) modifiziert ist. Die so modifizierte Nukleinsäure-Sonde wird

a) in Puffer (z. B. 10-500 mM Phosphat-Puffer, pH = 7,1 mM EDTA) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche angebunden oder
b) in Gegenwart eines bifunktionalen Linkers (z. B. einer geeigneten Diaminothiolverbindung oder einer als Aktivester aktivierten Mercaptopropionsäure und anschließender Reaktion mit einer entsprechenden Triaminoverbindung) in Puffer (z. B. 100 mM Phosphat-Puffer, pH = 7,1 mM EDTA, 0,1-1 M NaCl) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers gemeinsam mit dem bifunktionalen Linker an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche angebunden, wobei darauf geachtet wird, dass genügend bifunktionaler Linker geeigneter Kettenlänge zugesetzt wird (etwa 0.1 bis 10 facher Überschuss), um zwischen den einzelnen Sonden-Oligonukleotiden genügend Freiraum für eine Hybridisierung mit den Signal-Liganden bzw. dem Target-Oligonukleotid zur Verfügung zu stellen oder
c) in Puffer (z. B. 10-350 mM Phosphat-Puffer, pH = 7,1 mM EDTA) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche angebunden und anschließend wird die so modifizierte Oberfläche mit dem entsprechenden bifunktionalen Linker in Lösung (z. B. einer geeigneten Diaminothiolverbindung oder einer als Aktivester aktivierten Mercaptopropionsäure und anschließender Reaktion mit einer entsprechenden Triaminoverbindung in Phosphat-Puffer/EtOH- Mischungen bei Thiol-modifizierten Sondenoligonukleotiden) in Kontakt gebracht, wobei der bifunktionale Linker über seine reaktive Gruppe an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche anbindet (vgl. Abschnitt "Bindung des Ligaten an die Oberfläche").

The n nucleotide (nt) long nucleic acid probe (DNA, RNA or PNA, e.g. a 20 nucleotide long oligo) is near one of its ends (3 'or 5' end) directly or via one (any ) Provide spacers with a reactive group for covalent anchoring to the surface, e.g. B. as a 3'-thiol-modified probe oligonucleotide, in which the terminal thiol modification serves as a reactive group for binding to gold. Other covalent anchoring options arise e.g. B. from amine-modified ligate oligonucleotide, which is used for anchoring to surface-bonded carboxylic acid functions (z. B. via acid-functionalized thiols such as mercaptopropionic acid and an activation z. B. as an active ester). In the vicinity of the other terminus of the probe oligonucleotide, a fluorophore is covalently attached (see Example 1), which is modified with a functional group (e.g. a fatty acid, a bipyridyl group or a diamino group). The nucleic acid probe modified in this way is

a) dissolved in buffer (for example 10-500 mM phosphate buffer, pH = 7.1 mM EDTA) brought into contact with the surface and there via the reactive group of the probe nucleic acid oligomer to the - if appropriate derivatized - surface tied up or
b) in the presence of a bifunctional linker (e.g. a suitable diaminothiol compound or a mercaptopropionic acid activated as an active ester and subsequent reaction with a corresponding triamino compound) in buffer (e.g. 100 mM phosphate buffer, pH = 7.1 mM EDTA, 0.1-1 M NaCl) dissolved in contact with the surface and bonded there via the reactive group of the probe nucleic acid oligomer together with the bifunctional linker to the - if appropriate derivatized - surface, taking care that sufficient bifunctional linkers are more suitable Chain length is added (about 0.1 to 10-fold excess) in order to provide sufficient space between the individual probe oligonucleotides for hybridization with the signal ligands or the target oligonucleotide or
c) dissolved in buffer (for example 10-350 mM phosphate buffer, pH = 7.1 mM EDTA) brought into contact with the surface and there via the reactive group of the probe nucleic acid oligomer to the - if appropriate derivatized - surface attached and then the surface modified in this way with the corresponding bifunctional linker in solution (e.g. a suitable diaminothiol compound or a mercaptopropionic acid activated as an active ester and subsequent reaction with a corresponding triamino compound in phosphate buffer / EtOH mixtures in the case of thiol-modified probe oligonucleotides) brought into contact, wherein the bifunctional linker binds via its reactive group to the surface, which may be correspondingly derivatized (see section "binding of the ligate to the surface").

Die (Rest-) Fluoreszenz des Fluorophors am Sonden-Oligonukleotid wird durch ein geeignetes Verfahren detektiert, z. B. durch Fluoreszenzmessung mit einem Fluoreszenz-Scanner unter Nutzung spezifischer Wechselwirkungen zwischen funktionellen Gruppen am Farbstoff und gegebenenfalls entsprechend funktionalisierten Gruppen an der Goldoberfläche. Eine Ausführungsform sind z. B. am Farbstoffmolekül oder in dessen Nähe angebrachte Bipyridyl-Gruppen, die mit der Goldoberfläche unter geeigneten Bedingungen relativ stabile Wechselwirkungen eingehen. Eine weitere Ausführungsform sind am Farbstoffmolekül oder in dessen Nähe angebrachte Diaminogruppen, die über eine durch Kupfer(II) oder Nickel(II) erzeugte Komplexbindung an entsprechende an der Goldoberfläche angebrachte Diaminogruppen eine relativ stabile Wechselwirkung eingehen. The (residual) fluorescence of the fluorophore on the probe oligonucleotide is indicated by a suitable method is detected, e.g. B. by fluorescence measurement with a Fluorescence scanner using specific interactions between functional groups on the dye and, if appropriate, accordingly functionalized groups on the gold surface. An embodiment are e.g. B. on Dye molecule or bipyridyl groups attached in the vicinity, with the Gold surface relatively stable interactions under suitable conditions received. Another embodiment is on or in the dye molecule Nearby diamino groups, which are connected by a copper (II) or nickel (II) generated complex bond to appropriate attached to the gold surface Diamino groups enter into a relatively stable interaction.

Eine weitere Ausführungsform sind am Farbstoffmolekül angebrachte hydrophobe Alkylketten (z. B. über Anbindung einer Fettsäure), die über hydrophobe Wechselwirkungen mit der ebenfalls hydrophoben Goldoberfläche relativ stabile Wechselwirkungen eingehen. Another embodiment is hydrophobic attached to the dye molecule Alkyl chains (e.g. via attachment of a fatty acid) via hydrophobic Interactions with the also hydrophobic gold surface are relatively stable Enter into interactions.

Anschließend wird das gelöste Target zugegeben, potentielle Hybridisierungsereignisse werden unter geeigneten, dem Fachmann bekannten Bedingungen ermöglicht (beliebige, frei wählbare Stringenzbedingungen der Parameter Potential/Temperatur/Salz/chaotrope Salze etc. für die Hybridisierung) und die Messung zur Detektion des Fluorophors wiederholt. The dissolved target is then added, potential hybridization events are made possible under suitable conditions known to those skilled in the art (any freely selectable stringency conditions for the parameters Potential / temperature / salt / chaotropic salts etc. for hybridization) and the measurement repeated for detection of the fluorophore.

Der Unterschied im Messsignal (Zunahme der Fluoreszenzintensität nach der Hybridisierung, vgl. Fig. 2) ist proportional zur Anzahl der Hybridisierungsereignisse zwischen Sonden-Nukleinsäureoligomer auf der Oberfläche und passendem Target- Nukleinsäure-Oligomer in der Untersuchungslösung. The difference in the measurement signal (increase in fluorescence intensity after hybridization, cf. FIG. 2) is proportional to the number of hybridization events between probe nucleic acid oligomer on the surface and suitable target nucleic acid oligomer in the test solution.

Das beschriebene Verfahren kann für eine Targetart (z. B. eine bestimmte Targetoligonukleotid-Art mit bekannter Sequenz) an einer Oberfläche oder - bei Verwendung verschiedener Sonden-Arten je Test-Site - für mehrere Target-Arten (gleiche Ligandengruppen wie z. B. mehrere verschiedene Target-Oligonukleotid-Arten oder verschiedene Antikörper-Arten, Antigen-Arten etc., aber auch Mischungen davon) angewendet werden. The described method can be used for a target type (e.g. a specific one Target oligonucleotide type with known sequence) on a surface or - at Use of different probe types per test site - for several target types (same ligand groups as e.g. several different target oligonucleotide types or different antibody types, antigen types etc., but also mixtures thereof) be applied.

example 1 Representation of the amino-modified oligonucleotides for anchoring on modified Gold surfaces as ligate or probe oligonucleotides

Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid- Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 µmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 M Iodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Der Amino- Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird in die Sequenzen mit den jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT-Kationen-Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt. The oligonucleotides are synthesized in an automatic oligonucleotide Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA / RNA synthesizer) according to the manufacturer recommended synthesis protocols for a 1.0 µmol synthesis. With the syntheses with the 1-O-dimethoxytrityl-propyl-disulfide-CPG carrier (Glen Research 20-2933) The oxidation steps are performed with a 0.02 M iodine solution to make an oxidative Avoid cleavage of the disulfide bridge. Modifications to the 5 'position of the Oligonucleotides are carried out with a coupling step that is extended to 5 min. The amino Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) is included in the sequences with the respective Standard protocol built in. The coupling efficiencies are during the synthesis online via the DMT cation concentration photometrically or conductometrically certainly.

Die Oligonukleotide werden mit konzentriertem Ammoniak (30%) bei 37°C 16 h entschützt. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt mittels RP-HPL Chromatographie nach Standardprotokollen (Laufmittel: 0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer, Acetonitril), die Charakterisierung mittels MALDI-TOF MS. Die aminmodifizierten Oligonukleotide werden mit an die entsprechenden aktivierten Fluorophore (z. B. Fluoresceinisothiocyanat) gemäß dem Fachmann bekannten Bedingungen gekoppelt. Die Kopplung kann sowohl vor als auch nach der Anbindung der Oligonukleotide an die Oberfläche erfolgen. The oligonucleotides are concentrated ammonia (30%) at 37 ° C for 16 h deprotected. The oligonucleotides are purified using RP-HPL chromatography according to standard protocols (eluent: 0.1 M triethylammonium acetate buffer, Acetonitrile), characterization using MALDI-TOF MS. The amine modified Oligonucleotides are attached to the corresponding activated fluorophores (e.g. Fluoresceinisothiocyanat) coupled according to conditions known to those skilled in the art. The coupling can take place both before and after the oligonucleotides have been attached to the Surface.

Example 2 Representation of the fluorophore-modified oligonucleotides for anchoring modified gold surfaces as ligate or probe oligonucleotides

Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid- Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 µmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 M Iodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Die Fluorophore werden am Synthesizer beim vorletzten Kopplungsschritt als Phosphoramidite (Fluorescein-Phosphoramidite Glen Research 10-1963) in die Sequenzen mit dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird beim letzten Kopplungsschritt in die Sequenzen mit den jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT-Kationen-Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt. The oligonucleotides are synthesized in an automatic oligonucleotide Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA / RNA synthesizer) according to the manufacturer recommended synthesis protocols for a 1.0 µmol synthesis. With the syntheses with the 1-O-dimethoxytrityl-propyl-disulfide-CPG carrier (Glen Research 20-2933) The oxidation steps are performed with a 0.02 M iodine solution to make an oxidative Avoid cleavage of the disulfide bridge. Modifications to the 5 'position of the Oligonucleotides are carried out with a coupling step that is extended to 5 min. The Fluorophores are shown on the synthesizer in the penultimate coupling step as Phosphoramidites (Fluorescein-Phosphoramidites Glen Research 10-1963) in the Sequences built in with the respective standard protocol. The amino modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) is in the last coupling step in the sequences with the respective standard protocol installed. The coupling efficiencies are increased during the Synthesis online via the DMT cation concentration photometrically or determined by conductometry.

Anschließend wird an die Aminogruppe eine Fettsäure oder eine Ethylendiamin- Funktion (z. B. als Ethylendiamin-N,N'-diessigsäure) oder die Bipyridyl-Gruppe (z. B. als 2,2' Bipyridin-4,4'dicarbonsäure) über entsprechende Aktivester-Verfahren angebunden. A fatty acid or an ethylenediamine is then added to the amino group. Function (e.g. as ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) or the bipyridyl group (e.g. as 2,2 'bipyridine-4,4'dicarboxylic acid) via appropriate active ester processes tethered.

Example 3 Preparation of the oligonucleotide electrode Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-FP

Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S- S-(CH₂)₂-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist ein Fluorophor und eine Ethylendiamin-Gruppe (vgl. Bsp. 2) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5 × 10^-5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) mit Zusatz von ca. 10^-5 bis 10^-1 molarer Diaminothiol-Verbindung (oder anderen geeigneten Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge wie z. B. als Aktivester aktivierte Mercaptopropionsäure, an die anschließend eine Triamino-Gruppe angekoppelt wird) 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH₂)₂-S-S- (CH₂)₂-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au- Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxymercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie bifunktionelle Thiol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt). Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein. The quench surface (here: gold plate) is treated with a double-modified 20 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is marked with (HO- (CH ₂ ) ₂ -S) ₂ esterified to PO- (CH ₂ ) ₂ -S- S- (CH ₂ ) ₂ -OH; modification 2: at the 5 'end is a fluorophore and an ethylenediamine group (cf. Example 2) built in according to the respective standard protocol) in 5 × 10 ^-5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) with addition of approx. 10 ^-5 to 10 ^-1 molar diaminothiol compound (or other suitable thiols or disulfides of suitable chain length, such as, for example, mercaptopropionic acid activated as the active ester, to which a triamino group is then coupled) incubated for 2-24 h. During this reaction time, the disulfide spacer PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ -OH of the oligonucleotide is cleaved homolytically. The spacer forms a covalent Au-S bond with Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ss-oligonucleotide and the cleaved 2-hydroxymercaptoethanol. The free bifunctional thiol present in the incubation solution is also co-adsorbed by forming an Au-S bond (incubation step). Instead of the single strand oligonucleotide, this single strand can also be hybridized with its complementary strand.

Anschließend wird durch Zugabe von löslichen Nickel-Salzen (z. B. Ni(II)Chlorid) oder anderen geeigneten Metall-Ionen (wie z. B. Kupfer) über die Bildung eines Komplexes unter Nutzung der Komplexbildungseigenschaften der Diaminogruppe am Fluorophor und der Diaminogruppe an der Oberfläche ein Zustand erreicht, bei dem der Fluorophor in einer geometrischen Anordnung nahe an der Oberfläche vorliegt. Then by adding soluble nickel salts (e.g. Ni (II) chloride) or other suitable metal ions (such as copper) through the formation of a complex using the complex formation properties of the diamino group on the fluorophore and the surface diamino group reaches a state where the fluorophore is in a geometric arrangement close to the surface.

Example 4 Alternative preparation of the oligonucleotide electrode Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-FP

Die alternative Herstellung von Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-FP gliedert sich in 2 Teilabschnitte, nämlich der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten bifunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt). The alternative production of Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-FP is divided into two sections, namely the derivatization of the gold surface with the probe oligonucleotide (incubation step) and the subsequent coating of the electrode modified in this way with a suitable bifunctional Left (re-assignment step).

Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S- S-(CH₂)₂-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist ein modifizierter Fluorophor und eine Ethylendiamin-Gruppe (vgl. Beispiel 2) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5 × 10^-5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH₂)₂-S-S- (CH₂)₂-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au- Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxymercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein. The quench surface (here: gold plate) is treated with a double-modified 20 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is marked with (HO- (CH ₂ ) ₂ -S) ₂ esterified to PO- (CH ₂ ) ₂ -S- S- (CH ₂ ) ₂ -OH; modification 2: at the 5 'end is a modified fluorophore and an ethylenediamine group (cf. Example 2) built in according to the respective standard protocol) in 5 × 10 ^-5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) for 2-24 h. During this reaction time, the disulfide spacer PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ -OH of the oligonucleotide is cleaved homolytically. The spacer forms a covalent Au-S bond with Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ss-oligonucleotide and the cleaved 2-hydroxymercaptoethanol. Instead of the single strand oligonucleotide, this single strand can also be hybridized with its complementary strand.

Anschließend wird die so modifizierte Gold-Oberfläche mit einer ca. 10^-5 bis 10^-1 molaren Diaminothiol-Verbindung (oder anderen geeigneten Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge wie z. B. als Aktivester aktivierte Mercaptopropionsäure, an die anschließend eine Triamino-Gruppe angekoppelt wird) 2-24 h komplett benetzt und 2-24 h inkubiert. Die freie Thiolverbindung belegt die nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold-Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S Bindung. Then the gold surface modified in this way is mixed with an approx. 10 ^-5 to 10 ^-1 molar diaminothiol compound (or other suitable thiols or disulfides of suitable chain length, such as mercaptopropionic acid activated as an active ester, to which a triamino group is then coupled is completely wetted for 2-24 h and incubated for 2-24 h. The free thiol compound covers the free gold surface remaining after the incubation step by forming an Au-S bond.

Anschließend wird durch Zugabe von löslichen Nickel-Salzen (z. B. Ni(II)Chlorid) oder anderen geeigneten Metall-Ionen (wie z. B. Kupfer) ein Zustand erreicht, bei dem der Fluorophor in einer geometrischen Anordnung nahe an der Oberfläche vorliegt (vgl. Beispiel 4). Then by adding soluble nickel salts (e.g. Ni (II) chloride) or other suitable metal ions (such as copper) reaches a state in which the Fluorophore is present in a geometrical arrangement close to the surface (cf. Example 4).

Example 5 Alternative production of the oligonucleotide electrode Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-FP

Eine alternative Herstellung von Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-FP besteht in der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) ohne Nachbelegung. An alternative production of Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-FP consists in the derivatization of the gold surface with the probe oligonucleotide (incubation step) without subsequent loading.

Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S- S-(CH₂)₂-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist ein modifizierter Fluorophor und eine Bipyridyl-Gruppe (vgl. Beispiel 2) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5 × 10^-5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂- OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxymercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein. The quench surface (here: gold plate) is treated with a double-modified 20 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is marked with (HO- (CH ₂ ) ₂ -S) ₂ esterified to PO- (CH ₂ ) ₂ -S- S- (CH ₂ ) ₂ -OH; modification 2: at the 5 'end is a modified fluorophore and a bipyridyl group (cf. Example 2) built in according to the respective standard protocol) in 5 × 10 ^-5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) for 2-24 h. During this reaction time, the disulfide spacer PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ - OH of the oligonucleotide is cleaved homolytically. The spacer forms a covalent Au-S bond with the Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ss-oligonucleotide and the split off 2-hydroxymercaptoethanol. Instead of the single strand oligonucleotide, this single strand can also be hybridized with its complementary strand.

Die am Fluorophor oder in dessen Nähe angebrachte Bipyridyl-Gruppe geht mit der unmodifizierten Goldoberfläche eine Wechselwirkung ein, wodurch eine geometrische Anordnung erreicht wird, bei der der Fluorophor nahe an der Oberfläche vorliegt. The bipyridyl group attached to or near the fluorophore goes with the unmodified gold surface interacts, creating a geometric Arrangement is achieved in which the fluorophore is close to the surface.

Example 6 Alternative production of the oligonucleotide electrode Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-FP

Eine weitere alternative Herstellung von Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-FP besteht in der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) ohne Nachbelegung. Another alternative preparation of Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo-FP consists in the derivatization of the gold surface with the probe oligonucleotide (incubation step) without subsequent loading.

Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S- S-(CH₂)₂-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist ein modifizierter Fluorophor und eine Alkylkette (z. B. als Fettsäureeinheit, vgl. Beispiel 2) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5 × 10^-5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxymercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang- Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein. The quench surface (here: gold plate) is treated with a double-modified 20 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is marked with (HO- (CH ₂ ) ₂ -S) ₂ esterified to PO- (CH ₂ ) ₂ -S- S- (CH ₂ ) ₂ -OH; modification 2: at the 5 'end is a modified fluorophore and an alkyl chain (e.g. incubated as a fatty acid unit, see Example 2) according to the respective standard protocol) in 5 × 10 ^-5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) for 2-24 h. During this reaction time, the disulfide spacer PO- (CH ₂ ) ₂ -SS- (CH ₂ ) ₂ -OH of the oligonucleotide is cleaved homolytically. The spacer forms a covalent Au-S bond with the Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ss-oligonucleotide and the split off 2-hydroxymercaptoethanol. Instead of the single-strand oligonucleotide, this single strand can also be hybridized with its complementary strand.

Alternativ dazu kann die Goldoberfläche auch durch Koadsorption (vgl. Beispiel 3) oder Nachbelegung (vgl. Beispiel 4) mit hydrophoben Alkylthiolen (z. B. Propanthiol oder anderen Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge) entsprechend hydrophob modifiziert werden. Alternatively, the gold surface can also be coadsorbed (see Example 3) or Subsequent coating (cf. Example 4) with hydrophobic alkylthiols (e.g. propanethiol or other thiols or disulfides of suitable chain length) correspondingly hydrophobic be modified.

Die am Fluorophor oder in dessen Nähe angebrachte Fettsäureeinheit geht mit der hydrophoben Goldoberfläche Wechselwirkungen ein, wodurch eine geometrische Anordnung erreicht wird, bei der der Fluorophor nahe an der Oberfläche vorliegt. The fatty acid unit attached to the fluorophore or in its vicinity goes with the hydrophobic gold surface interactions, creating a geometric Arrangement is achieved in which the fluorophore is close to the surface.

Example 7 Fluorescence intensity measurements on the system Au-ss-oligo-Fluorescein or on Au-ds-oligo-fluorescein system in the presence of liquid media

Die Sonden-Oberfläche wird analog zu den Beispielen 3-6 hergestellt. Dazu wird ein modifiziertes Oligonukleotid der Sequenz 5'-Fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3'[C₃-S-S-C₃-OH] auf Gold immobilisiert (50 µmol Oligonukleotid in Phosphat- Puffer (K₂HPO₄/KH₂PO₄ 500 mM, pH 7) und in der Form Au-S(CH₂)₂-ss-oligo- Fluorescein die Fluoreszenzintensität der Oberfläche mit einem Fluoreszenz-Scanner der Firma Lavision Biotech bestimmt. Zur Messung der Fluoreszenz in Gegenwart von flüssigen Medien werden 150 µl des Mediums auf die Goldoberfläche gegeben und anschließend mit einem Deckglas abgedeckt. Alternativ können auch Hybriwells oder Imaging Chambers verwendet werden. The probe surface is produced analogously to Examples 3-6. For this purpose, a modified oligonucleotide of the sequence 5'-fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '[C ₃ -SSC ₃ -OH] is immobilized on gold (50 μmol oligonucleotide in phosphate buffer (K ₂ HPO ₄ / KH ₂ PO ₄ 500 mM, pH 7) and in the form Au-S (CH ₂ ) ₂ -ss-oligo- fluorescein the fluorescence intensity of the surface was determined with a fluorescence scanner from Lavision Biotech for measuring the fluorescence in the presence of liquid media 150 µl of the medium are placed on the gold surface and then covered with a cover glass, or alternatively Hybriwells or imaging chambers can be used.

Claims

1. A method for the detection of ligate-ligand association events by fluorescence quenching comprising the steps

a) providing a modified surface, the modification consisting in the attachment of at least one type of modified ligate ( 201 ) and the ligates ( 201 ) being modified by attachment of at least one type of fluorophore ( 102 ), the fluorophore with the modified surface a reversible bond is formed,

b) providing a sample with ligands,

c) bringing the sample into contact with the modified surface,

d) detection of the fluorescence of the fluorophore ( 102 ),

e) Comparison of the fluorescence intensity detected in step d) with reference values.

2. The method of claim 1, wherein after step a) and before step c) the step

1. b ₁ ) first detection of the fluorescence of the fluorophore ( 102 )

is carried out and in step e) the values obtained in step d) are compared with the reference values obtained in step b ₁ ).

3. The method of claim 1, wherein as step d) the step

a) detection of the fluorescence of the fluorophore ( 102 ) and detection of reference values

is carried out and in step e) the values obtained in step d) are compared with the reference values likewise obtained in step d).

4. The method according to claim 3, wherein the detection of the reference values in step d) by detecting the fluorescence of an area of the modified surface takes place in which essentially no ligands are present.

5. The method according to claim 3, wherein the detection of the reference values in step d) by detecting the fluorescence of an area of the modified surface takes place in which essentially only ligand / ligate complexes are present are.

6. The method according to claim 3, wherein the detection of the reference values in step d) by detecting the fluorescence of an area of the modified surface takes place in which essentially no ligands are present, and in addition by detection of a second area of the modified surface, in which are essentially exclusively ligand / ligate complexes.

7. The method according to any one of the preceding claims, wherein the fluorophore ( 102 ) is modified by linking at least one chemical group ( 206 ) which forms a reversible bond with the modified surface.

8. The method according to any one of the preceding claims, wherein the ligates ( 201 ) are additionally modified by binding at least one chemical group which forms a reversible bond with the modified surface.

The method of claim 8, wherein the chemical group is separated from the fluorophore ( 102 ) by a maximum of 10 chemical bonds.

10. The method according to claim 8 or 9, wherein the modified surface is additionally modified by attachment of chemical groups ( 207 ), wherein the chemical groups ( 207 ) bonded to the surface with the chemical groups attached to the ligates ( 201 ) a reversible bond received.

11. The method according to any one of the preceding claims, wherein the modified surface is additionally modified by binding chemical groups ( 207 ), wherein the chemical groups ( 207 ) bound to the surface form a reversible bond with the fluorophore ( 102 ).

12. The method according to claim 11, wherein the chemical groups ( 207 ) bound to the surface form a reversible bond with the chemical groups ( 206 ) bound to the fluorophore.

13. The method according to any one of the preceding claims, wherein the fluorophore through Attachment of at least one bipyridyl group or by attachment at least a diamino group is modified.

14. The method according to any one of the preceding claims, wherein the ligate additionally by linking at least one bipyridyl group or by linking at least one diamino group is modified.

15. The method according to claims 10 to 14, wherein the modified surface is additionally modified by linking diamino groups.

16. The method according to claim 15, wherein after step a) and before step c) the step

1. a ₁ ) Contacting a solution of a copper ( 11 ) or nickel (II) salt with the modified surface

is carried out.

17. The method according to any one of the preceding claims, wherein a fluorescent dye is used as the fluorophore ( 102 ).

18. The method according to any one of the preceding claims, wherein as the fluorophore ( 102 ) Texas Red, a rhodamine dye, in particular Rhodamine G6 (Basic Red 1 ), fluorescein (Resorcinphtalein), or a cyanine dye, in particular 5,5'-disulfo- , 1'di (-carbopentenyl) -3,3,3 ', 3'-tetramethyl-indodicarbocyanine (Cy3 ™) or 5,5', 7,7'-tetrasulfo-1,1'di (-carbopentenyl) -3 , 3,3 ', 3'-tetramethyl-benzindodicarbocyanin (Cy5 ™) is used.

19. The method according to any one of the preceding claims, wherein it is in the modified surface around a surface bearing at least one modification from a metal or a metal alloy, in particular from a Metal selected from the group consisting of gold, silver, copper and their Mixtures.

20. The method according to any one of the preceding claims, wherein as ligands Substrates, cofactors or coenzymes and as ligates proteins or enzymes be used.

21. The method according to any one of claims 1 to 19, wherein antibodies and antigens can be used as ligates.

22. The method according to any one of claims 1 to 19, wherein as ligands antigens and as Ligate antibodies can be used.

23. The method according to any one of claims 1 to 19, wherein receptors and as ligands hormones are used as ligates.

24. The method according to any one of claims 1 to 19, wherein hormones and as ligands can be used as ligate receptors.

25. The method according to any one of claims 1 to 19, wherein as the ligand nucleic acid Oligomers and nucleic acid oligomers complementary thereto as ligates be used.

26. The method according to claim 25, wherein the nucleic acid used as ligates Oligomers 3 to 5 g bases, in particular 5 to 40 bases, particularly preferably 12 comprise up to 30 bases.

27. Use of substrates, cofactors, coenzymes, proteins, enzymes, Antibodies, antigens, receptors, hormones and nucleic acid oligomers as Ligates and / or ligands in a process according to claims 1 to 19.

28. Kit for carrying out a method according to claims 1 to 19 comprising a modified surface, the modification consisting in the attachment of at least one type of modified ligate ( 201 ), the ligate ( 201 ) by attachment of at least one type of fluorophore ( 102 ) are modified and the fluorophore ( 102 ) is modified by linking at least one chemical group ( 206 ) which forms a reversible bond with the modified surface.

29. The kit of claim 28, wherein the kit additionally contains a copper (II) or nickel (II) salt or a solution of a copper (II) or nickel (II) salt.