DE19855180A1

DE19855180A1 - in situ hybridization method

Info

Publication number: DE19855180A1
Application number: DE19855180A
Authority: DE
Inventors: Andrea Kofler; Regina Bichlmaier; Ludwig Stoeckl
Original assignee: CHROMBIOS GmbH; Metabion Ges fur Angewan GmbH
Current assignee: CHROMBIOS GmbH; Metabion Ges fur Angewan GmbH
Priority date: 1998-11-30
Filing date: 1998-11-30
Publication date: 2000-05-31
Also published as: AU1386800A; WO2000032810A1

Abstract

The invention relates to an in situ hybridization method which is characterized in that at least one nucleic acid probe is used for the in situ hybridization which probe comprises at least one dendrimer that is labeled with one or more labeling molecules.

Description

Die Erfindung betrifft ein in situ-Hybridisierungsverfahren und speziell in situ-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von Nukleinsäuresonden, bei denen die Markierung über mindestens eine dendrimere Struktur an die Nukleinsäuresequenz gebunden ist.The invention relates to an in situ hybridization method and specifically using in situ hybridization methods of nucleic acid probes in which the marking has at least a dendrimeric structure attached to the nucleic acid sequence is.

Die in situ-Hybridisierung (ISH) oder, synonym, in situ- Cytohybridisierung stellt eine spezielle Anwendung der Nuklein säurehybridisierung dar, bei der die Hybridisierungsreaktion in Gewebeschnitten, Gewebekulturzellen, Chromosomenpräparationen und Zellkernen, die jeweils mittels entsprechender Vorbehandlung auf einem festen Träger, z. B. einem Objektträger, fixiert wur den, erfolgt.The in situ hybridization (ISH) or, synonymously, in situ Cytohybridization represents a special application of the nucleus acid hybridization, in which the hybridization reaction in Tissue sections, tissue culture cells, chromosome preparations and cell nuclei, each by means of appropriate pretreatment on a solid support, e.g. B. a slide, was fixed the, takes place.

Hierfür werden gegenwärtig DNA- oder RNA-Sonden eingesetzt, die mit Hapten (z. B. Biotin oder Digoxigenin), Fluoreszenz markierten Nukleotiden (dNTPs) oder auch radioaktiv markierten Nukleotiden markiert worden sind. Die Markierung der Sonden er folgt in der Regel über "nick translation", "random priming" oder über die Polymerasekettenreaktion (PCR). Die hybridisierten Sonden werden im Falle einer Markierung mit Haptenen, wie Biotin oder Digoxigenin, mittels Fluoreszenz-gekoppelter "Reporter moleküle" (z. B. Avidin oder Antikörper gegen Digoxigenin) nach gewiesen. Im Falle einer Verwendung von Fluoreszenzmarkierten dUTPs erfolgt der Nachweis direkt im Mikroskop, bei radioaktiv markierten Sonden beispielsweise mittels Röntgenfilmemulsionen, mit denen die Objektträger nach erfolgter Hybridisierungsreakti on überzogen werden.DNA or RNA probes are currently used for this purpose, those with hapten (e.g. biotin or digoxigenin), fluorescence labeled nucleotides (dNTPs) or radioactively labeled Nucleotides have been labeled. Marking the probes he usually follows via "nick translation", "random priming" or via the polymerase chain reaction (PCR). The hybridized Probes are used in the case of labeling with haptens, such as biotin or digoxigenin, using fluorescence-coupled "reporters molecules "(e.g. avidin or antibodies against digoxigenin) instructed. In the case of using fluorescent labels dUTPs are detected directly in the microscope, in the case of radioactive labeled probes, for example by means of X-ray film emulsions, with which the microscope slide after the hybridization reaction has taken place on to be coated.

Beispielsweise wird gegenwärtig insbesondere die Fluores zenz-in situ-Hybridisierung (FISH) an Chromosomen und Geweben in verschiedenen Feldern der biologischen Grundlagenforschung und der medizinischen Diagnostik angewandt. For example, fluorescence is currently being used in particular zence in situ hybridization (FISH) on chromosomes and tissues in various fields of basic biological research and applied in medical diagnostics.

Das in situ-Hybridisierungsverfahren erlaubt es nicht nur, die molekulare Homologie einer Sonde zu einem bestimmten Ge nomabschnitt zu belegen, sondern darüber hinaus mit Hilfe der Sonde die homologe DNA- oder RNA-Sequenz räumlich im Zellver band, in einer Zelle oder innerhalb eines Chromosomensatzes zu lokalisieren: Dies ist der wichtigste Unterschied zu klassischen molekularbiologischen Hybridisierungen (z. B. Blot-Hybridisie rungen, wie "Southern-Blot" oder "Northern-Blot", u. a.).The in situ hybridization process not only allows the molecular homology of a probe to a particular Ge nom section, but also with the help of the Probe the homologous DNA or RNA sequence spatially in the cell ver tied, in a cell or within a set of chromosomes localize: This is the most important difference to classic molecular biological hybridizations (e.g. blot hybridization such as "Southern blot" or "Northern blot", inter alia).

Gegenüber den klassischen molekularbiologischen Hybridisie rungsexperimenten, die an isolierter DNA erfolgen, ist der Nach weis komplementärer DNA-Sequenzen innerhalb eines Zell- oder Chromosomenverbands aufwendiger und komplizierter. So sind bei spielsweise für die geeignete Probenvorbereitung ausgefeilte und komplizierte Techniken erforderlich. Ein weiterer wesentlicher Punkt besteht darin, daß die eigentliche Hybridisierungsreaktion in einem wesentlich komplexeren, da biologischen oder im wesent lichen biologischen System erfolgt. Auch nach der Denaturierung zur Dissoziation der DNA-Doppelstränge liegt die DNA im wesent lichen in ihrer biologischen Umgebung vor, also umgeben von Hi ston-Proteinen, Zellmembranen und weiteren zellulären Komponen ten. Diese in der Umgebung der DNA vorliegenden Zellkomponenten interferieren mit der Hybridisierungsreaktion, indem sie bei spielsweise den Zutritt der Nukleinsäuresonden zu der DNA ver hindern oder einschränken können.Compared to the classic molecular biological hybridization experiments that are carried out on isolated DNA, is the aftermath knows complementary DNA sequences within a cell or Chromosome association more expensive and complicated. So are at for example, sophisticated and suitable sample preparation complicated techniques required. Another essential one Point is that the actual hybridization reaction in a much more complex, since biological or essentially union biological system takes place. Even after denaturation The DNA is essentially responsible for the dissociation of the DNA double strands in their biological environment, i.e. surrounded by hi ston proteins, cell membranes and other cellular components th. These cell components present in the vicinity of the DNA interfere with the hybridization reaction by being at for example, the access of the nucleic acid probes to the DNA ver hinder or restrict.

In den letzten Jahren wurden Fluoreszenz-markierte DNA- Sonden von unterschiedlicher Komplexität entwickelt, die in der Lage sind, kleinste Chromosomenregionen, größere Chromosomenab schnitte, oder ganze Chromosomen "anzufärben". Diese DNA-Sonden werden auch als "chromosome paints" bezeichnet. Die Möglichkeit, eine DNA-Sonde nachzuweisen, hängt unmittelbar mit der Intensi tät des Fluoreszenzsignals und der Empfindlichkeit des mikrosko pischen Verfahrens ab. Je mehr fluoreszierende Moleküle die Son de enthält, desto stärker ist das Signal. Die Empfindlichkeit der Aufnahme der Signale kann durch hoch-sensitive Kamerasyste me, z. B. gekühlte "charge coupled device" (CCD)-Kameras, wie sie für die Astronomie verwendet werden, und durch Unterstützung mittels der digitalen Bildverarbeitung gesteigert werden.In recent years, fluorescence-labeled DNA Probes of varying complexity developed in the Smallest chromosome regions, larger chromosomes cuts, or "stains" whole chromosomes. These DNA probes are also known as "chromosome paints". The possibility, Detecting a DNA probe depends directly on the intensity ity of the fluorescence signal and the sensitivity of the microscope pischen procedure. The more fluorescent molecules the son de contains, the stronger the signal. The sensitivity the signals can be recorded by highly sensitive camera systems me, e.g. B. chilled charge coupled device (CCD) cameras like her used for astronomy, and by assistance can be increased by means of digital image processing.

Die Verwendung von unterschiedlich markierten fluoreszie renden Sonden im gleichen Experiment erlaubt die Darstellung vor FISH-Signalen in unterschiedlichen Farben. Dabei können ver schiedene Kombinationen von Haptenen und/oder direkt markierte Sonden eingesetzt werden ("combinatorial labelling"). In einem anderen Ansatz können die unterschiedlich markierten Sonden nicht nur durch unterschiedliche Kombinationeh sondern auch durch unterschiedliche Konzentrationen der fluoreszierenden Mar kierungsmoleküle verschieden angefärbte Chromosomen erzeugen ("ratio labelling"). Mit beiden Verfahren ist es prinzipiell denkbar, alle 24 verschiedenen Chromosomen des menschlichen Chromosomensatzes in unterschiedlichen Farben darzustellen. Ge zeigt wurde dies bisher aber nur für das "combinatorial label ling" (Speicher et al., Nature Genet 12: 368-375, 1996; Schröck et al., Science 273: 494-497, 1996; siehe auch US-Patent 8, 640, 657).The use of differently labeled fluorescence producing probes in the same experiment allowed the representation above FISH signals in different colors. Ver different combinations of haptens and / or directly labeled Probes are used ("combinatorial labeling"). In one Another approach can be the differently labeled probes not only through different combinations but also by different concentrations of the fluorescent Mar labeling molecules produce differently colored chromosomes ("ratio labeling"). It is a principle with both procedures conceivable all 24 different chromosomes of the human Chromosome set in different colors. Ge This has so far only been shown for the "combinatorial label ling "(Speicher et al., Nature Genet 12: 368-375, 1996; Schröck et al., Science 273: 494-497, 1996; see also US patent 8, 640, 657).

Im Vergleich zum "combinatorial labelling", bei dem für je de Farbe ein eigener Fluoreszenzfilter benötigt wird, kann beim "ratio labelling" mit weniger aufwendigen Mikroskopen gearbeitet werden, um zur gleichen Zahl unterschiedlicher Farbeh zu kommen. Die Erzeugung von präzisen und reproduzierbaren Verhältnissen ("ratios") der jeweiligen Markierungsintensitäten mit klassi schen Markierungstechniken ist aber schwierig bis unmöglich. Es gibt bisher keine publizierten Experimente, in denen ein "ratio labelling" erfolgreich für alle 24 unterschiedlichen Chromosomen des Menschen gezeigt wurde.Compared to "combinatorial labeling", where for ever de color a separate fluorescence filter is required, can be used with "Ratio labeling" worked with less complex microscopes to come to the same number of different colors. The creation of precise and reproducible conditions ("ratios") of the respective marking intensities with classi different marking techniques is difficult or even impossible. It So far there are no published experiments in which a "ratio labeling "successful for all 24 different chromosomes of man was shown.

Bei den oben genannten gängigen Markierungssystemen werden markierte dUTPs der Reaktion zur Synthese der Nukleotidsonden zugegeben. Um einen Einbau dieser Moleküle zu gewährleisten, werden sie in sehr hoher Konzentration angeboten, aber nur ein Bruchteil wird tatsächlich eingebaut. Nicht eingebaute Nukleoti de werden verworfen. Die markierten dUTPs machen jedoch mehr als 90% der Materialkosten bei der Herstellung markierter DNA-Sonden aus. Damit ist die geringe Einbaurate ein wesentlicher Faktor für die extremen Kosten von FISH-Experimenten. Eine wesentliche Verringerung der Produktionskosten könnte erreicht werden, wenn es gelingt, den Einbau markierter Nukleotide drastisch zu ver bessern.With the above-mentioned common marking systems labeled dUTPs of the reaction for synthesis of the nucleotide probes admitted. To ensure that these molecules are incorporated, they are offered in a very high concentration, but only one Fraction is actually built in. Nucleotides not incorporated de are discarded. However, the marked dUTPs do more than 90% of the material costs in the manufacture of labeled DNA probes the end. The low installation rate is therefore an essential factor for the extreme cost of FISH experiments. An essential one Reduction in production costs could be achieved, though it is possible to drastically reduce the incorporation of labeled nucleotides improve.

Die bisher gängigen Verfahren zur Markierung der Sonden ha ben darüber hinaus den weiteren Nachteil, daß das Ausmaß der Markierung nur unzureichend kontrolliert werden kann, z. B. wenn zwei unterschiedliche Haptene in die gleiche Sonde eingebaut werden sollen. Ein präzises, reproduzierbares "ratio labelling" ist im Rahmen derartiger Markierungen nicht möglich.The previously common methods of marking the probes ha ben in addition, the further disadvantage that the extent of the Marking can only be insufficiently controlled, e.g. B. if two different haptens incorporated into the same probe should be. A precise, reproducible "ratio labeling" is not possible in the context of such markings.

Seit Ende der 70er Jahre hat sich die Chemie der polyfunk tionalen organischen "starburst"-Polymere (Kaskaden, Silvane, Arborane, Dendrimere) zu einem wichtigen Zweig der Polymerwis senschaft entwickelt. Gemeinsam ist diesen Polymeren, daß sie eine Mehrzahl von organischen Molekülketten aufweisen, die sich von einem gemeinsamen Zentrum aus nach außen erstrecken. Für de ren Synthese wurden zwei grundlegende Strategien vorgeschlagen: eine divergente Synthese, bei der die Struktur ausgehend von dem Zentrum in Richtung der Peripherie aufgebaut wird, und eine kon vergente Synthese mit einem Wachstum des Moleküls von der Peri pherie zum Zentrum.Since the end of the 1970s, the chemistry of polyfunk tional organic "starburst" polymers (Kaskaden, Silvane, Arboranes, dendrimers) to an important branch of polymer science developed. What these polymers have in common is that they have a plurality of organic molecular chains that extend extend outward from a common center. For de Two basic strategies have been proposed for this synthesis: a divergent synthesis in which the structure is based on the Center is built up in the direction of the periphery, and a con Vergente synthesis with a growth of the molecule from the peri pherie to the center.

Das diesen "starburst"-Polymeren zugrundeliegende struktu relle Konzept wurde auch im Bereich der Biotechnologie aufge griffen, und zwar in Verbindung mit der durch diese Strukturen gebotenen Möglichkeit, eine Mehrzahl von Markierungsmolekülen an einer einzelnen molekularen Grundstruktur vorzusehen und damit eine Amplifizierung eines Markierungssignals zu erzielen.The structure on which these "starburst" polymers are based A real concept was also found in the field of biotechnology attacked, in conjunction with the through these structures offered possibility of a plurality of marker molecules to provide a single molecular basic structure and thus to achieve amplification of a marker signal.

So wurden Oligonukleotide, die mittels Dendrimeren markiert worden sind, verwendet, um in molekularbiologischen Hybridisie rungsexperimenten an isolierten Nukleinsäuren Signale zu ver stärken. Urdea et al. (Gene 61: 3, 253-264, 1987) verwendeten dieses System, um die Empfindlichkeit des Nachweises von Hepati tis B-Viren im menschlichen Serum zu steigern. Shchepinov et al. (Nucl. Acid Res. 25: 22, 4447-4454, 1997) synthetisierten mittels Dendrimeren mehrfach radioaktiv markierte Oligonukleotide und erzielten bei Einsatz dieser Oligonukleotide als Sonden in Hy bridisierungsassays an "oligonucleotide arrays" eine Signalver stärkung. In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, daß Den drimer-tragende Oligonukleotide in PCR-Reaktionen als Primer verwendet werden können.So were oligonucleotides labeled using dendrimers have been used to in molecular biological hybridization experiments on isolated nucleic acids to ver strengthen. Urdea et al. (Gene 61: 3, 253-264, 1987) were used this system to increase the sensitivity of the detection of hepati tis B viruses in human serum. Shchepinov et al. (Nucl. Acid Res. 25: 22, 4447-4454, 1997) synthesized by means of Dendrimers multiply radiolabeled oligonucleotides and obtained using these oligonucleotides as probes in Hy bridging assays on "oligonucleotide arrays" a signal ver Strengthening. In this work it could also be shown that Den drimer-bearing oligonucleotides as primers in PCR reactions can be used.

Nach Kenntnis der Aasmelder wurden somit Hybridisierungen unter Verwendung von Nukleinsäuresonden, bei denen eine Mehrzahl von Markierungsmolekülen über eine dendrimere Struktur an die für die Hybridisierung zur Verfügung stehende Nukleinsäurese quenz gebunden ist, nur an isolierten Nukleinsäuremolekülen, al so in rein molekularbiologischen Hybridisierungsverfahren durch geführt.As far as the carrion alarms were known, hybridizations were thus established using nucleic acid probes in which a plurality of marker molecules via a dendrimeric structure to the nucleic acidesis available for hybridization sequence is bound, only to isolated nucleic acid molecules, al so in purely molecular biological hybridization processes guided.

Wie bereits vorstehend erläutert, liegt im Vergleich zu rein molekularbiologischen Hybridisierungsverfahren bei in situ- Hybridisierungsverfahren ein wesentlich komplexeres Reaktionssy stem vor, bei dem insbesondere makromolekulare Zellbestandteile, wie Histonproteine und zelluläre Membranen, neben der zu analy sierenden DNA anwesend sind. Diese makromolekularen Zellbestand teile, die sich z. T. auch nach einer Denaturierung zur Trennung der DNA-Doppelstränge in enger Assoziierung mit der zu analysie renden DNA befinden, interferieren mit Nukleinsäuresonden und können bei fehlender Eignung der Sonden dazu führen, daß trotz komplementärer Sequenzen keine Hybridisierung mit der zu analy sierenden zellulären DNA erfolgt. Gründe für die fehlende Eig nung einer Nukleinsäuresonde für die in situ-Hybridisierung kön nen beispielsweise in sterischen und/oder elektrostatischen Ei genschaften des Sondenmoleküls liegen. Jedoch sind die gesamten Voraussetzungen, die bei einer Nukleinsäuresonde vorliegen müs sen, um diese für eine in situ-Hybridisierung geeignet zu ma chen, bei weitem noch nicht so umfassend erforscht, als daß eine Voraussage einer entsprechenden Eignung bei Kenntnis der Mole külstruktur der Nukleinsäuresonde möglich wäre.As already explained above, compared to purely molecular biological hybridization processes with in situ Hybridization process a much more complex reaction system system, in which macromolecular cell components in particular, such as histone proteins and cellular membranes, besides which to analy sizing DNA are present. This macromolecular cell structure parts that are z. T. also after denaturation for separation the DNA double strands in close association with the analysis rend DNA, interfere with nucleic acid probes and If the probes are unsuitable, this can lead to the situation in spite of complementary sequences do not hybridize with the analyte sizing cellular DNA takes place. Reasons for the lack of prop tion of a nucleic acid probe for the in situ hybridization can for example in steric and / or electrostatic eggs properties of the probe molecule. However, all of them are Requirements that must be met for a nucleic acid probe sen to make them suitable for in situ hybridization chen, nowhere near as extensively researched as that one Prediction of a corresponding suitability with knowledge of the mole külstruktur the nucleic acid probe would be possible.

Ein einfacher Rückschluß aus der Eignung einer Nukleinsäu resonde für rein molekularbiologische Hybridisierungsexperimente an "isolierter" DNA auf eine entsprechende Eignung für in situ- Hybridisierungsverfahren ist somit nicht möglich.A simple conclusion from the suitability of a nucleic acid resonde for purely molecular biological hybridization experiments of "isolated" DNA for a corresponding suitability for in situ Hybridization process is therefore not possible.

Gegenüber dem hier dementsprechend allein einschlägigen Stand der Technik in Verbindung mit in situ-Hybridisierungs verfahren liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein alterna tives in situ-Hybridisierungsverfahren bereitzustellen, das im Vergleich zu den bekannten Verfahren eine Reihe von Vorteilen aufweist:
Compared to the state of the art that is relevant here in connection with in situ hybridization methods, the object of the invention is to provide an alternative in situ hybridization method which has a number of advantages compared to the known methods:

- when using equivalent amounts of nucleic acid signal amplification is made possible by probe (s);
- The incorporation of marker molecules into the nucleic acid de can be more precise about the incorporation into the dendrimeric structure controls and thus the extent of the signal amplification according to the in individual needs can be varied in a targeted manner;
- due to the targeted possible incorporation of marking moles There is also the option of using a nucleic acid probe more than one type of marker molecule in according to the individual To mark needs of variable marking ratios, what a more reproducible and more comprehensively usable "ratio labeling" enables;
- due to the different synthesis strategy for the Her Positioning the nucleic acid probes will increase the immense cost due to the low rate of incorporation of the marked dNTPs into the Nucleic acid probes for the in situ hybridization process of the Prior art significantly reduced.

Hier wird erstmals ein Verfahren beschrieben, in dem Nu kleotidsonden, an die mit Markierungsmolekülen, wie Haptenen, Fluoreszenzfarbstoffen und radioaktiven Verbindungen, markierte Dendrimere angeknüpft sind, in der in situ-Hybridisierung und insbesondere in der molekularen Zytogenetik und Histologie ein gesetzt werden: Gegenstand der Erfindung sind die in situ- Hybridisierungsverfahren und Kits zur Verwendung in diesen Ver fahren, wie sie in den Ansprüchen definiert sind.Here a method is described for the first time in which Nu clothing probes to which marker molecules such as haptens, Fluorescent dyes and radioactive compounds, labeled Dendrimers are linked in the in situ hybridization and especially in molecular cytogenetics and histology are set: The subject of the invention are the in situ Hybridization Methods and Kits for Use in These Ver drive as defined in the claims.

Aufgrund der komplexen Zusammensetzung der Hybridisie rungsprobe mit z. T. eng mit der zu analysierenden DNA assoziier ten makromolekularen Zellbestandteilen und angesichts des be dingt durch die ausladenden dendrimeren Strukturen überaus hohen sterischen Platzbedarfs der erfindungsgemäß eingesetzten Nu kleinsäuresonden war die Feststellung der Eignung dieser Nu kleinsäuresonden für die in situ-Hybridisierung völlig überra schend. Wie erläutert, konnte diese Eignung aufgrund der aus dem Stand der Technik bekannten Hybridisierungsexperimente in Lösung oder von Oligonukleotiden an Oligonukleotid-Arrays nicht erwar tet werden, da bei diesen Experimenten die zu analysierende DNA stets isoliert von übrigen zellulären Bestandteilen vorlag.Due to the complex composition of the hybridisia rungsprobe with z. T. closely associated with the DNA to be analyzed th macromolecular cell components and in view of the be due to the overhanging dendrimeric structures, it is extremely high steric space requirement of the Nu used according to the invention small acid probes was the determination of the suitability of this Nu small acid probes for in situ hybridization completely surpassing shouting. As explained, this suitability could be based on the State of the art hybridization experiments in solution or of oligonucleotides on oligonucleotide arrays not expected because in these experiments the DNA to be analyzed was always isolated from other cellular components.

In dem hier vorgeschlagenden Verfahren
In the procedure proposed here

- are complex probes (e.g. using "degenerate oligonucleo tide primed PCR, Telenius et al., 1992, Genes, Chromosomes & Cancer 4: 257-263) containing dendrimers and
- These probes are attached to complex biological structures, such as e.g. cells, cell nuclei and chromosomes, hybridized.

Der generelle Aufbau der erfindungsgemäß eingesetzten Nu kleotidsonden umfaßt drei grundlegende Komponenten:
The general structure of the nucleus probes used according to the invention comprises three basic components:

- a polymeric chain that is able to use DNA sequences as to recognize complementary
- one or more polyfunctional dendrimeric structures, each starting from a central branching structure turunit made up of a plurality of monomeric branching units th are constructed and which are also called dendrimer in the following or "sapling", and
- one or more marker molecules, for example haptens Molecules and hapten-labeled compounds, fluorescent markers molecules or radiolabelled compounds attached to the outer ends of the dendrimers are attached.

The polymer chain

Die polymeren Ketten haben die Funktion, bestimmte Polynu kleinsäureketten (RNA oder DNA) aufgrund von deren Nukleinsäure abfolge spezifisch zu erkennen. Obwohl die polymere Kette häufig aus den vier monomeren Bausteinen der DNA oder RNA oder Hybriden aus den DNA- und RNA-Bausteinen aufgebaut sein wird, besteht die Möglichkeit, daß sich das Polymer in seiner chemischen Zusammen setzung von diesen klassischen Nukleinsäurebausteinen deutlich unterscheidet. Variationsmöglichkeiten der Polynukleinsäureket ten liegen zum einen in der Modifizierung der Purin- bzw. Pyri midinbasen z. B. unter Erzeugung der folgenden Bausteine: 5- Methylcytosin, 5-Bromcytosin, 5-Ethinyluridin, 5-(1-Propinyl)- 2'-desoxyuridin, 2,6-Diaminopurin, 2-Desoxyuridin, 2-Desoxy inosin, 2-Desoxynebularin, 3-Nitropyrrol, 5-Nitroindol; in der Modifizierung des Riboserings z. B. unter Erzeugung von 2'-O- Methyl- und 3'-Desoxy-Derivaten wie auch in der Modifizierung der kovalenten Verbindung zwischen den Zuckerresten, dem Rück grat des Polymerstrangs. Bei diesen Rückgratmodifizierungen kann das Phosphoratom konserviert und die Sauerstoffatome teilweise z. B. durch Schwefelatome, Methylen-, Dialkylamino-, Methoxy-, Ethoxygruppen ersetzt sein. Ein Beispiel hierfür bilden Phos phothioat-Oligonukleotide. Ebenso kann die gesamte Phosphordie sterbrücke durch andere funktionelle Einheiten, wie Carbamate, Harnstoff, Guanidine, Amine, Amide, Ether, Thioether, Ketone, Acetale, Hydroxylamine oder Sulfamate ausgetauscht werden.The polymer chains have the function of defining certain polynu small acid chains (RNA or DNA) based on their nucleic acid sequence specific to recognize. Although the polymer chain is common from the four monomeric building blocks of DNA or RNA or hybrids will be built up from the DNA and RNA building blocks, the Possibility of the polymer in its chemical composition setting of these classic nucleic acid building blocks differs. Possible variations of the polynucleic acid chain th are on the one hand in the modification of the purine or pyri midinbasen z. B. by generating the following blocks: 5- Methylcytosine, 5-bromocytosine, 5-ethynyluridine, 5- (1-propynyl) - 2'-deoxyuridine, 2,6-diaminopurine, 2-deoxyuridine, 2-deoxy inosine, 2-deoxynebularine, 3-nitropyrrole, 5-nitroindole; in the Modification of the ribose ring z. B. with generation of 2'-O- Methyl and 3'-deoxy derivatives as well as in the modification the covalent connection between the sugar residues, the back ridge of the polymer strand. With these backbone modifications, the phosphorus atom is conserved and the oxygen atoms partially z. B. by sulfur atoms, methylene, dialkylamino, methoxy, Be replaced by ethoxy groups. Phos is an example of this phothioate oligonucleotides. Likewise, the entire phosphorus can sterile bridge through other functional units, such as carbamates, Urea, guanidines, amines, amides, ethers, thioethers, ketones, Acetals, hydroxylamines or sulfamates can be exchanged.

Ein gänzlich alternatives Konzept ist der Aufbau des Poly mers aus sogenannten PNAs oder Peptidnukleinsäuren. Dabei han delt es sich um achirale, ungeladene Polyamidnukleinsäuren, die als Oligonukleotidanaloga fungieren und die aus einem Polyamid rückgrat aus sich wiederholenden Aminoethylglycyleinheiten be stehen. Die Purin- bzw. Pyrimidinbasen sind über einen Acetyl- Spacer kovalent an das Rückgrat gebunden.A completely alternative concept is the structure of the poly mers from so-called PNAs or peptide nucleic acids. Thereby han it is achiral, uncharged polyamide nucleic acids, the act as oligonucleotide analogs and those made of a polyamide backbone of repeating aminoethylglycyclic units be stand. The purine or pyrimidine bases are via an acetyl Spacer covalently attached to the backbone.

Die polymere Kette kann gleichfalls als Hybrid aus den mo nomeren Bausteinen z. B. der DNA, RNA, PNA und O-Methyl-RNA auf gebaut sein und gegebenenfalls eine oder mehrere unterschiedli che der vorstehend beispielhaft erläuterten weiteren Modifizie rungen aufweisen. In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist allein wesentlich, daß die resultierende polymere Kette die Fähigkeit aufweist, einen bestimmten Sequenzabschnitt von RNA oder DNA spezifisch zu erkennen, d. h. mit diesem zu hybridisie ren. Dies ist dann der Fall, wenn die polymere Kette die daran gebundenen, gegebenenfalls modifizierten Purin- und Pyrimidinba sen räumlich so ausrichten kann, daß diese eine Basenpaarung mit komplementären Purin- und Pyrimidinbasen des zu analysierenden DNA- oder RNA-Strangs eingehen können.The polymer chain can also be used as a hybrid of the mo nomeren building blocks z. B. the DNA, RNA, PNA and O-methyl-RNA be built and possibly one or more different surface of the further modifications explained by way of example above have stanchions. In connection with the present invention It is only essential that the resulting polymeric chain have the Ability to detect a specific sequence segment of RNA or to recognize DNA specifically, d. H. to hybridize with this ren. This is the case when the polymer chain is attached to it bound, optionally modified purine and pyrimidine ba sen can align spatially so that this base pairing with complementary purine and pyrimidine bases of the to be analyzed DNA or RNA strand can enter.

The dendrimers

Die Dendrimere können an das 5'-Ende der polymeren Kette, intern über eine modifizierte Base oder über das Rückgrat kova lent angeknüpft werden. Der Verzweigungsgrad der Dendrimere und letztlich auch die Anzahl der funktionellen Gruppen, die für die Anheftung von Markierungsmolekülen zur Verfügung stehen, wird durch die Struktur der monomeren Einheiten bestimmt, aus denen die Baumstruktur aufgebaut ist. Das einfachste Monomer ist ein Phosphoramidit, basierend auf Glycerin. Dabei sind zwei Hydroxylgruppen mit einer Dimethoxytritylgruppe geschützt und eine weitere Hydroxylgruppe ist als Cyanoethylphosphoramidit ak tiviert. Bei jedem Kopplungszyklus verdoppelt sich die Anzahl der reaktiven 5'-Hydroxylgruppen, wodurch man bei n Kondensatio nen 2ⁿ funktionale Hydroxylgruppen erhält. Auf Pentaerythritol basierende Synthone verdreifachen die Anzahl der reaktiven. Hydroxylfunktionen.The dendrimers can be linked to the 5 'end of the polymeric chain, internally via a modified base or via the backbone cova lent. The degree of branching of the dendrimers and ultimately also the number of functional groups that are available for the attachment of marker molecules is determined by the structure of the monomeric units that make up the tree structure. The simplest monomer is a phosphoramidite based on glycerin. Two hydroxyl groups are protected with a dimethoxytrityl group and another hydroxyl group is activated as cyanoethylphosphoramidite. In each coupling cycle, the number of reactive 5'-hydroxyl groups doubles, whereby 2 ⁿ functional hydroxyl groups are obtained for n condensations. Synthons based on pentaerythritol triple the number of reactive ones. Hydroxyl functions.

Zum Aufbau der Dendrimere stehen eine Vielzahl von monome ren Einheiten und deren Kombinationen zur Verfügung. So kann der Verzweigungsgrad durch eine größere Anzahl von Hydroxylgruppen (z. B. Sorbit; Saccharide) erhöht oder die Hydroxylgruppe durch andere nukleophile Gruppen, wie z. B. Amino- oder Thiolfunktionen ersetzt werden. Methylengruppen können durch N-Alkyl-Derivate, P-Alkyl-Derivate oder die Alkyl-Spacer durch Polyoxyethylenket ten unterschiedlichster Länge substituiert werden. A large number of monome ren units and their combinations are available. So can he Degree of branching due to a larger number of hydroxyl groups (e.g. sorbitol; saccharide) increases or the hydroxyl group through other nucleophilic groups, e.g. B. amino or thiol functions be replaced. Methylene groups can be replaced by N-alkyl derivatives, P-alkyl derivatives or the alkyl spacers by polyoxyethylene chain th of different lengths can be substituted.

Durch die Wahl von geeigneter orthogonaler Schutzgruppen technik und -strategie können diese Bäumchenstrukturen selektiv aufgebaut werden.By choosing suitable orthogonal protecting groups technology and strategy can selectively manage these tree structures being constructed.

Hinsichtlich Beispielen für mögliche erfindungsgemäß ein setzbare Dendrimere und deren Herstellungsverfahren sei auf die folgenden Beispiele sowie die bereits erwähnten Veröffentlichun gen von Urdea et al. (1987, a.a.O.) und Shchepinov et al. (1997, a.a.O.), deren Offenbarung in diese Anmeldung unter Bezugnahme aufgenommen wird, verwiesen.With regard to examples of possible one according to the invention settable dendrimers and their manufacturing process is based on the following examples as well as the aforementioned publications gen from Urdea et al. (1987, op. Cit.) And Shchepinov et al. (1997, loc. cit.), the disclosure of which in this application with reference is included, referenced.

Wie bereits erwähnt, können die Bäumchenstrukturen durch die Wahl von geeigneter orthogonaler Schutzgruppentechnik und strategie selektiv aufgebaut werden. Für diese Zwecke kann bei spielsweise ein mehrere Hydroxylgruppen umfassendes Monomer ein gesetzt werden, bei dem die einzelnen Hydroxylgruppen durch un terschiedliche Schutzgruppentypen geschützt sind. Aufgrund einer geeigneten Auswahl der Schutzgruppen sind somit Sonden zugäng lich, die eine unterschiedliche Anzahl von Markierungen und ggf. auch Markierungstypen in einem gewünschten Verhältnis enthalten. So kann beispielsweise ein auf Glycerin basierendes Monomer ein gesetzt werden, bei dem die eine Hydroxylfunktion mit einer Di methoxytritylgruppe und die andere mit einer Levulinylgruppe ge schützt ist.As already mentioned, the sapling structures can get through the choice of suitable orthogonal protective group technology and strategy can be built up selectively. For these purposes, for example a monomer comprising several hydroxyl groups be set, in which the individual hydroxyl groups by un different types of protection groups are protected. Because of a Appropriate selection of protective groups is therefore accessible to probes Lich, which have a different number of markings and possibly also contain marker types in a desired ratio. For example, a glycerine-based monomer can be used be set, in which a hydroxyl function with a Di methoxytrityl group and the other with a levulinyl group protects is.

Im Rahmen dieser Erfindung gegenwärtig besonders bevorzugte Nukleinsäuresonden beruhen auf dem in den nachfolgenden Beispie len beschriebenen sowie auch aus der Fig. 1 beispielhaft zu entnehmenden Dendrimer-Strukturkonzept.In the context of this invention, nucleic acid probes which are currently particularly preferred are based on the dendrimer structural concept described in the following examples and also shown in FIG. 1 by way of example.

The marker molecules

Als Markierungsmoleküle können sämtliche im Stand der Tech nik für eine Verwendung mit Nukleinsäuresonden oder Primern be kannten Markierungsmoleküle, wie Hapten-Moleküle, Fluoreszenz markermoleküle (Fluorochrome), Chromophore, chemolumineszierende Moleküle, radioaktiv markierte Moleküle oder enzymatisch aktive Moleküle oder Fragmente, eingesetzt werden. As marker molecules can all in the prior Tech nik for use with nucleic acid probes or primers be knew marker molecules, such as hapten molecules, fluorescence marker molecules (fluorochromes), chromophores, chemiluminescent Molecules, radiolabelled molecules or enzymatically active ones Molecules or fragments.

Markierungsmoleküle, wie Haptene oder fluoreszierende Farb stoffe, die als Phosphoramidit erhältlich sind, können direkt an die freien Hydroxylfunktionen, die die äußeren Enden der Dendri mere bilden, gekoppelt werden. Markierungen, die als Aktivester vorliegen, müssen über aminofunktionalisierte Dendrimerenden an geknüpft werden.Marking molecules such as haptens or fluorescent stains Substances that are available as phosphoramidite can be sent directly to the free hydroxyl functions that make up the outer ends of the dendri form mers, be coupled. Marks as active esters must be present via amino-functionalized dendrimer ends be knotted.

Als Haptene können beispielsweise Digoxigenin, Biotin, Di nitrophenol, Estradiol, Benzopyran oder auch Fluoresceinisothio cyanat (FITC) eingesetzt werden. Nach der Hybridisierungsreakti on können Haptene unter Verwendung eines - bevorzugt mittels ei nes fluoreszierenden Moleküls - markierten Anti-Haptens nachge wiesen werden. Beispielsweise wird Avidin (z. B. Avidin-Cy5, Avi din-FITC, Avidin-Cy3) verwendet, um Biotin-markierte Sonden nachzuweisen. Digoxigenin wird mittels eines anti-Digoxigenin- Antikörpers, z. B. eines FITCkonjugierten anti-Digoxigenin- Antikörpers oder Rhodamin-anti-Digoxigenin-Antikörpers, nachge wiesen. FITC-Markierungsmoleküle können beispielsweise unter nacheinander erfolgender Verwendung eines primären unmarkierten Kaninchen-anti-FITC-Antikörpers und eines sekundären FITC- konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-Antikörpers detektiert werden.As haptens, for example, digoxigenin, biotin, Di nitrophenol, estradiol, benzopyran or fluorescein isothio cyanate (FITC) can be used. After the hybridization reaction on can haptens using a - preferably by means of ei ne fluorescent molecule - labeled anti-hapten be shown. For example, avidin (e.g. Avidin-Cy5, Avi din-FITC, avidin-Cy3) used to make biotin-labeled probes to prove. Digoxigenin is produced using an anti-digoxigenin Antibody, e.g. B. a FITC conjugated anti-digoxigenin Antibody or rhodamine anti-digoxigenin antibody, nachge grasslands. FITC marker molecules can, for example, under successive use of a primary unlabeled Rabbit anti-FITC antibody and a secondary FITC conjugated goat anti-rabbit antibody can be detected.

Die als Markierungsmolekül im vorliegenden Zusammenhang einsetzbaren fluoreszierenden Farbstoffe sind zahlreich. Ledig lich beispielhaft seien hier Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Cyaninfarbstoffe, wie z. B. Cyanin2, Cyanin3, Cyanin3.5, Cyanin5, Cyanin5.5 und Cyanin7, Rhodamin, Rhodamin 110, Lissamin, Phyco erythrin, Fam, FluorX, Hex (Hexachlorfluorescein), Tet (Tetra chlorfluorescein), Texas Red, Fluorescein, Rox, Tamra, Joe, die BODIPY-Farbstoffe, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Spectrum Green, Spectrum Orange, die Alexa- Farbstoffe, Pyrene, Eosin oder Erythrosin angeführt.As a marker molecule in the present context fluorescent dyes that can be used are numerous. Single Lich examples are fluorescein isothiocyanate (FITC), Cyanine dyes, such as. B. Cyanin2, Cyanin3, Cyanin3.5, Cyanin5, Cyanin5.5 and Cyanin7, Rhodamine, Rhodamine 110, Lissamine, Phyco erythrin, Fam, FluorX, Hex (Hexachlorfluorescein), Tet (Tetra chlorofluorescein), Texas Red, Fluorescein, Rox, Tamra, Joe, the BODIPY dyes, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Spectrum Green, Spectrum Orange, the Alexa Dyes, pyrenes, eosin or erythrosin are listed.

Denkbar sind hier auch Donor-Akzeptor-Paare (Energie- Transfer-Paare), die kovalent an die Dendrimere gebunden werden.Donor-acceptor pairs (energy Transfer pairs) that are covalently bound to the dendrimers.

Da es bei einer zu hohen Dichte an Fluoreszenzfarbstoffen zu Fluoreszenzlöschungen kommen kann, ist in einem solchen Falle das Vorsehen von Spacer-Struktureinheiten, wie langkettigen Al- kyl- oder Polyoxyethylenketten unterschiedlicher Länge, die als Abstandshalter (Spacer) dienen, an den äußeren Dendrimerenden ein probates Mittel, um dieses Phänomen zu unterdrücken. Die hierfür vorzunehmenden präparativen Maßnahmen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt.Because there is too high a density of fluorescent dyes fluorescence quenching can occur in such a case the provision of spacer structural units, such as long-chain Al- kyl or polyoxyethylene chains of different lengths, which as Spacers are used on the outer dendrimer ends an effective means of suppressing this phenomenon. the The preparative measures to be undertaken for this are known to the person skilled in the art well known in the field.

Der Einbau der jeweiligen Markierungs- oder Reportermolekü le an jeder gewünschten Position und in beliebiger Anzahl, be vorzugt in einer automatisierten Synthese, wird insbesondere durch den Einsatz von mehrfach einander zu koppelnder "Multi- Reporter-Phosphoramidite", z. B. Multi-Biotin-Phosphoramidit, er möglicht.The incorporation of the respective marker or reporter molecule le in any desired position and in any number, be is preferred in an automated synthesis, in particular through the use of multiple "multi- Reporter phosphoramidites ", e.g. multi-biotin phosphoramidite, er possible.

Die erfindungsgemäß einsetzbaren Nukleinsäuresonden können mit ihrer gesamten Nukleinsäuresequenz durch insbesondere auto matisierte Synthese, wie sie beispielsweise in Beispiel 1 erläu tert wird, hergestellt werden. Bevorzugt werden sie jedoch aus gehend von das oder die Dendrimere enthaltenden Oligonukleo tidprimern, die z. B. wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt werden, hergestellt. Die Nukleinsäuresonde wird in diesem Falle beispielsweise durch PCR-Reaktion zur Verlängerung des Oligonu kleotidanteils bis zur gewünschten Länge hergestellt. Als PCR- Matrize dient dabei chromosomenspezifische DNA. Für die Herstel lung von hierzu geeigneten Chromosomenpräparaten sind dem Fach mann diverse Methoden bekannt. Mit diesem Verfahren gelingt es, 100% der Markierung des Primers in die synthetisierte Sonde zu inkorporieren. Alternativ erfolgt die Markierung der Nukleinsäu resonden mittels "random priming" unter Verwendung der das oder die Dendrimere enthaltenden Oligonukleotidprimer.The nucleic acid probes which can be used according to the invention can with its entire nucleic acid sequence by in particular auto Computed synthesis, as it is explained, for example, in Example 1 tert will be produced. However, they are preferred from starting from the oligonucleo containing the dendrimers tidprimers z. B. prepared as described in Example 1 are produced. The nucleic acid probe is used in this case for example by PCR reaction to extend the oligonucleotide Dressing part made up to the desired length. As a PCR Chromosome-specific DNA is used as a template. For the manuf The development of chromosome preparations suitable for this purpose are the subject of the subject various methods are known. With this procedure it is possible 100% of the labeling of the primer in the synthesized probe too incorporate. Alternatively, the nucleic acid is labeled resonde by means of "random priming" using the das oder the oligonucleotide primers containing the dendrimers.

Das erfindungsgemäße in situ-Hybridisierungsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß für die in situ-Hybridisierung min destens eine Nukleinsäuresonde verwendet wird, die mindestens ein Dendrimer umfaßt, das mit einem oder mehreren Markierungsmo lekülen markiert ist. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann mehr als ein Markierungsmolekül und/oder mehr als ein Markierungsmolekültyp an eine Dendrimerstruktur gebunden sein. Darüber hinaus kann die polymere Kette auch mehr als eine mit Markierungsmolekül(en) markierte Dendrimerstruktur tragen. Beispielsweise kann eine erfindungsgemäß einsetzbare Nukleo tidsonde mehrere Dendrimere tragen, die jeweils unterschiedliche Markierungsmoleküle daran gebunden aufweisen, wobei auch hier als eine Möglichkeit in Betracht gezogen wird, mehrere unter schiedliche Markierungsmolekültypen an ein und demselben Dendri mer vorzusehen. In einer besonderen Ausführungsform umfaßt die Nukleinsäuresonde unterschiedliche Markierungsmolekültypen in einem bestimmten, präzise festgelegten Verhältnis zueinander.The in situ hybridization method of the present invention is characterized in that for the in situ hybridization min at least one nucleic acid probe is used that contains at least comprises a dendrimer, which with one or more Marking Mo lekülen is highlighted. According to preferred embodiments of the Invention can have more than one marker molecule and / or more than a type of marker molecule attached to a dendrimer structure be. In addition, the polymer chain can have more than one Carrying a dendrimer structure marked with marker molecule (s). For example, a nucleo which can be used according to the invention tidsonde carry several dendrimers, each with a different one Have marker molecules bound to it, here too as one option is being considered, several among different types of marker molecules on the same dendriol more to be provided. In a particular embodiment, the Nucleic acid probe different types of marker molecules in a certain, precisely defined relationship to one another.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die vorstehend er läuterte Nukleinsäuresonde beispielsweise als "chromosome paint", als Zentromer-spezifische Sonde oder als Sonde zum Iden tifizieren eines Gens eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße in situ-Hybridisierungsverfahren kann an einer Vielzahl biologi scher oder klinischer Proben von Menschen, Tieren oder Pflanzen, an Zellen in Mitose und Meiose oder an Interphasezellen ausge führt werden, beispielsweise an Chromosomen, Zellkernen, aus biologischen Proben gewonnenen Zellen, wie Lymphozyten des peri pheren Bluts, Zellen aus Zellkultur, Gewebeschnitten oder an ge spreiteter DNA.In the method according to the invention, the above he refined nucleic acid probe, for example, as "chromosome" paint ", as a centromere-specific probe or as a probe for iden a gene can be used. The in situ hybridization processes can be carried out in a variety of biological ways shear or clinical samples from humans, animals or plants, on cells in mitosis and meiosis or on interphase cells is carried out, for example on chromosomes, cell nuclei cells obtained from biological samples, such as lymphocytes of the peri external blood, cells from cell culture, tissue sections or an ge spread DNA.

Das erfindungsgemäße Hybridisierungsverfahren unter Verwen dung von Dendrimer-markierten Nukleinsäuresonden erfolgt anson sten durch Standard-in situ-Hybridisierungstechniken (siehe z. B. Gall und Pardue, 1981, Meth. Enzym. 21: 470-480; Henderson, 1982, Int. Review of Cytology 76: 1-46). Eine gegebenenfalls nötige An passung der Hybridisierungsbedingungen kann durch den Fachmann anhand der zahlreichen bekannten in situ-Hybridisierungsproto kolle leicht vorgenommen werden.The hybridization method according to the invention using Generation of dendrimer-labeled nucleic acid probes takes place on an anonic basis by standard in situ hybridization techniques (see e.g. Gall and Pardue, 1981, Meth. Enzyme. 21: 470-480; Henderson, 1982, Int. Review of Cytology 76: 1-46). Any necessary An Adaptation of the hybridization conditions can be carried out by the person skilled in the art based on the numerous known in situ hybridization protocols should be made easily.

Allgemein umfaßt die in situ-Hybridisierung die folgenden hauptsächlichen Schritte:
In general, in situ hybridization comprises the following main steps:

1. Fixation of the biological sample to be analyzed;
2. Treatment of the biological sample to ensure accessibility to increase the target DNA (e.g. denaturation by means of heat or alkali);
3. If necessary, a prehybridization treatment to obtain a reduce non-specific binding (e.g. through Bloc coding of the hybridization capacity of repetitive sequences);
4. Hybridization of the nucleic acid probe (s) with the nucleic acid ren in the biological sample;
5. Washing steps to remove during hybridization ration reaction of unbound nucleic acid probe molecules;
6. Detection of the nucleic acid hybridized to the target DNA probes;
7. If necessary, counterstaining of the chromosomes.

Die in situ-Hybridisierungsreaktion kann auch gemäß einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens mit tels des "primed in situ" (PRINS)-Verfahrens erfolgen. Es kann hierfür ein PCR-Primer ähnlich dem "PRINS control oligonucleoti de primer" von Boehringer Mannheim (Kat.-Nr. 1699 172) verwendet werden, der beispielsweise ein Dendrimer mit acht Biotin- Molekulen enthält und nach dem unter 1) beschriebenen Verfahren synthetisiert werden kann. Dem Reaktionsansatz der PRINS- Reaktion werden üblicherweise keine markierten freien Nukleotide zugesetzt werden. Die PRINS-Reaktion kann nach einem gängigen Protokoll (siehe z. B. Beipackzettel für PRINS-Reagenzien der Fa. Boehringer-Mannheim) erfolgen. Die Nachweisreaktion für das Hy bridisierungssignal kann unter Zusatz von Fluorescein gekoppeltem Avidin entsprechend jener, die nachfolgend für das "chromosome painting"-Experiment beschrieben wird, ausgeführt werden. Nach nur wenigen Stunden sollte ein signifikantes Signal auf den Chromosomen nachgewiesen werden.The in situ hybridization reaction can also according to a special embodiment of the method according to the invention with by means of the "primed in situ" (PRINS) method. It can for this a PCR primer similar to the "PRINS control oligonucleotide de primer "from Boehringer Mannheim (cat. no. 1699 172) was used be, for example, a dendrimer with eight biotin Contains molecules and according to the method described under 1) can be synthesized. The reaction approach of the PRINS Reaction will usually not include any labeled free nucleotides can be added. The PRINS response can follow a common Protocol (see e.g. leaflet for PRINS reagents from Boehringer-Mannheim). The detection reaction for the Hy bridisierungssignal can with the addition of fluorescein coupled avidin in accordance with those that are described below for the "chromosome painting" experiment is described will. After just a few hours there should be a significant signal can be detected on the chromosomes.

Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Kit zur Verwen dung in dem erfindungsgemäßen in situ-Hybridisierungsverfahren. Als wesentlichen Bestandteil umfaßt der Kit eine oder mehrere der vorstehend erläuterten Nukleinsäuresonden, die sowohl ein zeln als auch in Form von Mischungen in dem Kit vorgesehen wer den können. Für die Bereitstellung der Nukleinsäuresonden in dem Kit werden diese auf im Stand der Technik übliche Weise formu liert und gegebenenfalls mit üblichen Hilfsstoffen versetzt. Der Kit kann darüber hinaus weitere für die in situ-Hybridisierung erforderliche Reagenzien enthalten, wie Formamid und Dextransul fat, und gegebenenfalls zusätzlich erforderliche Reagenzien für den Nachweis der Markierungsmoleküle, wie z. B. einen oder mehre re Antikörper, umfassen. Diese zusätzlichen Reagenzien können getrennt oder, sofern möglich, auch in Form von Mischungen be stimmter Komponenten vorgesehen werden. Die Zubereitungen der Reagenzien können ebenfalls im Stand der Technik übliche Hilfs stoffe umfassen, die jedoch die Hybridisierungsreaktion und den anschließenden Nachweis nicht negativ beeinflussen sollten. Darüber hinaus kann der Kit eine Gebrauchsanweisung ent halten, die zusätzlich Zeichnungen und Referenzabbildungen ent halten kann.The invention also relates to a kit for use manure in the in situ hybridization method according to the invention. The kit comprises one or more as an essential component of the nucleic acid probes discussed above, which contain both a tent as well as in the form of mixtures in the kit who provided the can. For the provision of the nucleic acid probes in the Kit, these are formu in the manner customary in the prior art lated and optionally mixed with customary auxiliaries. Of the Kit can also be used for in situ hybridization contain necessary reagents, such as formamide and dextransul fat, and any additional reagents required for the detection of the marker molecules, such as. B. one or more re antibodies. These additional reagents can be separately or, if possible, also in the form of mixtures certain components are provided. The preparations of the Reagents can also be auxiliary which are customary in the prior art substances include, however, the hybridization reaction and the should not have a negative impact on subsequent evidence. In addition, the kit can include instructions for use which also contain drawings and reference images can hold.

Das neue Verfahren soll den Aufwand (Material- und Arbeits kosten) bei der Markierung der Sonden drastisch verringern hel fen und wird wesentlich für den wirschaftlichen Erfolg von ent sprechend kostengünstig markierten DNA/RNA-Sonden sein.The new procedure should reduce the effort (material and labor costs) when marking the probes drastically reduce hel and is essential for the economic success of ent Speaking of inexpensive labeled DNA / RNA probes.

Durch die Ankopplung einer Mehrzahl von Markierungsmolekü len über ein einzelnes Dendrimer oder alternativ auch über meh rere Dendrimere an die Nukleinsäuresonde wird eine bedeutende Signalverstärkung erzielt. Hierbei kann unter Umständen in Ab hängigkeit von dem speziellen Aufbau des Dendrimers ein mehr als additiver Effekt beobachtet werden, d. h. das Signäl erfährt eine größere Verstärkung als dies aufgrund der Anzahl der Markie rungsmoleküle zu erwarten gewesen wäre. Es wird vermutet, daß dies ist auf einen gewissen Einfluß der Dendrimerstruktur zu rückzuführen ist.By coupling a plurality of marker molecules len over a single dendrimer or alternatively over several rere dendrimers to the nucleic acid probe becomes an important one Signal gain achieved. Under certain circumstances, Ab depending on the special structure of the dendrimer a more than additive effect can be observed, d. H. the signal experiences one greater gain than this due to the number of markies molecules would have been expected. It is supposed that this is due to a certain influence of the dendrimer structure is to be traced back.

Ein weiterer Vorteil dieser Markierung ist, daß erstmalig auch ein genau definiertes "ratio labelling" von DNA-Sonden durchgeführt werden kann. Durch geschickte Auswahl der Schutz gruppenkombinationen sind Sonden zugänglich, die eine unter schiedliche Zahl von Markierungen in einem gewünschten Verhält nis enthalten. Werden z. B. Sonden mit PCR-Primern markiert, die mit FITC bzw. mit Cyanin 3 markierte Dendrimere enthalten, kön nen die Verhältnisse der Markierungen anhand der Anzahl der ein zelnen Fluorochrom-markierten Dendrimeren genau bestimmt werden. Eine Nukleotidsonde kann z. B. drei FITC-Dendrimere enthalten, die andere FITC und Cyanin 3 im Verhältnis 1 : 2, usw. Durch die Wahl einer geeigneten orthogonalen Schutzgruppentechnik können diese Bäumchenstrukturen, wie erläutert, selektiv aufgebaut wer den.Another advantage of this marking is that it is first time also a precisely defined "ratio labeling" of DNA probes can be carried out. By skillful selection of protection group combinations are accessible to probes that have one under different number of marks in a desired ratio nis included. Are z. B. Probes labeled with PCR primers that contain dendrimers labeled with FITC or with cyanine 3, may nen the proportions of the markings based on the number of one individual fluorochrome-labeled dendrimers can be precisely determined. A nucleotide probe can e.g. B. contain three FITC dendrimers, the other FITC and cyanine 3 in a ratio of 1: 2, etc. By the Be able to choose a suitable orthogonal protective group technique these tree structures, as explained, are selectively built up the.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird für diese Zwecke das auf der Glycerinstruktur basierende Monomer eingesetzt. Da bei wird eine Hydroxylfunktion mit einer Dimethoxytritylgruppe, die andere mit einer Levulinylgruppe geschützt.In a preferred embodiment, for this purpose the monomer based on the glycerine structure is used. There at is a hydroxyl function with a dimethoxytrityl group, the other protected with a levulinyl group.

Ein derart präzises "ratio labelling" ist mit herkömmlichen Verfahren der PCR-Markierung oder mit "nick translation" nicht möglich und wird es erlauben, daß die "Viel-Farben"-Fluoreszenz mikroskopie drastisch vereinfacht werden kann. Im Vergleich zu dem klassischen "combinatorial labelling" kann mit weniger Fil tern gearbeitet werden, um zu der gleichen Anzahl unterschiedli cher Farben zu kommen.Such a precise "ratio labeling" is with conventional PCR labeling or nick translation methods do not possible and will allow the "multicolor" fluorescence microscopy can be drastically simplified. Compared to the classic "combinatorial labeling" can be done with less fil tern be worked to differentiate to the same number cher colors to come.

Der Einsatz von mehrfach aneinander zu koppelnden "Multi- Reporter-Phosporamiditen" ermöglicht den Einbau der jeweiligen Reportermoleküle an jeder gewünschten Position und in beliebiger Anzahl, wobei diese Synthese bevorzugt automatisiert wird.The use of multiple "multi- Reporter phosphoramidites "enables the incorporation of the respective Reporter molecules in any desired position and in any desired Number, this synthesis preferably being automated.

Zur Veranschaulichung wird die Erfindung im Folgenden am Beispiel zweier erfindungsgemäßer in situ-Hybridisierungsverfah ren unter Verwendung Dendrimer-markierter Sondentypen, von "chromosome paints" und von Satelliten-DNA, beschrieben. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist aber prinzipiell auch jede andere dendrimer-markierte DNA-, RNA- oder PNA-Sonde einsetzbar, deren polymerer Kettenanteil komplementär zu einem Sequenzabschnitt der in der zu untersuchenden Probe vorliegenden DNA ist oder sein könnte. For the purpose of illustration, the invention is described below on Example of two in situ hybridization methods according to the invention ren using dendrimer-labeled probe types, from "chromosome paints" and from satellite DNA. For the In principle, however, the method according to the invention is also any other dendrimer-labeled DNA, RNA or PNA probe can be used, their polymeric chain portion complementary to a sequence segment the DNA present in the sample to be examined or could be.

EXAMPLES 1. Synthesis of the nucleic acid probes PCR primer synthesis

Es wurden PCR-Primer synthetisiert, die jeweils mit einem Dendrimer mit acht Biotin- oder acht Fluorescein-Molekülen mar kiert waren. Die Synthese dieser mehrfach markierten Primer wur de an einem ABI 392 DNA Synthesizer mittels der Standardphos phoramidit-Chemie (ABI) durchgeführt. Der Synthesezyklus erfolg te gemäß dem im Benutzerhandbuch ("User Manual") von ABI be schriebenen konventionellen Protokoll für eine 40 nMol Synthese. Die Konzentration der eingesetzten Phosphoramidite (A, G, C, T) lag bei 0,05 mol/l. Die Kopplungsausbeuten wurden über Leitfä higkeitsmessung des DMT-Kations bestimmt. Die sich verzweigenden Äste des Dendrimers wurden mit dem auf der molekularen Struktur von Glycerin basierenden symmetrischen "Branching-Phosphor amidit" von Cruachem Ltd. (((DMTO-CH₂)₂CH-O-CEP); C₅₄N₆₁N₂O₈P); Be stellnummer 22-8424-17) synthetisiert. Das Branching-Phosphor amidit, das mit Acetonitril (max. 7 ppm Wasser) auf eine Konzen tration von 0,1 molar gelöst wurde, wurde an einer separaten Flaschenposition in den Synthesezyklus eingeführt. Die Zunahme des Verzweigungsgrades konnte über die Leitfähigkeitsmessungen des DMT-Kations (Verdoppelung der gemessenen Werte) verfolgt werden. Nach drei Zyklen erhielt man acht freie Hydroxylgruppen an der Peripherie des Dendrimers. Die Modifizierung mit Biotin bzw. Fluorescein erfolgte mittels der Amidite von Cruachem Ltd. (Fluorescein; Bestellnummer 22-8409-35) und ABI (Biotin; Be stellnummer 401396). Sowohl der Aufbau des Dendrimers als auch die Modifizierung der freien Hydroxylgruppen mit Biotin bzw. Fluorescein zur Markierung des Dendrimers erfolgten nach dem vorstehend erwähnten Standardprotokoll für eine 40 nMol Synthe se.PCR primers were synthesized, each marked with a dendrimer with eight biotin or eight fluorescein molecules. The synthesis of these multiply labeled primers was performed on an ABI 392 DNA synthesizer using standard phosphoramidite chemistry (ABI). The synthesis cycle was carried out according to the conventional protocol for a 40 nmol synthesis described in the ABI User Manual. The concentration of the phosphoramidites (A, G, C, T) used was 0.05 mol / l. The coupling yields were determined by measuring the conductivity of the DMT cation. The branching branches of the dendrimer were coated with the symmetrical "Branching-Phosphor amidit" from Cruachem Ltd. based on the molecular structure of glycerine. (((DMTO-CH ₂ ) ₂ CH-O-CEP); C ₅₄ N ₆₁ N ₂ O ₈ P); Order number 22-8424-17) synthesized. The branching phosphor amidite, which was dissolved with acetonitrile (max. 7 ppm water) to a concentration of 0.1 molar, was introduced into the synthesis cycle at a separate bottle position. The increase in the degree of branching could be followed via the conductivity measurements of the DMT cation (doubling of the measured values). After three cycles, eight free hydroxyl groups were obtained on the periphery of the dendrimer. The modification with biotin or fluorescein was carried out using the amidites from Cruachem Ltd. (Fluorescein; order number 22-8409-35) and ABI (biotin; order number 401396). Both the construction of the dendrimer and the modification of the free hydroxyl groups with biotin or fluorescein for labeling the dendrimer were carried out according to the standard protocol mentioned above for a 40 nmol synthesis.

Die Abspaltung vom CPG-Träger (1000 Å) und die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgte mit 33% Ammoniak-Lösung (800 µl) bei 55°C über 6 h. Nach Abziehen des Ammoniaks wurde das Oligonukleo tid nach Zuaabe von 60 µl 3 M Natrimacetatpuffer, pH 5,2, mit 2 ml Ethanol ausgefällt. Nach 20 min Abkühlen bei -20°C, Zentrifu gation bei 13 500 U/min. Dekantieren des Überstandes und Lösen des Pellets in entionisiertem oder desinfiziertem Wasser wurde die Menge an Oligonukleotid durch UV-Messung bei 260 nm be stimmt.The cleavage from the CPG support (1000 Å) and the cleavage the protective groups were carried out with 33% ammonia solution (800 μl) 55 ° C for 6 h. After stripping off the ammonia, the oligonucleotide became tid after adding 60 µl of 3 M sodium acetate buffer, pH 5.2, with 2 ml Precipitated ethanol. After 20 min cooling at -20 ° C, centrifuge gation at 13,500 rpm. Decant the supernatant and dissolve of the pellet in deionized or disinfected water be the amount of oligonucleotide by UV measurement at 260 nm it's correct.

Zur Veranschaulichung ist in Fig. 1 schematisch die Struk tur des vorstehend hergestellten PCR-Primer-Oligonukleotids ge zeigt.For illustration, the struc ture of the PCR primer oligonucleotide prepared above is shown schematically in FIG. 1.

Production of the nucleic acid probes by means of PCR

Für die Synthese der Nukleinsäuresonden mittels PCR wurden Primer, die jeweils, wie im vorangegangenen Abschnitt erläutert, mit einem Dendrimer mit acht Biotin- bzw. acht Fluorescein- Molekülen markiert waren, verwendet. Für die PCR wurde der Pri mer 6-MW (5'-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3'; N = A, C, G oder T) (Telenius et al., 1992, a.a.O.) verwendet. Der verwendete PCR-Puffer bestand aus 100 mM Tris-HCl, pH 9,0, 15 mM MgCl₂, 500 nM KCl, 1% Triton X-100, 0,1% (Gew./Vol.) Stabilisator.For the synthesis of the nucleic acid probes by means of PCR, primers were used which, as explained in the previous section, were marked with a dendrimer with eight biotin or eight fluorescein molecules. The primer 6-MW (5'-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3 '; N = A, C, G or T) (Telenius et al., 1992, loc. Cit.) Was used for the PCR. The PCR buffer used consisted of 100 mM Tris-HCl, pH 9.0, 15 mM MgCl ₂ , 500 nM KCl, 1% Triton X-100, 0.1% (w / v) stabilizer.

Als Matrize für die PCR-Reaktion diente menschliche chromo somenspezifische DNA.Human chromo served as template for the PCR reaction somebody specific DNA.

Ein 50-µl-Reaktionsansatz für die Sondensynthese enthielt folgende Komponenten:
A 50 µl reaction mixture for the probe synthesis contained the following components:

1 µl1 µl DNA-Matrize (etwa 50 ng)DNA template (approximately 50 ng) 5 µl5 µl 10 × PCR-Puffer10x PCR buffer 5 µl5 µl 10 × dNTP-Mix (Endkonzentration: jeweils 250 µmol)10 × dNTP mix (final concentration: 250 µmol each) 5 µl5 µl 6 MW-Primer, markiert mit Dendrimeren (etwa 20 µM)6 MW primers, labeled with dendrimers (about 20 µM) 2 µl2 µl 25mM MgCl₂ 25mM MgCl ₂ 0,5 µl0.5 µl Taq-Polymerase (5 U/µl; SuperTaq, HT Biotechnology Ltd.)Taq polymerase (5 U / µl; SuperTaq, HT Biotechnology Ltd.) 31,5 µl31.5 µl Aqua dest.Aqua dest.

Es wurden folgende PCR-Bedingungen gewählt (Biometra Trio Ther mocycler):
The following PCR conditions were selected (Biometra Trio Ther mocycler):

94°C 5 Min. (Anfangsdenaturierung, 1 ×)94 ° C 5 min. (Initial denaturation, 1 ×) 94°C 1 Min.94 ° C 1 min. 30 Zyklen30 cycles 62°C 1 Min.62 ° C 1 min. 72°C 1 Min.72 ° C 1 min. 72°C 5 Min.72 ° C 5 min.

Auf diese Weise wurden Nukleinsäuresonden als sogenanntes DOP-PCR-Produkt erhalten, die in der Folge in in situ-Hybridi sierungsexperimenten eingesetzt wurden. Der Dendrimer- und Mar kierungsabschnitt der so erzeugten Nukleinsäuresonden entspricht der in Fig. 1 gezeigten Struktur; es wurde lediglich der Oligo nukleotidabschnitt des dort gezeigten Moleküls durch die PCR- Reaktion verlängert.In this way, nucleic acid probes were obtained as so-called DOP-PCR products, which were subsequently used in in situ hybridization experiments. The dendrimer and marking section of the nucleic acid probes generated in this way corresponds to the structure shown in FIG. 1; only the oligo nucleotide segment of the molecule shown there was extended by the PCR reaction.

2) FISH with chromosome paints and satellite DNA in situ hybridization

Es wurde 1 µl DOP-PCR-Produkt als DNA-Sonde in 14 µl Hybri disierungspuffer für eine Hybridisierung auf einer Fläche von 22 mm × 22 mm eingesetzt. Der Hybridisierungspuffer bestand aus 50% Formamid, 20% Dextransulfat in 2 × SSC. Die DNA-Sonde wurde 5 min bei 70°C denaturiert und anschließend 60 min bei 37°C inku biert, sodaß repetitive DNA-Sequenzen reassoziieren konnten.1 μl of DOP-PCR product was used as a DNA probe in 14 μl of Hybri dizing buffer for hybridization on an area of 22 mm × 22 mm inserted. The hybridization buffer consisted of 50% formamide, 20% dextran sulfate in 2x SSC. The DNA probe was 5 min denatured at 70 ° C and then incubated for 60 min at 37 ° C biert so that repetitive DNA sequences could reassociate.

Bei der Hybridisierung von Satelliten-DNAs wurde die dena turierte Sonde direkt auf die denaturierten Chromosomen gegeben, ohne eine Reassoziierung der DNA abzuwarten.In the hybridization of satellite DNAs, dena tured probe applied directly to the denatured chromosomes, without waiting for the DNA to reassociate.

Die Herstellung von Chromosomenpräparaten erfolgte nach Standardprotokollen. Ein beispielhaftes Standardprotokoll umfaßt die folgenden Schritte:
The production of chromosome preparations was carried out according to standard protocols. An exemplary standard protocol includes the following steps:

1. Synchronization of cells by colchicine. After adding Colchicine to a final concentration of 0.1 ug / ml was the Kul incubated for 1-2 hours at 37 ° C.
2. Hypotonic treatment of the cells. After trypsinization and Ab Centrifuging the cells they were in 10 ml of 0.4% KCl solution resuspended and incubated at 37 ° C for 12 min.
3. Fixation of the cells in fixative (glacial acetic acid / methanol in ver ratio 3: 1). After adding about 1 ml of fixative, the cell centrifuged suspension and the supernatant removed. The pel let was resuspended in 10 ml fixative. Centrifugation and re suspend were repeated twice. The last resuspension tion takes place in a smaller volume (approx. 5 ml).

Die Präparation wurde bei -20°C bis zur Verwendung aufbewahrt.The preparation was stored at -20 ° C until used.

Die Objektträger mit der darauf aufgebrachten Chromosomen präparation wurden für 50-100 Sekunden in einer auf 68°C vorge heizten Küvette mit 70% Formamid/2 × SSC inkubiert und anschlie ßend in einer aufsteigenden Ethanolreihe (70%, 90%, 100%) dehy driert.The microscope slide with the chromosomes attached to it preparations were performed for 50-100 seconds in one at 68 ° C heated cuvette with 70% formamide / 2 × SSC and then incubated ßend in an ascending ethanol series (70%, 90%, 100%) dehy dries.

Die DNA-Sonde wurde auf ein zuvor ausgewähltes Areal des Objektträgers pipettiert, mit einem 22 mm × 22 mm großen Deck glas versehen und mit Fixogum versiegelt. Die Hybridisierung er folgte bei 37°C ("chromosome paints") bzw. 42°C (Satelliten- DNAs) für 24 h.The DNA probe was applied to a previously selected area of the Pipetted slide, with a 22mm × 22mm deck provided with glass and sealed with Fixogum. The hybridization he followed at 37 ° C ("chromosome paints") or 42 ° C (satellite DNAs) for 24 h.

Detection reaction

Nach der Hybridisierung wurden die Deckgläser entfernt und die Objektträger 2 × 4 min in 1 × SSC/50% Formamid, 2 × 4 min in 2 × SSC (jeweils bei 45°C) und 1 × 4 min in 0,1 × SSC (45°C) ge waschen.After the hybridization, the cover slips were removed and slides 2 x 4 min in 1 x SSC / 50% formamide, 2 x 4 min in 2 × SSC (each at 45 ° C) and 1 × 4 min in 0.1 × SSC (45 ° C) ge to wash.

Einer Äquilibrierung in 4× SSC/0,2% Tween (Raumtemperatur) folgte eine zwanzigminütige Inkubation in 4 × SSC/0,2% Tween/3% Rinderserumalbumin (Gew./Vol.) bei 37°C.Equilibration in 4 × SSC / 0.2% Tween (room temperature) this was followed by a 20-minute incubation in 4 × SSC / 0.2% Tween / 3% Bovine serum albumin (w / v) at 37 ° C.

Einem weiteren Waschschritt in 4 × SSC/0,2% Tween (Raumtem peratur) schloß sich die Nachweisreaktion der mit Biotin mar kierten DNA-Sonden mittels Fluorescein-gekoppeltem Avidin an. Die Nachweisreaktion der mit Biotin markierten DNA-Sonden er folgte in diesem Falle mittels Fluorescein-gekoppeltem Avidin und Fluorescein-gekoppeltem Anti-Avidin-Antikörper. Ersteres wurde 1 : 250 in 4 × SSC/l% Tween, 15% humanes AB-Serum verdünnt, der Antikörper 1 : 125 in der gleichen Lösung. Beide wurden im Verhältnis 1 : 1 zusammengegeben. Jeweils 100 µl dieser Mischung wurden pro Objektträger eingesetzt. Es erfolgte eine Inkubation bei 37°C für 20 min. Anschließend wurde dreimal bei 42°C mit 4 × SSC/l% Tween gewaschen.Another washing step in 4 × SSC / 0.2% Tween (Raumtem temperature) the detection reaction of the biotin mar labeled DNA probes using fluorescein-coupled avidin. The detection reaction of the biotin-labeled DNA probes er followed in this case by means of fluorescein-coupled avidin and fluorescein-coupled anti-avidin antibody. The former was diluted 1: 250 in 4 × SSC / 1% Tween, 15% human AB serum, the antibody 1: 125 in the same solution. Both were im Ratio 1: 1 put together. 100 µl each of this mixture were used per slide. Incubation followed at 37 ° C. for 20 minutes, followed by three times at 42 ° C. with 4 × SSC / 1% Tween washed.

Wurde mit PCR-Primern gearbeitet, die ausschließlich mit direkt Fluorochrom-gekoppeltem Dendrimer markiert worden waren, schloß sich statt dessen eine chromosomale Gegenfärbung mit DAPI an.Was worked with PCR primers exclusively with directly labeled fluorochrome-coupled dendrimer, Instead, a chromosomal counterstain with DAPI was used at.

a) microscopy

Die mikroskopische Analyse erfolgte an einem Zeiss Fluores zenzmikroskop (Axioplan 11), das mit Fluoreszenzfiltern der Fir ma Chroma Techn., Bratlbourgh, USA, ausgestattet war.The microscopic analysis was carried out on a Zeiss Fluores zenzmikoskop (Axioplan 11) with fluorescence filters from Fir ma Chroma Techn., Bratlbourgh, USA.

Auf die geschilderte Weise wurde mittels des in diesem Bei spiel veranschaulichten erfindungsgemäßen Verfahrens eine menschliche Metaphase mit dem für das Chromosom 4 spezifischen "paint" deutlich nachweisbar angefärbt. Die Hybridisierungs signale waren selbst unter kleiner Vergrößerung (25 × Objektiv) sichtbar und zeigten eine stabile Fluoreszenz. Chromosomen, die über den indirekten Nachweis mittels Biotin/Fluorescein-gekop peltes Avidin angefärbt wurden, zeigten eine etwas stärkere Fluoreszenz, als jene in Experimenten, in denen Fluoreszein di rekt an die Dendrimere gekoppelt war.In the manner described by means of the in this case game illustrated method according to the invention a human metaphase with that specific for chromosome 4 "paint" is clearly detectable. The hybridization signals were even under small magnification (25 × objective) visible and showed stable fluorescence. Chromosomes that via the indirect detection using biotin / fluorescein-cop peltes avidin were stained, showed a slightly stronger Fluorescence, than those in experiments in which fluorescein di was directly coupled to the dendrimers.

Claims

1. in situ hybridization method, characterized in that at least one nucleic acid probe is used for the in situ hybridization which comprises at least one dendrimer which is marked with one or more marker molecules.

2. The method according to claim 1, characterized in that the Nucleic acid probe a DNA, RNA or PNA sequence or a Hybrid of DNA, RNA and / or PNA.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that that more than one marker molecule is bound to the dendrimer that is.

4. The method according to claim 3, characterized in that two or several different types of marker molecules the dendrimers are tied.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized indicates that the marker molecule (s) is selected is or are made up of hapten molecules, fluorescent marker moles kulen, chromophores, chemiluminescent molecules, ra dioactively labeled molecules or enzymatically active Mo leaks or fragments.

6. The method according to claim 5, characterized in that the or the marker molecule (s) is or are selected from Biotin, digoxigenin, dinitrophenol, fluorescein isothiocya nat (FITC), cyanine dyes, such as. B. Cyanin2, Cyanin3, Cyanin3.5, Cyanin5, Cyanin5.5 and Cyanin7, Rhodamine, Rhoda min 110, lissamine and phycoerythrin.

7. The method according to claim 6, characterized in that the or the marker molecule (s) is or are selected from Biotin and fluorescein isothiocyanate (FITC).

8. The method according to claim 4, characterized in that the Nucleic acid probe comprises a dendrimer which with one or several hapten molecules and one or more fluores zenzmarkermoleküle is marked.

9. The method according to claim 7, characterized in that the Nucleic acid probe comprises a dendrimer which with one or several biotin molecules and one or more FITC Molecule (s) is marked.

10. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized draws that the nucleic acid probe has two or more Den drimere includes.

11. The method according to claim 9, characterized in that min at least one of the dendrimers with more than one markie is marked.

12. The method according to claim 9, characterized in that min at least one of the dendrimers with two or more under different marker molecule types is marked.

13. The method according to any one of claims 9 to 11, characterized ge indicates that the nucleic acid probe has two or more Dendrimers, each with haptens or fluorescence marker molecules or combinations of haptens and / or Fluorescent marker molecules are marked in different conditions.

14. The method according to claim 13, characterized in that the Nucleic acid probe dendrimers, each with FITC or Biotin are labeled in different ratios contains.

15. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that the nucleic acid probe is a "chromosome paint "is.

16. The method according to any one of claims 1 to 14, characterized ge indicates that the nucleic acid has a centromere specific probe is.

17. The method according to any one of claims 1 to 14, characterized ge indicates that the nucleic acid probe is a probe for Identifying a gene is.

18. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that the hybridization reaction to Chromo somen takes place.

19. The method according to any one of claims 1 to 17, characterized ge indicates that the hybridization reaction on cell nuclei he follows.

20. The method according to any one of claims 1 to 17, characterized ge indicates that the hybridization reaction is spread on ter DNA takes place.

21. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that the hybridization reaction in one Tissue cut is done.

22. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that the in situ hybridization reaction by means of the "primed in situ (PRINS)" method.

23. The method according to claim 22, characterized in that the PRINS reaction carried out using nucleic acid probes containing differently labeled dendrimers, or by means of different nucleic acid probes that each because contain differently labeled dendrimers.

24. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that the dendrimer-containing nucleic acids resonde using the dendrimer or dendrimers ent holding oligonucleotide primers.

25. The method according to claim 24, characterized in that the Nucleic acid probes by polymerase chain reaction (PCR Reaction) to extend the dendrimers ent holding oligonucleotide primers are produced.

26. The method according to claim 24, characterized in that the Marking of the nucleic acid probes with the dendrimer structure ren by means of "random priming" using the or the dendrimers containing oligonucleotide primers takes place.

27. Kit for use in an in situ hybridization ver drive according to one of claims 1 to 26, characterized records that he has at least one nucleic acid probe that comprises at least one dendrimer with one or more ren marker molecules is marked, optionally white other reagents for cytogenetics and, if necessary, one Instructions for use included.

28. Kit according to claim 27, characterized in that it is as other reagents for cytogenetics formamide, dextran sulfate and / or, if necessary, additionally required Reagents for the detection of marker molecules, such as one or more antibodies.

29. Kit according to one of claims 27 or 28, characterized draws that he has several different DNA, RNA and / or PNA probes.

30. Kit according to claim 29, characterized in that it is several re different "chromosome paints" included.

31. Kit according to claim 30, characterized in that it is several re different "chromosome paints", each one are marked differently.

32. Kit according to claim 30 or 31, characterized in that he single or several different "chromosomes" paints "as probes for the identification of an or multiple genes and / or other DNA sequences.