DE10154540A1

DE10154540A1 - Verfahren zur Prädikation oder Prognose der Wirksamkeit einer Tumorbehandlung

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Publication number: DE10154540A1
Application number: DE2001154540
Authority: DE
Original assignee: Cellcontrol Biomedical Labs AG
Current assignee: Cellcontrol Biomedical Labs AG
Priority date: 2001-11-07
Filing date: 2001-11-07
Publication date: 2003-05-22
Also published as: WO2003040724A1

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Prädiktion oder Prognose der Wirksamkeit einer Tumorbehandlung, die einen Interaktionspartner und ein Therapeutikum umfaßt und deren Wirksamkeit durch Messung einer Modulation eines EGF-Rezeptor-vermittelten Signals prädiziert oder prognostiziert wird. Darüber hinaus umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation und Modifikation neuer Interaktionspartner und Therapeutika für eine Tumorbehandlung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prädiktion oder Prognose der Wirksamkeit einer Tumorbehandlung, die einen Interaktionspartner und ein Therapeutikum umfaßt und deren Wirksamkeit durch Messung einer Modulation eines EGF-Rezeptor-vermittelten Signals prädiziert oder prognostiziert wird. Darüber hinaus umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation und Modifikation neuer Interaktionspartner und Therapeutika für eine Tumorbehandlung.
Verschiedene Dokumente werden im Text dieser Beschreibung zitiert. Der Offenbarungsgehalt der zitierten Dokument (einschließlich aller Herstellerbeschreibungen, -angaben etc.) ist hiermit per Referenz Teil dieser Beschreibung.
Während in der Vergangenheit Infektionskrankheiten im Mittlepunkt der Medizin standen, stellt heute die Krankheit Krebs das Gebiet dar, auf dem der Großteil der medizinischen Forschung angesiedelt ist.
Jährlich werden 1,2 Millionen neue Tumore eines invasiven Typs diagnostiziert. 560 000 Amerikaner starben 2000 an einer Form von Krebs (siehe "Epidemilogy: Reports find cancer rating declining" in "Health & Medicine Week", 5-29, 2000).
Die Anzahl der jährlichen Neudiagnosen wird bei Frauen vom Brustkrebs und bei Männern vom Prostatakrebs angeführt. Bei der Todeszahl verdrängt der Lungenkrebs die beiden Entitäten mit der größten Zahl der Neuerkrankungen auf die Plätze zwei und drei.
Die Therapie von Tumorpatienten stellt eine große Herausforderung für den behandelnden Onkologen dar. Das Behandlungsspektrum des Arztes umfaßt dabei die operative Entfernung des Tumors, die Bestrahlung des Patienten, sowie die Verabreichung von tumorschädigende Agenzien. Diese Agenzien werden nachfolgend Therapeutika genannt. Aufgrund der Individualität von Tumoren läßt sich bis heute keine auf alle Patienten ansprechende Standardtherapie durchführen. Zusätzlich kann der Onkologe auf keine zuverlässigen Tests zurückgreifen, die ihn bei der Auswahl eines oder mehrerer Therapeutika zur Behandlung eines Patienten unterstützen. Der Grund für das Fehlen solcher Test liegt in der oben genannten Individualität der Tumore als auch an dem Mangel verwendbarer funktionaler Testverfahren. Alle heute verfügbaren funktionalen Tests haben folgende Nachteile:

a) lange Versuchszeiten (7-14 Tage);
b) limitierte Auswertbarkeit durch die Gefahr von Kontaminationen;
c) Bedarf an großen Tumorzellmengen;
d) Notwendigkeit der Kultivierung von Tumorzellen.

Diese Einschränkungen können die Meßergebnisse verändern oder die Auswertung sogar unmöglich machen.
Für die Tumorbehandlung stehen verschiedene Therapeutika zur Verfügung. Diese lassen sich in Zytostatika, Zytokine, zytostatisch wirksame Hormone oder Hormonderivate und zytostatisch wirkende Antikörper unterteilen. In Deutschland sind 55 Zytostatika, 8 Zytokine, 17 Hormone oder Hormonderivate und 3 monoklonale Antikörper als Krebstherapeutika zugelassen (Preiss et al. (2000), Onkologie 2000: Empfehlungen zur Therapie, 10. Auflage, W. Zuckschwerdt Verlag GmbH).
Brustkrebs ist die häufigste Form von Krebs bei Frauen und die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache nach Lungenkrebs. Die Heterogenität beim Brustkrebs bringt das Problem mit sich, daß Standardtherapien kaum zur Verfügung stehen. Tumore einer Entität, aber unterschiedlicher Morphologie können sich sehr unterschiedlich verhalten. Um eine möglichst spezifische Therapie anwenden zu können, müssen prognostische und therapierelevante Faktoren hinzugezogen werden.
Gängige Verfahren zur Tumorbehandlung sind heute Operation, Bestrahlung, Hormon- und Chemotherapie. Diese werden häufig kombiniert, um die Effizienz der Behandlung zu verbessern.
Bei der Chemotherapie erfolgt die Behandlung mit Zytostatika. Es gibt heute eine Vielzahl solcher Substanzen, und für die Zusammenstellung der passenden Chemotherapie wird die klassische Morphologie und bereits erste "surrogate Marker" eingesetzt. Bei der Indikation Mammakarzinom kommen ca. 15 verschiedene Behandlungen mit Zytostatika in Frage (Onkologie (2000) 10). Meist haben diese Zytostatika typische Nebenwirkungen, da sie relativ unspezifisch wirken. Für die Wirkung der Zytostatika nutzt man den erhöhten Metabolismus von Tumorzellen. Deshalb sind bei einer Chemotherapie schnell wachsende Zellen, wie Immunzellen oder Haarzellen ebenfalls betroffen. Der Angriff von Immunzellen manifestiert sich in einer unter Therapie zunehmenden Immunschwäche, welche oft die Ursache von therapieassoziierten Komplikationen ist.
Individuelle Unterschiede bezüglich der Wirkung der Zytostatika ließen sich bislang im Vorfeld meist nicht klären. Daher werden in vielen Fällen suboptimale Therapieformen gewählt.
Eine spezifische Therapie, welche die Toxizität gezielt auf Tumorzellen richtet, wäre der Ansatz, der das Auftreten von Nebenwirkungen reduzieren könnte. Daher werden große Anstrengungen unternommen, tumorspezifische "Targets" zu identifizieren, die charakteristisch für Tumore sind, sogenannte Tumormarker. Diese könnten einerseits zur Diagnose, andererseits auch für die Therapie verwendet werden.
Bereits im Stand der Technik beschrieben sind spezifische Therapieformen erfordern beispielsweise monoklonale Antikörper, die spezifisch mit Tumorzellen, bzw. Targetstrukturen auf deren Oberfläche, interagieren (Kischkel et al (1995), EMBO J., 14, 5579-88). Als Folge einer solchen spezifischen Interaktion können Tumorzellen unter anderem durch Antikörper-induzierte Signale eliminiert werden. Diese Antikörperinduzierten Signale sind oft Signale, die durch Bindung der spezifischen Antikörper an einen Rezeptor auf der Zelloberfläche induziert werden. Die Bindung eines Antikörpers kann aber beispielsweise auch die Bindung eines physiologischen Liganden kompetitieren.
Für Rezeptoren für Wachstumsfaktoren ist in diesem Zusammenhang bereits eine Inhibition des Wachstumsimpuls beschrieben (Zimmermann et al. (2001) Microvasc. Res. 62, 15-25).
Ein Beispiel für eine Gruppe von Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, deren induziertes Signal als relevant in der Tumorentwicklung beschrieben wurde, ist die Familie der Rezeptoren für epidermale Wachstumsfaktoren (epidermal growth receptor family/EGFR-Familie). Für diese Rezeptorfamilie wurden bereits transmembrane Mitgliedern beschrieben. Diese Proteine besitzen intrinsische Tyrosinkinaseaktivität. Beispiele hierfür sind der EGFR (Her1, erbB-1; Ullrich et al. (1984), Nature 309: 418-425), Her2 (Her2/neu, erbB-2; Coussens et al., (1985), Science 230: 1132-1139), Her3 (erbB-3; Kraus et al. (1989), PNAS 86: 9193-9197; Guy et al. (1994), PNAS 91: 8132-8136) und Her4 (erbB-4; Plowman et al. (1993), PNAS 90: 1746-1750). Diese Rezeptoren werden in normalen Epithelien, mesenchymalen, wie neuronalen Geweben exprimiert. Aufgrund der Tatsache, daß Rezeptoren dieser Familie in manchen Tumoren vermehrt auftreten wurde postuliert, daß diese eine Rolle bei der Tumorentstehung und dem Fortschreiten der Tumorentwicklung spielen (Cooke et al., (2001), European Journal of Cancer, 37: S3-S10).
Von besonderem Interesse scheint hierbei der Rezeptor Her2 zu sein. Dieser Rezeptor wurde zunächst für die Ratte (Shih et al. (1981), Nature 290: 261-264), später auch für den Menschen (Coussens et al. (1985) Science 230: 1132-1139) beschrieben. Für das humane Mammakarzinome wurde eine Überexpression von Her2 gezeigt (King et al. (1985), Science 229: 974-976). Diese Überexpression wurde darüber hinaus mit einer schlechten Prognose, einer kürzeren Gesamtüberlebenszeit und einem aggressivem Phänotyp in Verbindung gebracht (Slamon et al. (1987), Science 235: 177-182). Eine Überexpression von Her2 ist über die Karzinome der Mamma hinaus für Karzinome des Kolon (Meltzer et al. (1987), Gastroenterology 92: 1174-1180), der Lunge (Cline et al. (1987), Cancer 60: 2669-2674), des Magens (Jähne et al. (1994), Chirurg 65: 307-311), des Ovars (Meden et al. (1997), European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology 71: 173-179), sowie des (Buchler et al. (2001), Journal of Gastrointestinal Surgery 5: 139-146) beschrieben. Aus diesem Grund gilt Her2 als prognostischer Faktor.
Das transformierende Potential von Her2 wurde an NIH3T3 Zellen untersucht, welche mit dem Her2 Gen transfiziert wurden. Eine moderate Expression konnte keine transformierende Aktivität hervorrufen, während eine verstärkte Expression zur Aktivierung des Onkogen führte (Di Fiore et al. (1987), Science 237: 178-182). Die Gruppe der EGFR zählt zu den Typ I Rezeptortyrosinkinasen (RTK). Die Signalübertragung erfolgt nach dem Stand der Technik durch eine ligandeninduzierte Stabilisierung eines Rezeptordimers. Die Liganden der EGFR- Familie haben einen bivalenten Charakter. Ein hochaffiner Bindungsplatz mit hoher Spezifität für den einen Rezeptor (EGFR, Her3, Her4) befindet sich am N-terminalen Ende und erleichtert die Bindung der niederaffinen Bindungsstelle, deren Spezifität breiter ist (Tzahar et al. (1997), The EMBO Journal 16: 4938-4950) und den Heterodimerisierungsartner des Rezeptors festlegt (Tzahar und Yarden (1998) Biochim Biphys Acta, 1377, M25-27). Her2, das nur eine niederaffine Bindungsstelle für die beschriebenen physiologischen Liganden besitzt, interagiert mit Rezeptoren, die eine hochaffine Bindungsstelle besitzen, z. B. Her2 oder Her4 (Horan et al. (1995) Journal of Biological Chemistry 270: 24604-24608).
Die Heterodimerisierung des Rezeptors induziert eine intrinsische Protein-Tyrosin- Kinaseaktivität und eine Tyrosin-Autophosphorylierung. Diese zellulären Ereignisse induzieren nach dem Stand der Technik eine Anlagerung und Phosphorylierung verschiedener intrazellulärer Substrate (Steen H, et al. (2001) J Biol Chem. In press).
Es sind zu Zeit mindestens sechs Liganden für diese Rezeptoren bekannt, die mit unterschiedlichen Affinitäten an die Rezeptoren binden. Heregulin (HRG) ist der am besten untersuchte (indirekte) Ligand für den HER2 Rezeptor. Diese Liganden induzieren durch Bindung an die Rezeptoren der EGFR-Familie ein spezifisches Signal (EGFR-vermitteltes Signal).
Aufgrund der hohen Proliferations- und Metastasierungsrate von Her2- überexprimierenden Zellen (Her2⁺⁺) (agressiver Phänotyp (Cooke et al., (2001), European Journal of Cancer, 37: S3-S10)) wurde Her2 als Target für eine Immuntherapie ausgewählt.
Es wurde gezeigt, daß das Wachstum von humanen Her2⁺⁺ Brustkrebszellen mit murinen Antikörpern inhibiert wird. Entsprechende Antikörper wirken auch im natürlichen Umfeld von humanen Tumoren wachstumsinhibierend (Basalega et al. (1996), Journal of Clinical Oncology 14: 737-744; Lewis et al. (1993), Cancer Immunology, Immunotherapy 37: 255-263; Shepard et al. (1991), Journal of Clinical Immunology 11: 117-127).
Ein Antikörper mit der beschriebenen inhibitorischen Funktion wird von GENENTECH als Herceptin (Trastuzumab) vermarktet. Obwohl auch Daten über eine Monotherapie mit Herzeptin publiziert wurden (Cobleigh et al. (1999), Journal of Clinical Oncology 17: 2639-2648), wird der mAb heute in Kombination mit Zytostatika wie Cisplatin eingesetzt (Baselga et al. (1998), Cancer Research 58: 2825-2831; Pegram et al. (1999), Oncogene 18: 2241-2251). Herceptin gilt als relativ gut verträgliches Arzneimittel.
Darüber hinaus befinden sich Antagonisten der intrazellulären EGFR-vermittelten Signalwege in der klinischen Entwicklung. Dies sind in der Regel kleine chemische Verbindungen (wie z. B. das Quinazolin ZD1839 (Iressa™) gegen die Tyrosinkinase des EGF Rezeptors (HER1).
Weitere Untersuchungen mit dem oben genannten mAb Herzeptin zeigten, daß die Wirksamkeit einer Herceptintherapie von der Her2 Überexpression/Genamplifikation abhängt. Aus diesem Grund ist heute ein positiver Her2-Rezeptortest Voraussetzung für eine Behandlung mit Herceptin.
Von der FDA (Food and Drug Administration der USA) sind in diesem Zusammenhang zwei Testverfahren zugelassen (immunhistochemische Färbung (IHC) und Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH)). Eine Genamplifikation kann außerdem mit Hilfe der "Polymerase Chain Reaction" (PCR) oder dem "Southern Blot" (SB) nachgewiesen werden. Die Expression des Proteins kann auch mit Hilfe eines "Enzyme-Linked Immunosorbation Assay" (ELISA) nachgewiesen werden. Diese Tests sind u. a. in der Arbeit von Waldenmaier (Etablierung eines Her2/neu- Rezeptortests auf der Grundlage sensor-basierender Technologien (2001), Diplomarbeit der Fakultät für Biologie der Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg im Breisgau) näher beschrieben und miteinander verglichen worden. Auf Offenbarungsgehalt dieser Diplomarbeit wird hiermit vollständig, als z. T. bevorzugte Ausführungsform des unten näher beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens, Bezug genommen.
Nach IHC werden Patienten in vier Gruppen eingeteilt: 1. Status 0 und 2. 1+ werden als negativ eingeteilt. Der Status 3. 2+ gilt als leicht positiv und die FDA empfiehlt in solchen Fällen einen zusätzlichen FISH Test um den Status eindeutig festzulegen. Der Status 4. 3+ ist das laut IHC positive Ergebnis. Bei der FISH-Diagnostik erfolgt die Unterteilung in positive und negative Fälle, da die Amplifikation genau definiert werden kann. Obwohl in Patienten eine Überexpression von Her2 vor einer entsprechenden Therapie nachgewiesen wird, sprechen nur 10 bis 20% dieser Patienten auf diese teure Therapie an (Baselga (2001), Annals of Oncology 12 suppl. 1: S49-S55).
Ein Test, der eine eindeutigere Prognose für die Wirksamkeit einer Herzeptin- Therapie oder einer damit verwandten Therapie, wäre also, auch aus Gründen der Gesundheitsökonomie, wünschenswert. Darüber hinaus ist es für die Entwicklung neuer Therapieformen erstrebenswert, Substanzen zu finden, die in Kombination mit Herzeptin oder ähnlichen Arzneimitteln für eine effektive Tumortherapie geeignet sind. Ebenfalls sollten Substanzen identifiziert werden, die in Kombination mit bekannten Therapeutika eine entsprechende oder verbesserte Wirksamkeit als Herzeptin haben und dabei vorzugsweise kostengünstiger hergestellt werden können.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit das technische Problem zugrunde, ein einfach zu nutzendes Verfahren bereitzustellen, daß eine verbesserte Prognose über die Wirksamkeit einer Therapie von Tumoren erlaubt, die mit einer pathologischen Expression von EGF-Rezeptoren oder von Proteinen, die an der Signaltransduktion des entsprechenden Rezeptorsignals beteiligt sind, in Verbindung stehen.
Dieses technische Problem wird durch die in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion oder Prognose der Wirksamkeit einer Tumorbehandlung umfassend

a) Inkontaktbringen einer Probe, die lebende Zellen mit einer abnormen Aktivität eines Mitglieds der EGF-Rezeptorfamilie aufweist mit
- a) einem Interaktionspartner, wobei der Interaktionspartner das durch den natürlichen Liganden vermittelte Signal des Rezeptors moduliert; und
- b) einem oder mehreren Therapeutika
unter Bedingungen, die eine Interaktion der lebenden Zellen mit dem Interaktionspartner und dem dem einen oder mehreren Therapeutika erlauben; und
b) Messung des über das Mitglied der EGF-Rezeptorfamilie vermittelten Signals, wobei die Modulation dieses Signals die Wirksamkeit der Tumorbehandlung prädiziert oder prognostiziert.

Der Begriff "Zellen mit einer abnormen Aktivität eines Mitglieds der EGF- Rezeptorfamilie" beschreibt Zellen, bei denen das EGFR-vermittelte Signal unphysiologisch (pathologisch) verändert ist. Diese Veränderung umfaßt sowohl eine Ligand-induzierte Veränderung des Signals, als auch Veränderung, die ein Signal "weiter unterhalb" im Signalweg ("downstream") initiiert. Diese Veränderung kann sowohl eine Steigerung als auch eine Inhibition des physiologischen Signals sein.
Die "Proben lebender Zellen" werden entweder für das erfindungsgemäße Verfahren entsprechend der in der Beschreibung weiter unten beschriebenen Verfahren isoliert oder stammen aus Kulturen isolierter Patientenzellen(-gewebe). Der Begriff "Interaktionspartner" wird im Kontext mit der vorliegenden Erfindung zur Beschreibung eines Moleküls verwendet, das spezifisch mit einem anderen Molekül wechselwirkt. Diese Wechselwirkung ist durch eine Modulation des von dem natürlichen Liganden induzierte Signal gekennzeichnet. Die Definition der Interaktionspartner umfaßt organische als auch anorganische Substanzen und Verbindungen. Dies sind z. B. Makromoleküle und kleine Moleküle oder niedermolekulare Moleküle. Der Begriff schließt ferner sowohl chemisch unmodifizierte als auch modifizierte Moleküle ein.
Unter dem Begriff "Makromoleküle" werden Moleküle mit einer hohen molekularen Komplexität oder einem hohen Molekulargewicht verstanden. Vorzugsweise sind dies Biomoleküle, wie z. B. Biopolymere, insbesondere Proteine, Oligo- oder Polypeptide, aber auch DNA, RNA, Oligo- oder Polynucleotide, prosthetische Gruppen, Lipide, Oligo- und Polysaccharide, sowie deren Modifikationen, sowie auch synthetische Moleküle verstanden. Im Zusammenhang mit Proteinen kommen insbesondere Liganden in Betracht, aber auch Proteine oder Peptide, die Epitope oder antigene Determinanten von Proteinen repräsentieren. Ferner können die Proteine auch Fusionsproteine sein. Der Begriff Peptide oder Proteine umfaßt sowohl natürliche als auch synthetische Peptide oder Proteine. Beispiele für natürliche Proteine umfassen u. a. Antikörper, Antikörperfragmente, Rezeptoren, die an ihre spezifischen Liganden binden, peptidische Liganden, die mit ihren spezifischen Rezeptoren oder Peptiddomänen, die mit spezifischen Substraten, einschließlich Proteinen und Coenzymen, und anderen Peptiden oder Enzymen etc. interagieren. Ebenfalls umfaßt sind hiermit rekombinant hergestellte Formen der vorgenannten Proteine oder Peptide. Natürliche Peptide umfassen entsprechend unter anderem Fragmente der oben beschriebenen Proteine, die mit spezifischen Affinitätsliganden interagieren. Synthetische Proteine oder Peptide umfassen sowohl zur Expression gebrachte Pseudogene oder Fragmente davon, als auch Proteine oder Peptide mit einer zufälligen Aminosäuresequenz.
Unter dem Begriff "kleine Moleküle" oder "niedermolekulare Moleküle" werden Moleküle verstanden, die von geringerer molekularer Komplexität sind, als die oben definierten Makromoleküle. In der Literatur wird der Begriff "kleine Moleküle" ("small molecules") oder "niedermolekulare Moleküle" ("low molecular weight molecules") nicht einheitlich verwendet. In WO 89/03041 und WO 89/03042 werden Moleküle mit Molekülmassen bis 7000 g/mol als kleine Moleküle beschrieben. Üblicherweise werden jedoch Molekülmassen zwischen 50 und 3000 g/mol, häufiger aber zwischen 75 und 2000 g/mol und meistens im Bereich zwischen 100 und 1000 g/mol angegeben. Beispiele sind dem Fachmann aus den Schriften WO 86/02736, WO 97/31269, US-A-5928868, US-A-5242902, US-A-5468651, US-A-5547853, US-A-5616562, US-A-5641690, US-A-4956303 und US-A-5928643 bekannt.
Als Beispiele für solche kleinen Moleküle können Oligomere oder auch kleine organische Moleküle angeführt werden, wie Oligopeptide, Oligonucleotide, Kohlenhydrate (Glycoside), Isoprenoide oder Lipidstrukturen. In der Literatur stellt zumeist das Molekulargewicht die Definitionsgrundlage für solche kleinen Moleküle dar.
Die Definition der Interaktionspartner umfaßt damit Moleküle, die eine spezifische Wechselwirkung mit einem Zielmolekül aufweisen. Entsprechende Zielmoleküle sind Bestandteil der EGFR-vermittelten Signaltransduktionskette. Mit dieser Beschreibung sind damit sowohl Stoffe umfaßt, die mit extrazellulären Domänen (z. B. der Rezeptoren) oder mit intrazellulären Zielmolekülen interagieren. Beispiele für solche intrazelluläre Zielmoleküle, die Bestandteil der EGFR-vermittelten Signaltransduktionskette sind, umfassen Inhibitoren von Kinasen (z. B. Tyrosinkinase-Inhibitoren, Proteinkinase C-Kinaseinhibitoren/PKC- Kinaseinhibitoren) aber auch andere, z. B. kompetitierbare Substrate, die für diese Signaltransduktion relevant sind.
Eine spezifische Interaktion oder Wechselwirkung kann beispielsweise mit einem "Schlüssel-Schloß-Prinzip" charakterisiert werden. Der Interaktionspartner und das Zielmolekül, besitzen Strukturen oder Motive, die spezifisch zueinander passen, wie z. B. eine antigene Determinante (Epitop), die mit der Antigen-Bindungstelle eines Antikörpers wechselwirkt. Entsprechend steht spezifische Interaktion im Gegensatz zu einer universelleren, unspezifischen Wechselwirkung. Durch die Kenntnis der Struktur eines der Interaktionspartner lassen sich Rückschlüsse auf mögliche bevorzugte Strukturen bzw. auf spezielle Strukturelemente eines geeigneten damit interagierenden Partners ziehen.
Der Begriff "natürliche Liganden" definiert natürlich vorkommende Liganden, die spezifisch mit Rezeptoren der EGFR-Familie interagieren. Beispiele hierfür sind dem Fachmann aus der Literatur bekannt (Pinkas-Kramarski et al. (1997), J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2 (2) 97-107)
Der Begriff "Therapeutikum" beschreibt im Kontext der vorliegenden Erfindung Substanzen (Wirkstoffe), die selbst als Arzneimittel oder als Bestandteil eines solchen verabreicht werden können. Darüber hinaus umfaßt der Begriff auch Behandlungsverfahren, die in der Tumortherapie verwendet werden. Beispiele für solche Behandlungsverfahren sind Beispielswiese Bestrahlungstherapien oder hyperthermische Therapieformen.
Die Bedingungen, die eine Interaktion der lebenden Zellen mit dem Interaktionspartner und dem Therapeutikum erlauben, gewährleisten, daß eine Interaktion nicht durch weitere Komponenten verhindert werden. Diese Komponenten schließen z. B. Bestandteile von Kulturmedien ein. Diese Bedingungen im erfindungsgemäßen Verfahren schließen darüber hinaus ein, daß weitere Substanzen, die gegebenenfalls auch nachweislich nicht oder nur gering wirksam sind, zugesetzt werden.
Der Begriff "Modulation" definiert im Zusammenhang mit dieser Erfindung sowohl eine Steigerung, als auch, in einer alternativen Ausführungsform, eine Inhibition des EGFR-vermittelten Signals. Eine Inhibition umfaßt bevorzugt auch eine vollständige Blockade dieses Signals.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Modulation dadurch erreicht, daß der Interaktionspartner anstelle des natürlichen Liganden an den Rezeptor bindet und damit eine Bindung des natürlichen Liganden unterbindet oder teilweise unterbindet (kompetitiert).
Die Wirksamkeit der getesteten Tumorbehandlung läßt sich aus der gemessenen Modulation des Signals ableiten.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Modulation des Rezeptor-vermittelten Signals in einer lebenden Zelle mit einer abnormen Aktivität eines Mitglieds der EGFR-Familie mit der Modulation des entsprechenden und unter den gleichen Verfahrensbedingungen herbeigeführten Signals in einer lebenden Zelle mit normaler Aktivität des Mitglieds der EGFR- Familie verglichen. Die Wirksamkeit der Tumorbehandlung wird hierbei durch den Unterschied in der Modulation prädiziert oder prognostiziert.
Entsprechend der oben beschriebenen Definition für Zellen mit einer abnormen Aktivität eines Mitglieds der EGFR-Familie sind Zelle mit normaler Aktivität des Mitglieds der EGFR-Familie dadurch gekennzeichnet, daß das EGFR-vermittelte Signal nicht unphysiologisch verändert ist.
Die gleichen Verfahrensbedingungen beziehen sich auf die Bedingungen, unter denen die Probe der jeweiligen Zellen mit dem Interaktionspartner und dem Therapeutikum in Kontakt gebracht werden. Bevorzugt werden die Zellen mit der abnormen und der normalen Aktivität des Mitglieds der EGFR-Familie in parallelen Ansätzen entsprechend des beschriebenen Verfahrens inkubiert.
Bevorzugt ist das in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Therapeutikum ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus einer Substanz mit spezifischer toxischer Wirkung, einem ionischen Strahler, einem Antikörper und einem hyperthermischen Therapeutikum.
Weiter bevorzugt ist das Therapeutikum eine Kombination aus zwei oder mehreren Therapeutika.
Darüber hinaus bevorzugt sind der Interaktionspartner und das Therapeutikum/die Therapeutika miteinander fusioniert. Der Begriff "fusioniert" beschreibt im Zusammenhang mit der Erfindung die Kopplung der Interaktionspartner mit dem Therapeutikum/den Therapeutika zu einer Verbindung. Entsprechend ist das Therapeutikum in dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Substanz.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines für die Tumorbehandlung wirksamen Therapeutikums oder einer Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum umfassend

a) Inkontaktbringen einer Probe, die lebende Zellen mit einer abnormen Aktivität eines Mitglieds der EGF-Rezeptorfamilie aufweist mit
- a) einem Interaktionspartner, wobei der Interaktionspartner das durch den natürlichen Liganden vermittelte Signal des Rezeptors moduliert; und
- b) einer oder mehreren Testsubstanzen unter Bedingungen, die eine Interaktion der lebenden Zelle mit dem Interaktionspartner und der Testsubstanz erlauben;
b) Messung des über das Mitglied der EGF-Rezeptorfamilie vermittelten Signals; und
c) Vergleich des Meßergebnisses aus Schritt (b) mit einem Meßergebnis, das ohne die Zugabe der Testsubstanz erhalten wurde, wobei die Modulation dieses Signals mit der Testsubstanz im Vergleich zum Wert ohne die Testsubstanz ein Indiz für die Wirksamkeit der Testsubstanz als Therapeutikum oder als Leitsubstanz für ein Therapeutikum darstellt.

Der Begriff "Leitsubstanz" beschreibt im Zusammenhang mit der Erfindung Substanzen, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert wurden. Eine solche Leitsubstanz wird jedoch, im Gegensatz zu einem identifizierten Therapeutikum, so weiter formuliert, daß pharmakologische Parameter optimiert werden. Bevorzugt optimierte Parameter werden in der weiteren Beschreibung der Erfindung definiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Interaktionspartner ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment oder Derivat davon.
Monoklonale Antikörper und Verfahren zu deren Herstellung sind dem Fachmann bekannt. Diese basieren auf einer zuerst von Köhler und Milstein (1975) beschriebenen Methode. Diese ist u. a. in dem Laborhandbuch von Harlow und Lane (Antibodies, A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory; (1988); Chapter 6) detailliert beschrieben. Durch die Definition umfaßt sind ebenfalls bispezifische Antikörper, synthetische Antikörper und Fragmente oder Derivate dieser Antikörper. Diese umfassen Fragmente wie Fab, Fv oder scFv und chemisch modifizierte Derivate dieser Antikörper oder Antikörperfragmente.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der monoklonale Antikörper ein IgG.
Ebenfalls bevorzugt ist der monoklonale Antikörper ein humanisierter Antikörper.
In einer darüber hinaus bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der humanisierte Antikörper Herceptin (Trastuzumab).
Die Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zur Identifizierung eines für die Tumorbehandlung wirksamen Therapeutikums oder einer Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum umfassend

a) Inkontaktbringen einer Probe, die lebende Zellen mit einer abnormen Aktivität eines Mitglieds der EGF-Rezeptorfamilie aufweist mit
- a) einem oder mehreren Tumortherapeutika; und
- b) einem auf Wirksamkeit bei der Tumorbehandlung zu testenden Interaktionspartner, wobei der Interaktionspartner das durch den natürlichen Liganden vermittelte Signal des Rezeptors moduliert
unter Bedingungen, die eine Interaktion der lebenden Zelle mit dem Tumortherapeutikum und dem Interaktionspartner erlauben;
b) Messung des über das Mitglied der EGF-Rezeptorfamilie vermittelten Signals; und
c) Vergleich des Meßergebnisses aus Schritt (b) mit einem Meßergebnis, das ohne die Zugabe des Interaktionspartners erhalten wurde, wobei die Modulation dieses Signals mit dem Interaktionspartner im Vergleich zum Wert ohne den Interaktionspartner ein Indiz für die Wirksamkeit des Interaktionspartners als Kombinationstherapeutikum oder als Leitsubstanz für ein Kombinationstherapeutikum darstellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der oben beschriebenen Verfahren wird die Modulation des Rezeptor-vermittelten Signals in einer lebenden Zelle mit einer abnormen Aktivität eines Mitglieds der EGFR-Familie mit der Modulation des entsprechenden Signals in einer lebenden Zelle mit normaler Aktivität der Mitglieder der EGFR-Familie verglichen. Hierbei stellt die Modulation dieser Signale in den unterschiedlichen Zellen ein Indiz für die Wirksamkeit des Therapeutikums oder Kombinationstherapeutikums oder einer Leitsubstanz für ein solches dar.
Bevorzugt ist die abnorme Aktivität eines Mitglied der EGFR-Familie Folge einer Überexpression des Rezeptors. Eine solche Überexpression umfaßt die Expression einer deutlich erhöhten Anzahl der entsprechenden Rezeptoren auf der Zelloberfläche der verwendeten Zellen. Ebenfalls umfaßt ist eine erhöhte Expression des entsprechenden Rezeptors ohne daß dieser auf der Oberfläche der Zellen exprimiert wird. Diese schließt eine intrazelluläre Überexpression des entsprechenden Rezeptors ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besitzt der Interaktionspartner intrinsisches Potential für die Modulation des Rezeptorvermittelten Signals.
Darüber hinaus bevorzugt ist der Interaktionspartner ein Agonist des Rezeptorvermittelten Signals. Der Interaktionspartner steigen in diesem Fall als Folge der Interaktion mit dem spezifischen Zielmolekül das EGFR-vermittelte Signal.
Ebenfalls bevorzugt ist der Interaktionspartner ein Antagonist des Rezeptorvermittelten Signals ist. Der Interaktionspartner inhibiert in diesem Fall als Folge der Interaktion mit dem spezifischen Zielmolekül das EGFR-vermittelte Signal. Eine solche Inhibition schließt eine Vollständig Blockade des Signals explizit mit ein.
Entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Mitglied der EGF- Rezeptorfamilie bevorzugt der HER2-Rezeptor.
Die Probe, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird ist bevorzugt eine Zell- oder Gewebeprobe. Verfahren zur Isolation entsprechender Proben sind dem Fachmann bekannt. Hierbei umfaßt sind unterschiedliche Entnahmearten, bei denen lebende Zellen einem Probanden oder Patienten entnommen werden. Dies sind beispielsweise Feinnadelbiopsien (Feinnadelaspirate), Stanzbiopsien, die Entnahme solider Gewebestücke (z. B. durch chirurgische Verfahren), Pleuraergüsse, Ascitesproben, Spülflüssigkeiten, Blutproben, Urinproben, Spermaproben oder Proben von Spinal- und Zerebralflüssigkeiten oder ganzer Organe (z. B. Nebennieren). Die verschiedenen Entnahmetechniken sind z. B. beschrieben in: Kremer et al. (Chirurgische Operationslehren, Georg Thieme Verlag, Stuttgart/New York (1999), Band 4, S. 186; Band 7, 2, S. 370; Band E, Seiten 146 bis 147 und Band 5, S. 238), Pichlmayr und Löhlein (Chirurgische Therapie, Springer Verlag (1991), S. 225, 130, 89, 93, 116, 546 und 547), Malte (Angiologie in Klinik und Praxis, Georg Thieme Verlag (1998), S. 258), Niethard und Pfeil (Orthopädie, Hippokrates Verlag Stuttgart, S. 38) und Bonk (Biopsie und Operationspräparat Kompendium für Ärzte und Studenten).
Bevorzugt ist die Zell- oder Gewebeprobe eine Tumorprobe.
In einer darüber hinaus bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Tumorprobe eine Probe eines soliden Tumors oder von metastasierende Zellen, die von einem soliden Tumoren abstammen.
Dieser solide Tumor ist weiter bevorzugt ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Mamakarzinome, Ovarialkarzinome, Bronchialkarzinome, Kolonkarzinome, Melanome, Blasenkarzinome, Magenkarzinome, Kopf/Halstumore, Gehirntumore, Gebärmutterhalstumore, Prostatakarzinome, Hodenkarzinome, Schwanome, Leiomyosarkome, Knochentumore, Nierenkarzinome, Bauchspeicheldrüsentumore und Speiseröhrentumore.
Ebenfalls bevorzugt ist die Tumorprobe eine Probe eines Tumors hämatopoetischen Ursprungs. Tumore hämatopoetischen Ursprungs stammen generisch von hämatopoetischen Stammzellen ab. Entsprechend dieser Definition sind alle Lymphomarten hierin umfaßt.
Bevorzugt ist der Tumor hämatopoetischen Ursprungs ausgewählt aus einer Gruppe umfassend maligne Lymphome, leukämische Zelle, Non-Hodgkin- Lymphome, Hodgkin-Lymphome und Schilddrüsenlymphome.
Ebenfalls bevorzugt ist die Tumorprobe eine Probe von im Blut zirkulierender Tumorzellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Modulation des Rezeptor-vermittelten Signals gemessen als Induktion von Zelltod oder Proliferation oder Inhibition von Proliferation.
Die Induktion von Zelltod umfaßt sowohl die Induktion von Apoptose (programmierter Zelltod), als auch von Nekrose.
Bevorzugt erfolgt die Messung dieser Modulation in einem funktionellen Assay. Ein funktioneller Assay für das erfindungsgemäße Verfahren ist bevorzugt ein Assay, in dem Proben intakter, lebender Zellen verwendet werden (Ganz-Zell-Assays/whole cell assays). Assays, bei denen Präparate aus Zellen oder Geweben (z. B. Lysate) hergestellt werden, sind durch das beschriebene aber ebenso umfaßt.
Der funktionelle Assay ist darüber hinaus bevorzugt ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Proliferationsassays, Zytotoxizitätsassays und metabolische Assays.
Entsprechende Assays sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für Proliferationsassays sind Assays, die einen MTT- oder [³H]-Thymidin-Einbau messen. Zytotoxizitätsassays umfassen sowohl Assays, in denen Nekrose und/oder Apoptose (siehe z. B. angehängtes Beispiel 1) gemessen werden kann. Beispiele hierfür sind DNA-Fragmentierungstests (z. B. JAM-Test), [⁵¹Cr]-Freisetzungstests, Annexin V-Tests, Enzymtests (z. B. Caspasenaktivierungstest), metabolische und Morphologische Tests. Die Messung kann u. a. durchflußzytometrisch oder histologisch erfolgen. Beispiele für einige dieser Zytotoxizitätsassyas sind zusammengefaßt in Dulat et al. (Eur J Immunol. (2001), 31 (7), 2217-26).
Darüber hinaus sind Assaysysteme umfaßt, die auf Microphysiometer- oder "Fluorescent Imaging Plate Reader (FLIPR)-Geräten basieren (Parce, (1989), Science, 246, 243-7; McConnel, I (1989), Science, 257, 1906-1912).
Vorzugsweise ist die Meßkavität derart ausgestaltet, daß sie mehrere innere Oberflächen hat. Diese sind darüber hinaus vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß eine dieser Oberflächen ein Boden ist und daß diese für den kontinuierlichen Durchfluß von Lösungen oder Suspensionen angepaßt ist. Bevorzugt ist diese so angepaßt, daß ein uneingeschränkter Kontakt der zu untersuchenden Substanz und den Zellen gewährleistet ist und daß die Menge der mit den Zellen in Kontakt kommenden Substanzen gesteuert werden kann.
Die Meßkavität, in der die lebenden Zellen für die Messung bereitgestellt werden, ist weiter bevorzugt so ausgestaltet, daß die Zellen in der Kammer während eines Durchflusses von Lösungen oder Substanzen oder anderen Zellsuspensionen in dieser zurückgehalten werden können. Das Zurückhalten der Zellen in der Meßkavität kann dabei auf verschiedene Weise erfolgen. Vorzugsweise werden die Zellen durch spontane oder natürliche Adhäsion der Zellen an die innere Oberfläche der Kammer oder durch eine poröse Membran zurückgehalten. Ebenfalls bevorzugt ist ein zurückhalten durch eine andere Art von Träger, die in der Kammer vorgesehen ist. Bevorzugt ist auch, die Zellen in ein Substrat, wie z. B. Gelatine, Kollagen oder Agarose, Fibronektin, Poly-L-Lysin, einzubetten. Ebenfalls bevorzugt ist, daß am Boden der Meßkavität Vertiefungen vorgesehen sind. In solchen Vertiefungen verbleiben die Zellen bevorzugt z. B. aufgrund von Gravitationskraft auch bei einer gewöhnlichen Durchflußrate.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Meßkavität ausgestaltet wie beschrieben in EP-B1 0 394 406, insbesondere auf Seite 4, Zeile 5 bis 48, in Fig. 1 bis 4, sowie in den dazugehörigen Legenden auf Seite 6, Zeile 8 bis Seite 7, Zeile 39, auf Seite 8, Zeile 14 bis 24 und Seite 8, Zeile 44 bis Seite 9, Zeile 9. Das Hindurchfließenlassen der Lösung oder Suspension durch die Messkavität gemäß des dort beschriebenen Verfahrensschritt (b) kann mittels dem Fachmann geläufigen Vorrichtungen erreicht werden. Hierzu zählen insbesondere in der Labortechnik gängige Pumpensysteme, bzw. Mikropumpen (z. B. für Chromatographie). Vorzugsweise sollte auch eine Vorrichtung vorgesehen sein, die sicherstellt, daß die Lösung oder Suspension bei Einleitung in der Messkavität frei von Luftblasen ist. Bevorzugt ist die Vorrichtung zum Hindurchfließenlassen der Lösung oder Suspension ausgestaltet wie beschrieben in EP-B1 0 394 406, insbesondere in Fig. 5 und 6, sowie in den dazugehörigen Legenden auf Seite 5, Zeile 40 bis Seite 6, Zeile 7, und auf Seite 8, Zeile 1 bis 13.
Die Messung der Modulation des Rezeptor-vermittelten Signals kann ebenfalls bevorzugt mit Hilfe von chemischen, physikalischen Meßverfahren erfolgen. So kann der pH-Wert z. B. durch Messung der Fluoreszenz oder der Absorption eines pH-empfindlichen Farbstoffes bestimmt werden (z. B. Fluorescein oder Phenolrot). Auch die Änderung des Redoxpotentials kann mit entsprechenden Farbstoffen gemessen werden.
Die nächste bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft das Therapeutikum oder Kombinationstherapeutikum oder die Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum, das eine niedermolekulare Substanz, ein Peptid, Aptamer, Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon ist. Definitionen für die hier aufgeführten Gruppen von Substanzen wurden oben beschrieben oder sind dem Fachmann bekannt.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens gibt an, daß dieses ein Hochdurchsatzverfahren sein soll.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform zeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren Computer-assistiert ist.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren als solches, das zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften des nach dem Erfindungsgemäßes Verfahren identifizierten Therapeutikums oder Kombinationstherapeutikums oder der Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum, wobei man

a) die Bindungsstelle des Therapeutikums oder der Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum an den Rezeptor, an einen rezeptorassoziierten Corezeptor oder an ein mit dem Signal des Rezeptors in Zusammenhang stehendes und signalvermittelndes Molekül identifiziert;
b) die Bindungsstelle des Therapeutikums oder der Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum an den Rezeptor, an einen rezeptorassoziierten Corezeptor oder an ein mit dem Signal des Rezeptors in Zusammenhang stehendes und signalvermittelndes Molekül durch molekulares Modellieren modifiziert; und
c) das Therapeutikum oder die Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum dergestalt modifiziert, daß dessen Bindungsspezifität oder Bindungsaffinität oder Bindungsavidität für den Rezeptor, einen rezeptorassoziierten Corezeptor oder ein mit dem Signal des Rezeptors in Zusammenhang stehendes und signalvermittelndes Molekül durch molekulares Modellieren erhöht wird.

Eine andere besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die Bindungsstellen in Schritt (a) durch Positions-spezifische Mutagenese ermittelt werden.
Weiter bevorzugt wird das identifizierte oder verbesserte das Therapeutikum oder die Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum durch Peptidomimetics pharmakologisch weiter verbessert.
Die nächste besonders bevorzugte Ausführungsform legt ihren Schwerpunkt auf ein Erfindungsgemäßes Verfahren, das zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften des nach dem Erfindungsgemäßes Verfahren identifizierten Inhibitors oder des nach dem Erfindungsgemäßes Verfahren verbesserten Inhibitors dient, das Polypeptid jedoch als Leitstruktur weiter modifiziert wird, um ein modifiziertes aktives Zentrum, ein modifiziertes Aktivitätsspektrum, eine modifizierte Organspezifizität, eine verbesserte Aktivität, eine gesteigerte Toxizität für Tumorzellen (einen verbesserten therapeutischen Index), verminderte Nebenwirkungen, einen zeitlich versetzten Beginn der therapeutischen Wirksamkeit oder der Länge der therapeutischen Wirksamkeit, veränderte pharmakokinetische Parameter (Resorption, Distribution, Metabolismus oder Exkretion), modifizierte physikochemische Parameter (Löslichkeit, hygroskopische Eigenschaften, Farbe, Geschmack, Geruch, Stabilität, Zustandsform), verbesserte generelle Spezifizität, Organ-/Gewebespezifizität, und/oder eine optimierte Verabreichungsform und -route aufweist, was durch die Veresterung von Carboxylgruppen, Hydoxylgruppen mit Carbonsäuren, Hydroxylgruppen zu beispielweise Phosphaten, Pyrophosphaten, Sulfaten, "Hemisukzinaten" oder die Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen, pharmazeutisch verträglichen Komplexen oder die Synthese von pharmakologisch aktiven Polymeren oder die Einführung von hydrophilen Gruppen, die Einführung bzw. den Austausch von Substituenten in Aromaten oder Seitenketten, die Veränderung des Substituentenmusters oder der Modifikation durch die Einführung von isosterischen oder bioisosterischen Gruppen oder die Synthese von homologen Verbindungen, bzw. der Einführung von verzweigten Seitenketten, der Konversion von Alkylsubstituenten zu zyklischen Analogen, der Derivatisierung von Hydroxylgruppen zu Ketalen oder Acetalen, der N-Acetylierung zu Amiden, Phenylcarbamaten, der Synthese von Mannich-Basen bzw. Iminen oder durch die Umwandlung von Ketonen, Aldehyden in Schiffs-Basen, Oxime, Acetale, Ketale, Enolester, Oxaholidine, Thiozolidine oder deren Kombinationen erreicht wird.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels oder Medizinpräparates, das mit einem nach dem Erfindungsgemäßes Verfahren erhaltenen Therapeutikum oder die Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel formuliert wird.
Darüber hinaus bevorzugt ist das Therapeutikum oder Kombinationstherapeutikum oder die Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum ein Zytostatikum oder eine zytotoxische Substanz.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Therapeutikums oder Kombinationstherapeutikums zur Herstellung eines Arzneimittels oder Medizinproduktes zur Behandlung von Tumoren und oder Tumorerkrankungen.
Des weiteren betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die ein oder mehrere Therapeutika oder Kombinationstherapeutika enthält, die nach dem Erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert oder verbessert wurden.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 schematische Darstellung des HER2/neu-Rezeptors: Zwei extrazelluläre cysteinreiche Domänen und zwei hydrophile Regionen, welche die Tyrosinkinase Domäne flankieren, bestimmen die Charakteristik des Rezeptors. Peles et al., 1993;
Fig. 2 die Wechselwirkung der Rezeptoren der EGF-Familie sind abhängig von Liganden und von der Rezeptor-Zusammenstelllung der Zelle. A: Heregulin (HRG/NDF/NRG) bindet die Rezeptoren HER3 (3) und HER4 (4). Diese rekrutieren daraufhin bevorzugt HER2/neu-Rezeptoren (2). Ist kein HER2/neu auf der Zellmembran vorhanden, so interagieren die HRG Rezeptoren mit EGFR Rezeptoren (HER1)(1). B: Exemplarisch für die Gruppe der EGFR bindenden Moleküle ist EGF dargestellt. Dieses bindet EGFR. Daraufhin kann dieser mit den anderen Mitgliedern der EGFR Familie, bevorzugt mit HER2/neu, dimerisieren. C: Exemplarisch für die Gruppe der EGFR und HER4 bindenden Moleküle ist BTC dargestellt. Dieses bindet EGFR und HER4. Daraufhin können diese Rezeptoren bevorzugt mit HER2/neu aber auch mit HER3 interagieren. Graus-Porta et al., 1997;
Fig. 3 Wirkung von Herceptin Monotherapie bei metastasiertem, HER2/neu positivem Brustkrebs (n = 43, HER2/neu +): Das Ansprechen des Tumors wurde nach 11 Wochen am Ende der ersten Behandlungsperiode untersucht. Konnte nach dieser Zeit der Tumor mit visuellen und Röntgenuntersuchungen nicht nachgewiesen werden, so wurde dies als komplette Remission definiert. Konnte eine Reduktion der Tumorgröße von über 50% beobachtet werden, so wurde dies als Teilremission beschrieben. Bei einer geringen Remission reduzierte sich der Tumor um über 25%, während der Begriff "Stabile Krankheit" den Zustand ohne Veränderung der Tumorgröße beschreibt. Baselga et al., 1996;
Fig. 4 Zusammenfassung zweier Phase III Studien zur Kombination von AC und Paclitaxel mit Herceptin. Baselga et al., 2001;
Fig. 5 Vergleich von Methoden zur HER2/neu-Diagnostik. Müller et al., 2000;
Fig. 6 HER2/neu-Diagnostik: Einfluss der Einschlussgröße auf das Ergebnis. Bojar, H. et al. 1998;
Fig. 7 zelluläre Biologie und extrazelluläre Ansäuerung. Mc Connell et al., 1992;
Fig. 8 mittlere metabolische Aktivität verschiedener Zelllinien in Abhängigkeit der Zelldichte;
Fig. 9 Stimulation von SK-BR-3 Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von HRG in einem Stimulationsintervall von 30 Minuten;
Fig. 10 Dosis Wirkungskurve SK-BR-3: Mittelwerte und Standardabweichung verschiedener HRG-Stimulationsexperimente mit einen Stimulationsintervall von 30 Minuten (n = 8);
Fig. 11 Stimulation von MDA-MB-453 Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von HRG in einem Stimulationsintervall von 30 Minuten;
Fig. 12 Dosis Wirkungskurve MDA-MB-453: Mittelwerte und Standardabweichung verschiedener HRG-Stimulationsexperimente mit einem Stimulationsintervall von 30 Minuten (n = 8);
Fig. 13 Vergleich der Dosis Wirkungskurven der Zelllinien SK-BR-3 und MDA- MB-453: Mittelwerte und Standardabweichung verschiedener HRG- Stimulationsexperimente mit einem Stimulationsintervall von 30 Minuten (n = 8);
Fig. 14 Stimulation von MCF-7 Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von HRG in einem Stimulationsintervall von 30 Minuten;
Fig. 15 Stimulation von SK-OV-3 Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von HRG in einem Stimulationsintervall von 30 Minuten;
Fig. 16 Stimulation von SK-BR-3 Zellen mit 100 ng/ml HRG bei unterschiedlicher Expositionszeit;
Fig. 17 Stimulation von MDA-MB-453 Zellen mit 100 ng/ml HRG bei unterschiedlicher Expositionszeit;
Fig. 18 Partielle Inhibierung der HRG-Stimulation durch Herceptin bei SK-BR-3;
Fig. 19 Relative HRG-Stimulation in Abhängigkeit der Herceptin Konzentration: Dosis Wirkungskurve SK-BR-3 (n = 4);
Fig. 20 Inhibierung der HRG-Stimulation durch Herceptin bei MDA-MB-453;
Fig. 21 Inhibierung der HRG-Stimulation (30 Minuten) bei SK-BR-3 durch den Tyrosinkinase Inhibitor Genistein;
Fig. 22 Einfluss des Paclitaxel Lösungsmittels auf Chemosensibilitätsmessungen bei SK-BR-3 Zellen;
Fig. 23 Einfluss des Paclitaxel Lösungsmittels auf Chemosensibilitätsmessungen bei MDA-MB-453 Zellen;
Fig. 24 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von SK- BR-3 bezüglich des Zytostatikums Cisplatin und Herceptin (n = 5);
Fig. 25 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von SK- BR-3 bezüglich des Zytostatikums Carboplatin und Herceptin (n = 5);
Fig. 26 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von SK- BR-3 bezüglich des Zytostatikums Vinorelbin und Herceptin (n = 5);
Fig. 27 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von SK- BR-3 bezüglich des Zytostatikums Gemcitabin und Herceptin (n = 5);
Fig. 28 Zusammenstellung des Wirkungsprofils und Effekte von Herceptin an SK- BR-3 Zellen: Mittelwerte der Endpunkte;
Fig. 29 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von MDA- MB-453 bezüglich des Zytostatikums Cisplatin und Herceptin (n = 5);
Fig. 30 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von MDA- MB-453 bezüglich des Zytostatikums Carboplatin und Herceptin (n = 5);
Fig. 31 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von MDA- MB-453 bezüglich des Zytostatikums Vinorelbin und Herceptin (n = 5);
Fig. 32 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von MDA- MB-453 bezüglich des Zytostatikums Gemcitabin und Herceptin (n = 5);
Fig. 33 Zusammenstellung des Wirkungsprofils und Effekte von Herceptin an MDA-MB-453 Zellen: Mittelwerte der Endpunkte;
Fig. 34 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von MCF-7 bezüglich des Zytostatikums Cisplatin und Herceptin (n = 5);
Fig. 35 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von MCF-7 bezüglich des Zytostatikums Carboplatin und Herceptin (n = 5);
Fig. 36 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von MCF-7 bezüglich des Zytostatikums Vinorelbin und Herceptin (n = 5);
Fig. 37 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von MCF-7 bezüglich des Zytostatikums Gemcitabin und Herceptin (n = 5);
Fig. 38 Zusammenstellung des Wirkungsprofils und Effekt von Herceptin an MCF-7: Mittelwerte der Endpunkte;
Fig. 39 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von SK- OV-3 bezüglich des Zytostatikums Cisplatin und Herceptin (n = 5);
Fig. 40 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von SK- OV-3 bezüglich des Zytostatikums Carboplatin und Herceptin (n = 5);
Fig. 41 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von SK- OV-3 bezüglich des Zytostatikums Vinorelbin und Herceptin (n = 5);
Fig. 42 Mittelwerte und Standardabweichungen zur Chemosensibilität von SK- OV-3 bezüglich des Zytostatikums Gemcitabin und Herceptin (n = 5);
Fig. 43 Zusammenstellung des Wirkungsprofils und Effekte von Herceptin an SK- OV-3 Zellen: Mittelwerte der Endpunkte;
Fig. 44 Durchschnittlicher Anstieg der metabolischen Aktivität nach 30 Minuten Exposition mit 100 ng/ml HRG bei verschiedenen Zelllinien.
Die folgenden Beispiele erläutern die beschriebene Erfindung.

Beispiel 1

Aktivität, Proliferation und Apoptose

Verschiedene Zelllinien (KB, MDA-MB-453, MCF-7, SK-BR-3, SK-OV-3) wurden im ChemoSelect® Test auf verschiedenen Zytostatika analysiert. Die ermittelten Wirksamkeiten standen mit den Versuchen, die für Proliferation und für Apoptose gemessen wurden in Relation. Damit ist es möglich Vorhersagen über die Wirksamkeiten von Therapeutika anhand von Laborergebnissen zu machen. Insbesondere ergab die Analyse von Patienten, daß Zytostatika, mit den größten Wirkungen im Labor (ChemoSelect®), auch die besten Heilungserfolge in der Klinik zeigten.

Beispiel 2

Liganden/Target Funktionalität

Die Zelllinien MDA-MB-453, MCF-7, SK-BR-3, SK-OV-3 wurden auf die Funktionalität des Liganden HRG getestet. Dabei ergab sich, daß lediglich die Zellinien, die HER2 und entweder HER3 und/oder HER4 exprimieren auf HRG überhaupt reagierten (SK-BR-3 und MDA-MB-453), während eine nur HER2 (SK- OV-3) und eine wenig HER2 exprimierende Zelllinie (MCF-7) keine Aktivität zeigte. Diese Resultate wurden auch an Patientenmaterial bestätigt. Somit besteht ein direkter Test für die Funktionalität von Targetmolekülen.

Beispiel 3

Therapeutikum/Target Funktionalität

Lediglich die in Beispiel 2 verwendeten HRG-sensitiven Zelllinien (SK-BR-3 und MDA-MB-453) zeigten eine Reduktion der HRG Stimulation mit dem anti-HER2 Antikörper (Trastuzumab), während die Negativkontrollen (SK-OV-3 und MCF-7) - wie erwartet - keinen Effekt auf die Behandlung mit Trastuzumab zeigten. Diese Resultate wurden auch bei Patientenmaterial erhalten und korrelierten mit dem Ansprechen auf eine Trastuzumab-Therapie.

Beispiel 4

Kombinationstherapien

Die Behandlung der in Beispiel 2 verwendeten Zelllinien ergab mit Trastuzumab oder mit einem Zytostatikum (Vinorelbin, Cisplatin, Gemcitabin, Carboplatin) alleine keine großen Therapieerfolge. Bei der Kombination von Trastuzumab mit einem Zytostatikum jedoch konnte man klare Synergieeffekte erkennen. Hierzu gehörten die Kombination Vinorelbin oder Cisplatin mit Trastuzumab bei der SK-BR-3 Zelllinie und Vinorelbin, Gemcitabin oder Carboplatin mit Trastuzumab bei der MDA-MB-453 Zelllinie. Die beiden Negativkontrollen (SK-OV-3 und MCF-7) zeigten wieder wie erwartet kaum Synergieeffekte. Die Korrelation zwischen dieser Art von funktioneller Diagnose und einer Anzahl von Patienten zeigte eine gute Übereinstimmung.

Beispiel 5

Weitere Interaktionspartner

Die für diesen Punkt notwendigen Versuche sind identisch den Versuchanordnungen von Beispiel 2. Dabei zeigt sich, daß HRG lediglich in Gegenwart eines anderen EGF-Rezeptors mit HER2 interagiert. Hierzu sind die entscheidenden Versuche die Negativkontrollen, die zeigen, daß nur bei einem kompletten Rezeptorsatzes (z. B. HER2 und HER3) der Ligand das Signal in die Zelle weitergeben kann. Auch diese Daten korrelieren mit den Patientendaten.

Beispiel 6

Etablierung eines Her2/neu-Rezeptortests auf der Grundlage sensor-basierender Technologien

1 Material und Methoden

1.1 Zelllinien und Zellkultur

Die Zelllinien MDA-MB-453 (Kat. No.: ACC 65) und MCF-7 (Kat. No.: ACC 115) wurden von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DMSZ, Braunschweig, Deutschland) bezogen. Die Zelllinien SK-BR-3 (Kat. No.: HTB-30) und SK-OV-3 (Kat. No.: HTB-77) wurden von der "American Type Culture Collection" (ATCC, Manassas, USA) bezogen.
Die Zelllinien SK-BR-3 und SK-OV-3 wurden in modifiziertem Mc Coy's 5A Medium mit L-Glutamin (LIFE TECHNOLOGIES, Kat. No.: 26600-023), 10% FCS (PAA, Kat. No.: A 15-043) und 100 Einheiten/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin- Sulfat kultiviert (LIFE TECHNOLOGIES, Kat. No.: 15140-122).
Die Zelllinie MDA-MB-453 wurde in Leibowitz L-15 Medium mit L-Glutamin (LIFE TECHNOLOGIES, Kat. No.: 11415-056), 10% FCS (PAA, Kat. No.: A 15-043) und 100 Einheiten/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin-Sulfat kultiviert (LIFE TECHNOLOGIES, Kat. No.: 15140-122).
Die Zelllinie MCF-7 wurde in RPMI 1640 Medium mit L-Glutamin (PAN, Kat. No.: P 04-16500), 10% FCS (PAA, Kat. No.: A 15-043), 100 Einheiten/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin-Sulfat (LIFE TECHNOLOGIES, Kat. No.: 15140-122), MEM nicht-essentielle Aminosäuren (LIFE TECHNOLOGIES, Kat. No.: 11140-035), 1 mM Natriumpyruvat (GIBCO, Kat. No.: 11360-039) und 10 µg/nl Rinderinsulin (BIOCHROM, Kat. No.: K 3510) kultiviert.
Zellen wurden alle 2-3 Tage mit 2-3 ml 1 × Trypsin-EDTA Lösung (LIFE TECHNOLOGIES, Kat. No.: 45300-043) abgelöst und in einem Verhältnis von 1 : 2 passagiert. Jeweils vor Verwendung für Experimente wurden die Zellen mit 2-3 ml EDTA/EGTA Lösung abgelöst. Diese bestand aus 0,25 mM EDTA (ROTH, Kat. No.: 8043.1), 0,125 mM EGTA (ROTH, Kat. No.: 3054.2), 30 mM Tris (ROTH, Kat. No.: 4855.2) 0,25 M Saccharose (ROTH, Kat. No.: 4621.1) und wurde anschließend mit NaOH (ROTH, Kat. No.: 6771.1) auf einen pH von 7,8 eingestellt.

1.2 Einfrieren von Kulturzellen

Rückstellproben wurden aus den Passagen P3 bis P8 gebildet. Dabei wurden die Zellen wie oben beschrieben mit Trypsin abgelöst. Jeweils ca. 10⁶ Zellen wurden mit 2 Teilen des jeweiligen Mediums, 2 Teilen FCS (PAA, Kat. No.: A 15-043) und einem Teil DMSO (SIGMA, Kat. No.: D2579) in 2 ml Cryotubes (COSTAR) gegeben. Die Zellen wurden 2-4 h bei 4°C und über Nacht bei -70°C gekühlt, bevor sie in flüssigem Stickstoff gelagert wurden.

1.3 Zytostatika

Medikamente, die synergistische oder additive Effekte in Kombination mit Herceptin zeigen, wurden entsprechend ihrer "Peak Plasma"-Konzentration verwendet. Dabei wurden Substanzen mit verschiedenen Wirkmechanismen ausgewählt:
Antimetabolite: Gemcitabin (22,5 µg/ml; LILLI, Deutschland)
Mitoseinhibitoren: Vinorelbin (1 µg/ml; PIERRE FABRE, Deutschland), Paclitaxel (13,6 µg/ml, BRISTOL MYERS, Deutschland)
Alkylierende Agenzien: Carboplatin (8 µg/ml; SIGMA, Deutschland), Cisplatin (3,8 µg/ml; SIGMA, Deutschland)
6 mg Paclitaxel wurden in 0,5 ml Cremophor und 0,5 ml 100% EtOH gelöst. Alle anderen verwendeten Zytostatika waren wasserlöslich.
Die Paclitaxel Lösungsmittelkontrolle setzte sich aus 1,13 µl/ml Cremophor und 1,13 µl/ml 100% EtOH zusammen.

1.4 Verbrauchsmaterialien

Humanes Serum Albumin (HSA) wurde von SIGMA-ALDRICH (Deutschland) bezogen (Kat. No.: 05420). Die rekombinante EGF-Domäne von humanem HRG-α wurde von R & D SYSTEMS (Minneapolis, USA) bezogen. Eine Stocklösung einer Konzentration von 50 µg/ml wurde, wie empfohlen, mit 0,1% HSA auf Basis von PBS hergestellt. Der monoklonale anti-HER2/neu-Antikörper Trastuzumab (Herceptin) wurde von ROCHE DIAGNOSTICS (Mannheim, Deutschland) bezogen. Der Tyrosinkinase Inhibitor Genistein (Kat. No.: G 6776) wurde von SIGMA ALDRICH (Deutschland) bezogen.

1.5 Pufferlösungen

Für zytometrische Vormessungen wurde als Laufpuffer modifiziertes "low buffered" RPMI 1640 Medium mit L-Glutamin und ohne NaHCO₃ (Pan, Kat. No.: P 04- 162000) verwendet.
Weitere Versuche wurden mit einer "Balanced Salt Solution" (BSS) durchgeführt. Diese setzte sich aus 1 M Glukose (ROTH, Kat. No.: 6887.1), 4 M NaCl (ROTH, Kat. No.: 3957.1), 1 M KCl (ROTH, Kat. No.: 6781.1), 1 M CaCl₂ (ROTH, Kat. No.: 5239.1), 1 M MgCl₂ (ROTH, Kat. No.: 2189.1), 1,1 M NaH₂PO₄ (ROTH, Kat. No.: 2370.1) und 0,5 M Na₂HPO₄ (ROTH, Kat. No.: 4984.1) zusammen und wurde mit Na₂HPO₄ auf einen pH von 7,3 eingestellt.

1.6 Messung der Tumorzellaktivität mit Hilfe des Cytosensor- Mikrophysiometers

Das verwendete Mikrophysiometer wird von der Firma MOLECULAR DEVICES INC. als Cytosensor vermarktet. Es stellt eine biologische Anwendung der aus der Computertechnologie bekannten Silizium Technologie dar. Mit Hilfe dieser Anwendung lassen sich Effekte verschiedenster Substanzen auf die biologische Funktion von Zellen darstellen. Eine häufige Anwendung für den Cytosensor ist die Untersuchungen von Rezeptor-Liganden Interaktionen.
Der Energiebedarf von Zellen in Kultur wird vornehmlich durch Glykolyse gedeckt. Bei dieser Umsetzung von Glukose und Sauerstoff in Intermediärprodukte wie Protonen, Laktat und CO₂ kommt es zu einer Ansäuerung des umgebenden Mediums. Diese Ansäuerungsrate ist die zentrale Messgröße des Cytosensor- Mikrophysiometers und charakterisiert den Zellmetabolismus (Abb. 7). Der Metabolismus wird durch Substanzen wie Giftstoffe, Hormone, Viren oder Kosmetika beeinflusst und kann mit Hilfe des Cytosensors gemessen werden.
Die Zentraleinheit des Cytosensor-Mikrophysiometers (cm) ist ein LAPS ("Light- Adressable Potentiometric Sensor"). Diese Einheit misst potentiometrisch die Konzentration bestimmter Ionen, die das Oberflächenpotential an der Grenzfläche zwischen einer Elektrolytlösung und der Oberfläche des Halbleiters bestimmen. Die Oberfläche des LAPS besteht aus einer 130 nm dünnen Oxynitrit-Isolierschicht. Diese trennt den Siliziumchip vom wässrigen Medium. Durch eine Referenzelektrode lässt sich eine Spannung an die Grenzfläche des Sensors anlegen, die ein senkrecht dazu orientiertes elektrisches Feld erzeugt. Eine auf die Unterseite des Sensors gerichtete LED-Lichtquelle emittiert Photonenpulse, welche von der Siliziumschicht absorbiert werden, was zur Ausbildung von Elektronenlochpaaren führt. Da sich diese im elektrischen Feld bewegen, sind sie als vorübergehender Strom messbar. Der entstehende Wechselstrom ist abhängig von der angelegten Vorspannung und von der Oberflächenspannung des Siliziumchips. Die Oxynitritschicht kann in Lösung befindliche Protonen binden, wodurch ein zusätzliches elektrostatisches Potential ausgebildet wird. Der Wechselstrom ist also pH abhängig. Durch eine solche Messung wird eine Empfindlichkeit von über 1/1000 pH Einheiten erreicht.
In die Messeinheit eines LAPS werden Zellen auf einer durchlässigen Polykarbonatmembran eingebracht. Dabei werden adhärente Zellen direkt auf dieser Membran kultiviert, während Zellsuspensionen mit Hilfe von Agarose immobilisiert werden. Durch diese Messeinheit fließt, angetrieben durch eine Peristaltikpumpe, ein Flüssigkeitsstrom, welcher die Zellen einerseits mit Nährstoffen versorgt, andererseits Metaboliten abtransportiert. Umströmt werden die Zellen dabei von einem geeignetem Medium, das die Versorgung mit essentiellen Substanzen gewährleistet, im Unterschied zu Kulturmedium aber eine wesentlich geringere Pufferkapazität aufweist. Hierbei hat sich als Standardmedium ein modifiziertes RPMI Medium (PAN) bewährt, welchem das Natriumbikarbonatsystem fehlt. Versuche haben gezeigt, dass eine "Balanced Salt Solution" (BSS, s. Abschnitt 1.5) die Auflösung des Sensors noch vergrößern kann. Zellen lassen sich im cm über Stunden bis Tage beobachten. Dem Perfusat können Substanzen beigefügt werden, um deren Wirkung auf die eingesetzten Zellen zu charakterisieren. In periodisch festgelegten Zeitabständen wird der Flüssigkeitsstrom unterbrochen und die Ansäuerung des Mediums als Maß für die zelluläre metabolische Aktivität gemessen. Auf diese Weise können je nach eingesetzter Substanz spezifische Effekte beobachtet werden, indem der Metabolismus als Folge von Einzelmessungen festgehalten wird. Anwendungsbeispiele sind Toxizitätsuntersuchungen von Zytostatika an Tumorzellen, Verträglichkeitstests mit Kosmetika oder spezifische Rezeptor- Liganden Reaktionen.
Neben den Peristaltikpumpen und den LAPS sind Entgaser ("Debubbler"), Heizsysteme und ansteuerbare Ventile wichtige Bestandteile des cm. Die Ventile ermöglichen eine Umschaltung des Flüssigkeitsstromes von einem Referenz- oder Eichungsmedium auf das mit der zu untersuchenden Substanz versehene Medium aus einem separaten Behälter. Dabei kann der Zeitpunkt des Umschaltens, ebenso wie die Dauer der Exposition beliebig festgelegt werden. Ein integriertes Heizungssystem bestimmt die Temperatur des Mediums zwischen 4°C und 43°C. Eine Einheit eines cm besteht aus acht individuellen Kanälen und einer zentralen Recheneinheit, welche das System steuert.

1.6.1 Stimulation der Tumorzellen mit HRG

Vor dem Ausplattieren wurden die Zellen mit EDTA/EGTA Dissoziationslösung (s. Abschnitt 1.1) und im Falle der Zelllinie SK-OV-3 mit Hilfe eines Zellschabers aus den Kulturflaschen gelöst. Daraufhin wurden die Zellen zum Anwachsen für mindestens 10 h bei 37°C und 5% CO₂ in entsprechendem Medium mit 10% FCS auf der Polykarbonatmembran belassen. Unmittelbar vor der Messung im cm wurde dieses Kulturmedium gegen ein entsprechendes Medium ohne FCS ausgetauscht. In diesem Medium wurden die Zellen für einen Zeitraum von ca. 17 h belassen. Für Untersuchungen der HRG Reaktivität wurde dem Laufpuffer BSS HSA (SIGMA, Kat. No.: 05420) in einer Konzentration von 1 mg/ml zugegeben, um zu vermeiden, dass Peptide an die Wände der Pufferleitbahnen binden. Dieses wurde vor der Zugabe von HRG vorgelegt.

1.6.2 Chemosensibilitätsmessung

Die Zellen wurden wie unter 1.6.1 beschrieben aus Kulturflaschen und auf der Polykarbonatmembran anwachsen gelassen. Darauf verblieben sie über Nacht bei 37°C und 5% CO₂ im Brutschrank. Am Tag der Untersuchung wurde das Medium gegen ein entsprechendes Medium ohne FCS ausgetauscht. In diesem Medium wurden die Zellen für 5 h belassen, bevor sie in die Untersuchungskammern eingelegt wurden.
Für Chemosensibilitätsmessungen wurde der Laufpuffer BSS mit 100 Einheiten/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin-Sulfat (LIFE TECHNOLOGIES, Kat. No.: 15140-122), 0,01 mg/ml Kanamycin (SIGMA, Kat. No.: K 1377) und 2,5 µg/ml Amphotericin B (Fungizone, LIFE TECHNOLOGIES, Kat. No.: 15280-026) versehen, um Infektionen während des Untersuchungszeitraums von 15 h zu kontrollieren.

2 Ergebnisse

2.1 Heregulin Stimulation

Der funktionelle Nachweis einer Rezeptorüberexpression soll mit Hilfe des Liganden HRG untersucht werden. HRG ist ein direkter Ligand für die Rezeptoren HER3 und HER4. An der durch Ligandenbindung induzierten Signalgenerierung und Signaltransduktion ist HER2/neu maßgeblich beteiligt (siehe Abschnitt 1.4.4). Die Antwort soll Aufschluss über eine relative Beteiligung von HER2/neu und dessen Quantität und Funktionalität geben.
Aufbauend auf Erkenntnissen von Chan et al. 1995, wurden Zelllinien für Untersuchungen ausgesucht, die sich bezüglich der Rezeptoren HER2/neu, HER3 und HER4 unterschieden (Tabelle 7). Tabelle 7 Untersuchte Zelllinien, Rezeptorexpression. Chan et al., 1995

2.1.1 Optimierung der Messparameter

Um ein repräsentatives Testverfahren zu entwickeln, wurde der Einfluss verschiedener Faktoren untersucht, welche die Messung bestimmen. Diese sollten anschließend für eine einheitliche Testprozedur normiert werden. Die Versuche wurden an den in Tabelle 6 aufgeführten Zelllinien durchgeführt.

2.1.1.1 Zelldichte

Zellen können sich bezüglich der im Cytosensor gemessenen metabolischen Aktivität unterscheiden. Faktoren wie Wachstumsrate, Zellgröße und Zeit zwischen Ausplattierung und Messung spielen dabei eine Rolle. Um Messungen mit verschiedenen Zelllinien vergleichbar zu machen, wurde zunächst eine geeignete Zelldichte ermittelt. Die untere Grenze ist definiert durch eine Mindestaktivität, die für die zytometrische Messung notwendig ist. Die gemessene Aktivität sollte nicht unter 30 µV/s liegen. Bei niedrigeren Aktivitäten kann der Messfehler kritische Werte erreichen. Generell sollte eine Zelldichte von 500 000 nicht überschritten werden, da sonst der Flüssigkeitsstrom, welcher Protonen zur Referenzelektrode transportiert, durch die große Zellmenge behindert wird. Dadurch verschiebt sich die typische Ansäuerungskurve und das Ergebnis ist nicht mehr reproduzierbar (Daten nicht dargestellt). Zur Ermittlung dieser geeigneten Zelldichte wurden Zellen in Dichten von 50 000, 100 000 und 300 000 Zellen/Kammer ausplattiert und die metabolische Aktivität gemessenen. Dabei zeigten sich große Unterschiede in der Aktivität bezogen auf die Zelldichte (Abb. 8).
SK-BR-3 Zellen erreichten bei einer Zelldichte von 50 000 eine ausreichende Aktivität von ca. 70 µV/s und wurden daher für weitere Versuche in dieser Dichte ausplattiert, während die anderen untersuchten Zellen in einer Dichte zwischen 200 000 (MDA-MB-453) und 300 000 (MCF-7, SK-OV-3) ausplattiert wurden. Diese Zellen wiesen im Vergleich zu SK-BR-3 einen niedrigeren Grundmetabolismus auf. Wurden die Zellen länger als eine Nacht vor der Messung ausplattiert, so wurde die Zelldichte entsprechend kleiner gewählt.

2.1.1.2 Bestimmung der optimalen Heregulin-Dosis

Die zweite Variable im Testansatz ist die HRG Konzentration. Es wurde die ideale Konzentration ermittelt, ab der eine maximale Reaktion erfolgt. Zu diesem Zweck wurden die Zellen für 30 min verschiedenen Konzentrationen von HRG ausgesetzt. Dabei wurde ein Konzentrationsbereich von 1 ng/ml bis 250 ng/ml untersucht. Für verschiedene Zelllinien ergaben sich unterschiedliche Reaktionsprofile. Für die HRG reaktiven Zelllinien war eine Mindestdosis von 5 ng/ml notwendig, um eine nachweisbare Reaktion auszulösen. Ab einer Konzentration von 25 ng/ml näherte sich die Reaktion schnell ihrem Maximum. Im Bereich zwischen diesen Konzentrationen lagen die Messwerte nahe bei einander.
Die Sättigungskonzentration von 100 ng/ml wurde für weitere Versuche als Standard-Stimulationskonzentration definiert. Diese Konzentration sollte sicherstellen, dass die Komplexität der funktionellen Effekte nachgewiesen werden kann. Abb. 9 zeigt eine Messung zur dosisabhängigen HRG Stimulation der Zelllinie SK-BR-3. Der Pfeil markiert die Zugabe von HRG.
Abb. 10 fasst alle auswertbaren Messungen zu einer Dosis Wirkungskurve dieser Zelllinie zusammen. Dargestellt ist das Maximum der metabolische Aktivität nach Stimulation.
Die Zelllinie MDA-MB-453 zeigt ein wesentlich geringeres Ausmaß der Stimulation. Bei gleicher Stimulationsdauer und gleichem verwendeten Konzentrationsbereich zeigt sich nach Stimulation eine maximale Aktivität von ca. 130%. Da im dargestellten Experiment (Abb. 11) die Kontrollmessung ebenfalls steigt, wurde dieser Wert an der entsprechenden Stelle vom Wert der HRG Stimulationskurve abgezogen, um auf eine effektive Stimulation zu schließen. Daraus ergibt sich eine maximale Stimulation von ca. 20% bei 100 ng/ml HRG.
Obwohl die Dosis Wirkungskurve der Zelllinie MDA-MB-453 ein ähnliches Profil zeigt wie die Zelllinie SK-BR-3, fällt die Reaktion bei allen untersuchten Konzentrationen deutlich geringer aus (Abb. 12).
Abb. 13 zeigt einen Vergleich der Dosis Wirkungskurve von SK-BR-3 mit der von MDA-MB-453. Die Stimulation bei SK-BR-3 Zellen zeigt deutlich höhere Werte als dies bei MDA-MB-453 Zellen der Fall ist.
Die Zelllinie MCF-7 reagiert in nur geringem Maße auf eine Exposition mit HRG (Abb. 14).
Bei der Zelllinie SK-OV-3 handelt es sich um eine Ovarial-Zelllinie. Diese Zelllinie zeigt trotz einer deutlichen HER2/neu-Rezeptor Amplifikation keine Reaktion auf HRG (Abb. 15).

2.1.1.3 Stimulationsintervall

Für Untersuchungen zur Dosis Wirkungskurve wurde in Anlehnung an Untersuchungen von Chan et al. ein Stimulationsintervall von 30 Minuten verwendet. Der Kurvenverlauf zeigte, dass die Reaktion bei einigen der Zelllinien bereits nach kürzerer Zeit ihren Scheitelpunkt erreichte (Abb. 9, 11). Zu untersuchen war der Einfluss der Expositionszeit auf die Reaktion.
Um die Mindestexpositionszeit zu ermitteln, die zu einer maximalen Reaktion führt, wurden die HRG reaktiven Zellen mit einer konstanten HRG Konzentration von 100 ng/ml für unterschiedliche Zeitintervalle stimuliert. Dabei wurde ein Zeitfenster von 0 bis 28 Minuten mit einem Intervall von 4 Minuten untersucht.
Die eingesetzten Zellen zeigten deutliche Unterschiede bezüglich der kinetischen Rezeptorreaktion. Eine komplette Reaktion konnte bei SK-BR-3 bereits nach ca. 12 Minuten Exposition beobachtet werden (Abb. 16), während MDA-MB-453 eine Mindestexposition von ca. 20 Minuten benötigte (Abb. 17). Ab diesem Intervall lässt sich durch eine Verlängerung der Exposition keine Steigerung der Antwortrate erreichen. Eine Stimulationszeit von 30 min sollte in weiterführenden Experimenten sicherstellen, dass eine komplette Antwort ablaufen kann und wurde als Standard für weitere Experimente definiert. Abb. 16 und 17 zeigen Einzelmessungen zur HRG Stimulation in Abhängigkeit der Expositionszeit. Der Pfeil markiert den Beginn der Exposition.
Die Stimulation der Zelllinie MDA-MB-453 ist für das dargestellte Experiment sehr gering. Daher lässt sich keine genaue Aussage treffen. Die maximale Stimulation tritt jedoch bei Expositionszeiten über 20 min auf.

2.1.2 Inhibierung der Stimulation durch Herceptin

Wie in zahlreichen Untersuchungen zur Signalleitung an Rezeptoren der EGF- Familie beschrieben, sind an einer Antwort auf Heregulin neben HER2/neu andere Rezeptoren beteiligt (Beerli et al., 1995). Um eindeutige Hinweise bezüglich des Anteils von HER2/neu an der HRG vermittelten Antwort zu erhalten, wurden Versuche zur Herceptin Inhibierung durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde der HER2/neu-Rezeptor spezifisch mit dem monoklonalen anti-HER2/neu-Antikörper Herceptin blockiert und anschließend die Zellen 30 min mit 100 ng/ml HRG stimuliert und mit der gleichen Stimulation ohne Blockierung von HER2/neu verglichen. Lässt sich eine Zelle trotz Herceptin-Blockade von HER2/neu durch HRG stimulieren, so sollte diese Antwort den Anteil repräsentieren, welcher ohne Beteiligung von HER2/neu abläuft. Zunächst wurden verschiedene Konzentrationen des Antikörpers eingesetzt, um die Konzentration zu ermitteln, bei der die Stimulation maximal inhibiert wird.
Die größte beobachtete metabolische Aktivierung durch HRG wurde bei der Zelllinie SK-BR-3 beobachtet. Mit einer Stimulation von über 40% bei einer Konzentration von 100 ng/ml HRG eignen sich diese Zellen zum Nachweis der Inhibierung dieser Reaktion durch Herceptin. Bereits bei einer Antikörperkonzentration von 2 µg/ml wird die Antwort partiell inhibiert. Bei einer Konzentration von 4 µg/ml fällt die Inhibierung mit ca. 50% maximal aus (Abb. 18). Diese deutliche Inhibierung bei 4 µg/ml Herceptin konnte in wiederholten Experimenten verifiziert werden und definierte diese Konzentration als Standard Konzentration für weitere Experimente mit Herceptin.
Abb. 19 fasst mehrere Messungen zur Herceptin-Inhibierung für die Zelllinie SK-BR-3 zusammen. Dargestellt ist die prozentuale Inhibierung der maximalen Stimulation ohne Herceptin.
Abb. 20 zeigt, dass für eine Aussage zur Differenzierung des Signals eine gewisse Mindestaktivierung notwendig ist. Ein Grundrauschen der Messreihe verhindert Aussagen, die unterhalb eines Bereiches von ca. 10% liegen. Dennoch lässt sich erkennen, dass im dargestellten Versuch bei keiner der getesteten Herceptin-Konzentrationen eine Inhibierung der HRG-Aktivierung erfolgte. Statt dessen war eine leichte Aktivierung durch die Blockierung von HER2/neu zu beobachten. Die Stimulation von 20%, die bei Versuchen zur Dosis-Wirkungskurve erreicht wurde, konnte zum Zeitpunkt der Messreihe zur Herceptin-Inhibierung nicht rekonstruiert werden. Auf die Erstellung einer Dosis Wirkungskurve wurde aufgrund der angesprochenen Inkonsistenz der Ergebnisse verzichtet.

2.1.3 Inhibierung der Heregulinantwort durch den Tyrosinkinaseinhibitor Genistein

Um zu untersuchen, ob bei dem durch HRG eingeleitenden Weg der Signalleitung Tyrosinkinasen beteiligt sind, wurde untersucht, ob Genistein die Stimulation einer HRG reaktiven Zelllinie inhibieren kann.
Zu diesem Zweck wurden SK-BR-3 Zellen für ein Intervall von 30 Minuten mit 100 ng/ml HRG und parallel mit 25 µg/ml Genistein stimuliert.
Die Stimulation in Anwesenheit von Genistein fiel dabei um ca. 60% geringer aus (Abb. 21). Dies belegt eine Beteiligung von Tyrosinkinasen an der durch HRG ausgelösten Signalkaskade.

2.2 Chemosensibilität

Um Ergebnisse aus den Stimulationsexperimenten mit HRG mit einem Ansprechen auf Herceptin in Verbindung setzen zu können, wurden Chemosensibilitätsmessungen durchgeführt. Damit sollte gezeigt werden, ob sich Untersuchungen verifizieren lassen, die aussagen, dass gewisse Zytostatika in Kombination mit Herceptin additive oder synergistische Effekte zeigen.

2.2.1 Auswahl der Zytostatika

Es wurden Zytostatika untersucht, von denen bekannt ist, dass sie in Kombination mit Herceptin eine verstärkte Wirkung haben können (Pegram et al., 1999a).

- Cisplatin
- Carboplatin
- Vinorelbin
- Gemcitabin
- Paclitaxel

Additive oder synergistische Interaktionen wurden von Taxanen insbesondere Paclitaxel und Docetaxel beschrieben. Hierzu wurden Chemosensibilitätsuntersuchungen durchgeführt. Es zeigte sich jedoch, dass dieser Ansatz an Zelllinien keine Aussage liefert.
Taxane sind nicht wasserlöslich und fungieren in einem Lösungsmittel aus Ethanol oder DMSO gelöst werden. Bei Chemosensibilitätsmessungen müssen diese Lösungsmittel als negative Kontrolle. Dabei hat sich gezeigt, dass Zelllinien sehr sensitiv gegenüber solchen Lösungsmitteln sind. Das Lösungsmittel verringerte die metabolische Aktivität in den Experimenten annähernd so stark, wie das Zytostatikum. Daher lies sich keine Wirkung des Zytostatikums ableiten. Abb. 22 und 23 zeigen Chemosensibilitätsmessungen von SK-BR-3 und MDA-MB-435 bezüglich Paclitaxel.
Aufgrund dieser starken Effekte wurde auf Untersuchungen von Taxanen verzichtet. In der Darstellung wurde für einen Messzeitraum von 50 Minuten jeweils ein Mittelwert gebildet. Von diesem Wert wurde der entsprechende Wert der Kontrollmessung ohne Wirkstoff abgezogen. Um das Verhältnis dieses Wertes zum Kontrollwert anschaulich darzustellen, wurde dieser Wert mit 100 addiert. Somit repräsentieren Werte über 100% eine Aktivierung und Werte unter 100% eine Inhibierung. In der gewählten Form der Darstellung entspricht also die Kontrollmessung in jedem Punkt 100%. Jede der vier Zelllinien wurde fünffach mit der gleichen Substanz getestet. Dabei wurden die Zellen für 15 Stunden mit dem Zytostatikum in Kontakt gebracht.
Diese Darstellung trifft dann zu, wenn der Kontrollwert nicht entscheidend von 100 abweicht. Dies war bei allen dargestellten Messungen der Fall.

2.2.2 Chemosensibilität SK-BR-3

Die Zelllinie SK-BR-3 zeigte ein leichtes Ansprechen auf Cisplatin. Die geringe Wirkung von 5% im Endmesspunkt der Kurve ließ sich durch Zusatz von Herceptin um weitere 10,5% auf insgesamt 15,5% verbessern (Abb. 24).
Carboplatin zeigte bei der Zelllinie SK-BR-3 keine Wirkung. Diese Substanz führte zu einer leichten Stimulation. Auch für die Kombination mit Herceptin konnte keine Wirkung nachgewesen werden (Abb. 25).
Vinorelbin zeigte bei dieser Zelllinie in Kombination mit Herceptin den größten Effekt unter den getesteten Substanzen. Während sich für die Monosubstanz noch keine Wirkung beobachten ließ, führte die Kombination mit Herceptin zu einem Effekt von ca. 15% im letzten Messpunkt (Abb. 26).
Gemcitabin wirkte auf SK-BR-3 Zellen minimal. Dieser Effekt ließ sich in Kombination mit Herceptin etwas verstärken (Abb. 27).
Abb. 28 stellt die Ergebnisse der getesteten Substanzen einander gegenüber. In dieser Darstellung werden jeweils nur die Endpunkte entsprechend der letzten 50 Minuten der Messung berücksichtigt. Auffallend ist, dass Vinorelbin ausschließlich in Kombination mit Herceptin wirkte, während Cisplatin bereits als Monosubstanz einen leichten Effekt zeigte.
Bei allen getesteten Substanzen führte die Kombination mit Herceptin zu einer negativen Beeinflussung des Zellmetabolismus. Dieser Effekt reichte allerdings bei Carboplatin nicht aus, um den leicht aktivierenden Effekt der Monosubstanz aufzuheben. Eine Wirkung konnte also für dieses Therapeutikum nicht nachgewiesen werden.

2.2.3 Chemosensibilität MDA-MB-453

Bei der Mamma-Karzinom Zelllinie MDA-MB-453 zeigte Cisplatin keine Wirkung. Die Kombination mit Herceptin zeigte hingegen eine geringe Inhibierung der metabolischen Aktivität (Abb. 29).
Das Zytostatikum Carboplatin zeigte als Monosubstanz eine Wirkung, die ähnlich der von Cisplatin + Herceptin war. Herceptin konnte den durch Carboplatin vermittelten zytostatischen Effekt um ca. 15% im Endpunkt vergrößern (Abb. 30).
Das Ergebnis der Chemosensibilitätstestung von Vinorelbin wies neben einer guten Wirkung der Monosubstanz auch auf eine deutliche Verstärkung der Inhibition durch Zusatz von Herceptin hin. Der Effekt ergab eine Wirkung von 20% respektive 35% für die Kombination (Abb. 31). Dieses Ergebnis war sehr deutlich.
Bei Vinorelbin war der Effekt, der durch die Kombination mit Herceptin erreicht wurde, am deutlichsten. Während für die Monosubstanz keine Wirkung festgestellt werden konnte, erreichte die Kombination von Vinorelbin mit Herceptin eine Inhibierung der metabolischen Aktivität um über 30% (Abb. 32).
Die Untersuchungen des Zytostatika-Wirkungsprofils der Zelllinie MDA-MB-453 ergaben einen sehr deutlichen Effekt von Herceptin. Im Falle von Gemcitabin bewirkte der Zusatz von Herceptin eine Steigerung der Wirkung um über 30%, während bei Vinorelbin der Effekt der Monosubstanz von 20% um weitere 15% auf über 35% verstärkt werden konnte. Bei allen getesteten Substanzen zeigte sich eine zusätzliche Wirkung durch die Kombination der Substanzen mit Herceptin (Abb. 33).

2.2.4 Chemosensibilität MCF-7

Chemosensibilitätsuntersuchungen der Zelllinie MCF-7 zeigten für die Substanz Cisplatin als Einzelsubstanz, wie auch in Kombination mit Herceptin im Endpunkt der Messung einen zytostatischen Effekt von ca. 10%. Herceptin beeinflusste die Wirkung dieser Substanz also nicht (Abb. 34).
Carboplatin zeigte einen geringen zytostatischen Effekt. Dieser wurde durch Kombination des Zytostatikums mit Herceptin um ca. 5% auf 10% im Endpunkt gesteigert (Abb. 35). Der zusätzliche Effekt ist gering.
Auch bei Vinorelbin ließ sich ein leichter Effekt beobachten. Ein geringer Effekt von Herceptin erhöhte die Wirkung dieses Zytostatikums von ca. 10% im Endpunkt um weitere 5% auf 15%, was ebenfalls einem geringen Effekt entsprach (Abb. 36). Von den getesteten Substanzen zeigte Vinorelbin die größte Wirkung.
Gemcitabin zeigte auf die Zelllinie MCF-7 keine Wirkung. Der Endpunkt lag bei 100% und entsprach also dem Wert, den die Kontrollmessung ohne Zytostatikum ergab. Herceptin zeigte keine Wirkung (Abb. 37).
Das Wirkungsprofil der Zelllinie MCF-7 sagt aus, dass die größte beobachtete Wirkung von den untersuchten Zytostatika ausgeht (Abb. 38). Zwar lässt sich bei Carboplatin und Vinorelbin eine leichte Steigerung des Effektes durch Herceptin erzielen, doch liegt dieser deutlich unter dem Wert, den Herceptin bei HER2/neu überexprimierenden Zelllinien SK-BR-3 und MDA-MB-453 auslöst.

2.2.5 Chemosensibilität SK-OV-3

Untersuchungen der Zelllinie SK-OV-3 konnten keine Wirkung des Zytostatikums Cisplatin belegen. Auch durch Kombination mit Herceptin ließ sich kein inhibierender Effekt aufzeigen (Abb. 39).
Die Substanz Carboplatin zeigte ein ähnliches Ergebnis. Während sich die Monosubstanz nur minimal negativ auf die metabolische Aktivität der Zellen nach 15 Stunden auswirkte, ergab sich auch für die Kombination mit Herceptin keine Wirkung (Abb. 40).
Die Substanz Vinorelbin wirkte ebenfalls nicht zytostatisch auf die Zelllinie SK-OV-3. Auch hier konnte Herceptin keinen zusätzlichen Effekt herbeiführen, sondern zeigte sogar noch einen leicht aktivierenden Effekt (Abb. 41). Vinorelbin zeigt somit eine antagonistische Wirkung.
Die Substanz Gemcitabin konnte die metabolische Aktivität diese Zelllinie nicht negativ beeinflussen. Sowohl die Monosubstanz, als auch die Kombination mit Herceptin führte zu einer leichten Stimulation (Abb. 42).
Bei der Zelllinie SK-OV-3 zeigte sich bei keiner der untersuchten Substanzen ein zytostatischer Effekt. Auch durch Kombination dieser Substanzen mit Herceptin ließ sich keine Wirkung aufzeigen (Abb. 43).

2.3 Zusammenfassung der Ergebnisse

Die untersuchten Zelllinien zeigten große Unterschiede bezüglich ihres Reaktionsprofils auf HRG. Abb. 44 veranschaulicht das unterschiedliche Ausmaß der Reaktion auf eine Exposition von 100 ng/ml HRG für ein Intervall von 30 Minuten. Die größte Reaktion erfolgte mit einer Aktivierung von durchschnittlich 38% bei der Zelllinie SK-BR-3. MDA-MB-453 Zellen weisen mit einer Aktivierung von durchschnittlich 19% eine geringere, aber immer noch deutlich nachweisbare Reaktion auf. Bei der Zelllinie MCF-7 ließ sich eine minimale Reaktion von ca. 5% nachweisen, während bei der Zelllinie SK-OV-3 keine Reaktion gemessen werden konnte.
Chemosensibilitätsuntersuchungen verdeutlichten große Unterschiede der Zelllinien bezüglich ihres Ansprechens auf die getesteten Substanzen. Die HER2/neu hoch exprimierenden Zelllinien SK-BR-3 und MDA-MB-453 zeigten bei einigen der getesteten Substanzen eine deutlich erhöhte Wirkung, wenn diese mit Herceptin kombiniert wurden. Die Zelllinie MCF-7 zeigte hingegen bei zwei von vier getesteten Substanzen keine erhöhte Wirkung der Kombination von Zytostatikum und Herceptin. In den anderen zwei Fällen zeigte Herceptin einen minimalen additiven Effekt. Für die Zelllinie SK-OV-3 konnten weder für eines der getesteten Zytostatika, noch für eine Kombination mit Herceptin Effekte aufgezeigt werden, die sich negativ auf die metabolische Aktivität auswirkten (Tabelle 8). Tabelle 8 Verstärkung der Wirkung von Zytostatika durch Herceptin nach 15 Stunden Exposition

3 Diskussion

3.1 Hintergrund

Der Begriff "Theranostics" beschreibt Produkte, die therapeutisches und diagnostisches Potential besitzen. Eine gezielte Diagnose erlaubt, einen spezifischen Ansatzpunkt für Therapeutika zu identifizieren und kann dadurch einem Patienten zur Auswahl einer optimalen Therapie verhelfen. Aufgrund großer individueller Unterschiede im Hinblick auf ein therapeutisches Ansprechen, zeichnet sich in der Onkologie bezüglich des Krebspatienten ein großes Potential für die Entwicklung von "Theranostika" ab. Immer mehr Therapeutika machen die prätherapeutische Untersuchung eines zu erwartenden Ansprechens notwendig, da diese Substanzen durch ansteigende Teuerungsraten zunehmend Probleme für die Kostenerstattung verursachen. Auf dem Gebiet der Krebsforschung befasst man sich mit der Identifizierung von Tumormarkern, der Entwicklung und Automatisierung von diagnostischen Techniken und der Erhebung klinischer Daten, um die Prognose und die therapeutischen Aussichten zu charakterisieren (Bromley, 2000).
Das bekannteste Beispiel für den Einsatz von "Theranostika" ist HER2/neu, mit dem therapeutischen Antikörper Herceptin. Der Nachweis einer Amplifikation dieses Wachstumsfaktor-Rezeptors gewährt eine Prognose über einen aggressiven Krankheitsverlauf. Dadurch kann eine Aussage bezüglich eines zu erwartenden Ansprechens auf bestimmte Therapeutika gemacht werden. Dies ist besonders entscheidend für die Anwendung des Anti-HER2/neu-Antikörpers Herceptin (Cooke et al., 2001). Der Einfluss der Diagnostik auf die Therapie zeigt sich an diesem Beispiel besonders deutlich, da in diesem Fall ein positiver Nachweis der Amplifikation des Rezeptors in den USA von der "Food and Drug Administration" (FDA) als notwendiges Kriterium für die Zulassung zur Therapie mit Herceptin ist. Ziel der Arbeit war es, einen anwendungsorientierten und funktionellen diagnostischen Test zu entwickeln, der die Patientengruppe identifizieren kann, die von einer Therapie mit dem monoklonalen Anti-HER2/neu-Antikörper Herceptin profitiert. Dieser Test soll eine größere prognostische Relevanz haben, als die etablierten und von der "Food and Drug Administration" zugelassenen HER2/neu- Testmethoden.
Herceptin war der erste therapeutische monoklonale Antikörper, der zur Therapie des metastasierten Mamma-Karzinoms zugelassen wurde und ist ein repräsentatives Beispiel für den spezifischen Ansatz der Immuntherapie im Rahmen der Tumortherapie (Shepard et al., 1991). Eine häufige HER2/neu-Amplifikation als Voraussetzung für diese Form der Therapie konnte bei Tumoren der Mamma (King et al., 1985), des Kolon (Meltzer et al., 1987), der Lunge (Cline et al., 1987), des Magens (Jähne et al., 1994), des Ovars (Meden et al., 1997), wie auch des Pankreas (Buchler et al., 2001) festgestellt werden. Somit eignet sich dieser Therapieansatz grundsätzlich für die Behandlung verschiedener Tumore. Der größte wissenschaftliche Hintergrund bezüglich des monoklonalen Antikörpers Herceptin liegt jedoch auf dem Gebiet der gynäkologischen Tumore und hier speziell auf dem Gebiet des Mamma-Karzinoms. Klinische Studien wurden sowohl für eine Herceptin-Monotherapie, als auch für eine Kombinationstherapie mit Zytostatika auf diesem Gebiet etabliert (Baselga et al. 1996). Aus diesem Grund wurden die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit an Zelllinien durchgeführt, die sich von Mamma- und Ovarial-Karzinomen ableiten lassen.
Eine HER2/neu-Ampifikation bildet die Voraussetzung für eine Wirkung von Herceptin. Aufgrund zunehmender Entwicklungskosten für zukünftige Therapeutika und damit verbunden immer höheren Therapiekosten ist davon auszugehen, dass in Zukunft solche prädiktiven Testverfahren zunehmend von Patienten zu durchlaufen sind (Bromley et al., 2000). Eine Behandlung mit Herceptin kostet pro Jahr und Patient 36 000 US $ (Taylor, 1999).
Diese Erhebungen wurden bereits bei Konsensustreffen von Experten diskutiert. Bestrebungen zur Erforschung eines zuverlässigen prognostischen Testverfahrens wurden dabei in den Mittelpunkt der Diskussion gestellt (Nelson et al., 2000).
Im Mittelpunkt der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit steht der HER2/neu- Rezeptor, für den prognostische Relevanz bei der Diagnose des Mamma- Karzinoms belegt ist (Cooke et al., 2001). In dieser Arbeit wurde die funktionelle Analyse für diesen Rezeptor und assoziierter Mitglieder der EGFR-Familie zugrunde gelegt (Pinkas-Kramarski et al., 1996). Die Wechselwirkung spezifischer Liganden, antagonistischer Wirkstoffe und Antikörper fungierte als Basis zur Ausarbeitung eines diagnostischen Tests, der als Vorlage angehender klinischer Studien entwickelt und optimiert wurde (Le et al., 2000). Mit dieser Zielsetzung sollte ein "Theranostikum" entwickelt werden, das sowohl prognostischen, als auch prädiktiven Charakter hat und eine Differenzierung und Verbesserung der bisher etablierten HER2/neu-Testverfahren ermöglicht.

3.2 Etablierung eines funktionellen HER2/neu-Rezeptortests

Der Nachweis einer Rezeptor- bzw. Genamplifikation ist die Grundlage der konventionellen und etablierten HER2/neu-Testverfahren. Aus diesem Grund näherten wir uns zunächst diesem Ansatz mit einer funktionellen Ausrichtung experimentell an. Diese Untersuchungen dienten primär als Basis, eine Validierung der etablierten Verfahren, die an fixiertem Gewebe erfolgen, nun auf vitale Zellsysteme zu übertragen.
HRG bewirkt an HER2/neu eine agonistische Stimulierung, wie vorab durch entsprechende "Ligandenassays" beschrieben wurde (Graus-Porta et al., 1997). Im Kontext dieser Arbeit interessierte uns, ob sich dieser Effekt über ein funktionelles Ansprechen und über eine Veränderung in der Protonenabgabe der Tumorzelle nachweisen lässt. Daher wurde eine Dosiseskalation mit HRG zugrunde gelegt und eingehend untersucht.
Es ließ sich zeigen, dass die Substanz eine entsprechend der Rezeptordichte konsistente Antwort liefert, die mit der Dosiseskalation einhergeht. Aufbauend auf Untersuchungen von Chan et al. 1995 wurden Stimulationsexperimente mit dem spezifischen Liganden HRG angesetzt, um eine Aussage über die HER2/neu- Rezeptordichte auf der Zellmembran zu treffen. Die Signalleitung, die durch Bindung dieses Liganden induziert wird, bezieht HER2/neu mit ein. Lewis et al. konnten 1996 zeigen, dass HER2/neu bei der HRG induzierten Antwort eine entscheidende Rolle spielt. In diesen Untersuchungen wurde belegt, dass HER2/neu bei der Auslösung einer proliferativen Antwort essentiell ist und diese nur stattfindet, wenn HER2/neu vorhanden ist. Für eine Reaktivität gegenüber HRG sind somit einerseits die Rezeptoren HER3 bzw. HER4 als direkte Interaktionspartner für HRG notwendig, als auch HER2/neu für eine effektive Signalleitung. Untersuchungen einer anderen Gruppe zeigten, dass HER2/neu für die anderen Mitglieder der EGFR-Familie den präferierten Rezeptor bei der ligandeninduzierten Heterodimerisierung darstellt (Graus-Porta et al., 1997).
In den durchgeführten Versuchen ließen sich die Ergebnisse von Chan et al. 1995 bestätigen. So reagierten alle Zelllinien mit einer Zunahme der metabolischen Aktivität auf eine HRG-Exposition, die einerseits mindestens einen der HRG- Rezeptoren (HER3, HER4) und andererseits eine Amplifikation des HER2/neu- Rezeptors aufwiesen (SK-BR-3, MDA-MB-453). Die Zelllinie, der die genannten HRG-Rezeptoren fehlten (SK-OV-3), als auch die, bei der keine HER2/neu- Amplifikation nachgewiesen werden konnte (MCF-7), ließen sich nicht oder kaum stimulieren (Chan et al., 1995; De Fazio et al., 2000). Quantitative Unterschiede bei einer erfolgten Stimulation konnten mit der relativen Menge an exprimierten HER2/neu-Rezeptoren in Verbindung gebracht werden. Hiervon ausgehend konnte der Einfluss der Testparameter auf die HRG-Stimulation untersucht und der Versuchsansatz optimiert werden. In dessen Folge konnte eine deutlichere Zunahme der Aktivierung erzielt werden, als dies 1995 von Chan et al. erreicht wurde.
Die Ergebnisse belegen, dass der Testansatz eine Möglichkeit repräsentiert, eine Aussage bezüglich der EGF-Rezeptor Verteilung zu treffen, die zusätzlich Hinweise bezüglich der Menge an HER2/neu-Rezeptoren auf der Zellmembran der untersuchten Zellen berücksichtigt.
Eine Erweiterung dieses Testansatzes sollte aufzeigen, ob an der durch HRG induzierten Signalleitung Tyrosinkinasen beteiligt sind. Durch eine Inhibierung mit Hilfe des Tyrosinkinase-Inhibitors Genistein konnte die ausgelöste Reaktion effektiv minimiert werden (Abb. 21). Dies belegt die dominante Funktion von Tyrosinkinasen an dem durch HRG induzierten Signalweg. Die Entwicklung spezifischer Tyrosinkinase-Inhibitoren könnte dazu führen, dass eine Weiterentwicklung dieses Testansatzes spezifischere Schlüsse zulässt.

3.3 Nachweis spezifischer Interaktionen von Herceptin mit HER2/neu

Eine weitere Fragestellung, der bei der Untersuchung des HER2/neu-Rezeptors nachgegangen wurde, war, ob sich mit dem beschriebenen Ansatz des funktionellen Rezeptortests auch spezifische Interaktionen des monoklonalen Antikörpers Herceptin nachweisen lassen.
Um solche Interaktionen von Herceptin mit dem HER2/neu-Rezeptor zu untersuchen, wurde der Einfluss von Herceptin in Wechselwirkung mit HRG untersucht. Es wurde beschrieben, dass Anti-HER2/neu-Antikörper die Stabilität von HER2/neu-HER3- wie auch HER2/neu-HER4-Heterodimeren beeinträchtigen und dadurch eine Ligandendissoziazion beschleunigen (Klapper et al., 1997). Diese Kompetition des monoklonalen Antikörpers Herceptin mit dem agonistischen Liganden HRG um eine Bindung von HER2/neu ist ein Mechanismus, der für die Wirkung von Herceptin verantwortlich gemacht wird (Baselga et al., 2001b).
Die Erwartung, dass die HRG-induzierte Aktivierung durch Blockierung von HER2/neu mit dem Antikörper inhibiert wird, bestätigte sich bei der Zelllinie SK-BR- 3. So fällt die Stimulation mit HRG bei vorgelegter Exposition der Zellen mit Herceptin abhängig von der Konzentration des monoklonalen Antikörpers geringer aus, als in Kontrollexperimenten, die ohne Zugabe des Antikörpers erfolgten. Eine komplette Unterdrückung der Reaktion ließ sich nicht durch Herceptin bewirken (Abb. 18). Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die Interaktion von HRG mit dem Rezeptor nicht alleine kompetitiv ist und so ein Anteil der Rezeptoren trotz Blockierung weiter an einer Signalleitung beteiligt ist. Eine andere Erklärung wäre, dass durch die HER2/neu-Blockade andere Rezeptoren wie der EGFR für die Heterodimerisierung hinzugezogen werden.
Graus-Porta et al. publizierten 1997 ein Modell, das aussagt, dass die HRG- Rezeptoren HER3 und HER4 bevorzugt mit HER2/neu interagieren, in Abwesenheit von HER2/neu jedoch auch mit EGFR. Nach diesem Modell ließe sich eine Reaktion, die trotz Blockierung des HER2/neu-Rezeptors abläuft, damit erklären, dass alternativ zur präferierten Dimerisierung der HRG-Rezeptoren mit HER2/neu auch eine Interaktion dieser Rezeptoren mit dem EGFR auftreten kann und dadurch ein Signal generiert werden kann, das in Form einer Stimulation des Metabolismus nachweisbar ist. Vergleichbare Untersuchungen wurden 1996 von Lewis et al. durchgeführt. Sie untersuchten den Einfluss von monoklonalen Anti-HER2/neu- Antikörpern auf die Tyrosinphosphorylierung von HER2/neu, die auf eine Exposition mit HRG erfolgte. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich diese Phosphorylierung durch eine Blockierung mit Hilfe des Antikörpers um ca. 50% reduzieren ließ.
Versuche zur Herceptin-Inhibierung der HRG-Stimulation an der Zelllinie MDA-MB- 453 bewiesen sich als wenig aussagekräftig. Die in Abschnitt 2.1.1.2 erreichte Stimulation ließ sich für diese Versuche nicht reproduzieren. Eine Inhibierung ließ sich nicht nachweisen. Bei der Interpretation der Ergebnisse für die Zelllinie MDA- MB-453 ist zu berücksichtigen, dass die Reaktion in einem Messbereich liegt, in dem der Messfehler im Verhältnis zur Reaktion relativ groß ist. So lassen sich Differenzen der erhaltenen Messkurven nur annähernd quantifizieren (Abb. 20).
Die weiteren in dieser Arbeit untersuchten Zelllinien zeigten keine oder eine kaum nachweisbare Reaktion auf HRG. Die Untersuchung der Herceptin-Interaktion bei diesen Zelllinien bestätigte die Erkenntnis, dass diese Zellen gegenüber HRG nicht reaktiv sind. Eine Veränderung dieses Reaktionsprofils durch Blockierung des HER2/neu-Rezeptors durch Herceptin konnte nicht festgestellt werden (Daten nicht dargestellt).
Weitere Einsicht in die Zusammenhänge der Rezeptorinteraktionen und ihrer Wirkung auf die Kinetik einer Reaktion auf HRG könnten in weiteren Versuchen gewonnen werden, indem andere Rezeptoren der EGF-Familie durch Antikörper blockiert werden. So wäre zu erwarten, dass eine Blockierung des EGFR in Kombination mit der durchgeführten Blockierung des HER2/neu-Rezeptors zu einer vollständigen Unterdrückung der HRG induzierten Reaktion führt.

3.4 Untersuchungen zur Kombination von Herceptin mit Zytostatika

Eine Validierung der Ergebnisse für die untersuchten Zelllinien erfolgte durch Chemosensibilitätsmessungen. Grundlage dieser mikrophysiometrischen Analyse ist das diagnostische Testverfahren ChemoSelect der Firma CELLCONTROL AG. Bei diesem Verfahren können Tumorzellen mit verschiedenen Zytostatika in Kontakt gebracht werden. Eine Messung des Zellmetabolismus gibt Aufschluss über eine Wirkung der getesteten Substanzen. Für dieses diagnostische Testverfahren wurde bereits eine gute in-vitro/in-vivo-Korrelation belegt (Metzger et al., 2001).
Während Herceptin zunächst als Monotherapie verabreicht wurde, wird es heute in Kombination mit Zytostatika gegeben. Um eine Validierung der oben erhaltenen Testergebnisse möglichst anwendungsbezogen zu gestalten, wurde die Frage nach einem Ansprechen auf Herceptin untersucht. Additive oder synergistische Effekte von Herceptin mit diesen Zytostatika sollten untersucht werden. Dazu wurden Zytostatika untersucht, bei denen solche Interaktionen belegt wurden (Baselga et al., 1998; Pegram et al., 1999a; Baselga et al., 2001, Nabholtz et al., 2001).
Durch das Verfahren der Chemosensibilitätsmessung kann zusätzlich zu der Aussage über ein Ansprechen auf Herceptin eine Angabe der optimalen Kombination aus Zytostatikum und Herceptin erfolgen. In diesem Punkt bietet ein funktionelles Testverfahren eine signifikante Verbesserung zu den etablierten HER2/neu-Tests, die der in der Klinik auftretenden Problematik der Therapiewahl begegnet.
Chemosensibilitätsuntersuchungen belegten, dass sich bei den Zelllinien SK-BR-3 und MDA-MB-453 eine zusätzliche Wirkung von Herceptin in Kombination mit einigen der untersuchten Zytostatika ergab. Ein therapeutischer Effekt konnte somit bei diesen Zelllinien aufgezeigt werden. Dieser therapeutische "Benefit" ist in diesen Fällen positiv mit dem Nachweis einer Reaktivität gegenüber HRG korreliert und bestätigt die Hypothese, dass bei einer erfolgten Stimulation durch HRG ein Ansprechen auf Herceptin zu erwarten ist. Diese Ergebnisse stehen somit in Einklang mit der Annahme einer HER2/neu-Überexpression als notwendigem, aber nicht ausreichendem Kriterium für ein Ansprechen auf Herceptin.
Bei den Zelllinien, die sich nicht durch HRG stimulieren ließen (MCF-7, SK-OV-3), konnte kein therapeutischer Nutzen der Kombinationen von Zytostatika mit Herceptin nachgewiesen werden. Dennoch lies sich für einige Zytostatika eine Wirkung feststellen, die aber nicht oder nur minimal durch Herceptin verstärkt werden konnte. Ein Ansprechen auf Herceptin konnte also bei diesen Zellen nicht beobachtet werden. Auch in diesen Fällen ist die HRG-Reaktivität positiv mit einem Ansprechen auf Herceptin korreliert.
Die Zelllinie MCF-7 weist einen EGF-Rezeptor-Zusammenstellung auf, der bereits bei den etablierten HER2/neu-Testmethoden kein Ansprechen erwarten lässt. Eine Überexpression des HER2/neu-Rezeptors kann nicht gefunden werden und somit würden Zellen dieses Typs auch mit den etablierten HER2/neu-Testverfahren als "Non-Responder" klassifiziert (Chan et al., 1994). Die Zelllinie SK-OV-3 zeigt hingegen deutlich amplifizierte Werte bezüglich diese Rezeptors. Für diese Zellen ließ sich jedoch kein therapeutischer Nutzen von Herceptin nachweisen, obwohl diese Zellen nach den Kriterien der FDA für eine Therapie in Frage kommen. Somit scheinen diese Zellen einen Fall darzustellen, in dem mit etablierten Methoden aufgrund eines positiven HER2/neu-Tests fälschlicherweise auf ein Ansprechen auf Herceptin geschlossen würde. Dieser Fall ist repräsentativ für 75-90% der HER2/neu positiv getesteten Patientinnen, die nicht auf eine Behandlung mit Herceptin ansprechen (Baselga et al., 1996).
Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die untersuchte Reaktivität gegenüber HRG eine Korrelation mit dem Ansprechen auf Herceptin aufweist. Dieser Schluss ist zu ziehen, da in den untersuchten Tumorzellmodellen aufgezeigt werden konnte, dass eine Wirkung von Herceptin nur bei Zellen zu beobachten war, die über eine HER2/neu-Amplifikation und zusätzlich über eine gewisse Menge an HER3 bzw. HER4 auf der Zellmembran verfügten. Die Ergebnisse der Chemosensibilitätsmessungen belegen eine prognostische Relevanz, die im Vergleich zu den etablierten HER2/neu-Testmethoden eine deutlich verbesserte Vorhersage ("predictive value") ermöglichen.

3.5 Ausblick

Zahlreiche Bestrebungen werden unternommen, um Kriterien festlegen zu können, nach denen man Tumorpatienten eine optimale Therapie garantieren kann. Der Großteil der Forschung befasst sich mit der molekularbiologischen Erfassung von Tumormarkern auf genetischer Ebene. So erhofft man sich, durch ein standardisiertes "Screening" von mehreren Tausend Genen ein genetisches Profil zu definieren, das charakteristisch für die Chemosensibilität gegenüber bestimmten Substanzen ist (Staunton et al., 2001). Für solche Ansätze gibt es jedoch zum heutigen Zeitpunkt noch keine ausreichenden klinischen Daten. Um eine endgültige Aussage bezüglich des prädiktiven Wertes solcher Verfahren machen zu können, müssen diese Daten erhoben werden.
Einen ganz anderen Ansatz bieten funktionelle "Assays". Im Gegensatz zu molekularbiologischen Anwendungen befassen sich diese Techniken mit Effekten, die durch funktionsfähige Zellen in einem physiologischen Umfeld wiedergegeben werden. So bieten Proliferationsmodelle einen Ansatz, der funktionelle Effekte anhand der Proliferationsrate von Tumorzellen misst. Ebenso können Tiermodelle eine gewisse Aussage über ein Ansprechen von transplantierten Zellen geben. Beide Verfahren sind jedoch aufwendig und von langer Messdauer (Tage bis Wochen), bis eine Aussage gemacht werden kann. Diese Zeit bedingt sich schon durch die hierfür notwendigen Phasen der Zellkultur.
Der in dieser Arbeit untersuchte funktionelle Testansatz bietet ideale Voraussetzungen, ein konkurrenzfähiges und auf die Bedürfnisse des Marktes ausgerichtetes Produkt zu entwickeln. Der Test bietet im Vergleich zu alternativen Verfahren folgende Vorteile:

1. Bezüglich der hier untersuchten Zelllinien kann prognostische Relevanz erreicht werden, die deutlich bessere Ergebnisse erzielt, als dies mit den etablierten HER2/neu-Testverfahren möglich ist.
2. Da der Test im Optimalfall innerhalb von 24 Stunden nach Entnahme der Biopsie abgeschlossen ist, kann die Therapie bereits sehr bald begonnen werden.
3. Eine Veränderung von Tumorzellen vor der Testung (z. B. auftretende Resistenzen), wie sich bei Testverfahren mit notwendiger Zellkulturphase vorkommen kann, stellt für dieses Verfahren kein Problem dar.
4. Da der funktionelle Rezeptortest Effekte an lebenden Zellen misst, die der in- vivo Situation nahe kommen, werden besonders Faktoren berücksichtigt, die an der in-vivo-Reaktion beteiligt sind.

Um letztlich die erhaltenen Testergebnisse anhand klinischer Daten validieren zu können, müssen analoge Untersuchung an Zellen erfolgen, die unmittelbar aus Tumorgewebe stammen. Dem Nachteil eines eventuell zusätzlichen operativen Eingriffs steht für den Patienten eine hohe Sicherheit bei der Wahl einer optimalen Therapie gegenüber. Um die an Zelllinien gewonnenen Erkenntnisse auf Biopsien abzustimmen, können bereits erarbeitete Parameter des Tests auf diese Bedürfnisse angepasst werden.
Ein entscheidender Arbeitsschritt, der bei der Untersuchung von Gewebezellen im Vergleich zu Versuchen an Zelllinien hinzukommt, ist die Gewebeaufarbeitung. Dieser Arbeitsschritt wird durch den Verdau mit Enzymen dominiert und kann unter Umständen unspezifische Effekte an den extrazellulären Rezeptordomänen bewirken. Es gibt jedoch bereits Erfahrungen mit vom Standardaufarbeitungsprotokoll abweichenden Dissoziationsmethoden. Eine geeignete Aufarbeitungsmethode könnte beispielsweise mit milden Enzymkombinationen oder sanften mechanischen Verfahren durchgeführt werden. Probleme bei der Bereitstellung von Tumorzellen sind hingegen nicht zu erwarten. Erfahrungen der Firma CELLCONTROL AG im Bereich der Logistik und der Betreuung klinischer Studien im Rahmen der Entwicklung des ChemoSelect-Tests, werden nützlich sein, um einen reibungslosen Ablauf der Beschaffung von Tumorzellen zu gewährleisten.
Eine wichtige Substanzklasse, für die in klinischen Studien zusätzliche Effekte in Kombination mit Herceptin beschrieben wurden, sind die Taxane (Slamon et al., 2001). Anfängliche Chemosensibilitätsuntersuchungen dieser Substanzen zeigten, dass diese Messungen keinen Schluss auf eine Wirkung zulassen. Dies ist damit zu erklären, dass diese Substanzen nicht wasserlöslich sind und daher in den entsprechenden Negativkontrollversuchen Lösungsmittel zugegeben werden müssen. Diese Lösungsmittel zeigten eine starke Toxizität gegenüber den untersuchten Zelllinien. Als Folge dieser unspezifischen Lösungsmitteleffekte wurde die metabolische Aktivität der Zellen bereits durch das Lösungsmittel so stark reduziert, dass eine Ableitung einer Wirkung des untersuchten Zytostatikums in diesen Fällen nicht möglich war (Abb. 22, 23). Daher musste auf Untersuchungen mit diesen Zytostatika verzichtet werden.
Für Untersuchungen der Chemosensibilität wurden Zytostatika entsprechend ihrer "Peak Plasma"-Konzentration verwendet. Diese Konzentration soll der Situation im Körper bei Therapie nahe kommen. Ein Ansatz, um dem Problem der Toxizität von Lösungsmitteln zu begegnen, wäre, diese in entsprechend geringer Konzentration zu verwenden. Eine Versuchsreihe könnte Aufschluss darüber geben, ob bei einer entsprechend gering gewählten Konzentration der Zytostatika diese unspezifischen Effekte zu minimieren sind.
Eine Erweiterung des durchgeführten Testverfahrens ist mit anderen Liganden für die EGFR-Familie vorstellbar, welche ebenfalls HER2/neu bei der Signalleitung mit einbeziehen. So könnte beispielsweise das Reaktionsprofil von EGF oder anderen HRG-Isoformen untersucht werden. Auf diese Weise kann möglicherweise der prognostische Wert der Aussage einer erfolgenden Stimulation durch eine andere Substanz oder gar einen "Cocktail" verschiedener Substanzen weiter verbessert werden.
Eine Anwendung dieses Testansatzes ließe sich auf Untersuchungen von Tumoren anderer Organe erweitern. Voraussetzung für einen solchen Ansatz sind weitere klinische Daten bezüglich des Ansprechens auf Herceptin.
Von Interesse werden zukünftig weitere zelluläre "Targets" des Tumors sein, die über vergleichbare Signalübertragungswege koppeln, wie dies EGF-Rezeptoren tun. Bereits heute befinden sich Substanzen in der frühen klinischen Validierung, die eine spezifische Blockade der intrazellulären Signal-Effektor-Kaskade hervorrufen. Diese Wirkstoffe sind der Beginn einer spezifischen und auf die Zukunft gerichteten Therapie, deren Wirksamkeit durch moderne, funktionelle diagnostische Testverfahren bestätigt wird, um ein individuelles Ansprechen zu gewährleisten. Der dieser Arbeit zugrunde liegende Test hat hierfür erste Voraussetzungen geschaffen, die Anwendung in klinischen Studien zu überprüfen und zu bestätigen.

4 Zusammenfassung

Die "Epidermal Growth Factor" Rezeptoren (EGFR) stellen potenzielle "Targets" für die Tumortherapie dar. HER2/neu ist ein Mitglied dieser Rezeptorfamilie und wird bei Brustkrebs als prognostischer Marker eingesetzt. Gegen diesen Rezeptor wurde ein humanisierter, monoklonaler Antikörper (Trastuzumab, Herceptin) entwickelt, der den ersten für klinische Anwendungen in der Tumortherapie zugelassenen Antikörper darstellt und eine spezifische Inhibierung der Tumorzelle auslöst. Dieser kommt bei Brustkrebspatientinnen zur Anwendung, die eine hohe HER2/neu-Dichte aufweisen (bei ca. 25%). Obwohl Herceptin nur nach diagnostischer Bestätigung bei HER2/neu positiven Patienten verabreicht wird, sprechen dennoch weniger als 30% der Patientinnen auf eine Therapie mit dem Antikörper an. Daher wird Herceptin in Verbindung mit bestimmten Zytostatika als Kombinationstherapie verabreicht, um ein verbessertes Ansprechen zu bewirken. Dennoch profitieren viele HER2/neu-positive Patientinnen nicht von der eigentlichen Immuntherapie. Daher besteht die Notwendigkeit eines Testverfahrens. Ein funktioneller Herceptin- Test könnte dieses Problem lösen und "Therapieresponder" identifizieren. Zusätzlich könnte solch ein Test auch die synergistischen Substanzpartner einer Kombinationstherapie identifizieren.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde solch ein funktionelles Testverfahren etabliert. Dieser Test kann die Aktivierung des HER2/neu-Rezeptors durch den Liganden Heregulin und die selektive und antagonistische Wirkung von Herceptin auf diese Aktivierung nachweisen. Hierfür wurden verschiedene Zelllinien der Brust und des Ovars verwendet, die unterschiedliche Charakteristika besaßen. Es ließ sich zeigen, dass die Aktivierung mit der Rezeptordichte zunahm und differenzielle in-vitro- "Responseraten" bei den unterschiedlichen Zelltypen erzielt wurden. In der Rangfolge SK-BR-3 >> MDA-MB-453 >> MCF7 nahm die Wirkung mit dem Liganden analog zur Rezeptordichte ab. Allen Zelltypen war die Expression von zusätzlich HER3-Rezeptoren gemeinsam. Zudem konnte bewiesen werden, dass die Anwesenheit eines "Vermittlermoleküls", das einen weiteren spezifischen Rezeptorsubtyp darstellt, die Voraussetzung für eine funktionellen Antwort ist. SK- OV-3 zeigt unter Abwesenheit von HER3 eine vergleichbar hohe Rezeptordichte wie SK-BR-3. Eine stimulatorische Antwort konnte mit Heregulin nicht bewiesen werden, da das Fehlen von HER3 als Kofaktor kein funktionelles Ansprechen in diesem Zelltyp zuließ. In der Kombination Heregulin und Herceptin konnte zudem die inhibitorische Wirkung des Herceptins belegt werden. Herceptin zeigt auch an funktionell entkoppelten SK-OV-3 Zellen keine Wirkung.
Der Synergismus im Sinne einer selektiven Inhibierung der Tumorzellen wurde aus einer Kombinationstherapie aus Herceptin und fünf verschiedenen Zytostatika auf prädiktive Wertigkeit untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass nur die aktivierbaren Zelllinien (s. o.) ein selektives Ansprechen auf die additive Gabe von Herceptin und Zytostatika zuließen, während die SK-OV-3 Zelllinien keine Koeffekte aufwiesen. Weiterhin konnte bewiesen werden, dass individuelle Unterschiede bei den Zelllinien zu unterschiedlich stark ausgeprägter Koinhibierung führten. Es konnte neben der Wirksamkeit des Herceptins zusätzlich das Ansprechen der Zytostatika, im Sinne einer nachweisbaren Sensibilität bzw. Resistenz gezeigt werden.
Diese Erkenntnisse bestätigen, dass dieses Testsystem in Zukunft, für die Ermittlung der Patientenpopulation positioniert werden könnte, um "Herceptin- Responder" von "Non-Responder" vor einer anstehenden Therapie funktionell und schnell differenzieren zu können. Gleichzeitig lässt diese Testsystem eine genaue Bestimmung der synergistischen und antagonistischen Zytostatika an den Tumorbiopsien des Patienten zu.
Diese Arbeit bildet die Grundlage für ein "theranostisches" Verfahren, mit dem man in Zukunft die Behandlung mit Herceptin erstmals gezielt auf Patienten fokussieren kann, die auf das Medikament ansprechen. Dies würde zu einer deutlichen Verminderung von Nebenwirkungen und Kosten einer Therapie führen. Fortgeführte Arbeiten mit Biopsien von Patienten und klinische Studien müssen nun die Qualität dieses Systems ermitteln. 5 Literaturverzeichnis Alroy, I., Yarden, Y. The erbB signalling network in embryogenesis and oncogenesis: Signal diversification through combinatorial ligand-receptor interactions. FEBS Lett 410: 83-86 (1997);
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Abbildung: Abbildung
ATP: Adenosin 5'-Triphosphat
BSS: Balanced salt solution
CaCl₂: Kalziumchlorid
CDR: Complementary determining region
CHO: Chinese hamster ovary
CM: Cytosensor-Mikrophysiometer
Da: Dalton
DMSO: Dimethyl sulfoxid
ECD: Extracellular domain
EDTA: Ethylendiamin-tetraseeigsäure Dinatriumsalz Dihydrat
EGF: Epidermal growth factor
EGFR: Epidermal growth factor receptor
EGTA: Ethylenglykol-bis-(2-aminoethyl)-tetraessigsäure
ER: Estrogen receptor
EtOH: Ethanol
FDA: Food and Drug Administration
FISH: Fluorescence in situ hybridisation
HER2/neu: Human epidermal growth factor receptor 2
HER3: Human epidermal growth factor receptor 3
HER4: Human epidermal growth factor receptor 4
HRG: Heregulin
HSA: Human Serum Albumin
Ig: Immunglobulin
IgG1: Immunglobulin G1
IHC: Immunhistochemie
KCl: Kaliumchlorid
LAPS: Light addressable potentiometric sensor
M: Molar
MgCl₂: Magnesiumchlorid
ml: Milliliter
mM: Millimolar
mRNA: Messenger RNA
Na₂HPO₄: Dinatriumhydrogenphosphat
NaCl: Natriumchlorid
NaH₂PO₄: Natriumdihydrogenphosphat
NaHCO₃: Natriumpyruvat
NaOH: Natriumhydroxid
NDF: Neu differentiation factor
ng: Nanogramm
NRG: Neuregulin
PBS: Phosphate buffered saline
PBS: Phosphate buffered saline solution
PCR: Polymerase Chain Reaktion
RTK I: Rezeptor Tyrosin Kinase der Klasse I
RTK: Rezeptor Tyrosin Kinase
s: Sekunde
Tab: Tabelle
Tris: Tris-(hydoxymethyl)-aminomethan
µg: Mikrogramm
µV:

Claims

1. Verfahren zur Prädiktion oder Prognose der Wirksamkeit einer Tumorbehandlung umfassend

a) Inkontaktbringen einer Probe, die lebende Zellen mit einer abnormen Aktivität eines Mitglieds der EGF-Rezeptorfamilie aufweist mit

a) einem Interaktionspartner, wobei der Interaktionspartner das durch den natürlichen Liganden vermittelte Signal des Rezeptors moduliert; und

b) einem mehreren Therapeutika

unter Bedingungen, die eine Interaktion der lebenden Zellen mit dem Interaktionspartner und dem einen oder mehreren Therapeutika erlauben; und

b) Messung des über das Mitglied der EGF-Rezeptorfamilie vermittelten Signals, wobei die Modulation dieses Signals die Wirksamkeit der Tumorbehandlung prädiziert oder prognostiziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Modulation des Rezeptor-vermittelten Signals in einer lebenden Zelle mit einer abnormen Aktivität eines Mitglieds der EGF-Rezeptorfamilie mit der Modulation des entsprechenden und unter den gleichen Verfahrensbedingungen herbeigeführten Signals in einer lebenden Zelle mit normaler Aktivität des Mitglieds der EGF-Rezeptorfamilie verglichen wird und die Wirksamkeit der Tumorbehandlung durch den Unterschied in der Modulation prädiziert oder prognostiziert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Therapeutikum ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus einer Substanz mit toxischer Wirkung, einem ionischen Strahler, einem Antikörper und einem hyperthermischen Therapeutikum.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Therapeutikum eine Kombination aus zwei oder mehreren Therapeutika ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Interaktionspartner und das Therapeutikum miteinander fusioniert sind.

6. Verfahren zur Identifizierung eines für die Tumorbehandlung wirksamen Therapeutikums oder einer Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum umfassend

b) einer oder mehreren Testsubstanzen

unter Bedingungen, die eine Interaktion der lebenden Zelle mit dem Interaktionspartner und der Testsubstanz erlauben;

a) Messung des über das Mitglied der EGF-Rezeptorfamilie vermittelten Signals; und

b) Vergleich des Meßergebnisses aus Schritt (b) mit einem Meßergebnis, das ohne die Zugabe der Testsubstanz erhalten wurde, wobei die Modulation dieses Signals mit der Testsubstanz im Vergleich zum Wert ohne die Testsubstanz ein Indiz für die Wirksamkeit der Testsubstanz als Therapeutikum oder als Leitsubstanz für ein Therapeutikum darstellt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Interaktionspartner ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment oder Derivat davon ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der monoklonale Antikörper ein IgG ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der monoklonale Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der humanisierte Antikörper Herceptin (Trastuzumab) ist.

11. Verfahren zur Identifizierung eines für die Tumorbehandlung wirksamen Therapeutikums oder einer Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum umfassend

a) einem oder mehreren Tumortherapeutika; und

b) einem auf Wirksamkeit bei der Tumorbehandlung zu testenden Interaktionspartner, wobei der Interaktionspartner das durch den natürlichen Liganden vermittelte Signal des Rezeptors moduliert

unter Bedingungen, die eine Interaktion der lebenden Zelle mit dem Tumortherapeutikum und dem Interaktionspartner erlauben;

b) Messung des über das Mitglied der EGF-Rezeptorfamilie vermittelten Signals; und

c) Vergleich des Meßergebnisses aus Schritt (b) mit einem Meßergebnis, das ohne die Zugabe des Interaktionspartners erhalten wurde, wobei die Modulation dieses Signals mit dem Interaktionspartner im Vergleich zum Wert ohne den Interaktionspartner ein Indiz für die Wirksamkeit des Interaktionspartners als Kombinationstherapeutikum oder als Leitsubstanz für ein Kombinationstherapeutikum darstellt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei die Modulation des Rezeptor-vermittelten Signals in einer lebenden Zelle mit einer abnormen Aktivität eines Mitglieds der EGF-Rezeptorfamilie mit der Modulation des entsprechenden Signals in einer lebenden Zelle mit normaler Aktivität der Mitglieder der EGF-Rezeptorfamilie verglichen wird und die Modulation dieser Signale ein Indiz für die Wirksamkeit des Therapeutikums oder Kombinationstherapeutikums oder einer Leitsubstanz für ein solches darstellt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die abnorme Aktivität Folge einer Überexpression des Rezeptors ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Interaktionspartner intrinsisches Potential für die Modulation des Rezeptor-vermittelten Signals besitzt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der Interaktionspartner ein Agonist des Rezeptor-vermittelten Signals ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der Interaktionspartner ein Antagonist des Rezeptor-vermittelten Signals ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Mitglied der EGF- Rezeptorfamilie der HER2-Rezeptor ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Probe eine Zell- oder Gewebeprobe ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Zell- oder Gewebeprobe eine Tumorprobe ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Tumorprobe eine Probe eines soliden Tumors oder von metastasierende Zellen, die von einem soliden Tumoren abstammen, ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der solide Tumor ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Mamakarzinome, Ovarialkarzinome, Bronchialkarzinome, Kolonkarzinome, Melanome, Blasenkarzinome, Magenkarzinome, Kopf/Halstumore, Gehirntumore, Gebärmutterhalstumore, Prostatakarzinome, Hodenkarzinome, Schwanome, Leiomyosarkome, Knochentumore, Nierenkarzinome, Bauchspeicheldrüsentumore und Speiseröhrentumore.

22. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Tumorprobe eine Probe eines Tumors hämatopoetischen Ursprungs ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Tumor hämatopoetischen Ursprungs ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend maligne Lymphome, leukämische Zelle, Non-Hodgkin-Lymphome, Hodgkin-Lymphome und Schilddrüsenlymphome.

24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei die Tumorprobe eine Probe von im Blut zirkulierender Tumorzellen ist.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Modulation des Rezeptor-vermittelten Signals gemessen wird als Induktion von Zelltod oder Proliferation oder Inhibition von Proliferation.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei die Messung in einem funktionellen Assay erfolgt.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei der funktionelle Assay ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Proliferationsassays, Zytotoxizitätsassays und metabolische Assays.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 27, wobei das Therapeutikum oder Kombinationstherapeutikum oder die Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum eine niedermolekulare Substanz, ein Peptid, Aptamer, Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon ist.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 28, das ein Hochdurchsatzverfahren ist.

30. Verfahren nach Anspruch 29, das Computer-assistiert ist.

31. Verfahren zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften des nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 30 identifizierten Therapeutikums oder Kombinationstherapeutikums oder der Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum, wobei man

a) die Bindungsstelle des Therapeutikums oder der Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum an den Rezeptor, an einen rezeptorassoziierten Corezeptor oder an ein mit dem Signal des Rezeptors in Zusammenhang stehendes und signalvermittelndes Molekül identifiziert;

b) die Bindungsstelle des Therapeutikums oder der Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum an den Rezeptor, an einen rezeptorassoziierten Corezeptor oder an ein mit dem Signal des Rezeptors in Zusammenhang stehendes und signalvermittelndes Molekül durch molekulares Modellieren modifiziert; und

c) das Therapeutikum oder die Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum dergestalt modifiziert, daß dessen Bindungsspezifität oder Bindungsaffinität oder Bindungsavidität für den Rezeptor, einen rezeptorassoziierten Corezeptor oder ein mit dem Signal des Rezeptors in Zusammenhang stehendes und signalvermittelndes Molekül durch molekulares Modellieren erhöht wird.

32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Bindungsstellen in Schritt (a) durch Positions-spezifische Mutagenese ermittelt werden.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 32, wobei das identifizierte oder verbesserte das Therapeutikum oder die Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum durch Peptidomimetics pharmakologisch weiter verbessert wird.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 33, wobei das Therapeutikum oder die Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum weiter modifiziert wird, um

a) ein modifiziertes aktives Zentrum, ein modifiziertes Aktivitätsspektrum, eine modifizierte Organ-, Gewebe- oder Zellspezifizität;

b) eine verbesserte Aktivität;

c) gesteigerte Toxizität für Tumorzellen (einen verbesserten therapeutischen Index);

d) verminderte Nebenwirkungen;

e) ein zeitlicher versetzter Beginn der therapeutischen Wirksamkeit, der Länge der therapeutischen Wirksamkeit;

f) veränderte pharmakokinetische Parameter (Resorption, Distribution, Metabolismus oder Exkretion);

g) modifizierte physikochemische Parameter (Löslichkeit, hygroskopische Eigenschaften, Farbe, Geschmack, Geruch, Stabilität, Zustandsform);

h) verbesserte generelle Spezifität, Organ-/Gewebespezifität; und/oder

i) optimierte Verabreichungsform und -route

durch

a) Veresterung von Carboxylgruppen oder

b) Veresterung von Hydroxylgruppen mit Carbonsäuren oder

c) Veresterung von Hydroxylgruppen zu beispielsweise Phosphaten, Pyrophosphaten oder Sulfaten oder "Hemisukzinaten" oder

d) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder

e) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Komplexen oder

f) Synthese von pharmakologisch aktiven Polymeren oder

g) Einführung von hydrophilen Gruppen oder

h) Einführung/Austausch von Substituenten in Aromaten oder Seitenketten, Veränderung des Substituentenmusters oder

i) Modifikation durch Einführung von isosterischen oder bioisosterischen Gruppen oder

j) Synthese von homologen Verbindungen oder

k) Einführung von verzweigten Seitenketten oder

l) Konversion von Alkylsubstituenten zu zyklischen Analogen oder

m) Derivatisierung von Hydroxylgruppen zu Ketalen oder Acetalen oder

n) N-Acetylierung zu Amiden, Phenylcarbamaten oder

o) Synthese von Mannich-Basen, Iminen oder

p) Umwandlung von Ketonen oder Aldehyden in Schiffs-Basen, Oxime, Acetale, Ketale, Enolester, Oxazolidine, Thiozolidine

oder Kombinationen davon zu erreichen.

35. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels oder Medizinpräparates, wobei man das nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 34 erhaltene Therapeutikum oder die Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel formuliert.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 35, wobei das Therapeutikum oder Kombinationstherapeutikum oder die Leitsubstanz für ein solches Therapeutikum ein Zytostatikum oder eine zytotoxische Substanz ist.

37. Verwendung eines nach dem Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche identifizierten Therapeutikums oder Kombinationstherapeutikums zur Herstellung eines Arzneimittels oder Medizinproduktes zur Behandlung von Tumoren und oder Tumorerkrankungen.

38. Arzneimittel enthaltend ein oder mehrere der Therapeutika die nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 36 identifiziert oder verbessert wurden.