DE10150359A1

DE10150359A1 - Process for the production of vitamin B12

Info

Publication number: DE10150359A1
Application number: DE10150359A
Authority: DE
Inventors: Andreas Kuenkel; Heiko Barg; Dieter Jahn; Jan-Henning Martens; Martin Warren
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2001-08-22
Filing date: 2001-10-11
Publication date: 2003-03-13

Abstract

The invention relates to a method for producing vitamin B12 using Bacillus megaterium.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B₁₂ mittels Bacillus megaterium. The present invention relates to a process for the production of vitamin B ₁₂ by means of Bacillus megaterium.

Bereits in den zwanziger Jahren unseres Jahrhunderts wurde Vitamin B₁₂ indirekt durch seine Wirkung auf den menschlichen Körper durch George Minot und William Murphy entdeckt (Stryer, L., 1988, In Biochemie, vierte Auflage, pp. 528-531, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, New York). Im Jahre 1948 konnte Vitamin B₁₂ erstmals gereinigt und isoliert werden, so daß bereits acht Jahre später, im Jahre 1956, die Aufklärung seiner komplexen dreidimensionalen Kristallstruktur durch Dorothy Hodgkin gelang (Hodgkin, D. C. et al., 1956, Structure of Vitamin B₁₂. Nature 176, 325-328 und Nature 178, 64-70). Die in der Natur vorkommenden Endprodukte der Vitamin B₁₂-Biosynthese sind 5'- Desoxyadenosylcobalamin (Coenzym B₁₂) und Methylcobalamin (MeCbl), während Vitamin B₁₂ per Definition für Cyanocobalamin (CNCbl) steht, das die hauptsächlich von der Industrie hergestellte und gehandelte Form darstellt. In der vorliegenden Erfindung steht, wenn nicht speziell angegeben, Vitamin B₁₂ einheitlich für die Bezeichnung aller drei analogen Moleküle. As early as the 1920s, vitamin B _{12 was} indirectly discovered by its effects on the human body by George Minot and William Murphy (Stryer, L., 1988, In Biochemie, fourth edition, pp. 528-531, Spektrum Akademischer Verlag GmbH , Heidelberg, Berlin, New York). Vitamin B _{12 was} first purified and isolated in 1948, so that eight years later, in 1956, Dorothy Hodgkin's complex three-dimensional crystal structure was elucidated (Hodgkin, DC et al., 1956, Structure of Vitamin B ₁₂ . Nature 176, 325-328 and Nature 178, 64-70). The naturally occurring end products of vitamin B ₁₂ biosynthesis are 5'-deoxyadenosylcobalamin (coenzyme B ₁₂ ) and methylcobalamin (MeCbl), while vitamin B ₁₂ by definition stands for cyanocobalamin (CNCbl), which is the mainly manufactured and traded by industry Represents shape. In the present invention, unless specifically stated, vitamin B _{12 stands} for the designation of all three analog molecules.

Die Spezies B. megaterium wurde bereits vor über 100 Jahren (1884) das erste mal durch De Bary beschrieben. Obwohl generell als ein Bodenbakterium klassifiziert, läßt sich B. megaterium auch in diversen anderen Habitaten wie Seewasser, Sedimenten, Reis, getrocknetem Fleisch, Milch oder Bienenhonig nachweisen. Er tritt dabei oft in Begleitung von Pseudomonaden und Actinomyceten auf. B. megaterium ist, wie sein naher Verwandter Bacillus subtilis, ein Gram-postives Bakterium und zeichnet sich unter anderem aus durch seine relativ ausgeprägte, namengebende Größe von 2 × 5 µm, einem G+C-Gehalt von ca. 38% und einer sehr ausgeprägten Fähigkeit zur Sporulation. Bereits geringste Mengen an Mangan im Wachstumsmedium genügen dieser Spezies, um eine vollständige Sporulation durchzuführen, eine Fähigkeit die nur noch vergleichbar ist mit der Sporulationseffizienz einiger thermophiler Bacillen. Aufgrund seiner Größe und seiner sehr effizienten Sporulation und Germination wurden vielfältige Untersuchungen der molekularen Grundlagen dieser Vorgänge an B. megaterium durchgeführt, so daß mittlerweile mehr als 150 Gene in B. megaterium beschrieben sind, die an seiner Sporulation und Germination beteiligt sind. Physiologische Untersuchungen an B. megaterium (Priest, F. G. et al., 1988, A Numerical Classification of the Genus Bacillus, J. Gen. Microbiol. 134, 1847-1882) klassifizierten diese Spezies als obligat aerobes, Sporen-bildendes Bakterium, das Urease-positiv und Voges-Proskauer-negativ ist und kein Nitrat reduzieren kann. Eine der herausragendsten Eigenschaften von B. megaterium ist seine Fähigkeit, eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen für sich zu nutzen. So verwertet er eine sehr große Zahl von Zuckern und wurde z. B. in Korn-Sirup, Abfällen aus der Fleischindustrie und sogar in petrochemischen Abfällen gefunden. In Hinsicht auf diese Fähigkeit zur Metabolisierung eines äußerst breiten Spektrums von Kohlenstoffquellen, kann B. megaterium ohne Einschränkung mit den Pseudomonaden gleichgesetzt werden (Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium). The B. megaterium species first appeared over 100 years ago (1884) described by De Bary. Although generally classified as a soil bacterium, B. megaterium can also be found in various other habitats such as sea water, Detect sediments, rice, dried meat, milk or honey. He kicks often accompanied by pseudomonas and actinomycetes. B. megaterium is, like its close relative Bacillus subtilis, a gram-positive bacterium and is characterized, among other things, by its relatively distinctive, eponymous name Size of 2 × 5 µm, a G + C content of approx. 38% and a very pronounced one Ability to sporulate. Even the smallest amounts of manganese in the Growth media are sufficient for this species to complete sporulation a skill that is only comparable to that Sporulation efficiency of some thermophilic bacilli. Because of its size and its very efficient sporulation and germination were varied Studies of the molecular basis of these processes on B. megaterium carried out, so that now more than 150 genes in B. megaterium are described are involved in its sporulation and germination. physiological Studies on B. megaterium (Priest, F.G. et al., 1988, A Numerical Classification of the Genus Bacillus, J. Gen. Microbiol. 134, 1847-1882) classified this species as an obligate aerobic, spore-forming bacterium that Is urease-positive and Voges-Proskauer-negative and cannot reduce nitrate. One of the most outstanding properties of B. megaterium is its ability to to use a variety of carbon sources. So he uses a very large number of sugars and was e.g. B. in grain syrup, waste from the Meat industry and even found in petrochemical waste. In terms of this ability to metabolize a very wide range of Carbon sources, B. megaterium can be used without restriction with the Pseudomonas are equated (Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).

Die Vorteile der breiten Anwendung von B. megaterium bei der industriellen Produktion verschiedenster Enzyme, Vitamine etc. sind vielfältig. Dazu gehört zum ersten sicherlich der Umstand, daß in B. megaterium transformierte Plasmide sich als sehr stabil erweisen. Dies muß in direktem Zusammenhang gesehen werden mit der mittlerweile etablierten Möglichkeit, diese Spezies beispielsweise durch Polyethylenglykolbehandlung zu transformieren. Dies war bis vor wenigen Jahren noch ein Haupthindernis der Anwendung von B. megaterium als Produktionsstamm. Parallel hierzu ist auch der Vorteil einer relativ gut entwickelten Genetik zu sehen, die innerhalb des Bacillus-Genus nur von B. subtilis übertroffen wird. Zweitens weist B. megaterium keine alkalischen Proteasen auf, so daß bei der Produktion heterologer Proteine kaum eine Degradation beobachtet wurde. Zudem ist bekannt, daß B. megaterium Produkte von kommerziellem Interesse effekiv sezerniert, wie dies z. B. bei der Produktion von α- und β-Amylase ausgenutzt wird. Außerdem ist es mit B. megaterium durch seine Größe möglich, eine hohe Biomasse anzusammeln, bis eine zu hohe Populationsdichte zum Absterben führt. Von größter Bedeutung bei der industriellen Produktion mittels B. megaterium erweist sich weiterhin der günstige Umstand, daß diese Spezies in der Lage ist, aus Abfällen und minderwertigen Stoffen Produkte hohen Wertes und höchster Qualität herzustellen. Diese Möglichkeit der Metabolisierung eines enorm breiten Substratspektrums spiegelt sich auch wieder in der Anwendung von B. megaterium als Bodendetoxifizierer, der selbst Cyanide, Herbizide und persistente Pestizide abzubauen vermag. Schließlich ist die Tatsache, daß B. megaterium vollkommen apathogen ist und auch keine Toxine produziert, insbesondere in der Lebensmittel- und Kosmetikproduktion von größter Wichtigkeit. Wegen dieser mannigfaltigen Vorzüge wird B. megaterium bereits heute in einer Vielzahl von industriellen Anwendungen eingesetzt, wie der Produktion von α- und β-Amylase, Penicillin-Amidase, dem Aufbereiten toxischer Abfälle oder der aeroben Vitamin B₁₂-Produktion (zusammengefaßt in Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium). The advantages of the wide application of B. megaterium in the industrial production of various enzymes, vitamins etc. are manifold. The first of these is certainly the fact that plasmids transformed in B. megaterium have proven to be very stable. This must be seen in direct connection with the now established possibility of transforming this species, for example by means of polyethylene glycol treatment. Until a few years ago, this was a major obstacle to the use of B. megaterium as a production strain. At the same time, there is also the advantage of a relatively well-developed genetics that is only surpassed by B. subtilis within the Bacillus genus. Secondly, B. megaterium has no alkaline proteases, so that hardly any degradation was observed in the production of heterologous proteins. In addition, it is known that B. megaterium effectively secretes products of commercial interest, such as e.g. B. is used in the production of α- and β-amylase. With B. megaterium, it is also possible to accumulate high biomass due to its size, until an excessively high population density leads to death. Of great importance in industrial production by means of B. megaterium is the fact that this species is able to produce products of high value and highest quality from waste and inferior substances. This possibility of metabolizing an extremely wide range of substrates is also reflected in the use of B. megaterium as a soil detoxifier, which is able to break down cyanides, herbicides and persistent pesticides. Finally, the fact that B. megaterium is completely non-pathogenic and does not produce toxins is of paramount importance, especially in food and cosmetic production. Because of these diverse advantages, B. megaterium is already being used in a large number of industrial applications, such as the production of α- and β-amylase, penicillin amidase, the processing of toxic waste or aerobic vitamin B ₁₂ production (summarized in Vary, PS, 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).

Aufgrund seiner vielfältigen Vorteile zum Einsatz in der biotechnologischen Herstellung verschiedener, industriell interessanter Produkte ist der Einsatz von Bacillus megaterium wirtschaftlich sehr interessant. Because of its diverse advantages for use in biotechnological The production of various, industrially interesting products is the use of Bacillus megaterium economically very interesting.

Bei der industriellen Fermentation aerober Mikroorganismen treten jedoch im großtechnischen Maßstab regelmäßig Probleme, insbesondere bei der effizienten Sauerstoffdurchlüftung der Bakterienkulturen auf, die mit erheblichen Verlusten in der Produktausbeute verbunden sind. However, in industrial fermentation of aerobic microorganisms Large-scale technical problems, especially in the efficient Oxygen aeration of the bacterial cultures with significant losses in the Product yield are linked.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Herstellung von Vitamin B12 mit Bacillus megaterium zu optimieren. The object of the present invention is to produce vitamin B12 Optimize Bacillus megaterium.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 mittels einer Kultur enthaltend Bacillus megaterium gelöst, bei welchem die Fermentation unter anaeroben Bedingungen durchgeführt wird. This task is accomplished through a method of producing vitamin B12 a culture containing Bacillus megaterium, in which the fermentation is carried out under anaerobic conditions.

Grundsätzlich können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung alle üblichen B. megaterium-Stämme eingesetzt werden, die als Vitamin B12-Produktionsstämme geeignet sind. In principle, for the purposes of the present invention, all customary B. Megaterium strains are used as vitamin B12 production strains are suitable.

Unter Vitamin B12-Produktionsstämmen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Bacillus megaterium-Stämme oder homologe Mikroorganismen zu verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart verändert sind, daß ihr Stoffwechselfluß verstärkt in die Richtung der Biosynthese von Vitamin B12 oder dessen Abkömmlingen verläuft (metabolic engineering). Beispielsweise sind bei diesen Produktionsstämmen ein oder mehrere Gen(e) und/oder die korrespondierenden Enzyme, die an entscheidenden und entsprechend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechselweges (Flaschenhals) stehen in ihrer Regulation verändert oder sogar dereguliert. Die vorliegende Erfindung umfaßt hierbei sämtliche bereits bekannte Vitamin B12-Produktionsstämme, bevorzugt der Gattung Bacillus oder homologer Organismen. Zu den erfindungsgemäß vorteilhaften Stämmen gehören insbesondere die Stämme von B. megaterium DSMZ 32, DSMZ 509 und DSMZ 2894. Vitamin B12 production strains are within the meaning of the present invention To understand Bacillus megaterium strains or homologous microorganisms are so modified by classical and / or molecular genetic methods that their metabolic flow intensifies in the direction of the biosynthesis of vitamin B12 or whose descendants run (metabolic engineering). For example, at these production strains one or more genes and / or the corresponding enzymes that are crucial and correspondingly complex regulated key positions of the metabolic pathway (bottleneck) are in their regulation changed or even deregulated. The present invention encompasses all known vitamin B12 production strains, preferably the Genus Bacillus or homologous organisms. Among the advantageous according to the invention Strains belong in particular to the strains of B. megaterium DSMZ 32, DSMZ 509 and DSMZ 2894.

Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, daß B. megaterium zu einer anaeroben Lebensweise fähig ist und außerdem unter diesen Bedingungen die Vitamin B12 Produktion höher ist, als unter aeroben Bedingungen. Der Vergleich der Vitamin B12 Produktion von B. megaterium unter aeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen zeigt deutlich, daß die anaerobe Vitamin B12 Produktion bei allen untersuchten Stämmen gegenüber der aeroben Vitamin B12 Produktion wenigstens um den Faktor 3 bis 4 gesteigert ist. Weitere Steigerungen lassen sich durch eine systematische Optimierung der Wachstumsbedingungen und der Zusammensetzung des Kulturmediums sowie der eingesetzten Bakterienstämme erreichen. According to the invention it could be shown that B. megaterium is anaerobic Is capable of living and also vitamin B12 under these conditions Production is higher than under aerobic conditions. The comparison of vitamin B12 Production of B. megaterium under aerobic and anaerobic Growth conditions clearly shows that the anaerobic vitamin B12 production in all strains examined compared to aerobic vitamin B12 production is increased by at least a factor of 3 to 4. Further increases can be seen by systematically optimizing the growth conditions and the Composition of the culture medium and the bacterial strains used to reach.

Erfindungsgemäß kann die Herstellung von Vitamin B12 mittels Bacillus megaterium beispielsweise dadurch gesteigert werden, daß dem Kulturmedium wenigstens Cobalt zugesetzt wird. Auch der Zusatz von beispielsweise Betain, Methionin, Glutamat, Dimethylbenzimidazol oder Cholin oder deren Kombinationen wirkt sich vorteilhaft auf die Vitamin B12 Produktion gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren aus. Vorteilhaft können auch die zuvor genannten Verbindungen einzeln oder deren Kombinationen in Kombination mit Cobalt sein. According to the invention, the production of vitamin B12 by means of Bacillus megaterium for example, be increased in that the culture medium at least Cobalt is added. The addition of, for example, betaine, methionine, Glutamate, dimethylbenzimidazole or choline or their combinations have an effect advantageous to the vitamin B12 production according to the invention Procedure out. The aforementioned connections can also advantageously be used individually or combinations thereof in combination with cobalt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß auch ein Verfahren, das sich dadurch auszeichnet, das dem Kulturmedium wenigstens Cobalt zugesetzt wird. D. h. Cobalt kann beispielsweise einzeln oder in Kombination mit wenigstens Betain, Methionin, Glutamat, Dimethylbenzimidazol oder Cholin oder Kombinationen der zuletzt genannten Verbindungen zugesetzt werden. The present invention accordingly also relates to a method which can be used characterized in that at least cobalt is added to the culture medium. I.e. For example, cobalt can be used individually or in combination with at least betaine, Methionine, glutamate, dimethylbenzimidazole or choline or combinations of the last mentioned compounds are added.

In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der Vitamin B-12 Gehalt durch die Zugabe von etwa 200 bis 750 µM, vorzugsweise 250 bis 500 µM Cobalt pro Liter Kulturmedium angehoben werden. In a variant of the method according to the invention, the vitamin B-12 content by adding about 200 to 750 µM, preferably 250 to 500 µM cobalt per liter of culture medium.

In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren der zuvor genannten Art umfasst, bei dem B. megaterium zunächst aerob und anschließend anaerob fermentiert wird. In einer vorteilhaften Variante erfolgt der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentation in der exponentiellen Wachstumsphase der aerob fermentierten Zellen. Hierbei ist es vorteilhaft, wenn der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentation in der Mitte oder am Ende, bevorzugt am Ende, der exponentiellen Wachstumsphase der aerob wachsenden Zellen erfolgt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist hierbei ein Verfahren, bei dem der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentierung erfolgt, sobald die aerobe Kultur ihre maximale optische Dichte, wenigstens jedoch eine optische Dichte von etwa 2 bis 3 erreicht hat. In a further variant of the present invention is a method of the previous mentioned type, in the B. megaterium first aerobic and then is fermented anaerobically. In an advantageous variant, the transition from aerobic for anaerobic fermentation in the exponential growth phase of the aerobically fermented cells. It is advantageous if the transition from aerobic for anaerobic fermentation in the middle or at the end, preferably on End, the exponential growth phase of the aerobically growing cells takes place. According to the invention, a method is preferred in which the transition from the aerobic for anaerobic fermentation takes place as soon as the aerobic culture becomes its maximum optical density, but at least an optical density of about 2 to 3 has reached.

Unter anaeroben Bedingungen, sowohl in dem einstufigen, als auch in dem zweistufigen erfindungsgemäßen Verfahren, sind im Sinne der vorliegenden Erfindung diejenigen Bedingungen zu verstehen, die eintreten, wenn die Bakterien nach aerober Anzucht in Anaerobierflaschen überführt und dort fermentiert werden. Der Zeitpunkt der Überführung in die Anaerobierflaschen erfolgt insbesondere bei dem zweistufigen Verfahren, sobald sich die aerob angezüchteten Bakterienzellen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. D. h. nach der Überführung in die Anaerobierflaschen verbrauchen die Bakterien den dort vorliegenden Sauerstoff und es wird kein Sauerstoff mehr zugeführt. Diese Bedingungen können auch mit semianaerob bezeichnet werden. Die entsprechenden Vorgehensweisen sind gängige Laborpraxis und dem Fachmann bekannt. Under anaerobic conditions, both in the one-step and in the two-stage processes according to the invention are within the meaning of the present Invention to understand those conditions that occur when the bacteria after aerobic cultivation, transferred to anaerobic bottles and fermented there. The time of transfer to the anaerobic bottles is particularly at the two-step process as soon as the aerobically grown bacterial cells are in the exponential growth phase. I.e. after the transfer to the The bacteria consume the oxygen and oxygen present there oxygen is no longer supplied. These conditions can also be met with to be called semianaerobic. The corresponding procedures are common Laboratory practice and known to the expert.

Vergleichbare Bedingungen herrschen auch vor, wenn die Bakterien in einem Fermenter zunächst aerob kultiviert werden und dann die Sauerstoffzufuhr sukzessive reduziert wird, so daß sich mit der Zeit semi-anaerobe Bedingungen einstellen. Comparable conditions also prevail when the bacteria are in one Fermenters are first cultivated aerobically and then the oxygen supply is gradually reduced, so that over time semi-anaerobic conditions to adjust.

In einer besonderen Variante der vorliegenden Erfindung können auch beispielsweise durch die Zugabe von Reduktionsmitteln zum Kulturmedium strikt anaerobe Bedingungen geschaffen werden. In a special variant of the present invention, too for example strictly by adding reducing agents to the culture medium anaerobic conditions are created.

Generell ist für eine erfindungsgemäße Fermentation unter anaeroben Bedingungen (ob nun semi-anaerob oder strikt anaerob), eine aerobe Anzucht (Vorkultur) der Bakterien nicht zwingend erforderlich. D. h. die Bakterien können auch unter anaeroben Bedingungen angezüchtet werden und anschließend unter semianaeroben oder strikt anaeroben Bedingungen weiter fermentiert werden. Denkbar ist auch, daß das Inocculum direkt aus der Stammhaltung entnommen und zur Herstellung von Vitamin B12 unter anaeroben Bedingungen eingesetzt wird. Generally for an inventive fermentation under anaerobic conditions (whether semi-anaerobic or strictly anaerobic), an aerobic cultivation (pre-culture) of Bacteria not absolutely necessary. I.e. the bacteria can also get under anaerobic conditions are grown and then under Semi-anaerobic or strictly anaerobic conditions can be fermented further. Conceivable is also that the inoculum is taken directly from the stock and to Production of vitamin B12 is used under anaerobic conditions.

In einer Variante der vorliegenden Erfindung erfolgt die Fermentierung unter aeroben Bedingungen unter Zusatz von etwa 250 µM Cobalt; unter anaeroben Bedingungen ist ein Zusatz von etwa 500 µM Cobalt vorteilhaft. In a variant of the present invention, the fermentation takes place under aerobic conditions Conditions with the addition of about 250 µM cobalt; under anaerobic conditions an addition of about 500 µM cobalt is advantageous.

Eingeschlossen sind erfindungsgemäß auch genetisch veränderte Bakterienstämme, die durch klassische Mutagenese oder gezielte molekularbiologische Techniken und entsprechende Selektionsverfahren hergestellt werden können. Interessante Ansatzpunkte zur gezielten gentechnischen Manipulation sind u. a. Verzweigungsstellen der zum Vitamin B-12 führenden Biosynthesewege, durch die der Stoffwechselfluß gezielt in Richtung einer maximalen Vitamin B₁₂-Produktion gesteuert werden kann. Gezielte Modifikationen von an der Regulation des Stoffwechselflusses beteiligten Genen schließt auch Untersuchungen und Veränderungen der regulatorischen Bereiche vor und hinter den Strukturgenen ein, wie z. B. die Optimierung und/oder den Austausch von Promotoren, Enhancern, Terminatoren, Ribosomenbindungsstellen etc. Auch die Verbesserung der Stabilität der DNA, mRNA oder der durch sie kodierten Proteine, beispielsweise durch die Verringerung oder Verhinderung des Abbaus durch Nukleasen bzw. Proteasen ist erfindungsgemäß umfaßt. Genetically modified bacterial strains which can be produced by classic mutagenesis or targeted molecular biological techniques and corresponding selection processes are also included according to the invention. Interesting starting points for targeted genetic engineering manipulation include branches of the biosynthetic pathways leading to vitamin B-12, through which the metabolic flow can be controlled in the direction of maximum vitamin B ₁₂ production. Targeted modifications of genes involved in the regulation of the metabolic flow also include studies and changes in the regulatory areas before and after the structural genes, such as. B. the optimization and / or the exchange of promoters, enhancers, terminators, ribosome binding sites etc. Also improving the stability of the DNA, mRNA or the proteins encoded by them, for example by reducing or preventing the degradation by nucleases or proteases is according to the invention includes.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die entsprechenden Nukleotidsequenzen, kodierend für die an der Biosynthese von Vitamin B12 beteiligten Enzyme. Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch eine isolierte Nukleotidsequenz kodierend für die an der Biosynthese von Uroporphyrinogen III beteiligten Enzyme, organisiert in dem hemAXCDBL-Operon aus B. megaterium mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder deren Allele. Erfindungsgemäß sind auch die durch das hemAXCDBL-Operon aus B. megaterium kodierten Enzyme mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID No. 2-6 sowie Isoenzyme oder modifizierte Formen davon umfaßt. The present invention relates to the corresponding Nucleotide sequences coding for the biosynthesis of vitamin B12 involved enzymes. In particular, the subject of the present invention is also an isolated nucleotide sequence coding for the on the biosynthesis of Uroporphyrinogen III involved enzymes, organized in the hemAXCDBL operon from B. megaterium with a nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 or their Alleles. According to the invention, the hemAXCDBL operon from B. Megaterium encoded enzymes with the amino acid sequences according to SEQ ID No. 2-6 as well as isoenzymes or modified forms thereof.

Unter Isoformen sind Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen. Isoforms include enzymes with the same or comparable substrate and To understand effect specificity, which, however, has a different primary structure exhibit.

Unter modifizierten Formen sind erfindungsgemäß Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden. According to the invention, modified forms are understood to mean enzymes in which Changes in the sequence, for example at the N and / or C terminus of the Polypeptide or in the range of conserved amino acids, but without the Affect the function of the enzyme. These changes can take the form of Amino acid exchanges can be carried out according to methods known per se.

Eine besondere Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung umfaßt Varianten der erfindungsgemäßen Polypeptide, deren Aktivität beispielsweise durch Aminosäureaustausche, verglichen mit dem jeweiligen Ausgangsprotein, abgeschwächt oder verstärkt ist. Gleiches gilt für die Stabilität der erfindungsgemäßen Enzyme in den Zellen, die beispielsweise gegenüber dem Abbau durch Proteasen verstärkt oder vermindert anfällig sind. A special embodiment variant of the present invention comprises variants of the polypeptides according to the invention, their activity, for example, by Amino acid exchanges compared to the respective starting protein, is weakened or strengthened. The same applies to the stability of the enzymes according to the invention in the cells, for example compared to the Degradation by proteases is increased or reduced susceptible.

Unter einer isolierten Nukleinsäure oder einem isolierten Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein. Under an isolated nucleic acid or an isolated nucleic acid fragment according to the invention to understand a polymer from RNA or DNA, the single or can be double-stranded and optionally natural, chemically synthesized, may contain modified or artificial nucleotides. The term DNA polymer also includes genomic DNA, cDNA or mixtures thereof.

Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktionell äquivalente, d. h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktionell äquivalente Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, beispielsweise durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen. Darüber hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem Enzym beispielsweise eine Desensitivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht. According to the invention, alleles are functionally equivalent, i.e. H. essentially understand nucleotide sequences with the same effect. Functionally equivalent Sequences are those sequences which, despite a different nucleotide sequence, for example due to the degeneracy of the genetic code have the desired functions. Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described herein as well artificial, e.g. B. obtained by chemical synthesis and optionally to the Codon use of the host organism adapted nucleotide sequences. About that In addition, functionally equivalent sequences include those that have changed Have nucleotide sequence which, for example, a desensitivity to the enzyme or confers resistance to inhibitors.

Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen und somit funktionsneutral sind. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins betreffen, ohne jedoch die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluß auf die Proteinstruktur ausüben. A functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural ones or artificial mutations of an originally isolated sequence that continue show the desired function. Mutations include substitutions, additions, Deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues. Also included here are so-called sense mutations that refer to Protein level, for example, lead to the exchange of conserved amino acids can, but which do not fundamentally change the activity of the Proteins lead and are therefore functionally neutral. This also includes changes the nucleotide sequence that is at the protein level the N or C terminus of a protein affect, but without significantly affecting the function of the protein. These changes can even have a stabilizing influence on the protein structure exercise.

Ferner werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der Nukleotidsequenz, resultierend in entsprechenden Derivaten, erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym- Schnittstellen sein. Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist. Such nucleotide sequences are also, for example, by the includes the present invention, which can be obtained by modifying the Nucleotide sequence resulting in corresponding derivatives. Target one such modification can, for. B. the further narrowing of those contained therein coding sequence or z. B. also the insertion of further restriction enzyme Interfaces. Functional equivalents are also those variants whose Function, compared to the original gene or gene fragment, weakened or is reinforced.

Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung von mittels computergestützten Programmen (molecular modelling) erstellten Proteinen oder durch in-vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für den Wirtsorganismus spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit molekulargenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bereits bekannter Gene des zu transformierenden Organismus leicht ermitteln. The present invention also relates to artificial DNA sequences, as long as they convey the desired properties as described above. Such artificial DNA sequences can be translated back, for example of computer-aided programs (molecular modeling) Proteins or be determined by in vitro selection. Are particularly suitable coding DNA sequences by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific to the host organism. The specific codon usage can be done using molecular genetic methods familiar specialist through computer evaluations of other, already known genes easily determine the organism to be transformed.

Unter homologen Sequenzen sind erfindungsgemäß solche zu verstehen, die zu den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen komplementär sind und/oder mit diesen hybridisieren. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten stringenten Bedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den zuvor genannten Nukleotidsequenzen eingehen. Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen mit einer Länge von beispielsweise 10 bis 30, bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden. Dies umfaßt erfindungsgemäß u. a. auch sogenannte Primer oder Sonden. According to the invention, homologous sequences are to be understood as those which belong to the nucleotide sequences according to the invention are complementary and / or with these hybridize. The term hybridizing sequences includes the invention substantially similar nucleotide sequences from the group of DNA or RNA, the specific under stringent conditions known per se Interaction (binding) with the previously mentioned nucleotide sequences. This also includes short nucleotide sequences with a length of, for example 10 to 30, preferably 12 to 15 nucleotides. According to the invention, this includes u. a. also so-called primers or probes.

Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5'- oder upstream) und/oder nachfolgenden (3'- oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker. According to the invention, the coding regions (structural genes) are also preceding (5 'or upstream) and / or subsequent (3' or downstream) Sequence areas included. In particular, sequence areas are included here regulatory function included. You can see the transcription, the RNA stability or affect RNA processing and translation. examples for regulatory sequences are u. a. Promoters, enhancers, operators, Terminators or translation amplifiers.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner eine Genstruktur enthaltend die isolierte Nukleotidsequenz der zuvor genannten Art oder Teile davon, sowie operativ damit verknüpfte Nukleotidsequenzen mit regulatorischer Funktion. The present invention further comprises a gene structure containing the isolated one Nucleotide sequence of the aforementioned type or parts thereof, as well as operatively with it linked nucleotide sequences with regulatory function.

Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß auch um einen chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Beispielhaft sei hier das β-Galakosidase- oder Arabinose-System genannt. An operational link is understood to mean the sequential arrangement for example of the promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, others regulatory elements such that each of the regulatory elements has its own Fulfill the function in the expression of the coding sequence as intended can. These regulatory nucleotide sequences can be of natural origin or can be obtained by chemical synthesis. As a promoter is fundamental any promoter suitable for gene expression in the corresponding Can control host organism. According to the invention, this can also be act a chemically inducible promoter through which the expression of him underlying genes in the host cell are controlled at some point can be. The β-galacosidase or arabinose system is an example here called.

Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Sambrook, J. et al., 1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York beschrieben sind. A gene structure is produced by fusing a suitable promoter with at least one nucleotide sequence according to the invention using common recombination and cloning techniques, as described, for example, in Sambrook, J. et al., 1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2 ^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York described.

Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden. To connect the DNA fragments to one another, the fragments can be attached Adapters or linkers can be used.

Erfindungsgemäß umfasst ist auch ein Vektor enthaltend eine isolierte Nukleotidsequenz der zuvor genannten Art oder Teile davon oder eine Genstruktur der zuvor genannten Art, sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion, Replikation in der Wirtszelle und/oder Integration in das Wirtszellgenom. Beispiele für solche zusätzlichen Sequenzen sind in der Literatur zahlreich beschrieben und werden nicht weiter ausgeführt. According to the invention, a vector comprising an isolated is also included Nucleotide sequence of the aforementioned type or parts thereof or a gene structure of the aforementioned type, as well as additional nucleotide sequences for selection, Replication in the host cell and / or integration into the host cell genome. examples for such additional sequences have been widely described in the literature and will not be continued.

Geeignete Systeme für die Transformationen und Überexpressionen der erwähnten Gene in B. megaterium sind beispielsweise die Plasmide pWH1510 und pWH1520 sowie der plasmidfreie Überexpressionsstamm B. megaterium WH320, die bei Rygus, T. et al. (1991, Inducible high level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium, Appl. Microbiol. And Biotechnol., 35, 5: 594-599) beschrieben sind. Die Plasmide sind auch kommerziell erhältlich (Q-biogene und MoBiTec). Die genannten Systeme sind jedoch nicht limitierend für die vorliegende Erfindung. Suitable systems for the transformations and overexpression of the mentioned Genes in B. megaterium are, for example, the plasmids pWH1510 and pWH1520 and the plasmid-free overexpression strain B. megaterium WH320, which in Rygus, T. et al. (1991, Inducible high level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium, Appl. Microbiol. And Biotechnol., 35, 5: 594-599) are. The plasmids are also commercially available (Q-biogene and MoBiTec). The However, the systems mentioned are not limiting for the present invention.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren, das sich dadurch auszeichnet, daß ein Bacillus megaterium-Stamm fermentiert wird, dessen hemAXCDBL-Operon oder Teile davon verstärkt exprimiert wird/werden. The present invention also relates to a method which is characterized in that distinguishes that a Bacillus megaterium strain is fermented, the hemAXCDBL operon or parts thereof is / are expressed to a greater extent.

In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren umfasst, bei dem ein genetisch veränderter Bacillus megaterium-Stamm fermentiert wird, dessen hemAXCDBL-Operon oder Teile davon gegenüber dem genetisch nicht veränderten Bacillus in erhöhter Kopienzahl in der Zelle vorliegt/vorliegen. Die Anzahl der Kopien kann zwischen 2 bis mehrere hundert variieren. A variant of the present invention also includes a method in which a genetically modified Bacillus megaterium strain is fermented, the hemAXCDBL operon or parts thereof compared to the genetically unmodified one Bacillus is / are present in the cell in an increased number of copies. The number of copies can vary from 2 to several hundred.

Zur Erzielung einer erhöhten Genexpression (Überexpression) kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden. Ferner kann die Promotor- und/oder Regulationsregion und/oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, entsprechend so verändert werden, daß die Expression mit erhöhter Rate erfolgt. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der Vitamin B12-Produktion zu steigern. The number of copies can be used to achieve increased gene expression (overexpression) of the corresponding genes can be increased. Furthermore, the promoter and / or Regulatory region and / or the ribosome binding site that is upstream of the structural gene is accordingly changed so that the expression at an increased rate. Expression cassettes act in the same way be installed upstream of the structural gene. Through inducible promoters it is also possible to increase expression during the course of vitamin B12 production increase.

Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen und/oder im Chromosom integriert und/oder amplifiziert sein. Measures to extend the life of the mRNA will also Expression improved. The genes or gene constructs can either be in plasmids with different numbers of copies and / or integrated in the chromosome and / or be amplified.

Weiterhin kann auch die Aktivität des Enzyms selbst erhöht sein oder durch die Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins verstärkt werden. Alternativ kann ferner eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Furthermore, the activity of the enzyme itself can also be increased or by the Prevention of degradation of the enzyme protein can be reinforced. Alternatively, you can also an overexpression of the genes in question by changing the Media composition and cultural management can be achieved.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein transformierter Bacillus megaterium-Stamm zum Einsatz in ein Verfahren zur Vitamin-B12-Herstellung der zuvor genannten Art, der eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl der Nukleotidsequenz des hemAXCDBL-Operons oder Teile davon aufweist. Erfindungsgemäß umfaßt ist auch ein transformierter Bacillus megaterium-Stamm, der in replizierender Form eine Genstruktur oder einen Vektor der zuvor erwähnten Art enthält. The present invention also relates to a transformed Bacillus megaterium strain for use in a process for the production of vitamin B12 aforementioned type, which is an increased expression and / or increased number of copies the nucleotide sequence of the hemAXCDBL operon or parts thereof. The invention also includes a transformed Bacillus megaterium strain, which in replicating form is a gene structure or a vector of the aforementioned Kind contains.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung der isolierten Nukleotidsequenz des hemAXCDBL-Operons oder Teile davon oder der Genstruktur oder eines Vektors der zuvor genannten Art zur Herstellung eines transformierten Bacillus megaterium-Stammes der zuvor erwähnten Art. Die vorliegende Erfindung schießt auch die Verwendung des transformierten Bacillus megaterium-Stammes der zuvor genannte Art zur Herstellung von Vitamin B12 ein. The present invention also relates to the use of the isolated Nucleotide sequence of the hemAXCDBL operon or parts thereof or the gene structure or a vector of the aforementioned type for producing a transformed Bacillus megaterium strain of the aforementioned type. The present invention also uses the transformed Bacillus megaterium strain of the previously mentioned way of producing vitamin B12.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Sie wirken sich jedoch nicht limitierend auf die Erfindung aus. 1. Chemikalien und molekularbiologische Agenzien DNA-Isolations-Kit Qiagen
Fast-Link Ligation Kit Biozym
Molekularbiologische Enzyme Amersham-Pharmacia, NEN-LifeScience
Wachstumsmedien Difco The following examples serve to explain the present invention. However, they have no limiting effect on the invention. 1. Chemicals and molecular biological agents DNA isolation kit Qiagen
Fast-Link Ligation Kit Biozym
Molecular biological enzymes Amersham-Pharmacia, NEN-LifeScience
Growth media Difco

2. Bacterial strains and plasmids

Alle in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt. 3. Puffer und Lösungen 3.1. Minimalmedium E. coli-Minimalmedium K₂HPO₄ 60.3 mM KH₂PO₄ 33.1 mM (NH₄)₂SO₄ 7.6 mM Natriumcitrat 1.7 mM MgSO₄ 1.0 mM D-Glucose 10.1 mM Thiamin 3.0 µM Casaminoacids 0.025% (w/v) All bacterial strains and plasmids used in this work are listed in Tables 1 and 2. 3. Buffers and solutions 3.1. Minimal medium E. coli minimal medium K ₂ HPO ₄ 60.3 mM KH ₂ PO ₄ 33.1 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 7.6 mM sodium citrate 1.7 mM MgSO ₄ 1.0 mM D-glucose 10.1 mM thiamine 3.0 µM Casaminoacids 0.025% (w / v)

Für feste Medien wurden 15 g/l Agar-Agar zugesetzt. Mopso-Minimalmedium Mopso (pH 7.0) 50.0 mM Tricin (pH 7.0) 5.0 mM MgCl₂ 520.0 µM K₂SO₄ 276.0 µM FeSO₄ 50.0 µM CaCl₂ 1.0 mM MnCl₂ 100.0 µM NaCl 50.0 mM KCl 10.0 mM K₂HPO₄ 1.3 mM (NH₄)₆Mo₇O₂₄ 30.0 pM H₃BO₃ 4.0 nM CoCl₂ 300.0 pM CuSO₄ 100.0 pM ZnSO₄ 100.0 pM D-Glucose 20.2 mM NH₄Cl 37.4 mM Titrationsreagenz war KOH-Lösung. S. typhimurium-Minimalmedium NaCl 8.6 mM Na₂HPO₄ 33.7 mM KH₂PO₄ 22.0 mM NH₄Cl 18.7 mM D-Glucose 20.2 mM MgSO₄ 2.0 mM CaCl₂ 0.1 mM 15 g / l agar agar was added for solid media. Mopso minimal medium Mopso (pH 7.0) 50.0 mM Tricine (pH 7.0) 5.0 mM MgCl ₂ 520.0 µM K ₂ SO ₄ 276.0 µM FeSO ₄ 50.0 µM CaCl ₂ 1.0 mM MnCl ₂ 100.0 µM NaCl 50.0 mM KCl 10.0 mM K ₂ HPO ₄ 1.3 mM (NH ₄ ) ₆ Mo ₇ O ₂₄ 30.0 pM H ₃ BO ₃ 4.0 nM CoCl ₂ 300.0 pM CuSO ₄ 100.0 pM ZnSO ₄ 100.0 pM D-glucose 20.2 mM NH ₄ Cl 37.4 mM Titration reagent was KOH solution. NaCl 8.6 mM Na ₂ HPO ₄ 33.7 mM KH ₂ PO ₄ 22.0 mM NH ₄ Cl 18.7 mM D-glucose 20.2 mM MgSO ₄ 2.0 mM CaCl ₂ 0.1 mM

Für feste Medien wurden 15 g/l Agar-Agar zugesetzt. 3.2. Lösungen zur Protoplastentransformation von B. megaterium SMMP-Puffer Antibiotic Medium No. 3 (Difco) 17.5 g/l, Saccharose 500.0 mM Na-Maleinat (pH 6.5) 20.0 mM MgCl₂ 20.0 mM Titrationsreagenz war NaOH-Lösung. PEG-P-Lösung PEG 6000 40.0% (w/v) Saccharose 500.0 mM Na-Maleinat (pH 6.5) 20.0 mM MgCl₂ 20.0 mM Titrationsreagenz war NaOH-Lösung. cR5 Top-Agar Saccharose 300.0 mM Mops (pH 7.3) 31.1 mM NaOH 15.0 mM L-Prolin 52.1 mM D-Glucose 50.5 mM K₂SO₄ 1.3 mM MgCl₂ × 6 H₂O 45.3 mM KH₂PO₄ 313.0 µM CaCl₂ 13.8 mM Agar-Agar 4.0 g/l, Casaminoacids 0.2 g/l Hefe-Extrakt 10.0 g/l Titrationsreagenz war NaOH-Lösung. 15 g / l agar agar was added for solid media. 3.2. Protoplast transformation solutions for B. megaterium SMMP buffer Antibiotic Medium No. 3 (Difco) 17.5 g / l, sucrose 500.0 mM Na maleinate (pH 6.5) 20.0 mM MgCl ₂ 20.0 mM The titration reagent was NaOH solution. PEG 6000 40.0% (w / v) sucrose 500.0 mM Na maleinate (pH 6.5) 20.0 mM MgCl ₂ 20.0 mM The titration reagent was NaOH solution. sucrose 300.0 mM Pug (pH 7.3) 31.1 mM NaOH 15.0 mM L-proline 52.1 mM D-glucose 50.5 mM K ₂ SO ₄ 1.3 mM MgCl ₂ x 6 H ₂ O 45.3 mM KH ₂ PO ₄ 313.0 µM CaCl ₂ 13.8 mM Agar Agar 4.0 g / l, Casaminoacids 0.2 g / l Yeast extract 10.0 g / l The titration reagent was NaOH solution.

4. Media and media additions 4.1 Media

Falls nicht gesondert angegeben, wurde mit Vollmedium Luria-Bertani Broth (LB) wie bei Sambrook, J. et al. (1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben, gearbeitet. Unless otherwise specified, Luria-Bertani Broth (LB) was used with complete medium as in Sambrook, J. et al. (1989, Molecular cloning; a laboratory manual. 2 ^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

4.2. additions

Zusätze wie Kohlenstoffquellen, Aminosäuren oder Antibiotika wurden entweder den Medien zugefügt und zusammen autoklaviert oder als konzentrierte Stammlösungen in Wasser angesetzt und sterilisiert oder sterilfiltriert. Die Substanzen wurden den autoklavierten und auf unter 50°C abgekühlten Medien zugesetzt. Bei lichtempfindlichen Substanzen, wie Tetracyclin wurde auf Inkubation im Dunkeln geachtet. Die üblicherweise verwendeten Endkonzentrationen waren folgende:
Ampicillin 296 µM Tetracyclin 21 µM ALA 298 µM Häm 153 µM X-Gal 98 µM Methionin 335 µM Cystein 285 µM Natriumnitrat 10 mM Natriumnitrit 10 mM Dinatriumfumarat 10 mM Glucose 10 mM Ammoniumchlorid 37 mM Xylose 33 mM Lysozym 10 µg/ml Casaminoacids 0.025% (w/v) Additives such as carbon sources, amino acids or antibiotics were either added to the media and autoclaved together, or prepared as concentrated stock solutions in water and sterilized or sterile filtered. The substances were added to the autoclaved and cooled to below 50 ° C media. In the case of light-sensitive substances, such as tetracycline, care was taken to incubate in the dark. The final concentrations commonly used were as follows:
ampicillin 296 µM tetracycline 21 µM ALA 298 µM heme 153 µM X-Gal 98 µM methionine 335 µM cysteine 285 µM sodium nitrate 10 mM sodium nitrite 10 mM disodium 10 mM glucose 10 mM ammonium chloride 37 mM xylose 33 mM lysozyme 10 µg / ml Casaminoacids 0.025% (w / v)

5. Microbiological techniques 5.1. sterilization

Soweit nicht anders angegeben wurden sämtliche Medien und Puffer für 20 min bei 120°C und 1 bar Überdruck dampfsterilisiert. Temperaturempfindliche Substanzen wurden sterilfiltriert, Glaswaren mindestens 3 h bei 180°C hitzesterilisiert. Unless otherwise stated, all media and buffers were added for 20 min Steam sterilized at 120 ° C and 1 bar overpressure. Temperature sensitive substances were sterile filtered, glassware was heat sterilized at 180 ° C for at least 3 h.

5.2. General growth conditions

Aerobe Bakterienkulturen wurden in Schikanekolben bei 37°C und einer minimalen Drehzahl von 180 rpm inkubiert. Die Inkubationszeiten wurden entsprechend den erwünschten optischen Dichten der Bakterienkulturen variiert. Aerobic bacterial cultures were carried out in baffled flasks at 37 ° C and a minimum Incubated speed of 180 rpm. The incubation times were according to the desired optical densities of the bacterial cultures varied.

5.3. Conditions for Bacillus megaterium growth

Aerobe Kulturen wurden für eine bestmögliche Durchlüftung in Schikanekolben bei 250 rpm und, falls nicht anders angegeben, bei 30°C inkubiert. Anaerobe Kulturen wurden in einem Volumen von 100 ml in kleinen Anaerobenflaschen bei 30°C und 100 rpm fermentiert. In beiden Fällen wurde auf die Verwendung qualitativ konstanter Medien, Animpfung im Verhältnis 1 : 100 aus Übernachtkulturen, sowie Verwendung gleichbleibender Bedingungen für die Übernachtkulturen geachtet. Aerobic cultures have been used for the best possible ventilation in baffle flasks 250 rpm and, unless otherwise stated, incubated at 30 ° C. Anaerobic cultures were in a volume of 100 ml in small anaerobic bottles at 30 ° C and 100 rpm fermented. In both cases, the use of qualitatively more constant Media, inoculation in a ratio of 1: 100 from overnight cultures, and use constant conditions for overnight cultures.

5.4. Determination of cell density

Die Zelldichte einer Bakterienkultur wurde durch Messung der optischen Dichte bei 578 nm bestimmt, wobei davon ausgegangen wurde, daß einer OD₅₇₈ von eins eine Zellzahl von 1 × 10⁹ Zellen entspricht. The cell density of a bacterial culture was determined by measuring the optical density at 578 nm, it being assumed that an OD ₅₇₈ of one corresponds to a cell number of 1 × 10 ⁹ cells.

5.5. Comparative growth studies

Es wurden vergleichende Untersuchungen zum aeroben und anaroben Wachstumsverhalten verschiedener Bacillus megaterium-Stämme durchgeführt, die in den Fig. 1, 2 und 3 dargestellt sind. Bei den eingesetzten Stämmen handelt es sich um die Stämme B. megaterium DSMZ 32 (Wildtyp) oder die unter aeroben Bedingungen zur Vitamin B12-Produktion geeigneten "Produktionsstämme" DSMZ 509 und DSMZ 2894. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf den Einsatz dieser Stämme limitiert. Denkbar sind auch andere zur Herstellung von Vitamin B12 geeignete Stämme, eingeschlossen genetisch veränderte Bakterienstämme, die durch klassische Mutagenesen oder gezielte molekularbiologische Techniken und entsprechende Selektionsverfahren hergestellt werden können. Comparative studies on the aerobic and anarobic growth behavior of various Bacillus megaterium strains were carried out, which are shown in FIGS . 1, 2 and 3. The strains used are the strains B. megaterium DSMZ 32 (wild type) or the "production strains" DSMZ 509 and DSMZ 2894 which are suitable under aerobic conditions for vitamin B12 production. However, the present invention is not limited to the use of these strains , Other strains suitable for the production of vitamin B12 are also conceivable, including genetically modified bacterial strains which can be produced by classic mutagenesis or targeted molecular biological techniques and corresponding selection processes.

Bei den Untersuchungen, inwieweit B. megaterium zum anaeroben Wachstum befähigt ist, wurden anstelle des aeroben Elektronenakzeptors Sauerstoff, die alternativen Elektronenakzeptoren Nitrat, Nitrit und Fumarat zum Kulturmedium zugesetzt (Fig. 4-6). Parallel hierzu wurde untersucht, ob B. megaterium auch zur Fermentation in einem Medium ohne Zusatz dieser Elektronenakzeptoren fähig ist. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Erfindung wird dabei deutlich, daß der Elektronenakzeptor Nitrit eine toxische Wirkung auf das Bakterienwachstum ausübt. Auch Fumarat wirkt sich wachstumshemmend aus. Keiner der zugesetzten potentiellen Elektronenakzeptoren kann ein anaerobes Wachstum über das Maß des fermentativen Wachstums hinaus stimulieren. In the investigation of the extent to which B. megaterium is capable of anaerobic growth, oxygen and the alternative electron acceptors nitrate, nitrite and fumarate were added to the culture medium instead of the aerobic electron acceptor ( Fig. 4-6). In parallel, it was investigated whether B. megaterium is also capable of fermentation in a medium without the addition of these electron acceptors. It is clear from the results of the present invention that the electron acceptor nitrite has a toxic effect on bacterial growth. Fumarate also inhibits growth. None of the potential electron acceptors added can stimulate anaerobic growth beyond the level of fermentative growth.

5.6. Comparative studies on vitamin B12 production

Ferner wurden Analysen zur Vitamin B12 Produktion unter aeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen von Bacillus megaterium durchgeführt. Erfindungsgemäß wurden beispielhaft die Stämme Bacillus megaterium DSMZ 32, DSMZ 509 und DSMZ 2894 unter anaeroben Bedingungen in Glukose-haltigem (LB-Voll)-Medium herangezogen und am Ende der exponentiellen Wachstumsphase der Vitamin B12 Gehalt in pmol/OD₅₇₈ ermittelt. Parallel dazu wurde die Vitamin B12 Produktion bei aerober Lebensweise in der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 wiedergegeben. Analyzes of vitamin B12 production under aerobic and anaerobic growth conditions of Bacillus megaterium were also carried out. According to the invention, the strains Bacillus megaterium DSMZ 32, DSMZ 509 and DSMZ 2894 were used, for example, under anaerobic conditions in glucose-containing (LB full) medium and, at the end of the exponential growth phase, the vitamin B12 content in pmol / OD _{578 was} determined. At the same time, vitamin B12 production in the aerobic lifestyle was examined in the middle of the exponential growth phase. The results are shown in FIG. 7.

5.7. Influence of 5-amino-levulinic acid (ALA) on vitamin B12 production

Da ein zentraler Regulationspunkt im Tetrapyrrolbiosysntheseweg zur Synthese von Vitamin B12 die Bildung von 5-Amino-Lävulinsäure (ALA) ist, wurde erfindungsgemäß der Einfluß von ALA auf die Vitamin B-12 Produktion im Bacillus megaterium untersucht. Die aerobe Vitamin B-12 Produktion von B. megaterium mit und ohne externe Zugabe von ALA ist in Fig. 8 dargestellt. Dabei wurden ALA- Konzentrationen von etwa 50 µg/ml Kulturmedium eingesetzt. Since a central regulatory point in the tetrapyrrole biosynthetic pathway for the synthesis of vitamin B12 is the formation of 5-amino-levulinic acid (ALA), the influence of ALA on vitamin B-12 production in the Bacillus megaterium was investigated according to the invention. The aerobic vitamin B-12 production of B. megaterium with and without the external addition of ALA is shown in FIG. 8. ALA concentrations of about 50 µg / ml culture medium were used.

Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, daß sowohl bei aerober als auch bei anaerober Fermentation des Bakteriums die Zugabe von ALA keinen Effekt auf die Vitamin B-12 Produktion hat. Aufgrund dessen scheint die Regulation der Vitamin B- 12 Biosynthese nicht alleine durch die Bildung von ALA limitiert zu sein. According to the invention it could be shown that both aerobic and anaerobic fermentation of the bacterium the addition of ALA has no effect on the Has vitamin B-12 production. Because of this, the regulation of vitamin B- 12 Biosynthesis is not limited to the formation of ALA alone.

5.8. Quantitative vitamin B ₁₂ analysis

Aerobe B. megaterium-Kulturen wurden in der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase, anaerobe Kulturen am Ende der exponentiellen Wachstumsphase nach Bestimmung der OD₅₇₈ durch 15-minütiges Abzentrifugieren bei 5000 rpm geerntet (Centrifuge 5403, Eppendorf). Nach Waschen mit 40 ml Salzlösung wurde erneut 15 min bei 5000 rpm zentrifugiert (Centrifuge 5403, Eppendorf). Die erhaltenen Zellsedimente wurden abschließend lyophilisiert. S. typhimurium metE cysG Doppelmutanten (Raux, E. et al., 1996, J. Bacteriol., 178: 753-767) wurden über Nacht auf Methionin und Cystein enthaltendem Minimalmedium bei 37°C inkubiert, von der Platte gekratzt und mit 40 ml isotonischer Salzlösung gewaschen. Nach Abzentrifugieren wurde das Zellsediment wieder in isotonischer Salzlösung resuspendiert. Die gewaschene Bakterienkultur wurde sorgfältig mit 400 ml 47-48°C warmem, Cystein enthaltendem Minimalmedium-Agar gemischt. 10 µl der in deionisiertem, sterilem Wasser resuspendierten und 15 min im Wasserbad gekochten B. megaterium-Proben wurden auf die abgekühlten Platten gegeben und für 18 h bei 37°C inkubiert. Die Durchmesser der gewachsenen Salmonellenkolonien sind dann proportional dem Gehalt an Vitamin B₁₂ der aufgetragenen B. megaterium-Proben. Durch Vergleich mit einer Eichkurve, angefertigt aus der Zugabe von 0.01, 0.1, 1, 10 und 40 pmol Vitamin B₁₂, wurde auf den Gehalt an Vitamin B₁₂ in den untersuchten Proben zurückgeschlossen. Diese Standardmethode erlaubt schnell und sehr reproduzierbar den Nachweis geringer Vitamin B₁₂-Mengen in biologischen Materialien. Aerobic B. megaterium cultures were harvested in the middle of the exponential growth phase, anaerobic cultures at the end of the exponential growth phase after determination of the OD ₅₇₈ by centrifugation at 5000 rpm for 15 minutes (Centrifuge 5403, Eppendorf). After washing with 40 ml of saline, the mixture was centrifuged again at 5000 rpm for 15 min (Centrifuge 5403, Eppendorf). The cell sediments obtained were finally lyophilized. S. typhimurium metE cysG double mutants (Raux, E. et al., 1996, J. Bacteriol., 178: 753-767) were incubated overnight on minimal medium containing methionine and cysteine at 37 ° C., scratched from the plate and at 40 ml of isotonic saline solution. After centrifugation, the cell sediment was resuspended in isotonic saline. The washed bacterial culture was thoroughly mixed with 400 ml of 47-48 ° C minimal medium agar containing cysteine. 10 μl of the B. megaterium samples resuspended in deionized, sterile water and boiled for 15 minutes in a water bath were added to the cooled plates and incubated at 37 ° C. for 18 hours. The diameters of the grown Salmonella colonies are then proportional to the vitamin B ₁₂ content of the applied B. megaterium samples. By comparison with a calibration curve, made from the addition of 0.01, 0.1, 1, 10 and 40 pmol vitamin B ₁₂ , the content of vitamin B ₁₂ in the examined samples was inferred. This standard method allows the rapid and very reproducible detection of small amounts of vitamin B ₁₂ in biological materials.

6. Molecular biological techniques

Allgemeine Techniken, wie DNA-Präparation, Restriktion von DNA, Ligation, PCR, Sequenzierung, funktionelle Komplementation, Proteinexpression etc gehören zur gängigen Laborpraxis und sind bei Sambrook, J. et al. (1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben. General techniques, such as DNA preparation, restriction of DNA, ligation, PCR, sequencing, functional complementation, protein expression etc. belong to common laboratory practice and are described by Sambrook, J. et al. (1989, In Molecular cloning;.. A laboratory manual ^2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

6.1. Protoplast transformation of Bacillus megaterium

Protoplastenpreparation:
50 ml LB-Medium wurden mit 1 ml einer Übernachtkultur von B. megaterium angeimpft und bei 37°C inkubiert. Bei einer OD₅₇₈ von 1 wurden die Zellen bei 15,000 rpm und 4°C 15 min abzentrifugiert (RC 5B Plus, Sorvall) und in 5 ml SMMP- Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von Lysozym in SMMP-Puffer wurde die Suspension 60 min bei 37°C inkubiert und die Protoplastenbildung unter dem Mikroskop kontrolliert. Nach Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 3000 rpm und Rt (Centrifuge 5403, Eppendorf) wurde das Zellsediment vorsichtig in 5 ml SMMP- Puffer resuspendiert und der Zentrifugations- und Waschschritt ein zweites mal durchgeführt. Die Protoplastensuspension konnte nun, nach Zugabe von 10% (v/v) Glycerin, portioniert und bei -80°C eingefroren werden. Protoplastenpreparation:
50 ml LB medium were inoculated with 1 ml of an overnight culture of B. megaterium and incubated at 37 ° C. With an OD ₅₇₈ of 1, the cells were centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C. for 15 minutes (RC 5B Plus, Sorvall) and resuspended in 5 ml of SMMP buffer. After adding lysozyme in SMMP buffer, the suspension was incubated at 37 ° C. for 60 min and protoplast formation was checked under a microscope. After harvesting the cells by centrifugation at 3000 rpm and Rt (Centrifuge 5403, Eppendorf), the cell sediment was carefully resuspended in 5 ml SMMP buffer and the centrifugation and washing step was carried out a second time. After adding 10% (v / v) glycerol, the protoplast suspension could now be portioned and frozen at -80 ° C.

Transformation:
500 µl der Protoplastensuspension wurden mit 0.5 bis 1 µg DNA in SMMP-Puffer versetzt und 1.5 ml PEG-P-Lösung zugegeben. Nach Inkubation bei Rt für 2 min wurden 5 ml SMMP-Puffer hinzugefügt, vorsichtig gemischt und die Suspension bei 3000 rpm und Rt für 10 min zentrifugiert (Centrifuge 5403, Eppendorf). Sofort danach wurde der Überstand abgenommen und das kaum sichtbare Sediment in 500 µl SMMP-Puffer resuspendiert. Die Suspension wurde 90 min bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Danach wurden 50-200 µl der transformierten Zellen mit 2.5 ml cR5-Topagar gemischt und auf LB-Agar-Platten gegeben, die die für die Selektion geeigneten Antibiotika enthielten. Transformierte Kolonien wurden nach zweitägiger Inkubation bei 37°C sichtbar. Transformation:
500 µl of the protoplast suspension was mixed with 0.5 to 1 µg DNA in SMMP buffer and 1.5 ml PEG-P solution was added. After incubation at Rt for 2 min, 5 ml of SMMP buffer were added, mixed gently and the suspension was centrifuged at 3000 rpm and Rt for 10 min (Centrifuge 5403, Eppendorf). Immediately afterwards, the supernatant was removed and the barely visible sediment was resuspended in 500 µl SMMP buffer. The suspension was incubated at 37 ° C. for 90 min with gentle shaking. 50-200 μl of the transformed cells were then mixed with 2.5 ml of cR5 top agar and placed on LB agar plates which contained the antibiotics suitable for the selection. Transformed colonies became visible after two days of incubation at 37 ° C.

6.2. Identification and sequencing of the hemAXCDBL operon from B. megaterium

Zur Klonierung des hemAXCDBL-Operons wurde die Strategie der funktionellen Komplementation häm-auxotropher E. coli-Mutanten gewählt. Dazu wurde eine B. megaterium-Genbank nach gängigen Methoden hergestellt. Durch funktionelle Komplementation der E. coli hemB-Mutante RP523 mit dieser genomischen B. megaterium Plasmidgenbank konnten Kolonien isoliert werden, die wieder zur vollkommenen Tetrapyrrolbiosynthese befähigt waren, also phänotypisch den hämprototrophen Wildtyp darstellten. Nach Plasmid-DNA-Präparation und DNA- Sequenzierung der Vektor-lokalisierten B. megaterium-DNA konnte ein 3855 kb großes Insert identifiziert werden, das für das gesuchte hemAXCDBL Operon codiert. Die entsprechende Nukleotid-Sequenz ist in SEQ ID No. 1 und die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen in SEQ ID No. 2-6 aufgeführt. For the cloning of the hemAXCDBL operon, the strategy of the functional Complementation of heme auxotrophic E. coli mutants selected. A B. megaterium gene bank produced according to common methods. Through functional Complementation of the E. coli hemB mutant RP523 with this genomic B. Megaterium plasmid library was able to isolate colonies that were returned to the were capable of complete tetrapyrrole biosynthesis, i.e. phenotypically that hematoprotrophic wild type. After plasmid DNA preparation and DNA Sequencing of the vector-localized B. megaterium DNA allowed a 3855 kb large insert can be identified, which codes for the hemAXCDBL operon sought. The corresponding nucleotide sequence is in SEQ ID No. 1 and those of it derived amino acid sequences in SEQ ID No. 2-6 listed.

Die Sequenzen stromauf und stromabwärts des durch funktionelle Komplementation erhaltenen DNA-Fragments wurden mit Hilfe des Vectorette TM-Systems der Firma Sigma Genosis erhalten. Hierzu wurde die Turbo-Pfu-DNA-Polymerase der Firma Strategene verwendet, die aufgrund ihrer proofreading Funktion eine äußerst geringe Fehlerquote aufweist. The sequences upstream and downstream of by functional complementation DNA fragments obtained were analyzed using the company's Vectorette ™ system Get Sigma Genosis. For this purpose, the Turbo Pfu DNA polymerase from the company Strategic uses that due to their proofreading function an extremely low Has error rate.

6.3. Transformation and expression systems

Geeignete Plasmide zur Transformation und Überexpression von Genen in B. megaterium sind pWH1510 und PWH1520 sowie der plasmidfreie Überexpressionsstamm B. megaterium WH320 (Rygus, T. et al., 1991, Inducible high level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium, Appl. Microbiol. And Biotechnol., 35, 5: 594-599). Suitable plasmids for the transformation and overexpression of genes in B. megaterium are pWH1510 and PWH1520 as well as the plasmid-free Overexpression strain B. megaterium WH320 (Rygus, T. et al., 1991, Inducible high level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium, Appl. Microbiol. and Biotechnol., 35, 5: 594-599).

Das Kontrollplasmid pWH1510 enthält im unterbrochenen xylA-Leseraster eine spoVG-lacZ Fusion. SpoVG-lacZ bezeichnet dabei die Fusion aus einer sehr starken Ribosomen-Bindesequenz eines Sporulationsproteins aus B. subtilis (spoVG) mit dem für die β-Galaktosidase codierenden Gen (lacZ) aus E. coli. Dieses Plasmid ist damit hervorragend geeignet zur Untersuchung von Transformationseffizienzen und Überexpressionsbedingungen bei B. megaterium. The control plasmid pWH1510 contains one in the interrupted xylA reading frame spoVG-lacZ fusion. SpoVG-lacZ denotes the fusion of a very strong one Ribosome binding sequence of a sporulation protein from B. subtilis (spoVG) with the gene coding for the β-galactosidase (lacZ) from E. coli. This plasmid is therefore ideally suited for the study of transformation efficiencies and Overexpression conditions in B. megaterium.

Das Plasmid pWH1520 fungiert als eigentlicher Klonierungs- und Expressionsvektor. Beide Vektoren weisen ein Tetracyclin- und eine Ampicillinresistenz sowie die für die Replikation in E. coli und Bacillus spp wichtigen Elemente auf. Damit sind sie zugänglich für alle in E. coli etablierten Techniken für Abkömmlinge des Plasmids pBR322. Beiden Vektoren enthalten die B. megaterium xylA- und xylR- Gene des xyl Operons mit ihren regulatorischen Sequenzen (Rygus, T. et al., 1991, Molecular Cloning, Structure; Promoters and Regulatory Elements for Transcription of the Bacillus megaterium Encoded Regulon for Xylose Utilization, Arch. Microbiol. 155, 535-542). XylA codiert für die Xyloseisomerase, während xylR für ein Regulatorprotein codiert, das eine starke transkriptionelle Kontrolle auf xylA ausübt. XylA wird reprimiert in Abwesenheit von Xylose. Bei Zugabe von Xylose kommt es zu einer ca. 200-fachen Induktion durch Derepression von xylA. Mit Hilfe eines Polylinkers im xylA-Leseraster wird eine Fusion von Genen mit xylA möglich, die dann ebenfalls unter der starken transkriptionellen Kontrolle von XylR stehen. Dabei kann man zwischen den Alternativen zur Bildung einer Transkriptions- oder Translationsfusion wählen, da das xylA-Leseraster stromaufwärts des Polylinkers noch vollkommen intakt ist. The plasmid pWH1520 acts as the actual cloning and expression vector. Both vectors have a tetracycline and an ampicillin resistance as well as those for Replication in E. coli and Bacillus spp important elements. With that they are accessible to all techniques established in E. coli for descendants of the plasmid pBR322. Both vectors contain the B. megaterium xylA and xylR genes of xyl Operons with their regulatory sequences (Rygus, T. et al., 1991, Molecular Cloning, structure; Promoters and Regulatory Elements for Transcription of the Bacillus megaterium Encoded Regulon for Xylose Utilization, Arch. Microbiol. 155 535-542). XylA codes for xylose isomerase, while xylR for Coded regulatory protein that exerts a strong transcriptional control on xylA. XylA is repressed in the absence of xylose. When xylose is added, it happens an approximately 200-fold induction due to the depression of xylA. With help of a Polylinkers in the xylA reading frame allow a fusion of genes with xylA that then also under the strong transcriptional control of XylR. there one can choose between the alternatives to form a transcription or Choose translation fusion because the xylA reading frame is upstream of the polylinker is still completely intact.

Legend to the figures

Es wurden Bakterienstämme und Plasmide gemäß den Tabellen 1 und 2 eingesetzt.
Tabelle 1: Verwendete Bakterienstämme
Tabelle 2: Verwendete Plasmide Bacterial strains and plasmids according to Tables 1 and 2 were used.
Table 1: Bacterial strains used
Table 2: Plasmids used

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der Figuren noch erläutert. In the following the present invention will be explained with reference to the figures.

Fig. 1 zeigt einen Vergleich des Wachstums von B. megaterium DSMZ32 (Wildtyp) bei 30°C unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen. Anaerobes Wachstum wurde unter Zugabe von 10 mM Nitrat (leere Rauten), 10 mM Nitrit (leere Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze) gemessen. Fermentatives (leere Kreise) und aerobes Wachstum (gefüllte Rauten) fanden in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt. Fig. 1 shows a comparison of the growth of B. megaterium DSMZ32 (wild type) at 30 ° C under aerobic and anaerobic conditions. Anaerobic growth was measured with the addition of 10 mM nitrate (empty diamonds), 10 mM nitrite (empty triangles) and 10 mM fumarate (crosses). Fermentatives (empty circles) and aerobic growth (filled diamonds) took place in LB medium without additives. Samples were taken at the specified times and the optical density at 578 nm was determined.

Fig. 2 zeigt einen Vergleich des Wachstums von B. megaterium DSM509 bei 30°C unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen. Anaerobes Wachstum wurde unter Zugabe von 10 mM Nitrat (leere Rauten), 10 mM Nitrit (leere Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze) gemessen. Fermentatives (leere Kreise) und aerobes Wachstum (gefüllte Rauten) fanden in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt. Fig. 2 shows a comparison of the growth of B. megaterium DSM509 at 30 ° C under aerobic and anaerobic conditions. Anaerobic growth was measured with the addition of 10 mM nitrate (empty diamonds), 10 mM nitrite (empty triangles) and 10 mM fumarate (crosses). Fermentatives (empty circles) and aerobic growth (filled diamonds) took place in LB medium without additives. Samples were taken at the specified times and the optical density at 578 nm was determined.

Fig. 3 zeigt einen Vergleich des Wachstums von B. megaterium DSM2894 bei 30°C unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen. Anaerobes Wachstum wurde unter Zugabe von 10 mM Nitrat (leere Rauten), 10 mM Nitrit (leere Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze) gemessen. Fermentatives (leere Kreise) und aerobes Wachstum (gefüllte Rauten) fanden in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt. Fig. 3 shows a comparison of the growth of B. megaterium DSM2894 at 30 ° C under aerobic and anaerobic conditions. Anaerobic growth was measured with the addition of 10 mM nitrate (empty diamonds), 10 mM nitrite (empty triangles) and 10 mM fumarate (crosses). Fermentatives (empty circles) and aerobic growth (filled diamonds) took place in LB medium without additives. Samples were taken at the specified times and the optical density at 578 nm was determined.

Fig. 4 zeigt anaerobes Wachstum von B. megaterium DSM32 (Wildtyp) bei 30°C unter Zusatz von 10 mM Nitrat (Rauten), 10 mM Nitrit (Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze). Fermentatives Wachstum (Kreise) fand in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt. Fig. 4 shows anaerobic growth of B. megaterium DSM32 (wild type) at 30 ° C with the addition of 10 mM nitrate (diamonds), 10 mM nitrite (triangles) and 10 mM fumarate (crosses). Fermentative growth (circles) took place in LB medium without additives. Samples were taken at the specified times and the optical density at 578 nm was determined.

Fig. 5 zeigt anaerobes Wachstum von B. megaterium DSM509 bei 30°C unter Zusatz von 10 mM Nitrat (Rauten), 10 mM Nitrit (Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze). Fermentatives Wachstum (Kreise) fand in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt. Fig. 5 shows anaerobic growth of B. megaterium DSM509 at 30 ° C with the addition of 10 mM nitrate (diamonds), 10 mM nitrite (triangles) and 10 mM fumarate (crosses). Fermentative growth (circles) took place in LB medium without additives. Samples were taken at the specified times and the optical density at 578 nm was determined.

Fig. 6 zeigt anaerobes Wachstum von B. megaterium DSM2894 bei 30°C unter Zusatz von 10 mM Nitrat (Rauten), 10 mM Nitrit (Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze). Fermentatives Wachstum (Kreise) fand in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt. Fig. 6 shows anaerobic growth of B. megaterium DSM2894 at 30 ° C with the addition of 10 mM nitrate (diamonds), 10 mM nitrite (triangles) and 10 mM fumarate (crosses). Fermentative growth (circles) took place in LB medium without additives. Samples were taken at the specified times and the optical density at 578 nm was determined.

Fig. 7 zeigt die Vitamin B₁₂-Produktion von B. megaterium unter aeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen. Es wurde der Gehalt an Vitamin B₁₂ pro Zeilmasse angegeben in pmol/OD₅₇₈ für den Wildtypstamm B. megaterium DSM32 aerob gewachsen (1) und anaerob gewachsen (2), für B. megaterium DSM509 aerob gewachsen (3) und anaerob gewachsen (4), sowie für B. megaterium DSM2894 aerob gewachsen (5) und anaerob gewachsen (6), bestimmt. Fig. 7 shows the vitamin B ₁₂ production of B. megaterium under aerobic and anaerobic growth conditions. The content of vitamin B ₁₂ per cell mass was given in pmol / OD ₅₇₈ for the wild type strain B. megaterium DSM32 aerobically grown (1) and anaerobically grown (2), for B. megaterium DSM509 aerobically grown (3) and anaerobically grown (4 ), as well as for B. megaterium DSM2894 grown aerobically (5) and grown anaerobically (6).

Fig. 8 zeigt die aerobe Vitamin B₁₂-Produktion von B. megaterium mit und ohne externe Zugabe von 50 µg/ml ALA. Es wurde der Gehalt an Vitamin B₁₂ pro Zellmasse, gemessen in pmol/OD₅₇₈, für den Wildtypstamm B. megaterium DSM32 ohne ALA-Zugabe (1), mit ALA-Zugabe (2), für B. megaterium DSM509 ohne ALA- Zugabe (3), mit ALA-Zugabe (4), sowie für B. megaterium DSM2894 ohne ALA- Zugabe (5) und mit ALA-Zugabe (6), bestimmt. Tabelle 1

Tabelle 2

SEQUENCE LISTING

Fig. 8 shows the aerobic vitamin B ₁₂ production of B. megaterium with and without external addition of 50 ug / ml of ALA. The content of vitamin B ₁₂ per cell mass, measured in pmol / OD ₅₇₈ , was obtained for the wild-type strain B. megaterium DSM32 without ALA addition (1), with ALA addition (2), for B. megaterium DSM509 without ALA addition (3), with ALA addition (4), and for B. megaterium DSM2894 without ALA addition (5) and with ALA addition (6). Table 1

Table 2

SEQUENCE LISTING

Claims

1. A process for the preparation of vitamin B12 by means of a culture containing Bacillus megaterium, characterized in that the fermentation is carried out under anaerobic conditions.

2. The method according to claim 1, characterized in that B. megaterium first fermented aerobically and then anaerobically.

3. The method according to any one of claims 1 or 2, characterized in that that the transition from aerobic to anaerobic fermentation in the exponential growth phase of the aerobically fermented cells takes place.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the transition from aerobic to anaerobic fermentation in the middle or at the end, preferably at the end of the exponential phase of aerobic growth growing cells.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that at least cobalt is added to the culture medium.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that a Bacillus megaterium strain is fermented, the hemAXCDBL- Operon or parts of it is increasingly expressed.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that a Bacillus megaterium strain is fermented, the hemAXCDBL- There is an increased number of copies of operon in the cell.

8. Isolated nucleotide sequence coding for the on the biosynthesis of Uroporphyrinogen III involved enzymes according to SEQ ID No. ID No. 2-6 or their isoforms are organized in the hemAXCDBL operon with a Nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 or their alleles.

9. gene structure containing the isolated nucleotide sequence according to claim 8 or Parts of it and operatively linked nucleotide sequences with regulatory function.

10. Vector containing an isolated nucleotide sequence according to claim 8 or Parts thereof or a gene structure according to claim 9 and additional Nucleotide sequences for selection, replication in the host cell and / or Integration into the host cell genome.

11. Transformed Bacillus megaterium strain for use in a process for Vitamin B12 production according to one of claims 1 to 7, characterized characterized in that it increased expression and / or increased Copy number of the nucleotide sequence according to claim 8 or parts thereof having.

12. Transformed Bacillus megaterium strain according to claim 11, characterized characterized in that it has a gene structure in replicating form Claim 9 or a vector according to Claim 10.

13. Use of the isolated nucleotide sequence according to claim 8 or parts thereof or the gene structure according to claim 9 or a vector according to Claim 10 for the production of a transformed Bacillus megaterium Strain according to one of claims 11 or 12.

14. Use of the transformed Bacillus megaterium strain according to one of claims 11 or 12 for the production of vitamin B12.