DE10136375A1

DE10136375A1 - Process for cell enrichment

Info

Publication number: DE10136375A1
Application number: DE10136375A
Authority: DE
Inventors: Stefan Thoma; Roland Bosse; Gregor Schulz; Olivier Waridel; Claude Fell
Original assignee: Biosafe SA; CellGenix GmbH
Current assignee: Biosafe SA; CellGenix GmbH
Priority date: 2001-07-26
Filing date: 2001-07-26
Publication date: 2003-02-13
Also published as: WO2003009889A1

Abstract

The invention relates to a method for enriching cells according to which a composition, which contains a mixture of different cell types, is brought into contact with particles that bind to a sub-population of unwanted cells in the composition; the mixture consisting of cells and particles are centrifuged, and; the desired cell fraction is extracted before the centrifugation is concluded. The method is particularly suited for extracting therapeutic cells.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Zellseparation und Gewinnung bestimmter Zelltypen, insbesondere aus Blut. The present invention relates to the field of cell separation and extraction of certain Cell types, especially from blood.

Für die klinische Zelltherapie werden je nach Indikation und Therapieansatz verschiedene Zelltypen (z. B. hämatopoetische Stamm- oder Progenitorzellen, Monozyten/dendritische Zellen, T- und NK-Zellen) eingesetzt. In der Regel werden diese Zellen aus dem Blut oder Knochenmark von Patienten oder Spendern gewonnen. Dort machen sie aber nur einen geringen Prozentsatz des Ausgangsmaterials aus. Aus diesem Grund ist eine Anreicherung dieser "therapeutischen" Zellpopulationen notwendig. For clinical cell therapy, different are used depending on the indication and therapeutic approach Cell types (e.g. hematopoietic stem or progenitor cells, monocytes / dendritic Cells, T and NK cells) are used. As a rule, these cells are made of blood or Bone marrow obtained from patients or donors. But there they only do one low percentage of the starting material. For this reason there is an enrichment of these "therapeutic" cell populations.

Die Anreicherung von Zellen aus einem heterogenen Ausgangsmaterial wird seit vielen Jahren in Routineverfahren zur klinischen Zelltherapie durchgeführt. Die Anreicherung kann direkt erfolgen durch Selektion und Zurückhalten der gewünschten Zellen aus dem Ausgangsmaterial mittels geeigneter Verfahren (positive Selektion der therapeutischen Zellen) oder indirekt durch Selektion und Entfernung der nicht gewünschten Zellen (negative Selektion, das heißt Entfernung der Zielzellen, z. B. Tumorzellen). The enrichment of cells from a heterogeneous starting material has been around for many Years in routine clinical cell therapy procedures. The enrichment can directly by selecting and retaining the desired cells from the Starting material by means of suitable processes (positive selection of the therapeutic Cells) or indirectly by selection and removal of the unwanted cells (negative selection, i.e. removal of the target cells, e.g. tumor cells).

Bei diesen spezifischen Verfahren wird die Spezifität der Trennverfahren in der Regel durch monoklonale Antikörper (z. B. aus der Maus) gewährleistet, die spezifische auf der Zelloberfläche exprimierte Antigene erkennen und an diese binden. Um die mit Antikörper beladenen Zellen abtrennen zu können, sind die verwendeten Antikörper mit Partikeln (sogenannten "Beads") gekoppelt, die je nach Hersteller aus unterschiedlichem Material bestehen. Allen Partikeln gemeinsam ist ein metallischer Kern aus Eisen oder Nickel und dadurch die Eigenschaft, in einem magnetischen Feld zurückgehalten werden zu können. Die verfügbaren kommerziellen Systeme verwenden zur Auftrennung der Zellen einen Magneten. Somit können die mit Antikörper und "Beads" beladenen Zellen selektiv durch Einwirkung eines magnetischen Feldes abgetrennt werden. Solche Systeme werden von den Firmen Nexell, Miltenyi oder Eligix bereitgestellt. With these specific processes, the specificity of the separation process is usually determined by monoclonal antibody (e.g. from the mouse) ensures the specific on the Recognize and bind to cell surface expressed antigens. To those with antibodies To be able to separate loaded cells are the antibodies used with particles (so-called "beads"), which, depending on the manufacturer, are made of different materials consist. Common to all particles is a metallic core made of iron or nickel and thereby the property of being able to be retained in a magnetic field. The commercial systems available use one to separate the cells Magnet. Thus, the cells loaded with antibody and "beads" can selectively Exposure to a magnetic field can be separated. Such systems are used by provided by Nexell, Miltenyi or Eligix.

Bei der positiven Selektion unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern besteht der Nachteil darin, daß auf den therapeutischen Zellen Antikörper inklusive Partikel gebunden sind, die bei Rückführung der Zellen in den Patienten ebenfalls in den Körper gelangen und dort Nebenwirkungen wie unerwünschte Immunreaktionen hervorrufen können (Nickelallergie, Immunisierung gegen Mausantikörper). Demgegenüber binden Antikörper bei der negativen Selektion nur an Zielzellen, die depletiert, aber nicht für den therapeutischen Einsatz verwendet werden. Somit gelangt kein zellgebundener Antikörper ungewollt in den Patienten. In the case of positive selection using monoclonal antibodies, the The disadvantage is that antibodies, including particles, are bound to the therapeutic cells are, which also get into the body when the cells are returned to the patient and there can cause side effects such as unwanted immune reactions (Nickel allergy, immunization against mouse antibodies). In contrast, antibodies bind in the negative selection only on target cells that are depleted, but not for the therapeutic use. This means that no cell-bound antibody arrives unwanted in the patient.

Ein anderes Prinzip der Zellanreicherung besteht in der Auftrennung des Ausgangsmaterials nach unterschiedlicher Dichte der Zellen. Dabei erfolgt die Auftrennung der Zellen meist mittels eines Dichtegradienten. Eine häufig verwendete Dichtegradientenlösung ist das Ficoll, das aufgrund toxischer Eigenschaften für Zellen bei längerer Inkubation aber nicht für die klinische Anwendung zugelassen ist. Mangels Alternativen wird es jedoch in vielen Verfahren routinemäßig klinisch eingesetzt. In dem DACS®SC-Kit der Firma Dendreon wird durch Zentrifugation die Separation der Zellen in Anwesenheit des Dichtegradienten induziert und beschleunigt. Gemäß ihrer spezifischen Dichte und deren Relation zur Dichte des verwendeten Gradientenmaterials bleiben die verschiedenen Zellfraktionen oberhalb oder unterhalb des Dichtegradienten. Die Reinheit und Ausbeute der Zellfraktionen bei Auftrennung mittels Dichtegradienten ist in der Regel aber deutlich geringer als bei spezifischen Verfahren. Another principle of cell enrichment is the separation of the Starting material according to different cell density. The separation takes place the cells mostly by means of a density gradient. A commonly used Density gradient solution is the Ficoll, which due to toxic properties for cells prolonged incubation but is not approved for clinical use. for lack of However, alternatives are routinely used clinically in many procedures. By doing DACS®SC kit from Dendreon is used to centrifuge the cells in Presence of the density gradient induces and accelerates. According to their specific Density and its relation to the density of the gradient material used remain the different cell fractions above or below the density gradient. The purity and yield of the cell fractions when separated by means of density gradients is usually but significantly less than with specific processes.

Zellseparationsverfahren sollten kostengünstig, effizient und wenig zeitaufwendig sein. Ein weiteres Problemfeld stellt bei der Gewinnung von therapeutischen Zellen die Kontaminationsgefahr während des Isolierungsverfahrens dar. Cell separation processes should be inexpensive, efficient and not very time-consuming. On Another problem area arises in the production of therapeutic cells Risk of contamination during the insulation process.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein vorteilhaftes Verfahren zur Anreicherung von Zellen bereitzustellen. An object of the present invention is to provide an advantageous method for Provide cell enrichment.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß aus einer Mischpopulation von Zellen unerwünschte Zellen dadurch abgereichert werden können, daß die Mischpopulation mit Antikörper-gekoppelten magnetischen Kügelchen ("Beads"), die Antigene auf der Oberfläche der unerwünschten Zellen erkennen, in Kontakt gebracht werden und anschließend das Gemisch aus Kügelchen und Zellen zentrifugiert wird, wobei noch während der Zentrifugation die gewünschte Zellfraktion gewonnen wird. Anstelle von Antikörpern können auch andere an "Beads" gebundene Moleküle wie z. B. Liganden oder Rezeptoren verwendet werden. It was surprisingly found that from a mixed population of cells unwanted cells can be depleted in that the mixed population with Antibody-coupled magnetic beads ("beads") that carry antigens on the Detect surface of unwanted cells, be brought into contact and then the mixture of beads and cells is centrifuged while still the desired cell fraction is obtained during centrifugation. Instead of Antibodies can also other molecules bound to "beads" such as. B. ligands or Receptors are used.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Anreicherung von Zellen, bei dem man eine Zusammensetzung, die ein Gemisch unterschiedlicher Zelltypen enthält, mit Partikeln in Kontakt bringt, die an eine Subpopulation unerwünschter Zellen in der Zusammensetzung binden, das Gemisch aus Zellen und Partikeln zentrifugiert und die gewünschte Zellfraktion gewinnt, bevor die Zentrifugation beendet ist. The present invention therefore relates to a method for enriching cells in which a composition containing a mixture of different cell types with Brings particles in contact with a subpopulation of unwanted cells in the Binding composition, centrifuging the mixture of cells and particles and the desired cell fraction wins before centrifugation is complete.

Die Zusammensetzung, die ein Gemisch unterschiedlicher Zelltypen enthält, kann verschiedenster Art sein. Als Ausgangsmaterial kommt vorzugsweise Nabelschnurblut, peripheres Blut, Leukapheresat oder Knochenmark in Frage. Diese Zusammensetzungen können in der Form eingesetzt werden, wie sie zunächst isoliert wurden, sie können aber auch durch geeignete Puffer und/oder Salzlösungen verdünnt worden sein. Die Verfahren zur Gewinnung der genannten Ausgangsmaterialien sind dem Fachmann bekannt. The composition containing a mixture of different cell types can be of all kinds. Umbilical cord blood is the preferred starting material, peripheral blood, leukapheresate or bone marrow in question. These compositions can be used in the form in which they were initially isolated, but they can have also been diluted with suitable buffers and / or salt solutions. The proceedings to obtain the starting materials mentioned are known to the person skilled in the art.

Die Partikel, die mit der Zusammensetzung in Kontakt gebracht werden, haben üblicherweise eine höhere Dichte als die Dichte der anzureichernden Zellen. Die Dichte der Partikel ist vorzugsweise 1,1 bis 2 g/cm³, bevorzugter 1,3 bis 1,6 g/cm³, am bevorzugtesten ungefähr 1,5 g/cm³. The particles that are brought into contact with the composition usually have a higher density than the density of the cells to be enriched. The density of the particles is preferably 1.1 to 2 g / cm ³ , more preferably 1.3 to 1.6 g / cm ³ , most preferably approximately 1.5 g / cm ³ .

Die Partikel haben vorzugsweise eine Größe von 2,8 bis 5 µm, bevorzugter von 4,5 ± 0,2 µm. Als Größe ist bei annähernd kugelförmigen Partikeln der Durchmesser anzusehen, ansonsten die größte räumliche Ausdehnung des Partikels. Bei einer heterogenen Partikelpopulation ist der Durchschnittswert anzunehmen. The particles preferably have a size of 2.8 to 5 µm, more preferably 4.5 ± 0.2 µm. In the case of approximately spherical particles, the diameter is to be regarded as the size, otherwise the largest spatial extent of the particle. With a heterogeneous Particle population is to be assumed as the average value.

Die Form der Partikel ist nicht besonders eingeschränkt, es kann sich um längliche oder auch amorph geformte Partikel handeln. Vorzugsweise handelt es sich aber um Partikel, die im wesentlichen kugelförmig sind. Das Material der Partikel kann unterschiedlich sein. Vorzugsweise handelt es sich um ein Material hoher Dichte wie z. B. um ein Metall. Beispiele geeigneter Materialien sind Eisen und Nickel, andere Metalle können aber ebenfalls verwendet werden. Die Partikel müssen nicht in homogener Weise aus einem einzigen Material bestehen, es kann sich auch um Partikel handeln, die aus einem Gemisch unterschiedlicher Materialien oder um Partikel mit mehreren Schichten unterschiedlicher Materialien handeln. So ist es vorstellbar, daß die Partikel einen metallhaltigen Kem aufweisen und mit einer nicht-metallischen Oberfläche überzogen sind. The shape of the particles is not particularly limited, it can be elongated or also act amorphous particles. However, it is preferably particles that are substantially spherical. The material of the particles can be different. Preferably, it is a high density material such as. B. a metal. Examples of suitable materials are iron and nickel, but other metals can also be used. The particles do not have to be homogeneous from one only material, it can also be particles that consist of a mixture different materials or around particles with multiple layers different Trade materials. So it is conceivable that the particles have a metal-containing core have and are coated with a non-metallic surface.

Die Partikel binden an eine Subpopulation unerwünschter Zellen in der Zusammensetzung. Die geschieht vorzugsweise dadurch, daß die Partikel auf ihrer Oberfläche fest gebunden Antikörpermoleküle tragen. Diese Antikörpermoleküle erkennen Antigene auf der Oberfläche der abzureichernden Zellen. Vorzugsweise ist die Bindung der Antikörper an die Oberflächenantigene spezifisch. Das bedeutet, daß die Partikel nur an die abzureichernden Zellen binden. Es ist möglich, daß die Antikörper Oberflächenantigene von mehreren Zelltypen erkennen. Ebenfalls ist es möglich, daß die Zusammensetzung mit Partikeln in Kontakt gebracht wird, die mehrere Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten gegen unterschiedliche Oberflächenantigene tragen. Dadurch ist die Abreicherung mehrerer unerwünschter Zelltypen in einem Schritt möglich. Anstelle von Antikörpern können auch andere an "Beads" gebundene Moleküle wie z. B. Liganden oder Rezeptoren verwendet werden. The particles bind to a subpopulation of unwanted cells in the composition. This is preferably done by the particles being firmly bound on their surface Carrying antibody molecules. These antibody molecules recognize antigens on the Surface of the cells to be depleted. The antibody is preferably bound to the Specific surface antigens. This means that the particles only to be depleted Bind cells. It is possible that the antibodies have surface antigens of several Recognize cell types. It is also possible that the composition with particles in It is brought into contact with several antibodies with different specificities carry different surface antigens. This is the depletion of several unwanted cell types possible in one step. Instead of antibodies, too other molecules bound to "beads" such as e.g. B. ligands or receptors are used become.

Die spezifischen Antikörper, die Oberflächenantigene auf den Zielzellen erkennen, müssen nicht unmittelbar an die Oberfläche der Partikel gebunden sein. Vielmehr ist es bevorzugt, daß diese Antikörper (= Primärantikörper) über weitere Antikörpermoleküle (= Sekundärantikörper), die ihrerseits fest mit der Partikeloberfläche gekoppelt sind, an die Partikel gebunden werden. So kann der Primärantikörper beispielsweise ein Maus-anti- Human-Antikörper sein, während der Sekundärantikörper den Primärantikörper aus Maus erkennt. Partikel und "Beads" mit gekoppelten Sekundärantikörpern sind kommerziell erhältlich. The specific antibodies that recognize surface antigens on the target cells must not be bound directly to the surface of the particles. Rather, it is preferred that these antibodies (= primary antibodies) via other antibody molecules (= Secondary antibodies), which in turn are firmly coupled to the particle surface to which Particles are bound. For example, the primary antibody can be a mouse anti Human antibody, while the secondary antibody is the mouse primary antibody recognizes. Particles and "beads" with coupled secondary antibodies are commercial available.

Die Herstellung von Partikeln und Kügelchen mit immobilisierten Antikörpern auf ihrer Oberfläche ist dem Fachmann an sich bekannt. Die Auswahl der spezifischen Antikörper oder anderer Moleküle erfolgt aufgrund der auf der Oberfläche der zu depletierenden Zellen exprimierten Antigene. Folgende Zielzelltypen können durch Antikörper gegen die genannten Antigene auf ihrer Oberfläche depletiert werden: Tabelle 1

The production of particles and beads with immobilized antibodies on their surface is known per se to the person skilled in the art. The specific antibodies or other molecules are selected on the basis of the antigens expressed on the surface of the cells to be depleted. The following target cell types can be depleted on their surface by antibodies against the named antigens: Table 1

Diese Aufzählung ist nicht erschöpfend, vielmehr soll die Erfindung beispielhaft erläutert werden. This list is not exhaustive, rather the invention is to be explained by way of example become.

Bei den Antikörpermolekülen handelt es sich vorzugsweise um monoklonale Antikörper. Der Begriff "Antikörper" oder "Antikörpermoleküle" umfaßt komplette Antikörpermoleküle, aber auch funktionelle Fragmente und Derivate davon. Die Fragmente und Derivate sind funktionell, wenn sie an "ihr" Antigen binden können, das heißt an das Antigen, an das der Antikörper bindet, von dem sie abgeleitet sind. Beispiele für Fragmente und Derivate sind Fab-Fragmente, F(ab')₂Fragmente, "single-chain antibody fragments", bispezifische Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper sowie Fragmente, die CDRs (complementarity determining regions) enthalten, die ein Epitop erkennen. The antibody molecules are preferably monoclonal antibodies. The term “antibody” or “antibody molecules” encompasses complete antibody molecules, but also functional fragments and derivatives thereof. The fragments and derivatives are functional if they can bind to "their" antigen, that is, the antigen to which the antibody from which they are derived binds. Examples of fragments and derivatives are Fab fragments, F (ab ') ₂ fragments, "single-chain antibody fragments", bispecific antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies and fragments which contain CDRs (complementarity determining regions) which recognize an epitope ,

In einem ersten Schritt des Verfahrens werden beispielsweise die ausgewählten monoklonalen Maus-Anti-Human-Antikörper (Primärantikörper), die an Antigene wie z. B. CD10 (Expression auf B-Vorläuferzellen und neoplastischen Zellen), CD19 (Expression auf allen B-Zelldifferenzierungsstadien) oder CD20 (Expression auf frühen, ruhenden und aktivierten B-Zellen) binden, mit den magnetischen Kügelchen ("Beads") vorinkubiert. An die "Beads" sind vom Hersteller bereits Sekundärantikörper gekoppelt, die Primärantikörper aus der Maus erkennen. Durch Vorinkubation binden die monoklonalen Maus-Anti-Human- Antikörper an die auf den magnetischen "Beads" befindlichen Sekundärantikörper. In a first step of the process, for example, the selected ones mouse monoclonal anti-human antibodies (primary antibodies), which are linked to antigens such. B. CD10 (expression on B progenitor cells and neoplastic cells), CD19 (expression on all B cell differentiation stages) or CD20 (expression on early, resting and activated B cells), pre-incubated with the magnetic beads. On the manufacturer has already coupled the "beads" to secondary antibodies, the primary antibodies recognize from the mouse. By pre-incubation, the monoclonal mouse anti-human Antibodies to the secondary antibodies located on the magnetic "beads".

In einem zweiten Schritt werden die Zellen (Ausgangsmaterial) mit den vorbereiteten "Beads" (mit Primär- und Sekundärantikörper) inkubiert. Durch die spezifische Bindung der Primärantikörper an die zu entfernenden Zellen werden diese mit den "Beads" beladen und erhalten dadurch eine andere Dichte. Dieses Gemisch aus Zellen und Partikeln wird dann in das Zentrifugationssystem überführt und aufgearbeitet. In a second step, the cells (starting material) with the prepared ones "Beads" (with primary and secondary antibody) incubated. Due to the specific binding of the Primary antibodies to the cells to be removed are loaded with the "beads" and get a different density. This mixture of cells and particles is then in the centrifugation system transferred and refurbished.

Die Zentrifugation des Zell-Partikelgemisches erfolgt in einem dazu geeigneten System. Vorzugsweise handelt es sich um ein geschlossenes System, so daß keine Kontaminationen möglich sind. Es kann sich dabei vorteilhafterweise um ein System handeln, das eine Wegwerfgarnitur (zur einmaligen Verwendung) enthält. Die Wegwerfgarnitur kann ein Zentrifugationsgefäß mit einem Einfaß/Auslaß für die zu verarbeitende Mischung und die verarbeiteten Bestandteile der Mischung umfassen. Am bevorzugtesten wird das Sepax™-System der Firma Biosafe S. A. verwendet, das beispielsweise in WO 00/38762 offenbart ist. Das Sepax™-System wurde in zahlreichen Anwendungen zur Verarbeitung biologischer Flüssigkeiten erfolgreich eingesetzt, einschließlich der Konzentration von Progenitorzellen, die aus Nabelschnurblut, Leukapheresaten oder Knochenmark stammen. Es war aber völlig unerwartet, dass durch das System die Effizienz der Zellselektion deutlich erhöht werden konnte, wenn es zusammen mit der Technologie Antikörper-gekoppelter Mikrobeads ("microbeads antibody coated technology") eingesetzt wurde. The cell-particle mixture is centrifuged in a suitable system. It is preferably a closed system, so that none Contamination is possible. This can advantageously be a system act that contains a disposable set (for single use). The Disposable set can be a centrifugation vessel with an inlet / outlet for the processing mixture and the processed components of the mixture. At the most preferred is the Sepax ™ system from Biosafe S.A., which is disclosed for example in WO 00/38762. The Sepax ™ system has been used in numerous Applications for processing biological liquids successfully used including the concentration of progenitor cells derived from umbilical cord blood, Leukapheresaten or bone marrow originate. But it was completely unexpected that by the system's efficiency of cell selection could be increased significantly when it did together with the technology of antibody-coupled microbeads ("microbeads antibody coated technology ") was used.

Die Zentrifugation erfolgt vorzugsweise bei 200 bis 800 G, bevorzugter bei 400 bis 700 G, am bevorzugtesten bei ungefähr 600 G. Centrifugation is preferably carried out at 200 to 800 G, more preferably at 400 to 700 G, most preferably around 600 G.

Die Zentrifugationsdauer, bevor mit der Gewinnung der gewünschten Zellfraktion begonnen wird, ist üblicherweise 5 bis 20 Minuten, vorzugsweise 5 bis 10 Minuten, am bevorzugtesten ungefähr 7 Minuten. The centrifugation time before the desired cell fraction is obtained is usually 5 to 20 minutes, preferably 5 to 10 minutes, most preferred about 7 minutes.

In einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Zentrifugationsbehältnis um ein längliches Gefäß, vorzugsweise zylinderförmig, das während der Zentrifugation um seine Längsachse rotiert. Dabei ist es möglich, während der Zentrifugation an der Position der Längsachse Fraktionen zu entnehmen. Erfindungsgemäß wird nämlich die gewünschte Zellfraktion gewonnen, bevor die Zentrifugation beendet ist. Das bedeutet in der Regel, daß die Zellfraktion gewonnen wird, solange sich das Zentrifugationsgefäß dreht. Darin eingeschlossen ist die Gewinnung während der Zentrifugation und die Gewinnung während des Abbremsens bzw. "Auslaufens" der Zentrifuge. Die Entnahme kann somit "online" erfolgen. Das hat den Vorteil, daß keine Vermischung der Schichten erfolgt, darüber hinaus kann die Kontaminationsgefahr stark reduziert werden. Insbesondere kann die Gewinnung der gewünschten Zellfraktion kontinuierlich während der Rotation des Zentrifugationsgefäßes erfolgen. Alternativ kann aber auch eine bestimmte Zeit zentrifugiert werden, ohne daß die gewünschte Zellfraktion gewonnen wird. Die Gewinnung erfolgt dann erst kurz vor dem Ende der Zentrifugation. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine nur teilweise Gewinnung der gewünschten Zellfraktion während der Zentrifugation. So kann ein Teil der gewünschten Zellfraktion während der Zentrifugation des Gemisches gewonnen werden, ein weiterer Teil nach Ende der Zentrifugation. Als weitere Alternative kann die Zentrifuge zwischendurch angehalten werden, um die gewünschte Zellfraktion oder einen Teil davon zu entnehmen, und dann weiterzentrifugiert werden, um die Zentrifugation zu beenden. In a special embodiment, the centrifugation container is an elongated vessel, preferably cylindrical, that turns around during centrifugation its longitudinal axis rotates. It is possible to position it during centrifugation remove fractions from the longitudinal axis. According to the invention, namely the desired one Cell fraction obtained before centrifugation is complete. This usually means that the cell fraction is obtained as long as the centrifugation vessel is rotating. In this including during centrifugation and during braking or "running down" of the centrifuge. The removal can thus be "online" respectively. This has the advantage that the layers are not mixed, moreover the risk of contamination can be greatly reduced. In particular, the extraction the desired cell fraction continuously during the rotation of the Centrifugation vessel. Alternatively, a certain time can be centrifuged without the desired cell fraction being obtained. The extraction then takes place only shortly before centrifugation ends. The present invention also includes one only partial recovery of the desired cell fraction during centrifugation. So one can Part of the desired cell fraction obtained during the centrifugation of the mixture another part after centrifugation has ended. As a further alternative, the Centrifuge in between to stop the desired cell fraction or a Remove part of it, and then continue centrifuging to complete the centrifugation break up.

Das Zentrifugationsgefäß kann beispielsweise aufgebaut sein, wie es schematisch in Fig. 4 dargestellt ist. Es umfaßt in dieser Ausführungsform einen axialen Einlaß/Auslaß (1) für die zu verarbeitende Flüssigkeit bzw. für die verarbeiteten Flüssigkeitskomponenten. Der Einlaß/Auslaß (1) führt zu einem Trennungsraum (2) veränderbaren Rauminhalts, in dem die zentrifugale Verarbeitung der biologischen Flüssigkeit stattfindet. Die Zentrifugation/Rotation erfolgt um die zentrale Längsachse des Gefäßes. Das Gefäß enthält ein bewegbares Glied (3), üblicherweise einen Kolben, dessen Bewegung den Rauminhalt des Trennungsraums (2) verändert, wobei das Glied (3) innerhalb des Gefäßes bewegt werden kann, um eine gewählte Menge an zu verarbeitender Flüssigkeit vor oder während der zentrifugalen Verarbeitung über den Einlaß (1) in den Trennungsraum (2) hereinzunehmen und während der zentrifugalen Verarbeitung über den Auslaß (1) die verarbeiteten biologischen Flüssigkeitskomponenten (4, 5, 6) aus dem Trennungsraum hinauszudrücken. Vorzugsweise ist das bewegbare Glied ein Kolben, der in dem Zentrifugationsbehältnis so angeordnet ist, daß er flüssigkeitsdicht bewegt werden kann. The centrifugation vessel can be constructed, for example, as is shown schematically in FIG. 4. In this embodiment, it comprises an axial inlet / outlet ( 1 ) for the liquid to be processed or for the processed liquid components. The inlet / outlet ( 1 ) leads to a separable space ( 2 ) changeable volume in which the centrifugal processing of the biological fluid takes place. The centrifugation / rotation takes place around the central longitudinal axis of the vessel. The vessel contains a movable member ( 3 ), usually a piston, the movement of which changes the volume of the separation space ( 2 ), wherein the member ( 3 ) can be moved within the vessel to a selected amount of liquid to be processed before or during the centrifugal processing via the inlet ( 1 ) to take into the separation space ( 2 ) and during the centrifugal processing via the outlet ( 1 ) to press the processed biological fluid components ( 4 , 5 , 6 ) out of the separation space. The movable member is preferably a piston which is arranged in the centrifugation container in such a way that it can be moved in a liquid-tight manner.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Zentrifugation demnach in einem Zentrifugationsbehältnis mit variablem Rauminhalt durchgeführt, wobei der Rauminhalt erhöht wird, um eine gewählte Menge des zu verarbeitenden Gemisches aufzunehmen, und erniedrigt wird, um die gewünschte Zellfraktion aus dem Zentrifugationsbehältnis zu drücken. In one embodiment of the method according to the invention, centrifugation accordingly carried out in a centrifugation container with variable volume, wherein the volume is increased by a selected amount of the mixture to be processed record, and is lowered to the desired cell fraction from the Press centrifugation container.

Eine genaue Beschreibung derartiger Behältnisse kann EP 0 912 250 B1 entnommen werden. A precise description of such containers can be found in EP 0 912 250 B1 become.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines derartigen Zentrifugationsbehältnisses zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung eines hohlen Zentrifugationsbehältnisses, das um eine Drehachse drehbar ist und einen axialen Einlaß/Auslaß für die zu verarbeitende Mischung und die verarbeiteten Bestandteile der Mischung hat, wobei das Zentrifugationsbehältnis ein bewegbares Glied enthält, das einen Trennungsraum variabler Größe zur Aufnahme der Mischung definiert und bewegbar ist, um eine gewählte Menge der zu verarbeitenden Mischung durch den Einlaß in den Trennungsraum aufzunehmen und verarbeitete Bestandteile der Mischung während der Zentrifugation durch den Auslaß aus dem Trennungsraum herauszudrücken, zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Vorzugsweise wird dabei ein allgemein zylindrisches Zentrifugationsgefäß verwendet, dessen bewegbares Glied ein Kolben ist, der in dem Zentrifugationsbehältnis so angeordnet ist, daß er flüssigkeitsdicht bewegt werden kann. Another aspect of the invention is the use of such Centrifugation container for performing the method according to the invention. In particular, the invention relates to the use of a hollow Centrifugation container which is rotatable about an axis of rotation and an axial Inlet / outlet for the mixture to be processed and the processed components of the Mixture has, wherein the centrifugation container contains a movable member that one Separation space of variable size for receiving the mixture is defined and movable, by a selected amount of the mixture to be processed through the inlet into the Separation room to record and processed components of the mixture during the Press centrifugation through the outlet out of the separation chamber to Implementation of the method according to the invention. A general is preferred cylindrical centrifugation vessel is used, the movable member of which is a piston which is arranged in the centrifugation container so that it can be moved in a liquid-tight manner can.

Durch die Zentrifugation werden die Zellen nach Dichte aufgetrennt. Hierbei muß kein zusätzliches Dichtegradientenmaterial verwendet werden, es kann aber dennoch eingesetzt werden. Die mit "Beads" beladenen Zielzellen haben in der Regel eine deutlich höhere Dichte als die unbeladenen Zellen und können somit einfacher und schneller abgetrennt werden. Die nicht-beladenen therapeutischen Zellen stehen nach der Auftrennung für die weitere Verwendung zur Verfügung. The cells are separated by density by centrifugation. Here no additional density gradient material can be used, but it can still be used become. The target cells loaded with "beads" generally have a significantly higher one Density than the unloaded cells and can therefore be separated more easily and quickly become. The unloaded therapeutic cells stand for the after separation further use available.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Anreicherung von Zellen zur Verfügung, das die schnelle Gewinnung von gewünschten Zellen ermöglicht. Weiterhin wird die effiziente Anreicherung von therapeutischen Zellen bzw. die Abreicherung von zu depletierenden Zellen in einem einzigen Schritt ermöglicht. Außerdem ist in einem einzigen Schritt die Depletion mehrerer Zellpopulationen möglich. Das Verfahren läßt sich vorteilhafterweise in einem geschlossenen System, das vorzugsweise eine Wegwerfgarnitur (zur einmaligen Verwendung) enthält, durchführen, was steriles Arbeiten ermöglicht. Das Verfahren läßt sich als Software-gesteuertes Verfahren durchführen, somit ist eine hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei geringer Benutzerabhängigkeit gewährleistet. The present invention provides a method for cell enrichment, which enables the rapid extraction of desired cells. Furthermore, the efficient enrichment of therapeutic cells or depletion of depleting cells in a single step. It is also in one Step depletion of several cell populations possible. The procedure can be advantageously in a closed system, preferably a disposable set contains (for single use), which enables sterile work. The Process can be carried out as a software-controlled process, so it is a high one Reproducibility of the results guaranteed with little user dependency.

Die Anreicherung der Zellen erfolgt durch negative Selektion, daher befinden sich keine Antikörper bzw. "Beads" in der gewünschten Zellfraktion. Dies ist insbesondere wichtig bei therapeutischen Zellen, die in den Patienten zurückgegeben werden. Die gewonnenen Zellen werden darüber hinaus in ihren Eigenschaften wie Vitalität, Antigenexpressionsmusterfunktion usw. nicht verändert und stehen anschließend für weitere Verfahren, beispielsweise Expansion, Gentransfer, Differenzierung usw. unmittelbar zur Verfügung. The cells are enriched by negative selection, so there are none Antibodies or "beads" in the desired cell fraction. This is particularly important at therapeutic cells that are returned to the patient. The won Cells are also characterized in their properties such as vitality, Antigen expression pattern function, etc. are not changed and then stand for other processes, such as expansion, gene transfer, differentiation, etc. immediately to disposal.

Die Fig. 1 bis 3 zeigen Ergebnisse der Beispiele 1 bis 3. Figs. 1 to 3 show results of Examples 1 to 3.

Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung eines Zentrifugationsgefäßes, das erfindungsgemäß verwendet werden kann. Das Gefäß ist im wesentlichen zylinderförmig und umfaßt einen axialen Einlaß/Auslaß (1). Die Zentrifugation/Rotation erfolgt um die Längsachse, wie es im oberen Teil der Figur angedeutet ist, so daß ein Gradient von der zentralen Längsachse des Gefäßes bis an dessen Außenwand aufgebaut wird. Dadurch erfolgt die Trennung der Flüssigkeitskomponenten (z. B. 4, 5, 6). Noch während der Zentrifugation kann das bewegbare Glied (3) von unten (dem vom Einlaß/Auslaß (1) entfernt gelegenen Gefäßboden) nach oben in Richtung des Einlaß/Auslasses (1) bewegt werden. Dadurch werden die Flüssigkeitskomponenten (4, 5, 6) nacheinander durch den Auslaß (1) herausgedrückt und können entsprechend separiert werden. Komponente (4) könnte z. B. die gewünschte Zellfraktion sein, Komponente (6) könnte die unerwünschten Zellen, die an Partikel gebunden sind, enthalten. Die Doppelpfeile im unteren Teil der Figur sind keine Bestandteile des Gefäßes, sondern sollen die Beweglichkeit des bewegbaren Glieds (3) andeuten. Durch Bewegung des bewegbaren Glieds (3) kann der Rauminhalt des Trennungsraums (2) verändert werden. Fig. 4 shows a schematic representation of a centrifugation vessel, which can be used according to the invention. The vessel is substantially cylindrical and has an axial inlet / outlet ( 1 ). The centrifugation / rotation takes place around the longitudinal axis, as indicated in the upper part of the figure, so that a gradient is built up from the central longitudinal axis of the vessel to its outer wall. This separates the liquid components (e.g. 4, 5, 6). Even during the centrifugation, the movable member (3) from below (the remote from the inlet / outlet (1) the vessel bottom) upwards in the direction of the inlet / outlet (1) to be moved. As a result, the liquid components ( 4 , 5 , 6 ) are pushed out through the outlet ( 1 ) one after the other and can be separated accordingly. Component ( 4 ) could e.g. B. the desired cell fraction, component ( 6 ) could contain the unwanted cells bound to particles. The double arrows in the lower part of the figure are not part of the vessel, but are intended to indicate the mobility of the movable member ( 3 ). The volume of the separation space ( 2 ) can be changed by moving the movable member ( 3 ).

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. The following examples are intended to explain the invention in more detail.

example 1

Als Ausgangsmaterial wurde Nabelschnurblut verwendet. Zunächst wurde der Anteil der B- Zellen im Ausgangsmaterial bestimmt (Fig. 1a bis 1e). Cord blood was used as the starting material. First, the proportion of B cells in the starting material was determined ( Fig. 1a to 1e).

Vor Inkubation mit Antikörper-konjugierten magnetischen "Beads" wurde der Anteil der B- Zellen im Nabelschnurblut bestimmt. Fig. 1a zeigt die Verteilung der Zellen bezüglich forward scatter (FSC; Größenverteilung) und side scatter (SSC; Granularität) sowie die zugehörige Negativkontrolle (Fig. 1b). Der Anteil der CD10⁺-Zellen im Ausgangsmaterial lag im Bereich der Nachweisgrenze (< 0,1%) (Fig. 1c), der Anteil der CD19⁺- bzw. CD20⁺- B-Zellen betrug 7,3% bzw. 7,9% (Fig. 1d bzw. 1e). The proportion of B cells in the umbilical cord blood was determined before incubation with antibody-conjugated magnetic "beads". FIG. 1 a shows the distribution of the cells with respect to forward scatter (FSC; size distribution) and side scatter (SSC; granularity) and the associated negative control ( FIG. 1 b). The proportion of CD10 ⁺ cells in the starting material was in the range of the detection limit (<0.1%) ( Fig. 1c), the proportion of CD19 ⁺ or CD20 ⁺ - B cells was 7.3% or 7, 9% ( Fig. 1d or 1e).

Example 2

Das gleiche Ausgangsmaterial wie in Beispiel 1 wurde mit CD10-, CD19- und CD20- Antikörper-konjugierten "Beads" inkubiert und anschließend mit dem Biosafe Sepax™ prozessiert. Dazu wurde 50 ml Nabelschnurblut (ca. 3,5 × 10⁸ Zellen) für 15 Minuten mit 1,4 × 10⁹ "Beads" inkubiert. The same starting material as in Example 1 was incubated with CD10, CD19 and CD20 antibody-conjugated "beads" and then processed with the Biosafe Sepax ™. For this purpose, 50 ml of umbilical cord blood (approx. 3.5 × 10 ⁸ cells) were incubated for 15 minutes with 1.4 × 10 ⁹ “beads”.

Der Dichtegradient wurde während der 7-minütigen Zentrifugation mit einer Zentrifugationsgeschwindigkeit von 600 g aufgebaut. The density gradient was determined during the 7-minute centrifugation with a Centrifugation speed of 600 g built up.

Anschließend erfolgte die Separation in Plasma, Erythrozytenkonzentrat und "Buffy Coat" (Fraktion der mononukleären Zellen). Es wurde der Anteil der verbliebenen B-Zellen in den einzelnen Fraktionen bestimmt. The separation was then carried out in plasma, erythrocyte concentrate and "buffy coat" (Fraction of mononuclear cells). The proportion of remaining B cells in the determined individual fractions.

Das Ergebnis ist in Fig. 2 gezeigt. Der Anteil der CD10⁺-Zellen lag nach wie vor im Bereich der Nachweisgrenze (0,2%) (Fig. 2c), während der Anteil der CD19⁺- bzw. CD20⁺-B-Zellen auf 1,9% bzw. 2,2% erniedrigt war (Fig. 2d bzw. 2e). Tabelle 2 FACS-Analyse vor und nach Depletion der B-Zellen

The result is shown in Fig. 2. The proportion of CD10 ⁺ cells was still in the range of the detection limit (0.2%) ( Fig. 2c), while the proportion of CD19 ⁺ and CD20 ⁺ -B cells was 1.9% and 2, respectively , 2% was reduced ( Fig. 2d and 2e). Table 2 FACS analysis before and after depletion of the B cells

Beispiel 3Example 3

Es wurde eine Depletion von B-Zellen wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Zentrifugation für 7 Minuten bei 1250 g erfolgte. Depletion of B cells was carried out as described in Example 2, using the Exception that the centrifugation was carried out at 1250 g for 7 minutes.

Das Ergebnis ist in Fig. 3 gezeigt. Fig. 3a zeigt die Größenverteilung bzw. Granularität der Zeilen, in Fig. 3b ist die zugehörige Negativkontrolle (Fig. 1b) zu sehen. Der Anteil der CD10⁺-Zellen lag nach wie vor im Bereich der Nachweisgrenze (0,1%) (Fig. 3c), der Anteil der CD19⁺- bzw. CD20⁺-B-Zellen war auf 6,1% bzw. 7,5% reduziert (Fig. 3d bzw. 3e). The result is shown in FIG. 3. FIG. 3a shows the size distribution or granularity of the lines, FIG. 3b shows the associated negative control ( FIG. 1b). The proportion of CD10 ⁺ cells was still in the range of the detection limit (0.1%) ( Fig. 3c), the proportion of CD19 ⁺ and CD20 ⁺ -B cells was 6.1% and 7, respectively , 5% reduced ( Fig. 3d or 3e).

Die nicht erfolgte bzw. nur geringe Abreicherung der B-Zellen scheint damit zusammenzuhängen, daß die Bindung Zelle-Primärantikörper-Sekundärantikörper-Beads höheren Zentrifugationsgeschwindigkeiten nicht standhält und zerbricht. The lack of or only slight depletion of the B cells thus appears related to that binding cell-primary antibody-secondary antibody-beads does not withstand higher centrifugation speeds and breaks.

Claims

1. A method for enriching cells, characterized in that

a) a composition containing a mixture of different cell types in contact with particles that bind to a subpopulation of unwanted cells in the composition;

b) centrifuging the mixture of cells and particles; and

c) the desired cell fraction wins before centrifugation is complete.

2. The method according to claim 1, characterized in that the composition, which contains a mixture of different cell types is selected from the group consisting of umbilical cord blood, peripheral blood, leukapheresate and bone marrow.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the density of Particle is higher than the density of the cells to be enriched.

4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the particles are essentially spherical.

5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the particles have a diameter of 2.8 to 5 microns.

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that that the particles are essentially metal particles, in particular made of iron and / or Nickel.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that that molecules that bind to antigens on the surface of the unwanted cells can be firmly attached to the surface of the particles.

8. The method according to claim 7, characterized in that the molecules which Antigens can bind to the surface of the unwanted cells are selected from the group consisting of antibodies, ligands and receptors.

9. The method according to claim 7 or 8, characterized in that antibodies which the particles are coupled, can bind to other antibodies, which in turn to antigens can bind to the surface of the unwanted cells.

10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the centrifugation is carried out on average at 200 to 800 g.

11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that centrifugation is carried out for at least 5 minutes before the desired one Cell fraction is obtained.

12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that that the centrifugation in a centrifugation container with a variable volume is carried out, wherein the volume is increased to a selected amount of processing mixture, and is lowered to the desired To push the cell fraction out of the centrifugation container.

13. Using a hollow centrifugation container that is about an axis of rotation is rotatable and an axial inlet / outlet for the mixture to be processed and the has processed components of the mixture, the centrifugation container contains a movable member which contains a separation space of variable size for receiving the Mixture is defined and movable to a selected amount of the processed Mixture received through the inlet into the separation space and processed Components of the mixture during centrifugation through the outlet from the Push out separation space for performing the method according to claim 12.

14. Use according to claim 13, characterized in that the Centrifugation container is a generally cylindrical centrifugation container, the movable member is a piston which is arranged in the centrifugation container so that it can be moved liquid-tight.