DE102015013851B3 - Method for improved magnetic marking of biological materials - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Method verspricht eine hohe magnetische Beladungsdichte von Nanopartikeln auf einem biologischen Zielmaterial mit deutlich weniger Zeit- und Kostenaufwand. Die Methode erlaubt die Verwendung geringerer magnetische Partikelkonzentrationen und es genügt in einigen Fällen eine einfache Dauermagnetanordnung zur magnetischen Abscheidung. Die verbesserte magnetische Markierung wird durch aktive Erhöhung der Kollision und damit Assoziation der Reaktionspartner gelöst. Dabei werden die magnetischen Partikel in kontrollierter Art durch den Einfluss eines magnetischen Feldgradienten in ständiger Bewegung und Richtungsänderung innerhalb eines begrenzten Volumen gehalten. Das biologische Material wird dabei nicht bewegt wodurch erhöhte bzw. wiederholte Kollisionen erreicht wird. Die Methode findet generelle Anwendung in der magnetischen Zellseparation, wie zum Beispiel direkte und indirekte positive Selektion von Leukozytsubpopulationen. Die Methode kann automatisiert werden, erlaubt einen höheren Probendurchsatz und kann unter Anderem zu schneller und erhöhter Depletion von unerwünschten Zellen verwendet werden. Diese Verbesserung findet besondere Anwendung in der negativen Anreicherung von zirkulierenden Tumorzellen.The present method promises a high magnetic loading density of nanoparticles on a biological target material with significantly less time and expense. The method allows the use of lower magnetic particle concentrations and in some cases a simple permanent magnet arrangement for magnetic deposition is sufficient. The improved magnetic labeling is achieved by actively increasing the collision and thus associating the reactants. The magnetic particles are kept in a controlled manner by the influence of a magnetic field gradient in constant motion and change of direction within a limited volume. The biological material is not moved thereby increased or repeated collisions is achieved. The method has general application in magnetic cell separation, such as direct and indirect positive selection of leukocyte subpopulations. The method can be automated, allows higher sample throughput, and can be used, among other things, for faster and increased depletion of unwanted cells. This improvement finds particular application in the negative accumulation of circulating tumor cells.
Description
Technisches GebietTechnical area
Das technische Gebiet der Erfindung betrifft die spezifische Interaktionen zur Bindung von magnetischen Partikeln an nichtmagnetischen biologischen Materialien, und deren Separation und Isolation. Die Erfindung betrifft insbesondere eine Methode zur beschleunigten Assoziation von magnetischen Partikel mit biologischem Material, sowie zur Erhöhung der Partikeldichte auf dem biologischen Material.The technical field of the invention relates to the specific interactions for binding magnetic particles to non-magnetic biological materials, and their separation and isolation. In particular, the invention relates to a method for accelerated association of magnetic particles with biological material and for increasing the particle density on the biological material.
Stand der TechnikState of the art
Im Bereich der biologisch-medizinischen Forschung ist die Abscheidung von biologischen Materialen aus einer heterogenen Partikelsuspension fuer verschiedenste Analyseverfahren von grosser Bedeutung. Bei den Substanzen von Interesse, im folgenden benannt Zielsubstanz, handelt es sich zum Beispiel um Zellen, Zellfragmente, Bakterien, Viren, Proteine, oder Nukleinsäuren. Schwache oder keine Trennbarkeit zwischen Zielsubstanz und dem Rest wird artifiziell durch gezieltes Markieren der Zielsubstanz ausgeglichen.In the field of biological medical research, the separation of biological materials from a heterogeneous particle suspension is of great importance for a wide variety of analytical methods. The substances of interest, in the following named target substance, are, for example, cells, cell fragments, bacteria, viruses, proteins, or nucleic acids. Weak or no separability between the target substance and the rest is artificially compensated by targeted labeling of the target substance.
Ein bewährtes Abscheidungsverfahren basiert auf dem magnetischen Separationsprinzip. Die häufigste Anwendung dabei ist die Aufreinigung von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen oder deren Zellfragmenten. Zur Trennung von nichtmagnetischen Substanzen werden Zielsubstanzen durch das Anheften von synthetischen magnetischen Partikeln mittels biospezifischer Affinitätsreaktion markiert und demnach magnetisiert. Dieser Prozess soll im folgenden als magnetische Markierung benannt werden und beschreibt die Assoziation von charakteristischen Strukturen der Zielsubstanz, wie zum Beispiel Antigene, Haptene usw. mit einem spezifischen Bindungspartner, wie zum Beispiel monoklonale Antikörper oder dessen Fragmente, spezifische Bindungsproteine (ProteinA, Biotin, Streptavidin), Lectin und viele Weitere. Im Speziellen ist die Art der biospezifischen Bindung von nicht-kovalenter Natur, was eine schnelle Reaktion verspricht und besonders vorteilhaft fuer die Bindung zweier Reaktionsteilnehmer mit deutlichem Konzentrationsunterschied ist.A proven deposition method is based on the magnetic separation principle. The most common application is the purification of eukaryotic and prokaryotic cells or their cell fragments. For the separation of non-magnetic substances, target substances are labeled by the attachment of synthetic magnetic particles by biospecific affinity reaction and thus magnetized. This process will hereinafter be referred to as magnetic labeling and describes the association of characteristic structures of the target substance, such as antigens, haptens, etc. with a specific binding partner, such as monoclonal antibodies or fragments thereof, specific binding proteins (protein A, biotin, streptavidin ), Lectin and many more. In particular, the nature of the biospecific binding is of non-covalent nature, which promises a rapid reaction and is particularly advantageous for the binding of two reactants with a marked difference in concentration.
Der spezifische Bindungspartner oder mehrere spezifische Bindungspartner sind üblicherweise kovalent mittels funktionaler Gruppen auf dem magnetischen Partikel gebunden. Der Verwendungszweck und die Präperation von magnetischen Partikeln wurden zum Beispiel ausgiebig in den Patenten
Magnetische Partikel lassen sich in Abhängigkeit ihrer Grösse grob in Nano- und Mikropartikel eingruppieren. Magnetische Nanopartikel (30 nm bis 150 nm) werden auf Grund ihrer Eigenschaften auch als Ferrofluide bezeichnet. Derartige Partikelsuspensionen bilden stabile Kolloide aus, unterliegen der Brownschen Molekularbewegung und sedimentieren auch über längere Zeiträume (Monate bis Jahre) nicht. Nanopartikel sind daher sehr beweglich in Lösung und bilden hohe reaktive Oberflächen aus, versprechen demnach im Vergleich zu Mikropartikeln (> 0.2 um) effizientere magnetische Markeriung und Abscheidung und schnellere Reaktionskinetiken, wie zum Beispiel erwähnt in dem Patent
Die Qualität der magnetischen Abscheidung ist im wesentlichen durch die Abscheidungseffizienz und den Aufreinigungsgrad definiert und ist abhängig von der Anzahl der zu separierenden Zielsubstanzen, die Reaktivität der magnetischen Partikel, deren Dichte oder Konzentration im Inkubationsmedium, die zur effektiven Abscheidung erforderliche magnetische Mindestbeladung auf der Zelle, der Grad der unspezifischen Bindung, die Separationstechnologie, die Geometrie des Separations- bzw. Inkubationsbehälter und die Methode der magnetische Markierung.The quality of the magnetic deposition is essentially defined by the deposition efficiency and the degree of purification and is dependent on the number of target substances to be separated, the reactivity of the magnetic particles, their density or concentration in the incubation medium, the minimum magnetic charge on the cell required for effective deposition, the degree of non-specific binding, the separation technology, the geometry of the separation or incubation container and the method of magnetic marking.
Bedingt durch ihre geringe Anzahl an magnetischen Kristallen bilden Nanopartikel in Anwesenheit eines Magnetfeldes im Gegensatz zu Mikropartikeln ein schwaches magnetisches Moment aus. Aus diesem Grund ist die magnetische Abscheidung unter Verwendung von Nanopartikeln nur effizient für sogenannte hochgradient-Magnetabscheidungsverfahren (high gradient magnetic separation, HGMS), welche in interne und externe Gradientensysteme unterschieden werden. Höchste magnetische Effizienz erreichen die intrinsischen Systeme, beschrieben unter Anderem in den Patenten
Mängel bisher bekannter AusführungenDeficiencies of previously known designs
Die Ansprüche an die Zellseparation steigen mit dem Voranschreiten in der Krebs- und Stammzellforschung. Die im Vorhergehenden beschriebenen Vorteile von magnetischen Nanopartikeln gegenüber den Mikropartikeln offenbaren sich in der Abscheidung einzelner Zellen aus Million von Anderen. Für die effiziente magnetischen Markierung und damit Abscheidung häufiger Zellpopulationen wie zum Beispiel Monozyten aus einer Suspension von mononuklearen Leukozyten ist die Anzahl verfügbarer magnetischer Partikeln pro Zielzelle entscheident, jedoch rückt die Partikelkonzentration für äusserst seltene Zellen wie zum Beispiel zirkulierende Tumorzellen im peripheren Blut in den Vordergrund. Im allgemein gilt, je seltener eine Zielsubstanz desto grösser ist die Probenmenge, was ein höheres Inkubationsvolumen und damit eine grösser Menge an magnetischen Partikeln bedingt. Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit und des Reinheitsanspruches muss aber gelten, die eingebrachte Partikelmenge so niedrig wie möglich zu halten. Für die magnetische Markierung und Abscheidung von Zellen wurde im Vorhergehenden die Verwendung von Nanopartikeln in Bezug auf Wirtschaflichkeit, Abscheidungseffizienz, Reinheitsgrad und Reaktionsdauer unter Verwendung sehr hoher magnetischen Feldgradientensystemen wie zum Beispiel der intrinsichen HGMS als vorteilig beschrieben. Jedoch erzeugen Nanopartikel wie beschrieben von Owen et al. (
Das Patent
Das Patent
Neben Wirtschaftlichkeit und Abscheidungseffizienz ist es bei der magnetischen Abscheidung von lebenden Zellen besonders wichtig möglichst wenig Stress für Zellen zu produzieren. Stress kann physikalischer Natur sein, wie im Fall bei zu hoher magnetischer Anziehungskraft, so dass es zu Membranschäden der Zelle oder gar zu Zelllyse während der magnetischen Abscheidung kommen kann. Desweiteren schreiben viele Inkubationsprotokolle die Verwendung von mindestens einem Zentrifugationsschritt vor. Die Gegenwart von magnetischen Partikeln stellt ebenfalls ein Stressfaktor dar und kann zu Partikelinternalisierung führen. Zusätzlich findet die Inkubation unter für die Zellen relatif lebensunfreundlichen Bedingungen statt. Im Falle der zirkulierenden Tumorzellanalyse können stressanfällige Zellen zusätzlich vernichtet werden und damit die Sensitivität etwaiger Testverfahren verringern. Es sollte daher ein Ziel der Experimentoptimierung sein, möglichst schnell und hoch-effizient zu arbeiten. Die magnetische Markierung, so wie die magnetische Abscheidung ist für bisherige Protokolle bis auf wenige Anpassungen zeitaufwendig. Die Erfinder beabsichtigen eine verbesserte Methode zu der magnetischen Markierung vorzustellen, um höhre Abscheidungs- bzw. Aufreinigungseffizienz und wesentlich kürzere Assaydauer zu erzielen.In addition to economy and deposition efficiency, it is particularly important in the magnetic separation of living cells to produce as little stress as possible for cells. Stress can be of a physical nature, as in the case of too high magnetic attraction force, so that it can lead to membrane damage of the cell or even cell lysis during the magnetic deposition. Furthermore, many incubation protocols dictate the use of at least one centrifugation step. The presence of magnetic particles is also a stressor and can lead to particle internalization. In addition, incubation takes place under conditions which are relatively unfriendly to the cells. In the case of circulating tumor cell analysis, stress-susceptible cells can additionally be destroyed and thus reduce the sensitivity of any test procedures. It should therefore be an aim of the experiment optimization to work as fast as possible and highly efficiently. The magnetic marking, as well as the magnetic separation is time-consuming for previous protocols except for a few adjustments. The inventors intend to introduce an improved method of magnetic labeling to achieve higher deposition efficiency and significantly shorter assay time.
Problemstellungproblem
Der im Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung liegt das Problem zu Grunde, Nanopartikel in Assoziation mit Dauermagnetabscheidern zwecks wirtschaftlicher, schneller und effizienter magnetischer Markierung und Abscheidung von biologischen nichtmagnetischen Materialien zu verwenden. Dies soll durch Erhöhung der magnetischen Beladungsdichte auf der Zielsubstanzoberfläche während der magnetischen Markierung erreicht werden.The invention specified in
Lösung des Problemsthe solution of the problem
Das Problem der Reduzierung der Assaydauer und der Erhöhung der magnetischen Beladungsdichte auf nichtmagnetischen biologischen Material wird durch die im Patentanspruch 1 aufgeführte Methode zur Erhöhung der Kollision und damit Assoziation der Reaktionspartner gelöst. Dabei werden die magnetischen Partikel in kontrollierter Art durch den Einfluss eines magnetischen Feldgradienten in ständiger Bewegung und Richtungsänderung innerhalb eines begrenzten Volumen gehalten. Das biologische Material wird dabei nicht bewegt wodurch erhöhte Kollisionen erreicht wird.The problem of reducing the assay time and increasing the magnetic loading density on non-magnetic biological material is solved by the method set forth in
Vorteile der ErfindungAdvantages of the invention
Aus den vorangegangen Erläuterungen wird ersichtlich, dass bereits Methoden zur Verbesserung der magnetischen Markierung benannt worden, die nützlich jedoch nicht hinreichend optimal sind. Die vorliegende Method verspricht hohe magnetische Beladungsdichte von Nanopartikeln mit deutlich weniger Zeit- und Kostenaufwand. Unter Anwendung dieser Methode genügt in einigen Fällen eine einfache Dauermagnetanordnung zur magnetischen Abscheidung. Die verbesserte magnetische Markierungsmethode kann automatisiert werden, erlaubt einen höheren Probendurchsatz und kann unter Anderem zu schneller und erhöhter Depletion von unerwünschten Zellen verwendet werden. Diese Verbesserung findet besondere Anwendung in der negativen Anreicherung von zirkulierenden Tumorzellen.From the preceding explanations, it will be seen that methods for improving the magnetic mark have already been named, but which are useful but not sufficiently optimal. The present method promises high magnetic loading density of nanoparticles with significantly less time and expense. Using this method, a simple permanent magnet arrangement for magnetic deposition is sufficient in some cases. The improved magnetic labeling method can be automated, allows higher sample throughput, and can be used, among other things, for faster and increased depletion of unwanted cells. This improvement finds particular application in the negative accumulation of circulating tumor cells.
Weitere Ausgestaltung der ErfindungFurther embodiment of the invention
Zahlreiche Ansätze zur Verbesserung der magnetischen Abscheidbarkeit von biologischen Materialien wurden berichtet. Verbesserungen beziehen sich auf die Herstellung von magnetischen Partikel (
Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist in dem Patentanspruch 2 bis 7 für die Anwendung der Methode zur verbesserten magnetischen Markierung unter Verwendung von Nanopartikeln angegeben. Das der Erfindung zugehörige Verfahren umfasst zwei technische Lösungen. An advantageous embodiment of the invention is specified in the
In einer Variante werden das Inkubationsbehältnis und die Quelle des Magnetfeldgradienten in unmittelbare Nähe zueinander gebracht, so dass die magnetischen Partikel unter Einfluss des magnetischen Feldes stehen. In dieser Anordnung wird das Inkubationsbehältnis in axialer Rotation gedreht. Die magnetischen Partikel werden in der Inkubationsuspension in oszillierender bzw. kreisender Bewegungsart relatif zu dem biologischen Material durch wiederholte und zügige Drehbewegung des Inkubationsbehältnisses um 180 Grad und einer für die magnetische Partikelbewegung ausreichend langen Arretierungsdauer bzw. durch konstante Drehung des Inkubationsbehältnisses um 360 Grad in Gegenwart des positionsfixierten magnetischen Feldes bewegt. Das magnetische Feld sollte dabei für die magnetische Ansprechbarkeit der magnetischen Partikel einen ausreichend starken magnetischen Gradienten aufweisen und kann durch einen Dauer- oder Elektromagneten erzeugt werden.In a variant, the incubation container and the source of the magnetic field gradient are brought into close proximity to each other so that the magnetic particles are under the influence of the magnetic field. In this arrangement, the incubation container is rotated in axial rotation. The magnetic particles are in the incubation suspension in oscillating or circular motion relative to the biological material by repeated and rapid rotation of the incubation container by 180 degrees and a sufficiently long for the magnetic particle movement Arretierungsdauer or by constant rotation of the incubation container by 360 degrees in the presence of position-fixed magnetic field moves. The magnetic field should have a sufficiently strong magnetic gradient for the magnetic responsiveness of the magnetic particles and can be generated by a permanent or electromagnet.
Ähnlich wie in der ersten Variante ist in der zweiten technischen Lösung das Inkubationsbehältnis in direkter Nähe zu der magnetischen Quelle bzw. Quellen positioniert. Die magnetischen Quellen, so wie das Inkubationsbehältnis werden nicht bewegt. Die oszillierende bzw. kreisende Bewegungsart der magnetischen Partikel relatif zu dem biologischen Material wird durch mindestens zwei veränderbaren magnetischen Feldern, erzeugt durch Elektromagnete in konzentrischer, gleichwinkliger Anorndung um das Inkubationsbehältnis bewirkt. Die oszillierende bzw. kreisende Bewegung der magnetischen Partikel relatif zu dem biologischen Material entsteht, indem stets nur einer der magnetischen Felder wechselseitig, bzw. reihum für kurze Dauer wirksam ist.Similar to the first variant, in the second technical solution, the incubation container is positioned in close proximity to the magnetic source or sources. The magnetic sources, such as the incubation container are not moved. The oscillatory motion of the magnetic particles relative to the biological material is effected by at least two variable magnetic fields generated by electromagnets in concentric equiangular engagement about the incubation vessel. The oscillating or circular movement of the magnetic particles relative to the biological material is formed by always only one of the magnetic fields mutually, or in turn for a short time is effective.
Die Erfindung umfasst eine Methode zur verbesserten magnetischen Markierung von biologischen Material, wie zum Beispiel Zellen oder Zellfragmenten. Es soll deutlich gemacht werden, dass durch die oszillierende oder kreisende Bewegungsart der magnetischen Partikel eine gesteigerte Kollision mit dem biologischen Material entsteht, was erhöte Bindungsreaktionskinetiken zur Folge hat und zu einer erhöhten magnetischen Beladungsdichte führt. Es wird damit eine hohe magnetische Abscheidbarkeit in kürzerer Zeit erreicht.The invention includes a method for improved magnetic labeling of biological material, such as cells or cell fragments. It should be made clear that the oscillating or orbiting movement of the magnetic particles results in an increased collision with the biological material, which results in increased binding reaction kinetics and leads to an increased magnetic loading density. It is thus achieved a high magnetic Abscheidbarkeit in a shorter time.
Untersuchungen zu Bindungsreaktionskinetiken unter Verwendung herkömmlicher magnetischer Markierung (Inkubation in Ruhelage) zwischen magnetischen Partikeln, ähnlich denen verwendet in dieser Arbeit und Blutzellen wie zum Beispiel Monozyten, zeigte eine starke Abhängigkeit der Bindungsreaktionsgeschwindigkeit und magnetischen Beladungsdichte von der magnetischen Partikelkonzentration im Bereich von 80 bis 320 ng/uL (Waseem W., Int. J. Mol. Sci. Int., 2014: 15). Höhere Partikelkonzentrationen zeigten ein exponentielles Bindungsverhalten, demnach eine anfänglich stark beschleunigte Bindungskinetik, die nach wenigen Minuten in Sättigung überging. Demnach ist eine Verbesserung in der magnetischen Markierung durch einfache Erhöhung der Partikelkonzentrationen zu erzielen. Die Erklärung liegt in der gesteigerten Kollisionsfrequenz und damit erhöhten Bindungswahrscheinlichkeiten.Studies on binding reaction kinetics using conventional magnetic labeling (quiescent incubation) between magnetic particles similar to those used in this work and blood cells such as monocytes showed a strong dependence of the binding reaction rate and magnetic loading density on the magnetic particle concentration in the range of 80 to 320 ng / uL (Waseem W., Int. J. Mol. Sci. Int., 2014: 15). Higher particle concentrations showed an exponential binding behavior, thus an initially strongly accelerated binding kinetics, which became saturated after a few minutes. Thus, an improvement in magnetic labeling can be achieved by simply increasing the particle concentrations. The explanation lies in the increased collision frequency and thus increased binding probabilities.
Die Erfindung zur Verbesserung der magnetischen Markierung zeigt gesteigerte Abscheidungsraten und deutet auf verbessertes Bindungsreaktionsverhalten hin. Die neue Beobachtung in Vergleichsexperimenten zu herkömmlicher Methodik war, dass das Abscheidungsverhalten mit der neuen Methode der herkömmlichen Methode unter Verwendung einer wesentlich höheren Konzentration ähnelte. Demnach wurde eine erhöhte Abscheidungseffizienz mit vergleichsweise geringerer Partikelkonzentration erzielt.The invention for improving magnetic marking shows increased deposition rates and indicates improved bonding response behavior. The new observation in comparison experiments to conventional methodology was that the deposition behavior with the new method was similar to the conventional method using a much higher concentration. Accordingly, an increased separation efficiency was achieved with comparatively lower particle concentration.
Eine weitere Beobachtung war, dass durch die Vermischung der Suspension nach Anwendung der neuen Markierungsmethode die Ausgangsituation sprich die anfängliche hohe Bindungsreaktionskinetik mit exponentieller Entwicklung wieder hergestellt wird. Damit ist die exponentielle Phase überdauerbar bis alle reaktiven Partikel restlos gebunden haben. Die Aufrechterhaltung der exponentiel verlaufenden Bindungsreaktionskinetik führt zu äußerst effzienter magnetischer Markierung. Es ergibt sich somit ein Inkubationsprotokoll bestehend aus der Wiederholung der kontrollierten Einflussnahme auf die magnetischen Partikel mittels eines inhomogenen magnetischen Feldes für eine Dauer von wenigen Minuten und der anschließenden Vermischung der Suspension.Another observation was that by mixing the suspension after application of the new labeling method, the initial situation, that is, the initial high binding reaction kinetics with exponential evolution, is restored. Thus, the exponential phase is persistent until all reactive particles have bound completely. The maintenance of exponential binding reaction kinetics results in highly efficient magnetic labeling. This results in an incubation protocol consisting of the repetition of the controlled influence on the magnetic particles by means of an inhomogeneous magnetic field for a period of a few minutes and the subsequent mixing of the suspension.
Die verbesserte magnetische Markierung ist durch das Zusammenspiel von Brownscher Molekularbewebung und erzwungener und wiederholter Kollision von magnetischen Partikel mit dem biologischen Material zu erklären. Im Fall herkömmlicher (in Ruhelage) magnetischen Markierung binden nur diejenigen magnetischen Partikel, befindlich in unmittelbarer Nähe zu der Zielsubstanz. Die Kollision entfernter Partikel unterliegt der Zufallsbewegung und ist daher von Dauer. Daraus wird ersichtlich, dass eine hohe Partikelkonzentration vorteilig für schnellere Bindungsreaktionskinetiken ist. Nachteilig ist allerdings im Fall grosser Inkubationsvolumina die hohe einzubringende Partikelmenge. Desweiteren ist die Konzentration der magnetischen Partikel durch die rasche Ausbildung von unspezifischer Bindung limitiert. Oftmals ist die Zielsetzung der magnetischen Separation von biologischen Material sowohl hohe Abscheidungsraten als auch hohe Aufreinigungsgrade zu erzielen. Der magnetische Markierungsschritt ist Wegbereiter zur Erfuellung dieser Zielsetzungen, jedoch stehen diese bezüglich der Partikelkonzentration im Widerspruch. Hohe magnetische Partikelkonzentrationen erzeugen hohe Abscheidungsraten, und niedrige Konzentrationen sind vorteilhaft fuer hohe Aufreinigungsgrade. Ein spezielles Beispiel hiefür ist die restlose Abscheidung von Zielmaterial für die negative Anreichung von zirkulierenden Tumorzellen. Diese Disziplin der magnetischen Zellseparation birgt grosses Potential für die Krebsdiagnostikfrüherkennung, da die Biologie (z. B. Alter, oder Rezeptortyp bzw. -dichte) oder Physik (Grösse, Dichte, Elastizität, oder elektrische Ladungsdichte der Membran) der Zelle von Interesse für die magnetische Abscheidung keine Rolle spielen und darüber hinaus weitestgehends unberührt bleibt. Allerdings müssen Depletionsraten von Leukozyten zwecks effizienter optischer oder molekularer Analyse oder Zellkultivierung deutlich 1000-fache Depletion überschreiten und der Tumorzellverlust möglichst gering bleiben. Derart hohe Depletionsraten bedingen den Einsatz von hohen magnetischen Partikelmengen und hoher Partikelkonzentration, was in Konflikt mit dem zu erwartenden geringen Verlust der Zellen von Interesse ist. Die hier offengelegte Methode löst teilweise diesen Konflikt durch die artifizielle Erhöhung der Kollision, was die Einstellung einer reduzierten magnetischer Partikelkonzentration erlaubt.The improved magnetic marking can be explained by the interaction of Brownian molecular motion and forced and repeated collision of magnetic particles with the biological material. In the case of conventional (at rest) magnetic labeling, only those magnetic particles are present in close proximity to the target substance. The collision of distant particles is subject to random motion and is therefore permanent. It can be seen that high particle concentration is beneficial for faster binding reaction kinetics. A disadvantage, however, in the case of large incubation volumes, the high amount of particles to be introduced. Furthermore, the concentration of magnetic particles is due to the rapid formation of nonspecific binding limited. Often, the goal of magnetic separation of biological material is to achieve both high rates of deposition and high levels of purification. The magnetic labeling step is a pioneer in meeting these objectives, but these are inconsistent with particle concentration. High magnetic particle concentrations produce high deposition rates, and low concentrations are beneficial for high purification levels. A specific example of this is the complete removal of target material for the negative enrichment of circulating tumor cells. This discipline of magnetic cell separation has great potential for the early diagnosis of cancer diagnostics, since the biology (eg age or receptor type or density) or physics (size, density, elasticity or electrical charge density of the membrane) of the cell of interest for the magnetic deposition plays no role and beyond remains largely untouched. However, leucocyte depletion rates must significantly exceed 1000-fold depletion for efficient optical or molecular analysis or cell culture and minimize tumor cell loss. Such high depletion rates require the use of high levels of magnetic particles and high particle concentration, which is in conflict with the expected low cell loss. The method disclosed here partially solves this conflict by artificially increasing the collision, allowing the setting of a reduced magnetic particle concentration.
Die Methode stellt eine Verbesserung bisheriger Ausführungen zur magnetischen Markierung dar. Die Anwendung der Verbesserung gemäss der Erfindung zur magnetischen Markierung von einzelnen Zellen, Zellpopulationen, Zellfragmenten, Bakterien, Viren und anderen nicht-magnetischen biologischen Materialien führt zu einer deutlich höheren magnetischen Beladungsdichte, effizientere Nutzung der magnetischen Partikel, und verkürzte Reaktionsdauer. Die effizientere Nutzung der Partikel bedeutet, eine höhere abscheidbare Menge der Zielsubstanz bei gegebener Menge und Konzentration an magnetischen Partikeln zu erzielen und ergibt sich aus der mehrfachen Wiederholung der erzwungenen Kollision der magnetischen Partikel mit gleichen Teilen des biologischen Materials, so dass die Bindungswahrscheinlichkeit einzelner Partikel deutlich erhöht wird.The method is an improvement on previous embodiments of the magnetic marking. The application of the improvement according to the invention for magnetic labeling of individual cells, cell populations, cell fragments, bacteria, viruses and other non-magnetic biological materials leads to a significantly higher magnetic loading density, more efficient use the magnetic particle, and shortened reaction time. The more efficient use of the particles means to obtain a higher amount of the target substance that can be deposited given the amount and concentration of magnetic particles, and results from the multiple repetition of the forced collision of the magnetic particles with equal parts of the biological material, so that the bonding probability of individual particles becomes significant is increased.
Die Zielsetzung der Verbesserung ist zum einen die deutliche Verkürzung der Gesamtdauer der Aufreinungsprozedur und zum Anderen die Anwendbarkeit von vereinfachten technischen Lösung zur magnetischen Abscheidung. Im Besonderen, werden trotz Verwendung von Nanopartikeln kompliziertere magnetische Abscheidungssysteme wie zum Beispiel intrinische hochgradient Magnetabscheidungssysteme unnötig gemacht und die Verkürzung der Gesamtdauer der magnetischen Markierung und Abscheidung auf bis zu 10 Minuten ermöglicht.The objective of the improvement is on the one hand the significant reduction of the total duration of the purification procedure and on the other hand the applicability of a simplified technical solution for magnetic separation. In particular, despite the use of nanoparticles, more complicated magnetic deposition systems, such as intrinsic high-gradient magnetic separation systems, are made unnecessary and the total duration of magnetic labeling and deposition reduced to up to 10 minutes.
Unzählige Anwendungsbereiche sind möglich welche einschließen aber nicht auf die im folgenden begrenzt sind, Zell separation, Proteinisolation, oder Bakterianisolation. Im Besondern ist die Aufreinigung von niedrigfrequenten Zellen mittels Depletion des Restes von großer Bedeutung.Countless applications are possible, including but not limited to, cell separation, protein isolation, or bacterial isolation. In particular, the purification of low-frequency cells by depletion of the rest of great importance.
Der Begriff biologische Zielsubstanz schließt alle biologischen Materialien ein, für die zwecks magnetischer Markierung die Möglichkeit zur Bindung mit einem spezifischen Bindungspartner besteht. Dabei erkennt der spezifische Bindungspartner eine molekulare Kontaktregion auf der Oberfläche der biologischen Zielsubstanz. Die vorgestellte Methode zur verbesserten magnetischen Markierung zielt geeignetweise auf nichtmagnetische biologische Materialien ab, die grösser sind als die magnetischen Partikel. Grundlegend, handelt es sich hierbei um eukaryortische oder prokaryotische Zellen oder deren Fragmente, wie zum Beispiel Organellen und Suborganellen. Die Methode schließt allerdings gleichgroße oder kleinere biologische Materialien nicht aus, wie zum Beispiel Viren, Proteine, Hormone, Oligonucleotide, Nukleinsäuren, Peptide, Lectin und sonstige molekulare Zusammensetzungen, die ein charakterischtes Bindungsziel komplemetär zu einem spezifischen Bindungspartner aufweisen.The term biological target substance includes all biological materials for which there is the possibility of binding with a specific binding partner for the purpose of magnetic labeling. The specific binding partner recognizes a molecular contact region on the surface of the biological target substance. The proposed method for improved magnetic marking suitably targets non-magnetic biological materials larger than the magnetic particles. Basically, these are eukaryotic or prokaryotic cells or their fragments, such as organelles and suborganelles. However, the method does not exclude equally large or smaller biological materials, such as viruses, proteins, hormones, oligonucleotides, nucleic acids, peptides, lectin, and other molecular compositions that have a characteristic binding target complementary to a specific binding partner.
Der Begriff magnetische Partikel beschreibt eine hergestellte Zusammensetzung von beschichteten superparamagnetischen Teilchen in Kolloidgröße hauptsächlich bestehend aus Eisenoxid, die unter Einfluss eines magnetischen Feldes Magnetisierung aufweisen. Das Ausmass der Magnetisierung hängt von der magnetischen Ansprechbarkeit der Partikel ab. Die magnetischen Partikel müssen ein dem magnetischen Feld entsprechendes Moment aufweisen. Es ist daher zu empfehlen die Partikel nach magnetischer Kraft bei der Herstellung zu sortieren, wie beschrieben in Patent
Der Begriff spezifischer Bindungspartner beschreibt eine Gruppe von bindungsfähigen Proteinen, Oligopeptide oder Nukleinsäuren, die geeigneterweise hochspezifisch mit einer molekularen Kontaktregion auf der Zielsubstanz assoziieren können und zu einem spezifischen Bindungpaar reagieren. Der Begriff spezifisches Bindungspaar schließt die Interaktion zwischen Antigen-Antikörper, Fc-Rezeptor-Protein G/A, Avidin oder Streptavidin-Biotin ein. Üblicherweise werden Antikörper oder deren immunspezifische Teile zur Bindung an Zielsubstanzen verwendet. Dabei ist es vom Prinzip unerheblich, ob der spezifische Bindungspartner frei oder kovalent an den magnetischen Partikel gebunden ist. Ist der spezifische Bindungspartner an den magnetischen Partikel gebunden, so schließt der Begriff spezifischer Bindungspartner den magnetischen Partikel mit ein.The term specific binding partner describes a group of binding proteins, oligopeptides or nucleic acids that can suitably associate highly specifically with a molecular contact region on the target substance and react to a specific binding pair. The term specific binding pair includes the interaction between antigen antibody, Fc receptor protein G / A, avidin or streptavidin-biotin. Usually, antibodies or their immunospecific parts are used for binding to target substances. It does not matter whether the specific binding partner is free or covalently bound to the magnetic particle. Is the specific binding partners bound to the magnetic particles, so the term specific binding partner includes the magnetic particles.
Beispiel 1example 1
Magnetische Beschichtung und Abscheidung von weissen Blutzellen, welche die spezifische Oberflächenkontaktregion CD45 tragen (Pan-Leukozyten antigen CD45), in einer Suspension von polymorphkernigen und mononuklearen Leukozyten.Magnetic coating and deposition of white blood cells bearing the CD45 specific surface contact region (pan-leukocyte antigen CD45) in a suspension of polymorphonuclear and mononuclear leukocytes.
Material:Material:
- Inkubationspufferlösung: Isosomolare phosphatgepufferte LösungIncubation Buffer Solution: Isosomol phosphate buffered solution
- Neodymiumdauermagnet mit c. a. 0.35 TeslaNeodymium permanent magnet with c. a. 0.35 Tesla
- Eppendorf 1.5 mL Plastikbehälter als InkubationsbehälterEppendorf 1.5 mL plastic container as incubation container
Superparamagnetische Partikel mit Nenngrösse 100 nm (Chemicell GmbH, Eresburgstrs. 22–23, D-12103, Berlin, Deutschland) wurden mit anti-human CD45 monoklonalen Antikörper (ExBio, IgG, clone MEM-28) beschichtet.
Der VorgangThe process
Anti-CD45 konjugierte magnetische Partikel wurden mit 5 × 105 human peripheren Leukozyten in gleichen Mengen für alle Proben bei Raumtemperatur mittels Pipettieren in der Inkubationslösung vermischt. A) magnetische Beschichtung durch oszillierende Bewegungsart der magnetischen Partikel. Für die magnetische Beschichtung unter Vewendung des oszillatorischen Bewegungsprinzips wurde der Inkubationsbehälter mit 30 uL Testmedium, bestehend aus magnetischen Partikeln und weißen Blutzellen gefüllt und anschließend in das Einflußfeld eines magnetischen Gradienten gebracht. Unverzüglicher und stetiger Richtungswechsel des Behälters um 180 Grad erfolgte manuell mit einer Arretierungsdauer von 5 Sekunden über einen Zeitraum von 0.5, 1, 2, 3 und 4 Minuten. B) Zum Vergleich mit gängiger Art der magnetischen Beschichtung, wurden Testproben in Ruhe für die Dauer von 4 Minuten inkubiert. Bekanntermassen ist die Konzentration der magnetischen Partikel entscheident für die Bindungskinetiken. Drei Testproben variierten daher in dem Inkubationsvolumen (15 uL, 30 uL, und 60 ul). Nach erreichen der jeweiligen Inkubationsdauer wurden die Zellsuspensionen beider Protokollvarianten unter Zugabe von 50 uL Pufferlösung mittels Pipettieren durchmischt und für die Dauer von 5 Minuten magnetisch abgeschieden. Es wurde die nicht-abscheidbare Zellfraktion im Überstand zur Bestimmung der Abscheidungseffizienz der Proben verwendet. Zellzahlen wurden unter Verwendung eines Lichtmikroskops und Hämozytometer (Neubauer) bestimmt.Anti-CD45 conjugated magnetic particles were mixed with 5 x 10 5 human peripheral leukocytes in equal amounts for all samples at room temperature by pipetting in the incubation solution. A) magnetic coating by oscillating movement of the magnetic particles. For the magnetic coating using the oscillatory motion principle, the incubation container was filled with 30 μL of test medium consisting of magnetic particles and white blood cells and then placed in the influence field of a magnetic gradient. Immediate and steady change of direction of the vessel 180 degrees was carried out manually with a lock time of 5 seconds over a period of 0.5, 1, 2, 3 and 4 minutes. B) For comparison with common type of magnetic coating, test samples were incubated at rest for 4 minutes. As is known, the concentration of the magnetic particles is crucial for the binding kinetics. Three test samples therefore varied in incubation volume (15 μL, 30 μL, and 60 μL). After reaching the respective incubation period, the cell suspensions of both protocol variants were mixed by adding 50 μl of buffer solution by means of pipetting and deposited magnetically for a period of 5 minutes. The non-separable cell fraction in the supernatant was used to determine the separation efficiency of the samples. Cell numbers were determined using a light microscope and hemocytometer (Neubauer).
Auswertung und ErgebnisEvaluation and result
Gegenstand des examplarischen Versuchs war der Vergleich zwischen gebrauchsüblichen Inkubationsprotokollen und der Inkubation unter Anwendung der Erfindung. Das hierfür verwendete Vergleichskriterium ist die erreichte Abscheidungseffizienz beider Protokolle und wurde in dieser Versuchsanordnung durch die Anzahl der im Überstand verbleibenden bzw. nicht-abscheidbaren Zellen ermittelt. Prozentuale Angaben spiegeln die Abscheidungseffizienz wieder, demnach die magnetisch abgeschiedene Zellfraktion. Die Kontrollproben zeigten 49%, 53%, und 66% Abscheidungseffizienz in Abhängigkeit der verwendeten Volumina 60 uL, 30 uL, beziehungsweise 15 uL.
Beispiel 2Example 2
Protokolloptimierung der magnetische Beschichtung von weissen Blutzellen, welche die spezifische Oberflächenkontaktregion CD45 tragen (Pan-Leukozyten antigen CD45), zur weiteren Erhöhung der Abscheidungseffizienz.Protocol optimization of the magnetic coating of white blood cells carrying the CD45 specific surface-contact region (pan-leukocyte antigen CD45) to further increase the deposition efficiency.
Material:Material:
Wie im Beispiel 1As in Example 1
Der VorgangThe process
Ausgangsbedingungen der Versuchsanordnung sind wie in Beispiel 1 beschrieben. Es wurde jedoch ein Inkubationsvolumen von 18 uL gewählt. Ferner wurde die Inkubationszeit auf eine Minute begrenzt und die Arretierungszeit des Inkubationsbehälters in Rahmen der oszillierenden Bewegungsart der magnetischen Partikel von 5 auf 2 Sekunden reduziert. Dieser Inkubationszyklus bestehend aus Vermischen der Zellsuspension und der Behälterdrehung im ständigen Wechsel unter Einfluss eines magnetischen Feldes wurde in 1, 2, 3, und 4 einminütigen Zyklen wiederholt. Demnach dauerte die magnetische Markierung 4 Minuten. Die folgenden Schritte zur magnetischen Abscheidung sind wie in Beispiel 1 beschrieben.Starting conditions of the experimental setup are as described in Example 1. However, an incubation volume of 18 μL was chosen. Further, the incubation time was limited to one minute, and the incubation time of the incubation container was reduced from 5 to 2 seconds in the oscillating type of movement of the magnetic particles. This incubation cycle consisting of mixing the cell suspension and the container rotation in constant change under the influence of a magnetic field was repeated in 1, 2, 3, and 4 one-minute cycles. Thus, the magnetic mark took 4 minutes. The following magnetic deposition steps are as described in Example 1.
Auswertung und Ergebnis Evaluation and result
Prozentuale Angaben spiegeln die Abscheidungseffizienz wieder, demnach die magnetisch abgeschiedene Zellfraktion.
Beispiel 3Example 3
Unspezifische magnetische Beschichtung von weissen Blutzellen in einer Suspension von polymorphkernigen und mononuklearen Leukozyten.Nonspecific magnetic coating of white blood cells in a suspension of polymorphonuclear and mononuclear leukocytes.
Material:Material:
- Inkubationspufferlösung: Isosomolare phosphate gepufferte Lösung mit 3% fötalem Kälberserum und 2 mM EDTA.Incubation Buffer Solution: Isosomal phosphate buffered solution containing 3% fetal calf serum and 2 mM EDTA.
- Zellpufferlösung: Isosomolare phosphatgepufferte LösungCell Buffer Solution: Isosomol phosphate buffered solution
- Neodymiumdauermagnet mit c. a. 0.35 TeslaNeodymium permanent magnet with c. a. 0.35 Tesla
- Eppendorf 1.5 mL Plastikbehälter als InkubationsbehälterEppendorf 1.5 mL plastic container as incubation container
Superparamagnetische Partikel mit Nenngrösse 100 nm (Chemicell GmbH, Eresburgstrs. 22–23, D-12103, Berlin, Deutschland) wurden jeweils mit (i) anti-Biotin monoklonalen Antikörper (Biolegend, clone 1D4-C5) und (ii) anti-Phycoerythrin (anti-PE) (Biolegend, clone PE001) beschichtet.
Der VorgangThe process
Anti-Biotin und Anti-PE konjugierte magnetische Partikel wurden jeweils in zwei Proben mit 5 × 106 human peripheren Leukozyten in Raumtemperatur mittels Pipettieren in 40 uL Inkubationslösung vermischt. Die verwendete Konzentration an magnetischen Partikeln war für beide Proben wie in Beispiel 2. Das oszillatorische Inkubationsprotokoll wurde wie im Beispiel 1 beschrieben angewendet. Es wurden vier einminütige Zyklen mit einer Arretierungszeit von 5 Sekunden zwischen dem Magnetfeldwechsel angewendet. Nach Vollendung der Inkubationszyklen also vier Minuten, wurde die Probe unter Zugabe von 50 uL Pufferlösung mittels Pipettieren durchmischt und zwecks magnetischer Abscheidung in die Region des höchsten magnetischen Feldgradienten für 5 Minuten erneut an den Magneten angebracht. Der nicht-magnetische Rest wurde mit dem Überstand verworfen. Zur Erhöhung der Reinheit wurde die magnetische Abscheidung wiederholt. Die magnetische Fraktion wurde anschließend in 50 uL Pufferlösung suspendiert und Zellzahlen unter Verwendung eines Lichtmikroskops und Hämozytometer (Neubauer) bestimmt.Anti-biotin and anti-PE conjugated magnetic particles were each mixed in two samples with 5 × 10 6 human peripheral leukocytes at room temperature by pipetting into 40 μl incubation solution. The concentration of magnetic particles used was the same for both samples as in Example 2. The oscillatory incubation protocol was used as described in Example 1. Four one-minute cycles with a lock time of 5 seconds were applied between the magnetic field changes. After completing the incubation cycles, ie four minutes, the sample was mixed by adding 50 μL of buffer solution by pipetting and reapplied to the magnet for 5 minutes for magnetic deposition in the region of the highest magnetic field gradient. The non-magnetic residue was discarded with the supernatant. To increase the purity, the magnetic separation was repeated. The magnetic fraction was then suspended in 50 μL buffer solution and cell numbers determined using a light microscope and hemocytometer (Neubauer).
Auswertung und ErgebnisEvaluation and result
Das Abscheidungsergebnis von Leukozyten bei Inkubation mit anti-Biotin und der anti-PE magnetischen Partikeln zeigte 670 abgeschiedene Zellen für anti-Biotin magnetische Partikel und 450 Zellen für anti-PE magnetischen Partikeln.The deposition result of leukocytes incubated with anti-biotin and anti-PE magnetic particles showed 670 deposited cells for anti-biotin magnetic particles and 450 cells for anti-PE magnetic particles.
Beispiel 4Example 4
Aufreinigung von weissen Blutzellen, welche die spezifische Oberflächenkontaktregion CD14 tragen (CD14 positive Monozyten), aus einer Suspension von polymorphkernigen und mononukleären Leukozyten.Purification of white blood cells bearing the CD14 specific surface contact region (CD14 positive monocytes) from a suspension of polymorphonuclear and mononuclear leukocytes.
Material:Material:
Wie in Beispiel 3As in example 3
Superparamagnetische Partikel mit Nenngrösse 100 nm (Chemicell GmbH, Eresburgstrs. 22–23, D-12103, Berlin, Deutschland) wurden mit anti-human CD14 monoklonalen Antikörper (Exbio, clone MEM-18) beschichtet.
Der VorgangThe process
Anti-CD14 konjugierte magnetische Partikel wurden mit 5 × 106 human peripheren Leukozyten bei Raumtemperatur mittels Pipettieren in 60 uL Inkubationslösung vermischt. Zur magnetischen Markierung wurde auf die Blockierung der Fc-Rezeptoren general verzichtet. Der die Zellsuspension samt magnetischen Partikeln enthaltene Inkubationsbehälter wurde anschließend in den höchsten Einflussbereich des magnetischen Feldes positioniert. Daraufhin wurde der Inkubationsbehälter manuell 6 Mal für die Dauer von einer Minute um 360° gedreht. Der gesamte Vorgang wurde 3 weitere Male wiederholt. Nach 4 Minuten ist eine auszureichende magnetische Beschichtung der Zielzellen anzunehmen. Zur Verminderung der unspezifischen Bindung wurde die Zellsuspension mit der Pufferlösung im Verhältnis 1:3 verdünnt und vermischt. Zur magnetische Abscheidung der magnetisierten Zielzellen wurde der Inkubationsbehälter wie bereits im Vorgang der magnetischen Beschichtung beschrieben, in die Region des höchsten magnetischen Feldgradienten für 3 Minuten an den Magneten plaziert. Der nicht-magnetische Rest wurde mit dem Überstand verworfen. Zur Erhöhung der Reinheit wurde die magnetische Abscheidung wiederholt. Die Zielzellen wurden anschliessend in 50 uL Pufferlösung suspendiert und mit fluoreszenzmarkierten Antiköprer (anti-CD14 PE Konjugat clone MEM-18, eBioscience) für 30 min auf Eis inkubiert.Anti-CD14 conjugated magnetic particles were mixed with 5 x 10 6 human peripheral leukocytes at room temperature by pipetting into 60 μL incubation solution. For magnetic labeling, the blocking of the Fc receptors was generally omitted. The incubation container containing the cell suspension together with magnetic particles was then positioned in the highest influence range of the magnetic field. The incubation container was then manually rotated 360 times 6 times for a period of one minute. The entire process was repeated 3 more times. After 4 minutes, a sufficient magnetic coating of the target cells is assumed. To reduce nonspecific binding, the cell suspension was diluted 1: 3 with the buffer solution and mixed. For magnetic separation of the magnetized target cells, the incubation container was placed on the magnet in the region of the highest magnetic field gradient for 3 minutes, as already described in the magnetic coating process. The non-magnetic residue was discarded with the supernatant. To increase the purity, the magnetic separation was repeated. The target cells were then suspended in 50 μl buffer solution and incubated with fluorescently labeled antibody (anti-CD14 PE conjugate clone MEM-18, eBioscience) for 30 min on ice.
Auswertung und ErgebnisEvaluation and result
Dieses Protokoll benötigt eine Gesamtdauer von 10 Minuten für die magnetische Beschichtung sowie Abscheidung.
Beispiel 5Example 5
Negative Anreicherung von Tumorzellen durch die Depletion von weissen Blutzellen, welche die spezifische Oberflächenkontaktregion CD45 tragen (Pan-Leukozyten antigen CD45).Negative accumulation of tumor cells by the depletion of white blood cells carrying the specific surface contact region CD45 (pan-leukocyte antigen CD45).
Material:Material:
Wie in Beispiel 3As in example 3
Superparamagnetische Partikel mit Nenngrösse 100 nm (Chemicell GmbH, Eresburgstrs. 22–23, D-12103, Berlin, Deutschland) wurden mit anti-human CD45 monoklonalen Antikörper (ExBio, IgG, clone MEM-28).
- Tumorzellinie A549 (Lung carcinoma, ATCC)
- Acridine Orange Flüssigfluoreszenzfarbstoff
- Tumor cell line A549 (lung carcinoma, ATCC)
- Acridine orange liquid fluorescent dye
Der VorgangThe process
Eine Zellsuspension bestehend aus 1.5 × 107 Leukozyten in 10 mL Zellpufferlösung wurde mit 5 × 104 Tumorzellen (A549) versetzt und zusammen mit den Leukozyten durch Zentrifugation (300 × g, 10 min) aufkonzentriert. Die Häufigkeit der Tumorzellen in der Zellsuspension betrug somit 0.33%. 2 × 106 Leukozyten der mit Tumozellen angereicherten Zellsuspension wurden bei Raumtemperatur mit anti-CD45 magnetischen Partikeln mittels Pipettieren in 60 uL Inkubationslösung vermischt. Die magnetische Beschichtung erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Zellsuspension wurde nach magnetischer Markierung unverdünnt magnetisch abgeschieden wie in Beispiel 4 beschrieben. Der Überstand enthielt die Tumorzellen und nicht-abgeschiedene Leukozyten. Die magnetische Fraktion wurde verworfen. Zur Erhöhung der Depletioneffizienz wurde der Vorgang der magnetischen Markierung beziehungsweise Abscheidung ein weiteres Mal wiederholt. Die nicht-abgeschiedene Fraktion wurde anschliessend in 100 uL Zellpufferlösung resuspendiert und mit Acridine Orange zur weiteren Analysis versetzt.A cell suspension consisting of 1.5 x 10 7 leukocytes in 10 mL of cell buffer solution was washed with 5 x 10 4 tumor cells (A549) was added and together with the leukocytes by centrifugation (300 × g, 10 min) and concentrated. The frequency of the tumor cells in the cell suspension was thus 0.33%. 2 × 10 6 leukocytes of the cell-enriched cell suspension were mixed at room temperature with anti-CD45 magnetic particles by pipetting into 60 μl incubation solution. The magnetic coating was carried out as described in Example 4. The cell suspension was magnetically deposited undiluted after magnetic labeling as described in Example 4. The supernatant contained the tumor cells and non-deposited leukocytes. The magnetic fraction was discarded. To increase the depletion efficiency, the process of magnetic marking or deposition was repeated a second time. The non-deposited fraction was then resuspended in 100 μl of cell buffer solution and acridine orange was added for further analysis.
Auswertung und ErgebnisEvaluation and result
Es ist zu beachten, dass der gesamte Vorgang ab magnetischer Beschichtung und Abscheidung innerhalb von 20 Minuten abgeschlossen wurde.
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3693739A1 (en) | 2019-02-06 | 2020-08-12 | Stefan Schreier | Method and device for isolating desired cells from a sample of nonmagnetic biological material |
DE202021105458U1 (en) | 2021-10-08 | 2023-01-24 | Sanolibio Co., Ltd. | Device for the magnetic purification of biological samples |
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Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
FOURIKI, A. [u.a.]: Evaluation of the magnetic field requirements for nanomagnetic gene transfection. Nano Rev. (2010) 1, 1-5 * |
JENKINS, S.I. [u.a.]: Magnetic nanoparticles for oligodendrocyte precursor cell transplantation therapies: progress and challenges. Mol. Cell Ther. (2014) 2:23, 1-12 * |
WASEEM, S. [u.a.]: Antibody-Conjugated Paramagnetic Nanobeads: Kinetics of Bead-Cell Binding. Int. J. Mol. Sci. (2014) 15 (5) 8821-8834 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3693739A1 (en) | 2019-02-06 | 2020-08-12 | Stefan Schreier | Method and device for isolating desired cells from a sample of nonmagnetic biological material |
WO2020161252A1 (en) | 2019-02-06 | 2020-08-13 | Sanolibio Co., Ltd. | Method and apparatus for isolating desired cells from suspensions with non-magnetic biological materials |
CN113424061A (en) * | 2019-02-06 | 2021-09-21 | 赛诺利比奥有限公司 | Method and apparatus for separating desired cells from suspension with non-magnetic biological material |
DE202021105458U1 (en) | 2021-10-08 | 2023-01-24 | Sanolibio Co., Ltd. | Device for the magnetic purification of biological samples |
WO2023057632A1 (en) | 2021-10-08 | 2023-04-13 | Sanolibio Co., Ltd. | Apparatus for magnetic purification of biological samples |
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