DE10134833C2 - Verfahren zur Einbringung von Pilzsporen in Sedimentschichten - Google Patents

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einbringung von ungekeimten und gekeimten Pilzsporen bzw. Pilzsporengemischen in wasserführende Sedimentschichten, beispielweise in Lockersedimente wie Sande und Kiese, zur Bioremediation des unterirdischen Wassers.

Ein häufig auftretendes Umweltproblem ist die Beseitigung von sogenannten "Altlasten", d. h. Böden, die mit Schadstoffen kontaminiert sind. Solche Schadstoffe sind z. B. polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, Pestizide, Dioxine, Furane, Schwermetalle und finden sich beispielsweise in Klärschlamm, Müll, Ackerböden, Flugaschen und Industrieböden.

Es hat bereits einige Ansätze gegeben, kontaminierte Sedimentschichten zu entgiften. Hierbei wurde insbesondere der Einsatz von Bakterien in Betracht gezogen, die die Böden auf biologischem Wege dekontaminieren sollten. Dazu gehören z. B. die Beseitigung von Pestiziden wie Atrazin aus Böden mittels Bakterien (cf. Topp et al., 2000). Es wurde bereits vereinzelt über den Transport von Bakterien durch die geologischen Sedimente und ihre Modellierung berichtet (Maloszewski und Hendry, 1997; Hendry et al., 1999). Da die Mikroorganismen aus Membranen/Zellwänden bestehen, die auf Grund ihrer Zusammensetzung Schadstoffe (z. B. Schwermetalle, cf. Wang et al., 1997; Pestizide, cf. Hoque, 1999; Thiolverbindungen, Nitrate, cf. Ahmad et al., 1999) adsorbieren, komplexieren, binden, assoziieren bzw. aufnehmen können, ist die Beteiligung der Mikroorganismen bei dem Schadstofftransport und der Schadstoffentgiftung möglich. Bakterien leiden jedoch unter mehreren Nachteilen, die ihre Einsetzbarkeit für die Schadstoffentgiftung in geologischen Sedimenten stark beeinträchtigen:

Nachteilig beim Einsatz von Bakterien ist beispielsweise, daß diese in mancher Hinsicht eine schmale Substratspezifizität aufweisen. Demgegenüber sind sie z. B. Pilzen unterlegen, da die Pilze eine breitere Xenobiotika-Substratspezifität als die Bakterien besitzen, und somit in der Regel besser als Bakterien die Schadstoffgemische entgiften können. Zudem können aquatische Pilzarten, zumindest im oberflächennahen, sauerstoffreichen Grundwasser, effiziente Beiträge zur Schadstoffentgiftung leisten.

Bakterien zeigen weiterhin bei der Einbringung in geologische Sedimentschichten schlechte Migrationseigenschaften, die auf ihre spezielle Oberflächenbeschaffenheit zurückzuführen sind. Bakterien werden im allgemeinen deswegen nicht durch Sedimentschichten transportiert, weil sie auf ihrer Oberfläche u. a. sogenannte Adhäsinproteine aufweisen. Diese Oberflächenproteine werden durch die sog. Adhäsin- Gene codiert. Die Adhäsin-Proteine führen zu einer Adhäsion der Bakterien in der Sedimentmatrix, wobei unter Adhäsion hier das Festsitzen der Bakterien in der Sedimentmatrix verstanden wird.

Über die Migrationsfähigkeit der Pilzsporen in geologischen Schichten ist dagegen bisher nichts bekannt geworden, obwohl viele Pilzsporen ähnliche Größen wie Bakterien haben. Die aufgenommenen Schadstoffe können durch die Pilzsporen ähnlich wie bei Bakterien, zumindest im oberflächennahen O₂-reichen Grundwasser, effizient entgiftet werden, vorausgesetzt dass die Pilzsporen bzw. Pilzsporengemische dafür geeignet bzw. aktiviert sind. Die Migration von Pilzsporen in das unterirdische Wasser könnte so die Kolonisierung und die mikrobielle Vergesellschaltung sowie die Biofilmbildung in den wassergesättigten und -ungesättigten geologischen Schichten fördern. Manche Pilzarten sind fakultativ anaerob, und somit können sie in den tieferen geologischen Schichten, sogar in Sporenformen auch bezüglich der Schadstoffentgiftung aktiv sein (cf. Deacon, 1984).

Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur selektiven Einbringung von Pilzsporen in Sedimentschichten zur Bioremediation des unterirdischen Wassers bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch die in Patentanspruch 1 angegebenen Merkmale gelöst. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass Pilzsporen, gekeimt wie ungekeimt, zur Migration durch Sedimentschichten in der Lage sind. Dies ist auf ihre chemische und physikalische Oberflächenbeschaffenheit zurückzuführen, auf die später Bezug genommen wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Einbringung der Mikroorganismen in einen Grundwasserleiter umfasst zunächst den Schritt, Stoffe u./o. Partikel definiert in einen Grundwasserleiter einzubringen. Dies setzt zunächst die Kenntnis der Grundwasserströmungsverhältnisse (Grundwasser-Fließgeschwindigkeit und -Fließ­ richtung) voraus.

Die Grundwasser-Fließgeschwindigkeit und -Fließrichtung kann beispielsweise nach den klassischen Verfahren durch Pumpversuche (Fließgeschwindigkeit), Markierungsversuche zwischen einer oberstromigen und einer unterstromigen Pegelreihe (Fließgeschwindigkeit und Fließrichtung) sowie nach der Methode des hydrologischen Dreiecks (Fließrichtung) erfolgen.

Ein Pumpversuch kann in einer Pegelanordnung mit einem Zentralpegel und mehreren Beobachtungspegeln durchgeführt werde. Im Kontaminationsgebiet wird ein großkalibriger Zentralpegel abgeteufelt, kreisförmig herum kleinkalibrige Beobachtungspegel. Es wird hier die Ergiebigkeit im Beharrungszustand bestimmt. Aus der Ergiebigkeit, der Querschnittsfläche und der effektiven Porosität des Grundwasserleiters folgt die Fließgeschwindigkeit des Grundwassers. Der Pumpversuch ist aber in einem Kontaminationsgebiet nicht zu empfehlen, da man möglicherweise das bereits bekannte Kontaminationsgebiet verändert und laufend gering konzentrierte Kontaminationslösung abpumpt, die gesammelt werden muß.

Bei dem Markierungsversuch wird die beim Pumpversuch eingesetzte Pegelanordnung verwendet. Im Zentralpegel wird ein Markierungsstoff (Tracer) zugegeben und das Wasser in den Beobachtungspegeln auf diesen Markierungsstoff analysiert. Der Pegel mit positivem Befund liegt in Strömungsrichtung. Die Genauigkeit der Richtungsbestimmung ist abhängig von der Engmaschigkeit des Beobachtungspegelfeldes. Aus dem Schwerpunktszeit der Konzentrations-Durchgangskurve im positiven Beobachtungspegel und dem Abstand dieses Pegels vom Zentralpegel kann zudem die Fließgeschwindigkeit des Grundwassers bestimmt werden.

Als hydrologisches Dreieck wird eine Pegelanordnung bezeichnet, bei der drei Pegel, die nicht auf einer Geraden liegen, sondern in den Punkten eines Dreiecks abgeteufelt sind, notwendig sind. Im unbelasteten Zustand (keine Beeinflussung des Grundwasserleiters durch Wasserentnahme bzw. Bohren) werden die Wasserstandshöhen (sog. Standrohrspiegelhöhen) gemessen, aus denen dann die Fließrichtung (vom "Berg zum Tal") bestimmt wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung der Grundwasser­ fließgeschwindigkeit und -Richtung durch ein alternatives Verfahren, das sog. Tracerverdünnungsverfahren, wobei z. B. Uranin, Bromid und radioaktive Substanzen als Tracer eingesetzt werden können (cf. Behrens et al., 1997). Im Kontaminationsgebiet sind mindestens einer, besser mehrere Pegel (kleinkalibrig) notwendig. In dem Pegel wird in der Regel ein kurzlebiger Gammastrahler (Halbwertszeit < 1 Woche) eingegeben. Er wird in Strömungsrichtung aus dem Filterrohr ausgetragen. Die danach eingeführte richtungsabhängige Sonde (kollimierter Szintillations- oder Geigerzähler mit Fenster) zeichnet bei Drehung um die Längsachse das Richtungsdiagramm auf (Strahlungsmaximum zeigt in Strömungsrichtung). Durch das Tracerverfahren kann auch die Fließgeschwindigkeit des Grundwasserleiters bestimmt werden. Notwendig ist ein Pegel, bei mehreren Pegeln erhöht sich die Genauigkeit. Bei der Methode registriert man die Verdünnung eines im Pegelabschnitt eingebrachten Markierungsstoffes, der nicht unbedingt radioaktiv sein muß. Durch das zuströmende Wasser wird die Markierungsstoff- Konzentration exponentiell verdünnt; die Verdünnung ist ein Maß für die Geschwindigkeit.

Die klassischen Verfahren müssen aufwendig (mit Filterrohr als Stützelement und Filterkies als Filterelement) erschlossen werden und sind ungenau. Das Tracerverdünnungsverfahren benötigt nur eine ausgebaute Bohrung (kostengünstig), die Bestimmung der Grundwasser-Fließparameter erfolgt mit größerer Genauigkeit als nach den klassischen Verfahren.

Es hat sich ebenfalls als vorteilhaft erwiesen, die Körnung des Grundwasserleiters (GWL) zu bestimmen, um eine optimale Einbringung zu gewährleisten. Denn ein Transport von Mikroorganismen (Durchmesser: ca. 1 µm) findet nur durch Sedimente mit Porengrößen < 5 µm, d. h. durch Sande und Kiese, nicht durch bindige Sedimente (also Schluffe und Tone mit Korngrößen < 0,063 mm) statt. Die Untersuchung der Körnung des GWL erfolgt visuell (für geübte Hydrologen) oder durch Siebanalyse an dem Probenmaterial, das beim Abteufen der Bohrungen anfällt. Die Körnung des GWL ist weiterhin wichtig für die Abschätzung der transversalen Dispersion (seitliche Ausbreitung) von ins Grundwasser eingebrachten Stoffen u./o. Partikeln.

Nach Kenntnis der Grundwasser-Fließparameter ist oberstromig vom Kontaminationsort und senkrecht zur Strömungsrichtung eine Galerie von ausgebauten Bohrungen (Pegelgalerie) abzuteufen.

Der Ausbau dieser Pegelgalerie richtet sich nach den Abmessungen der Kontamination im GWL, nach der Größe der Grundwasser-Fließparameter und nach der Körnung des GWL.

Eine ausgebaute Bohrung bewirkt eine Verzerrung des Grundwasserströmungsfeldes. Die Breite der aus dem Filterrohr austretenden Stoff bzw. Partikelwolke beträgt α* Filterrohrdurchmesser (Kontraktionszahl α nimmt Werte zwischen 0 und 8 an). Für Bohrungen, die nach den Gesetzmäßigkeiten des Brunnenbaus ausgebaut sind, gilt in Näherung α = 4.

Durch hydrodynamische Dispersion beträgt die transversale Ausbreitung der Stoff oder Partikelwolke zusätzlich ca. 3° (für Sande) bzw. 5° (für Kiese), d. h. die Breite der Wolke nimmt mit wachsender Fließlänge zu.

In Tab. 1 sind unter vereinfachten Voraussetzungen die Wolkenbreiten abgeschätzt.

Die Zugabe der Mikroorganismen (mit Belüftung oder ohne Belüftung je nach Mikroorganismenart) erfolgt in den Filterrohren der Pegelgalerie und zwar kontinuierlich über einen längeren Zeitraum (abhängig vom Abstand Pegelgalerie- Kontaminationsort und von der Länge der Kontamination) und mit der Zeit zunehmender Konzentration, damit anfangs die Poren nicht verstopfen. Beispielsweise sind bei einer Breite der Kontamination quer zur Fließrichtung des Grundwassers von 30 m und Anordnung der Pegelgalerie in 50 m Entfernung von der Kontamination 9 (für sandige GWL) bzw. 6 Pegel (für kiesige GWL) im Abstand B = 3,42 m (Sande) bzw. 5,18 m (Kiese) voneinander entfernt erforderlich. Oberer Grenzwert der aufzubringenden Sporenmenge ist die Konzentration, bei der die Mikroorganismen zur Koagulation neigen. Die Konzentration der aufzubringenden Pilzsporen ist an die Gegebenheiten des vorliegenden GWL anzupassen, sie ist stark von den hydraulischen Parametern (sog. hydrodynamische Dispersion) sowie von den Filtrationseigenschaften des GWL für Pilzsporen (abhängig von der Dimension des Portenraumes und den Sporengrößen) abhängig. Beispielsweise sollten bei einer Kontamination in 10 m Entfernung für einen gering mächtigen GWL über einige Stunden, beispielsweise 5 Stunden, Pilzsporen in wenigen Litern Flüssigkeit in Konzentrationen von 10¹⁰/Liter appliziert werden, wobei die gesamte Applikationsmenge < 10¹³ Sporen sein muß.

Tab. 1

Abschätzung der Wolkenbreiten B für Sande und Kiese für eine mit Filterrohr der Nennweite 0,2 m ausgebaute Bohrung im Abstand A vom Kontaminationsort t = Fließzeit Pegel-Kontaminationsort

Damit die Pilzsporen durch die Sedimentproben transportiert werden, müssen 1. ihre Oberflächen negativ geladen sein, und 2. ihre Abmessungen kleiner als die Porenweite der Sedimentproben sein.

Da jedoch die Oberflächeneigenschaften nicht bei allen Pilzsporen bekannt sind, bieten sich vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Einbringung der Pilzsporen folgende Nachweisverfahren an, um deren Geeignetheit zu überprüfen:

• a) Charakterisierung der Pilzsporenzellwände
• b) Bestimmung der Oberflächenladung der Pilzsporen
• c) Säulenversuche mit ausgewählten Sedimentproben
• d) Nachweisverfahren der Pilzsporen bzw. Pilzsporengemischen in Sedimenten

Dadurch kann vorab die Migrationsfähigkeit der Pilzsporen durch die typischerweise elektrisch negativ geladenen Sedimentschichten bestimmt werden, wodurch sich bereits ein Anhaltspunkt für das Migrationsverhalten der Pilzsporen ergibt.

Beispielsweise können vor Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens zunächst eine mikroskopische Charakterisierung der Pilzsporenzellwände und eine Bestimmung der Oberflächenladung der Pilzsporen erfolgen.

Die Oberflächenladung der Pilzsporen wird vorzugsweise im Rahmen einer Säure-Base- Titration (sog. Zeta-Potentialbestimmung) ermittelt. Diese stellt ein zuverlässiges und einfach durchzuführendes Verfahren zur Bestimmung der Oberflächenladung der Pilzsporen dar. Es können jedoch jederzeit auch andere Verfahren, z. B. Fluoreszenzfarbstoff-Ratio-Imaging, zur Bestimmung des pH-Wertes bzw. der Oberflächenladung der Pilzsporenwände eingesetzt werden.

Zur Durchführung des Nachweisverfahrens der Migration von Pilzsporen beziehungsweise Gemischen von Pilzsporen können Sedimentproben einer oder mehrerer der zu untersuchenden Sedimentschichten entnommen werden. In diesen Sedimentproben werden sodann die einzelnen Sporenarten anhand ihrer charakteristischen Absorptions- und Autofluoreszenzeigenschaften nachgewiesen, wodurch zunächst ein qualitativer Nachweis ermöglicht wird, und überdies, nach rechnerischer Ermittlung, auch die Sporenkonzentration in der jeweiligen Sedimentschicht bestimmt werden kann.

Hierbei wird die Tatsache ausgenutzt, dass die Sporen in der Regel eine charakteristische Absorption und/oder nach Anregung durch Licht einer entsprechenden Wellenlänge, eine entsprechende Autofluoreszenz zeigen. Zur quantitativen/qualitativen Bestimmung/Charakterisierung der Pilzsporen können sowohl die mikroskopische Zählmethode als auch die Durchflußzytometrie sowie spektroskopische Methoden eingesetzt werden. Die Durchflußzytometrie ist insbesondere deswegen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet, da sie die simultane Unterscheidung der Pilzsporen in den Grundwassersedimentproben vorteilhafterweise ermöglicht. Hierbei stellt jedoch oft das neben den Pilzsporen im Sediment enthaltende Material, beispielweise Quarzsand, ein Hemmnis bei der Autofluoreszenzbestimmung dar.

Eine verbesserte Unterscheidung der Pilzsporenarten, insbesondere auch gegenüber zugegebenem Quarzsand oder anderen Sedimenten, lässt sich durch gleichzeitige Anfärbung der sporeneigenen DNA mit einem Farbstoff erreichen. Erfindungsgemäß ist hier der Farbstoff PO-PRO-3® (Molecular Probes, Oregon, USA) besonders geeignet. Grundsätzlich kann aber auch ein anderer Farbstoff (z. B. DAPI, Ethidiumbromid, Acridine Orange) verwendet werden, der zur Anfärbung der Sporen-DNA geeignet ist.

Insofern die charakteristischen Fluoreszenzspektren der zu untersuchenden Pilzsporen per se nicht bekannt sind, müssen die Sporen der Pilzarten zuvor jeweils getrennt auf ihre Autofluoreszenzeigenschaften hin untersucht werden.

Beispielsweise werden die Sedimentproben, in denen Sporen nachgewiesen werden sollen, mit Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt. Die geeignete Anregungswellenlänge je nach Pilzsporenart bzw. DNA-Anfärbung ist mittels Durchflußzytometrie bestimmbar. Beispielsweise können mit Hilfe der Durchflußzytometrie aufgrund der Unterschiede in der Autofluoreszenz bei Anregung mit 360 nm z. B. Sporen von Phanerochaete chrypsosporium und Mucor hiemalis unterschieden werden.

Der Sporennachweis in den Sedimentschichten kann auch durch eine Absorptionsmessung entsprechend den charakteristischen Absorptionsspektren der Sporen mittels UV-Vis- Spektroskopie erfolgen. Dieses Nachweisverfahren kann entweder alleine zur Charakterisierung der Migration der Pilzsporen verwendet werden, oder in Kombination mit den anderen Fluoreszenzverfahren eingesetzt werden. Hierbei ist beispielsweise für die Sporen von Phanerochaete chrysosporium eine Absorptionsmessung bei 316 nm, für die Sporen von Mucor hiemalis f. irnsingii bei 216 nm durchzuführen. Bei beiden Wellenlängen zeigten sich für die jeweiligen Sporenarten charakteristische Absorptionspeaks.

Insofern die charakteristischen Spektren der zu untersuchenden Pilzsporen zu Beginn des Nachweisverfahrens nicht bekannt ist, müssen zuvor geeignete Untersuchungen angestellt werden, um die Sporen der Pilzarten jeweils getrennt auf ihr Absorptionsverhalten hin zu untersuchen. Die Sporen der jeweiligen Pilzarten werden dann im Rahmen der Spektroskopie nachgewiesen und ihr Gehalt rechnerisch ermittelt. Zuvor werden die Sporen aus der Sedimentprobe mit einem geeigneten Volumen Flüssigkeit eluiert.

Zuletzt ist gemäß einer Ausführungsform ein Nachweis der Sporen in den Sedimentproben auch durch Fluoreszenzspektroskopie vorgesehen. Dies kommt jedoch nur für Sporen in Betracht, die durch Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt werden, und dann wiederum Licht einer anderen Wellenlänge emittieren, d. h. Autofluoreszenz zeigen.

Diese Bestimmung ist deswegen besonders vorteilhaft, weil eine starke, lineare Korrelation zwischen dem Fluoreszenzsignal und der Sporenkonzentration z. B. bei Phanerochaete chrysosporium besteht.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden mindestens eine Pilzart mit Monooxygenase-/Dioxygenase-Aktivität und/oder mindestens eine Pilzart mit Glutathion- S-Transferase-Aktivität eingesetzt.

Dabei können beispielsweise die Pilzarten Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus oder Phanerochaete chrysosporium eingesetzt werden. Die Pilzart Phanerochaete chrysosporium (ATCC 24725, ATCC 34541) zeigte dabei bei der gemeinsamen Verwendung mit Pilzarten mit Glutathion-S-Transferase-Aktivität besonders gute Entgiftungseigenschaften.

Erfindungsgemäß finden als Pilzarten mit Glutathion-S-Transferase-Aktivität insbesondere die Pilzarten der Klassen Basidiomycotina, Deuteromycotina oder Zygomycotina, z. B. Cephalosporium, Penicillium, Trichoderma und Mucor, Anwendung. Unter diesen hat sich die Pilzart Mucor hiemalis f. irnsingii (EH5, DSM 14200) als besonders vorteilhaft erwiesen. Im Gegensatz zu Mucor hiemalis f. hiemalis, der die Pflanzenteile saprophytisch besiedelt, wurde der Pilz Mucor hiemalis f irnsingii aus H₂S-Quellwässern isoliert, d. h., er verträgt außerdem H₂S. Dieser Aspekt ist von Bedeutung, da unter aeroben Bedingungen schwefelhaltige Kontaminationen häufig schlecht durch die Mikroorganismen abgebaut bzw. entgiftet werden. Die Pilzart Mucor hiemalis f. irnsingii verträgt zudem mehr als 500 ppm Natriumthiosulfat.

Die Migration der beiden Pilzarten Phanerochaete chrysosporium und Mucor hiemalis f. irnsingii durch Sedimentschichten ist aus folgenden Gründen von Bedeutung: a) Beide Pilzarten sind in Dualkulturen kompatibel und in Flüssigkulturen kultivierbar, b) Beide Pilzarten entgiften Schadstoffe durch zwei unterschiedliche Stoffwechselwege und c) Vorläufige Untersuchungen zeigten, dass die Mineralisierungsleistung vom Weißfäule-Pilz Phanerochaete chrysosporium sehr stark durch die Anwesenheit von Mucor hiemalis f. irnsingii elicitiert wird. Unter Elicitierung wird im vorliegenden Zusammenhang die Verstärkung der metabolischen Aktivität bzw. des metabolischen Signals eines biologischen Systems durch die Anwesenheit eines Teilsystems/des Gesamtsystems eines anderen Organismus verstanden.

Diese beiden Pilzarten können beispielsweise aufgrund ihrer hervorragenden synergistischen Effekte auch bei relativ niedrigen Temperaturen, wie beispielsweise bei Grundwassertemperatur, eingesetzt werden, und somit zur Entgiftung des Grundwassers dienen.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und anhand der beiliegenden Abbildungen beschrieben. Die Abbildungen zeigen:

Abb. 1 Sporen von P. chrysosporium nach Acridine-Orange-Färbung (Rotemissionsbild, < 595 nm) nach Anregung mit Grünlicht (543 nm), Nachweis von Chitin in P. chrysosporium-Sporen (Grünfluoreszenz) durch FITC-markierte Antichitin-Antikörper (Fa. MoBiTec, BRD) nach Anregung mittels λ = 488 nm Laser, (c) Sporangiosporen von M. hiemalis nach der Freisetzung aus den Sporangien, (d) Nachweis von Chitin (Grünfluoreszenz) bei M. hiemalis Sporangiosporen durch FITC-markierte Antichitin- Antikörper nach Anregung mittels λ = 488 nm Laser.

Abb. 2 Titrationskurven zur Bestimmung der Oberflächenladungen von ungekeimten M. hiemalis f. irnsingii-Sporen.

Abb. 3 Titrationskurven zur Bestimmung der Oberflächenladungen von ungekeimten Sporen von P. chrysosoporium

Abb. 4 Oberflächenladung von gekeimten Sporen von Mucor hiemalis EH5 in Abhängigkeit vom Nährstoff

Abb. 5 Nachweis der Sporen mittels Durchflußzytometrie (a) P. chrysosporium- und M. hiemalis f. irnsingii-Sporangiosporen (Streulicht vs. Autofluoreszenz) und (b) P. chrysosporium- und Mucor hiemali f. irnsingii-Sporen (PO-PRO-3 Fluoreszenz vs. Autofluoreszenz) in einer Mischung mit Quarzsand.

Abb. 6 Proteintypen in der Lipiddoppelschicht der Plasmamembran

Abb. 7 Migration von ungekeimten P. chrysosporium-Sporen durch Quarzsand

Abb. 8 Migration von ungekeimten M. hiemalis EHS-Sporen durch Quarzsand

Abb. 9 Migration von gekeimten M. hiemalis EHS-Sporen durch Quarzsand

Abb. 10 Säulenanordnung bei den Transportuntersuchungen (zur Realisierung längerer Migrationsstrecken können mehrere Säulen nacheinander geschaltet werden).

Beispiele

Die Voruntersuchungen sollen im Folgenden beispielhaft an den Pilzsporen der Pilzarten M. hiemalis f. irnsingii und P. chrysosporium verdeutlicht werden.

1. Mikroskopische Charakterisierung der Pilzsporen

Um die Morphologie und die äußere Beschaffenheit der Sporenwände charakterisieren zu können, wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt.

P. chrysosporium gehört zu Basidiomycotina, aber M. hiemalis f. irnsingii zu Zygomycotina. Die Abb. 1a zeigt die Sporen von P. chrysosporium nach Acridin-Orange- Färbung und die Abb. 1b nach Antichitin-Antikörper-Färbung. Die Abb. 1c zeigt Sporangiosporen von M. hiemalis f. irnsingii nach Safranin-Färbung und Abb, 1d nach Antichitin-Antikörper-Färbung. Beide Pilzsporen (Abb. 1b, 1d) zeigten das Vorkommen von Chitin auf der Oberfläche, das die Eigenschaften der Zellwände (Zellabtrennung, Zellwachstum, Festigkeit, Hydrophobizität, Dauerhaftigkeit, Schutzfunktion, u. a.) verstärken kann. Neben dem Polysaccharid "Chitin" kann Chitosan in Mucor (Zygomycotina), dagegen Mannan/Glucan in Basidiomycotina, z. B. Phanerochaete vorkommen. Weitere wichtige pilzlichen Zellwandkomponenten sind Lipide, Proteine und Cellulosen bzw. ihre Kreuzpolymere u. a. (cf. Deacon, 1984), die auch die Transport- und Adhäsionseigenschaften der Sporen beeinflussen können.

Der Gehalt an Chitin, Chitosan und Glukuronsäure in den Sporangiosporen und Hyphen von Mucor, z. B. bei Mucor hiemalis, ist wahrscheinlich niedriger als der entsprechende Gehalt in Sporangiophoren. Der Gehalt an Mannose, Glukose, Protein, Lipid und Melanin in den Sporangiosporen ist deutlich höher als der in den Sporangiophoren und Hyphen (cf. Deacon, 1984).

Um die Migrationsfähigkeit der Sporen durch die elektrisch negativ geladenen Gesteinsschichten untersuchen zu können, wurde die Oberflächenladung der Sporen bestimmt.

Oberflächenladung von P. chrysosporium- und M. hiemalis f. irnsingii-Sporen

Die Titration von P. chrysosporium-Sporen und M. hiemalis f. irnsingii-Sporen mittels Säure und Base zeigten keine distinkten pK-Werte im untersuchten pH-Bereich, also keine Dominanz von schwachem Säure- oder Base-Charakter. Die beobachtete Hysterese zwischen den Titrationskurven ist sowohl auf die zunehmende Ionenstärke als auch partielle Hydrolyse der Zellwandkomponenten zurückzuführen. Die Oberflächenladungen von beiden Sporen-Arten waren negativ für den pH-Bereich < 4, die auf eine gute Migrationsfähigkeit der Sporen wegen der Elektronegativität der Sedimente hinweist. Die Dissoziationen der Amino-/Thiol-Gruppen vom in Zellwand enthaltenen Protein (Aminosäuren)/Chitin (Glukosamin) oder der OH-Gruppen vom in der Zellwand enthaltenen Polysaccharid oder der COOH-Gruppen von in der Zellwand vorkommenden Phospholipiden (Fettsäuren)/Lipopolysaccharid im sauren Milieu können der Sporen- Zellwand die elektronegativen Eigenschaften verleihen. Vorläufige Ergebnisse der Titration von Chitin zeigen, dass die elektronegativen Eigenschaften der Sporen wahrscheinlich nicht hauptsächlich auf Zellwand-Chitine zurückgeführt werden können.

Die Pilze bzw. ihre Sporen kommen jedoch in unserem Ökosystem in Gemischen vor. Auch der Einsatz der pilzlichen Sporen zur Reinigung des Grundwasserleiters bzw. des Grundwassers erfordert eine Methode zur simultanen Unterscheidung der Pilzsporen in den Grundwasser-Sedimentproben. Deswegen wurde die Durchflußzytometrie-Methode angewendet.

Charakterisierung von Phanerochaete chrysosporium- und Mucor hiemalis-Sporen mittels Durchflußzytometrie

Mit Hilfe der Durchflußzytometrie konnten aufgrund der Unterschiede in der Autofluoreszenz bei Anregung mit 360 nm Sporen von Phanerochaete chrypsosporium (PC) und Mucor hiemalis (MH) unterschieden werden. PC-Sporen weisen bei Fluoreszenzanregung im UV (ca. 360 nm) gegenüber MH-Sporen eine etwa 10-fach größere Autofluoreszenz bei Fluoreszenzwellenlängen länger als 389 nm auf (Abb. 5).

Eine verbesserte Unterscheidung beider Sporenarten, insbesondere auch gegenüber zugegebenem Quarzsand, lässt sich durch gleichzeitige Anfärbung der sporeneigenen DNA mit dem Farbstoff PO-PRO-3 (Molecular Probes, Oregon, USA) erreichen, wie in Abb. 5 zu sehen ist. Diese Methode kann im Prinzip zur Bestimmung bzw. Einstellung der pilzlichen Sporenkonzentration in Gemischen bei den Grundwasser-Reinigungsversuchen ex- und in-situ eingesetzt werden.

Spektroskopische Charakterisierung und Transport von Phanerochaete chryso­ sporium-Sporen 1. Spektroskopische Charakterisierung

Das UV-Vis-Spektrum von P. chrysosporium-Sporen zeigt die charakteristischen Absorptionspeaks bei λ = 260 und λ = 316 nm, wobei der erste Peak wahrscheinlich unspezifisch auf die Zellwandproteine und der zweite Peak aber auf die spezifischen Zellwandkomponenten zurückzuführen sind. Die Anregungen bei diesen Wellenlängen zeigten eine sehr starke lineare Korrelation zwischen dem Fluoreszenzsignal und der Sporenkonzentration. Das Fluoreszenzsignal nach der Anregung mit Licht der Wellenlänge λ = 260 nm zeigte eine schlechtere Diskriminierung vom Hintergrund. Dagegen führte die Anregung mit der Wellenlänge λ = 316 nm zur spezifischen Fluoreszenz von P. chrysosporium-Sporen. Das Fluoreszenzspektrum von P. chrysosporium-Sporen nach Anregung mit λ = 316 nm zeigt ein Emissionsmaximum bei λ_em = 428 nm.

2. Transport von Phanerochaete chrysosporium-Sporen

Die Sporen von Phanerochaete chrysosporium sind elektronegativ bei pH < 4. Abb. 7 zeigt die Evidenz der Migration von Phanerochaete chrysosporium-Sporen mittels Fluoreszenzmessung durch die Quarzsandmatrix. Die Sporen von Phanerochaete chrysosporium wurden als distinkte Bande durch den Quarzsand (Korngröße 0,5-1,5 mm) über Strecken von 25-50 cm eluiert. Die Wiederfindungsrate lag bei bis zu 80%.

Spektroskopische Charakterisierung und Transport von Mucor hiemalis f. irnsingii-Sporen 1. Spektroskopische Charakterisierung

Die Sporangiosporen von Mucor hiemalis f. irnsingii zeigten keine Autofluoreszenz. Mittels UV-Vis-Spektren (Abb. 8) wurden charakteristische Absorptionspeaks bei λ = 216, 263 and 285 nm gefunden. Der Maximumabsorptionspeak lag bei λ = 216 nm. Dieser charakteristische Absorptionspeak wurde zur Kalibrierung der Sporenanzahl gegen Absorption mittels linearer Regressionsanalyse verwendet (Abb. 8). Die Sporenanzahl in Suspensionen wurde durch direkte Zählungen mit Hilfe eines Mikroskops und eines Hematocytometers (Sigma, Deisenhofen) bestimmt. Die Absorptionsmessung bei λ = 216 nm erwies sich als geeignet zur indirekten Zählung von M. hiemalis-Sporangiosporen mittels der Regressionsgleichung (siehe unten). Die Transformation der Daten erfolgte unter Verwendung von Sigma Plot (Version 4.0) Software (USA).

2. Transport von Mucor hiemalis f. irnsingii-Sporen

Die Sporangiosporen von Mucor hiemalis f. irnsingii hatten eine Größe von ca. 5-9 µm × 3-7 µm (cf. Hoque et al., 2000). Abb. 8 zeigt die Elutionskurve (C_i/C₀) von Mucor hiemalis f. irnsingii-Sporen durch die Quarzsandmatrix in Abhängigkeit vom Elutionsvolumen. Die Wiederfindung von Mucor hiemalis f. irnsingii-Sporen aus der Säule bei λ = 216 nm betrug bis zu ca. 80%.

Die vorliegenden Migrationsstudien zeigen zum ersten Mal den Transport von Pilzsporen, hier Sporen von P. chrysosporium- und M. hiemalis f. irnsingii durch wassergesättigten Quarzsand. Die Wiederfindungsrate von ungekeimten P. chrysosporium- und M. hiemalis f. irnsingii-Sporen betrug bis zu 80%. Die Durchflußzytometrie ermöglichte den simultanen Nachweis von beiden Pilzsporen in der wässrigen Phase der Wasser-Sediment- Fraktionen.

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Claims (14)

1. Verfahren zur Einbringung von Pilzsporen von kompatiblen Pilzarten mit Entgiftungseigenschaften in wasserführende Sedimentschichten zur Bioremediation des unterirdischen Wassers, bei dem die

• a) Keimungszustände der kompatiblen Pilzsporen bestimmt werden,
• b) Aktivierung der Entgiftungseigenschaften der Pilzsporen durch Elicitierung während der Keimung erreicht wird,
• c) Arbeitstemperatur der aktivierten Pilzsporen durch Elicitierung auf Grundwassertemperatur gesenkt wird,
• d) Haftung bzw. Eindringtiefe der Pilzsporen in Sedimentschichten durch Keimungszustände/-fortschritte bzw. Größenveränderungen geregelt werden, und die
• e) Grundwasserfließgeschwindigkeit/-richtung im Zusammenhang mit a) bis d) zu wählen ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die kompatiblen Pilzarten aktivierbar sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die kompatiblen Pilzsporen durch Keimung und/oder Elicitierung aktiviert werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem durch Variation der Keimungszustände die Eindringtiefe der kompatiblen Pilzsporen in den Grundwasserleiter eingestellt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Einstellparameter der Migration der kompatiblen Pilzsporen in die in Frage kommende Sedimentschicht durch Experimente festgelegt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem zuvor eine Bestimmung der Oberflächenladung, Abmessungen und Wiederfindungsrate der kompatiblen Pilzsporen nach der Aktivierung und der Nachweis der Sporengemische vor/nach der Migration sowie die Bestimmung der Eigenschaften der Sedimente/geologischen Schichten (Körnung der Sedimente, Grundwasserfließgeschwindigkeit/-richtung) vor der Migration der kompatiblen Pilzsporen erfolgt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem mindestens eine Pilzart mit Monooxygenase-/Dioxygenase-Aktivität und/oder mindestens eine andere Pilzart mit Glutathion-S-Transferase-Aktivität zur Elicitierung des Schadstoffabbaues eingesetzt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem mindestens eine der Pilzarten Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus und Phanerochaete chrysosporium als Pilzart mit Monooxygenase­ /Dioxygenase-Aktivität eingesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem mindestens eine Pilzart der Klassen Basidiomycotina, Deuteromycotina oder Zygomycotina als Pilzart mit Glutathion-S- Transferase-Aktivität eingesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem mindestens eine Pilzart der Klasse Zygomycotina als Pilzart mit Glutathion-S-Transferase-Aktivität eingesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem mindestens eine der Pilzarten Cephalosporium, Penicillium, Trichoderma and Mucor eingesetzt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem Mucor hiemalis-Stamm/-Stämme eingesetzt wird/werden.

13. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem Mucor hiemalis, f. irnsingii, eingesetzt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, bei dem eine Kombination von Phanerochaete chrysosporium und Mucor hiemalis, f. irnsingii, eingesetzt wird.