DE10132025A1 - Zweistufige Schutzgruppen für die Synthese von Biopolymeren - Google Patents

Zweistufige Schutzgruppen für die Synthese von Biopolymeren

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Biopolymeren durch schrittweisen Aufbau aus geschützten Synthesebausteinen, die zweistufige Schutzgruppen tragen. Die zweistufigen Schutzgruppen werden durch einen ersten Belichtungsschritt und einen anschließenden chemischen Behandlungsschritt abgespalten.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Biopolymeren durch schrittweisen Aufbau aus geschützten Synthesebausteinen, die zweistufige Schutzgruppen tragen. Die zweistufigen Schutzgruppen werden durch einen ersten Belichtungsschritt aktiviert und einen anschließenden chemischen Behandlungsschritt abgespalten.
  • Die Technologie der lichtgesteuerten Synthese von Biopolymeren unter Verwendung fotolabiler Schutzgruppen eröffnet die Möglichkeit, Biochips in situ durch Synthese aus Monomer- und Oligomerbausteinen zu erzeugen. Biochips haben für die Forschung und Diagnostik ganz erheblich an Bedeutung gewonnen, da sie eine schnelle und hochparallele Bearbeitung komplexer biologischer Fragestellungen erlauben. Hierzu werden jedoch Chips von höchster Qualität benötigt, so dass ein hohes Interesse an neuen effektiveren Synthesemethoden besteht.
  • Bei der lichtgesteuerten Synthese von Nukleinsäure-Chips finden fotolabile Nukleosid-Derivate Verwendung. Hierbei findet der Kettenaufbau der Nukleinsäure-Fragmente üblicherweise mittels Phosphoramidit-Synthonen statt. Die Bausteine tragen jeweils eine temporäre Fotoschutzgruppe, die durch Lichteinstrahlung entfernt werden kann. Das Syntheseprinzip sieht eine zyklische Abfolge von Kondensations- und Deprotektions-Schritten (durch Licht) vor. Die Effizienz, mit der eine solche lichtgesteuerte Synthese erfolgen kann, wird im Wesentlichen durch die verwendeten fotolabilen Schutzgruppen, insbesondere durch die Effizienz, mit der diese im Bestrahlungsschritt entfernt werden können, bestimmt. Bei den bislang zur lichtgesteuerten Synthese verwendeten Fotoschutzgruppen handelt es sich üblicherweise um die Schutzgruppen NVOC (S. P. A. Fodor et al., Science 251 (1991), 767 ff.), MeNPOC (A. C. Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994), 5022 ff.), DMBOC (M. C. Pirrung, J. Chem. 60 (1995), 1116 ff.) und NPPOC (A. Hassan et al., Tetrahedron 53 (1997), 4247 ff.). Weitere bekannte fotolabile Schutzgruppen in der Nukleosid- bzw. Nukleotidchemie sind o-Nitrobenzyl-Gruppen und ihre Derivate (vgl. z. B. Pillai, Org. Photochem. 9 (1987), 225; Walker et al., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988), 7170). Als weitere fotolabile Schutzgruppe wurde die 2-(o-Nitrophenyl)ethyl-Gruppe (Pfleiderer et al., In: "Biosphosphates an their Analogues - Synthesis, Structure, Metabolism and Activity", ELSEVIER Science Publishers B. V. Amsterdam (1987), 133 ff.) sowie Derivate davon (WO 97/44345 und WO 96/18634) vorgeschlagen.
  • Die gegenwärtig für die lichtgesteuerte Synthese von Nukleinsäuren verwendeten fotolabilen Schutzgruppen. (z. B. NVOC, MeNPOC, NPPOC) zeichnen sich im Allgemeinen durch einen vergleichsweise niedrigen Absorptionskoeffizienten bei der Wellenlänge der Lichteinstrahlung aus. Die Bestrahlung der fotolabilen Nukleosid-Derivate erfolgt üblicherweise mit Hg- Hochdrucklampen bei einer Wellenlänge von 365 nm. Der niedrige Absorptionskoeffizient der verwendeten fotolabilen Schutzgruppe bei dieser Wellenlänge hat zur Folge, dass nur ein sehr geringer Anteil des eingestrahlten Lichts zur Anregung der Moleküle verwertet werden kann. Desweiteren handelt es sich bei den verwendeten fotolabilen Schutzgruppen zumeist um farblose Derivate. Dies wiederum hat zur Folge, dass es während der Synthese nicht möglich ist, mit einfachen spektroskopischen Methoden zu detektieren, ob die fotolabile Schutzgruppe sich noch am Nukleosid-Derivat befindet oder bereits teilweise oder vollständig durch den Lichteintrag abstrahiert worden ist. Es lässt sich somit der Vorgang der Abstraktion nur schwer oder gar nicht verfolgen.
  • Gemäß vorliegender Erfindung wird eine neuartige Schutzgruppe bereitgestellt, bei der der Aktivierungsschritt lichtinduziert erfolgt und der eigentliche Entschützungsschritt am Reaktionszentrum durch chemische Mittel, z. B. säurekatalysiert, stattfindet (Abb. 1). Diese neuartige Schutzgruppe bzw. diese Schutzgruppe tragende Moleküle können für die Synthese von Biopolymeren eingesetzt werden.
  • Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Synthese von Biopolymeren durch schrittweisen Aufbau aus Synthesebausteinen, die Schutzgruppen tragen, wobei man mindestens einen Synthesebaustein verwendet, der eine zweistufige Schutzgruppe trägt, die durch einen Belichtungsschritt aktiviert und durch einen anschließenden chemischen Behandlungsschritt abgespalten wird. Der chemische Behandlungsschritt umfasst vorzugsweise eine Behandlung mit Base, eine Behandlung mit Säure, eine Oxidation, eine Reduktion oder/und eine enzymatische Reaktion. Besonders bevorzugt umfasst der chemische Behandlungsschritt eine Säurebehandlung.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man als zweistufige Schutzgruppe eine derivatisierte Tritylgruppe. Tritylgruppen zeichnen sich durch ihre hervorragenden Abspaltbarkeit, insbesondere durch Behandlung mit Säure, aus. Die erfindungsgemäßen zweistufigen Tritylschutzgruppen sind hingegen nicht säurelabil, sondern werden erst nach Aktivierung und Abspaltung einer oder mehrerer fotolabiler Komponenten in eine säurelabile Form überführt. Besonders bevorzugt wird daher ein Synthesebaustein mit einer zweistufigen Schutzgruppe verwendet, der die allgemeine Formel I aufweist:


    wobei R1 und R2 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, OR3, O(CH2)nCOOR3 und NHZ, R3 eine C1-C8 Alkylgruppe, eine C2-C8- Alkenylgruppe, eine C2-C8-Alkinylgruppe oder/und eine C6-C20 Arylgruppe enthält, die gegebenenfalls Substituenten aufweisen kann, X den Synthesebaustein darstellt, Y jeweils unabhängig eine fotoaktivierbare Schutzgruppe ist, Z eine Aminoschutzgruppe ist, n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und wobei gegebenenfalls R1 oder/und R2 durch Y ersetzt sein können.
  • Die Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen können linear oder cyclisch, geradkettig oder verzweigt sein. Bevorzugte Bedeutungen für R1 und R2 sind Wasserstoff, O-Methyl, OCOO-Methyl oder eine geschützte Aminogruppe, z. B. eine mit einer geeigneten Carbonsäure in eine Amidfunktion überführte Aminogruppe.
  • Die Erfindung erfasst auch Verbindungen, die mehrere fotoaktivierbare Schutzgruppen tragen, insbesondere Verbindungen der Formel I, worin zumindest einer von R1 oder R2 durch eine fotoaktivierbare Schutzgruppe Y ersetzt ist.
  • Durch Variation der Reste R1 und R2 und Substitution eines oder beider Reste durch fotoaktivierbare Schutzgruppen lässt sich die Säurelabilität den gewünschten Anforderungen anpassen.
  • Die Erfindung umfasst auch Verbindungen, die eine oder mehrere fluoreszierende Gruppen tragen, z. B. Verbindungen, bei denen Y eine fluoreszierende Fotoschutzgruppe oder/und R3 bzw. Z fluoreszierende Gruppen darstellen (R. Ramage, F. O. Wahl, Tetrahedron Lett., 34 (1993), 7133) oder Moleküle, bei denen die Fluoreszenz durch Substitution am Tritylgerüst (J. L. Fourrey et al., Tetrahedron Lett., 28 (1987), 5157) eingeführt wurde.
  • Diese fluoreszierenden Gruppen können, solange die Anregungs- und Emissionswellenlängen mit der lichtinduzierten Aktivierung nicht interferieren, zur Qualitätskontrolle von Biochips herangezogen werden. Dies kann beispielsweise in Biochip-Trägern gemäß WO 00/13018 geschehen.
  • Die fotoaktivierbare Gruppe Y der zweistufigen Schutzgruppe kann grundsätzlich aus beliebigen bekannten Fotoschutzgruppen ausgewählt werden, wie etwa Nitrovetatryloxycarbonyl (NVOC), α-Methyl-6- nitropiperonyloxycarbonyl (MeNPOC), 3,5-Dimethoxybenzoincarbonat (DMBOC), 2-(o-Nitrophenyl)propyloxycarbonyl (NPPOC), o-Nitrobenzyl und Derivaten davon, 2-(o-Nitrophenyl)ethyl und Derivaten davon.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird zur Synthese von Biopolymeren eingesetzt, wobei das zu synthetisierende Biopolymer schrittweise aus mehreren Synthesebausteinen aufgebaut wird. Besonders bevorzugt wird das Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuren, z. B. DNA oder RNA, eingesetzt. Es ist jedoch anzumerken, dass das Verfahren auch zur Synthese von anderen Biopolymeren, wie etwa Peptiden, Peptidnukleinsäuren (PNA) oder Sacchariden, geeignet ist. Der Synthesebaustein kann ein monomerer Baustein, z. B. ein Nukleosid-Derviat, aber auch ein oligomerer Baustein, z. B. ein Dimer oder Trimer, d. h. beispielsweise ein Di- oder Trinukleosid-Derivat, sein. Besonders bevorzugt ist der Synthesebaustein ein Phosphoramidit-Baustein. Es können jedoch auch andere Nukleotidsynthese-Bausteine, z. B. Phosphat- oder Phosphonat- Bausteine, verwendet werden. Weiterhin können als Synthesebausteine auch Linker- bzw. Spacer-Bausteine, z. B. als Phosphoramidite, eingesetzt werden. Besonders bevorzugte Linker bzw. Spacer als Träger zweistufiger Schutzgruppen sind in DE 100 41 539.3 beschrieben.
  • Die erfindungsgemäßen, eine zweistufige Schutzgruppe tragenden Synthesebausteine haben im Allgemeinen stärker lipophile Eigenschaften als die bislang die im Stand der Technik verwendeten Synthesebausteine. Durch diese Lipophilie erhöht sich die Solubilität der Synthesebausteine, insbesondere der Phosphoramidit-Synthone in organischen Lösungsmitteln. Die dadurch mögliche homogenere Reaktionsführung führt im Vergleich zu den reinen fotolabilen Phosphoramidit-Synthonen zu einer höheren Kopplungseffizienz. Durch die Abspaltung des farbigen Tritylkations der erfindungsgemäßen Fotoschutzgruppen, welches einen wesentlich höheren Absorptionskoeffizienten besitzt als die Abspaltungsprodukte bei anderen Fotoentschützungsprozessen, eröffnet sich weiterhin die Möglichkeit zur direkten online Prozesskontrolle. Dies führt zu einer Verbesserung bei der Qualitätskontrolle für Biochips.
  • Die Tritylgruppe der erfindungsgemäßen Fotoschutzgruppen ermöglicht außerdem die selektive Funktionalisierung der 5'-Hydroxyfunktion. Dies führt zu einer enormen Kostenreduzierung, da eine Trennung der 3'-5'- Isomere entfällt.
  • Besonders bevorzugt sind daher gemäß vorliegender Erfindung Phosphoramidit-Bausteine, die die zweistufige Schutzgruppe am 5'-O-Atom des Zuckers, insbesondere der Ribose oder der Deoxyribose, tragen.
  • Die Synthese der Biopolymeren kann auf übliche Weise durchgeführt werden, beispielsweise auf einer Festphase. Besonders bevorzugt werden mehrere Biopolymere, die eine unterschiedliche Sequenz von Synthesebausteinen tragen, auf einem einzigen Träger in Form eines Array in situ erzeugt.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel I


    wobei R1 und R2 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, OR3, O(CH2)nCOOR3 und NHZ, R3 eine C1-C8 Alkylgruppe oder/und eine C6-C20 Arylgruppe enthält, die gegebenenfalls Substituenten aufweisen kann, X einen Synthesebaustein zur Synthese von Biopolymeren oder eine Abgangsgruppe darstellt, Y jeweils unabhängig eine fotoaktivierbare Schutzgruppe ist, Z eine Aminoschutzgruppe ist, n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und wobei gegebenenfalls R1 oder/und R2 durch Y ersetzt sein können.
  • Substituenten von Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- bzw. Arylgruppen sind vorzugsweise ausgewählt aus Halogenen, z. B. F, Cl, Br oder I, OH, SH, -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, NO2 und CN. Die Substituenten können an dem betreffenden Rest einfach oder mehrfach vorliegen. Arylgruppen können auch Ringsysteme mit Heteroatomen, wie etwa O, N oder/und S, umfassen.
  • Wenn X eine Abgangsgruppe ist, handelt es sich um eine Gruppe, die bei einer Reaktion der Verbindung (1) mit einer anderen Verbindung abgespalten werden kann. Vorzugsweise ist X eine durch Reaktion mit eine Nukleophil, gegebenenfalls in Gegenwart einer Hilfsbase, wie Pyridin, abspaltbare Abgangsgruppe. Bevorzugte Beispiele für X sind:
    Cl, Br, I, Tosylat, Mesylat, Trifluorsulfonat etc.
  • Die schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Schutzgruppenkonzepts ist Abb. 1 gezeigt. Der Synthesebaustein 1A) trägt eine zweistufige Schutzgruppe (B-C). In einem ersten Belichtungsschritt wird der fotolabile Anteil (B) der Schutzgruppe abgespalten. Durch eine zweiten chemischen Behandlungsschritt, z. B. durch Zugabe von Säure, wird die chemisch labile Komponente (C) der Schutzgruppe abgespalten, so dass der Synthesebaustein (A) in aktiver Form vorliegt.
  • Abb. 2 zeigt eine Beispielsubstanz aus einer bevorzugten Klasse von erfindungsgemäßen zweistufigen Schutzgruppen. Sie basiert auf der säurelabilen Tritylgruppe, enthält jedoch in der p-Position eines Phenylrests eine fotolabile Komponente (hier die NPPOC-Gruppe), welche die Säureempfindlichkeit der Tritylgruppe verringert bzw. vollständig blockiert. Durch Belichtung und Abspaltung der fotolabilen Komponente wird die Schutzgruppe in eine säurelabile Form überführt und kann anschließend in Gegenwart von Säure unter Freisetzung des ungeschützten Synthesebausteins abgespalten werden.
  • Abb. 3 zeigt zwei Varianten zur Synthese einer erfindungsgemäßen zweistufigen Schutzgruppe.
  • Abb. 4 zeigt zwei weitere Varianten zur Herstellung erfindungsmäßer Synthesebausteine mit zweistufigen Schutzgruppen.
  • Abb. 5 zeigt eine dritte Variante der Synthese zweistufiger Schutzgruppen, wobei zwei der Phenylgruppen an der Tritylgruppe mit einer fotolabilen Gruppe substituiert sind.
  • Abb. 6 zeigt eine vierte Variante zur Synthese einer zweistufigen Schutzgruppe und
  • Abb. 7 zeigt schließlich eine fünfte Variante, wobei alle drei Phenylringe der Tritylgruppe eine fotolabile Schutzgruppe tragen.

Claims (21)

1. Verfahren zur Synthese von Biopolymeren durch schrittweisen Aufbau aus Synthesebausteinen, die Schutzgruppen tragen, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens einen Synthesebaustein verwendet, der eine zweistufige Schutzgruppe trägt, wobei die zweistufige Schutzgruppe durch einen Belichtungsschritt aktiviert und einen anschließenden chemischen Behandlungsschritt abgespalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der chemische Behandlungsschritt eine Behandlung mit Base, eine Behandlung mit Säure, eine Oxidation, eine Reduktion oder/und eine enzymatische Reaktion umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der chemische Behandlungsschritt eine Säurebehandlung umfasst.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als zweistufige Schutzgruppe eine derivatisierte Tritylgruppe verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Synthesebaustein mit der zweistufigen Schutzgruppe die allgemeine Formel I aufweist:


wobei R1 und R2 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, OR3, O(CH2)nCOOR3 und NHZ,
R3 eine C1-C8 Alkylgruppe, eine C2-C8-Alkenylgruppe, eine C2-C8- Alkinylgruppe oder/und eine C6-C20 Arylgruppe enthält, die gegebenenfalls Substituenten aufweisen kann,
X den Synthesebaustein darstellt,
Y jeweils unabhängig eine fotoaktivierbare Schutzgruppe ist,
Z eine Aminoschutzgruppe ist,
n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und
wobei gegebenenfalls R1 oder/und R2 durch Y ersetzt sein können.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man eine zweistufige Schutzgruppe verwendet, die mindestens eine fluoreszierende Gruppe trägt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Y, R3 oder/und Z die fluoreszierende Gruppe tragen.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Gruppe durch Substitution am Trityl-Gerüst eingeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die fotoaktivierbare Gruppe der zweistufigen Schutzgruppe ausgewählt wird aus Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC), α-Methyl-6- nitropiperonyloxycarbonyl (MeNPOC), 3,5-Dimethoxybenzoincarbonat (DMBOC), 2-(o-Nitrophenyl)propyloxycarbonyl (NPPOC), o- Nitrobenzyl und Derivaten davon und 2-(o-Nitrophenyl)ethyl und Derivaten davon.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Biopolymere ausgewählt werden aus Nukleinsäuren, Nukleinsäureanaloga, Peptiden und Sacchariden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Biopolymere ausgewählt werden aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Synthesebausteine Phosphoramidite verwendet werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass Phosphoramiditbausteine verwendet werden, die die zweistufige Schutzgruppe am 5'-O-Atom tragen.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese der Biopolymeren die Verwendung von Spacer- bzw. Linkerbausteinen umfasst.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese der Biopolymeren auf einer Festphase durchgeführt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine ortsabhängige Synthese von mehreren Biopolymeren mit jeweils einer unterschiedlichen Sequenz von Synthesebausteinen auf einem einzigen Träger durchgeführt wird.
17. Verbindungen der allgemeinen Formel I


wobei R1 und R2 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, OR3, O(CH2)nCOOR3 und NHZ,
R3 eine C1-C8 Alkylgruppe, eine C2-C8-Alkenylgruppe, eine C2-C8- Alkinylgruppe oder/und eine C6-C20 Arylgruppe enthält, die gegebenenfalls Substituenten aufweisen kann,
X einen Synthesebaustein zur Synthese von Biopolymeren oder eine Abgangsgruppe darstellt,
Y jeweils unabhängig eine fotoaktivierbare Schutzgruppe ist,
Z eine Aminoschutzgruppe ist,
n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist und
wobei gegebenenfalls R1 oder/und R2 durch Y ersetzt sein können.
18. Verbindungen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine fluoreszierende Gruppe tragen.
19. Verbindungen nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass Y, R3 oder/und Z eine fluoreszierende Gruppe tragen.
20. Verbindungen nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine fluoreszierende Gruppe durch Substitution am Trityl- Grundgerüst eingeführt ist.
21. Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel 1 als Synthesebausteine bzw. zur Herstellung von Synthesebausteinen für die Synthese von Biopolymeren.
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