DE10119999A1

DE10119999A1 - Identifying agents that modulate cellular transport, processing and secretion processes, useful as lead compounds for development of therapeutic and diagnostic compounds

Info

Publication number: DE10119999A1
Application number: DE10119999A
Authority: DE
Inventors: Walter Nickel
Original assignee: Universitaet Heidelberg
Current assignee: Universitaet Heidelberg
Priority date: 2001-04-23
Filing date: 2001-04-23
Publication date: 2002-10-24

Abstract

Identifying and developing substances (A), or their mixtures, that modulate transport, processing and/or secretion processes comprises stable incorporation into the genome of a eukaryotic or prokaryotic cell, and expression, of at least one cDNA construct (B), encoding the test compound with a luminophore (L) linked at N or C terminus, together with a receptor (R) and transactivator (TA). An Independent claim is also included for (A) or their mixtures prepared by the new method.

Description

Verfahren zur Identifizierung und Entwicklung von Substanzen oder Substanz gemischen, die zelluläre Transportprozesse und/oder Prozessierungsprozesse und/oder Sekretionsprozesse beeinflussen, dadurch gekennzeichnet, dass eines oder mehrere cDNA-Konstrukte von zu untersuchenden Molekülen N- oder C-terminal mit einem Luminophor verknüpft und stabil in Verbindung mit einem Rezeptor und einem Transaktivator in das Genom von eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen eingebaut und exprimiert wird.Process for the identification and development of substances or substance mix, the cellular transport processes and / or processing processes and / or secretion processes, characterized in that one or several cDNA constructs of molecules to be examined with N- or C-terminal linked to a luminophore and stable in connection with a receptor and one Transactivator in the genome of eukaryotic or prokaryotic cells is built in and expressed.

Proteinprozessierung, Proteintransport und Proteinsekretion sind essentielle Prozesse für die eukaryontische Zelle. Proteinprozessierung reguliert die Funktion von Proteinen, durch intrazellulären Proteintransport gelangen z. B. Oberflächenrezeptoren an die Plasmamembran. Proteinsekretion ist notwendig zur Ausschüttung von Antikörpern, Lipoproteinen und anderen Serumkomponenten. Auch Bestandteile der extrazellulären Matrix, die Zellen in einem Gewebeverband organisieren, werden nach Prozessierung und intrazellulären Transportschritten von Zellen sezerniert. Für einen höheren Organismus sind die genannten Prozesse deshalb essentiell, was in diversen Systemen auch experimentell bewiesen wurde. Bedingt durch die wichtige physiologische Verbreitung, ist es bezüglich einer biomedizinische Anwendung nicht sinnvoll nach unselektiven unspezifischen Inhibitoren zu suchen, die den generellen Prozess der Proteinsekretion hemmen. Diese wären klinisch wertlos, da ihre Anwendung massive Nebenwirkungen zur Folge hätte oder sogar lethal wäre. Deshalb ist es notwendig nach spezifischen Hemmstoffen zu suchen, die nur bestimmte Sekretionsprozesse hemmen, wobei deren Funktion nicht essentiell sein darf. Über die biomedizinischen Anwendungen hinaus haben Inhibitoren generell große Bedeutung für die Grundlagenforschung, da man mit ihrer Hilfe molekulare Mechanismen wichtiger zellulärer Prozesse studieren kann. Bisher existieren keine vergleichbaren Systeme die zur systematischen Identifizierung von Hemmstoffen der genannten Prozesse geeignet wären. Das Problem wurde bisher nicht gelöst. Hauptansatzpunkte bei dem Versuch der Neutralisierung bestimmter sezernierter Moleküle wie z. B. Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2) waren bisher, die Interaktion mit ihren downstream-Effektoren zu unterbinden, um sie auf diese Weise zu neutralisieren, was bisher allerdings nicht gelungen ist.Protein processing, protein transport and protein secretion are essential processes for the eukaryotic cell. Protein processing regulates the function of proteins, through intracellular protein transport z. B. surface receptors to the Plasma membrane. Protein secretion is necessary for the release of antibodies, Lipoproteins and other serum components. Also components of the extracellular Matrixes that organize cells in a tissue cluster are made after processing and intracellular cell transport steps. For a higher one Organism, the processes mentioned are therefore essential, what in various systems has also been proven experimentally. Due to the important physiological Widespread, it does not make sense according to a biomedical application to look for unselective nonspecific inhibitors that affect the general process of Inhibit protein secretion. These would be clinically worthless because of their massive application Would have side effects or even be lethal. Therefore it is necessary after to look for specific inhibitors that only inhibit certain secretion processes, their function may not be essential. About the biomedical In addition, inhibitors are generally of great importance for applications Basic research, because with their help molecular mechanisms are more important can study cellular processes. So far no comparable systems exist suitable for the systematic identification of inhibitors of the processes mentioned would. The problem has not yet been solved. Main starting points in the attempt the neutralization of certain secreted molecules such as B. Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2) have so far been interacting with their downstream effectors prevent them in order to neutralize them in this way, but not so far succeeded.

Aufgabe der Erfindung ist die gezielte Suche (Screening) nach Inhibitoren oder neuen Proteinen, die den intrazellulären Transport und/oder Prozessierung und/oder den zellulären Sekretionsvorgang hemmen beziehungsweise beeinflussen. Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.The object of the invention is the targeted search (screening) for inhibitors or new ones Proteins, which the intracellular transport and / or processing and / or the inhibit or influence cellular secretion. This object is achieved by a method with the features of claim 1.

protein secretion

Jedes Protein wird innerhalb von Zellen synthetisiert, weshalb extrazellulär lokalisierte Proteine (z. B. Antikörper, die sich in Körperflüssigkeiten wie dem Blutserum befinden) von Zellen ausgeschüttet werden müssen. Diesen Prozess bezeichnet man als Proteinsekretion.Every protein is synthesized within cells, which is why extracellularly localized proteins (e.g. antibodies that are found in body fluids such as blood serum) must be released by cells. This process is called protein secretion.

protein transport

Konventionell sezernierte Proteine werden in den sekretorischen Transportweg eingeschleust. Dazu gehören Organellen wie das endoplasmatische Retikulum und der Golgi-Apparat. Als intrazellulären Proteintransport bezeichnet man den Transport von Proteinen zwischen den Organellen einer Zelle.Conventionally secreted proteins are secreted in the Transport route introduced. These include organelles such as the endoplasmic Reticulum and the Golgi apparatus. This is called intracellular protein transport the transport of proteins between the organelles of a cell.

protein processing

Nach ihrer Biosynthese, d. h. der Verknüpfung der Aminosäuren zu einer langen Kette, werden Proteine dreidimensional gefaltet. Anschließend können sie weiter modifiziert werden, ein Prozess den man Proteinprozessierung nennt. Dazu gehören z. B. die Verknüpfung mit Zuckerresten, Phosphorylierung oder die proteolytische Spaltung der Kette in kleinere Fragmente.After their biosynthesis, i.e. H. the linkage of the amino acids proteins are folded three-dimensionally into a long chain. Then you can they are further modified, a process called protein processing. To include z. B. the linkage with sugar residues, phosphorylation or the proteolytic cleavage of the chain into smaller fragments.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt ein systematisches High Throughput Screening (HTS) zur Identifizierung und anschließenden Weiterentwicklung von Hemmstoffen, die mit dem intrazellulären Transport, der Prozessierung oder direkt mit dem Exportvorgang von sekretorischen Proteinen interferieren. Obwohl sich das im folgenden geschilderte Verfahren für praktisch alle sekretorischen Proteine eignet, ist es besonders interessant für eine Reihe klinischer relevanter Genprodukte und hat damit große biomedizinische Bedeutung. Die Identifizierung und Weiterentwicklung von niedermolekularen, zellpermeablen Verbindungen, die den intrazellulären Transport, die Prozessierung oder den Exportvorgang von sekretorischen Proteinen inhibieren liegen im Schwerpunkt. Verwendet werden cDNA-Konstrukte von zu untersuchenden exprimierbaren Zieltargets (Beispiele hierfür sind der angiogene Wachstumsfaktor Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2), das Zytokin Migration Inhibiting Factor (MIF) sowie das Alzheimer Vorläufer Protein APP). Die cDNA-Konstrukte werden N- bzw. C-terminal mit einem Luminophore (z. B. enhanced green fluorescent protein (eGFP)) verknüpft. Die Reporterkonstrukte werden stabil in das Genom von Säugetierzellen (z. B. HeLa, CHO und NIH-3T3) eingebracht, hierzu wird ein Rezeptor z. B. der ecotrope Retrovirusrezeptor MCAT stabil in die Zielzellen eingebaut und macht diese permissiv für ein Retrovirus mit ecotropem envelope Protein. Dies dient der Einführung von Genen oder ganzen cDNA-Bibliotheken unter Verwendung des Retrovirus als Gentransfer-Vehikel, und zwar unter S1-Bedingungen. Dadurch kann die Funktion von z. B. durch Mutagenese zerstörten Genen durch Komplementation wiederhergestellt werden. Auf diese Weise können auch genetisch kodierte Zufallspeptide in den Zielzellen exprimiert werden und bestimmte Peptide als Inhibitoren des untersuchten Prozesses identifiziert werden. Des weiteren wird ein für die induzierte Expression der GFP-markierten Reporter-Moleküle geeigneter Transaktivator (z. B. der Tetracyclin induzierbare Transaktivator "TetON") verwendet. Die Säugetierzellen werden mit einem oder mehreren cDNA Konstrukten stabil transfiziert. Der Rezeptor ermöglicht den Gentransfer z. B mit Retroviren, der Transaktivator die regulierte Expression der Luminophore-markierten Reportermoleküle für unkonventionelle Sekretion. Durch An- und Abschalten der Expression kann ein Pulse-Chase-Experiment (d. h. die Produktion des Reportermoleküls für einen definierten Zeitraum gefolgt von der Entfernung des Expressionsinduktors, wodurch die Transkription/Translation des Reportergens abgeschaltet wird. Hierdurch kann das Schicksal (z. B. der Sekretionsvorgang) der exprimierten Population des Reportermoleküls verfolgt werden, da kein Reporterprotein mehr nachproduziert wird. Dies bedeutet, dass die verwendeten Zellen nach einer bestimmten Zeit kein Fluoreszenz-markiertes Reporterprotein mehr enthalten.) durchgeführt werden, bei dem die gesamte Population des Luminophorereporters sezerniert wird. Somit kann die Hemmung des Prozesses durch Akkumulation des Reporters nachgewiesen und Einzelzellen mit diesem Phänotyp via Fluorescence- Activated Cell Sorting (FACS) isoliert werden.The method according to the invention allows a systematic high throughput Screening (HTS) for the identification and subsequent further development of Inhibitors involved in intracellular transport, processing or directly interfere with the export process of secretory proteins. Although in is suitable for practically all secretory proteins, it is particularly interesting for a number of clinically relevant gene products and thus has great biomedical importance. The identification and further development of low molecular weight, cell permeable compounds that facilitate intracellular transport Inhibit processing or the export process of secretory proteins in focus. CDNA constructs from those to be examined are used expressible target targets (examples of this are the angiogenic growth factor Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2), the cytokine migration inhibiting factor (MIF) as well the Alzheimer precursor protein APP). The cDNA constructs become N- and C-terminal linked to a luminophore (e.g. enhanced green fluorescent protein (eGFP)). The reporter constructs are stable in the genome of mammalian cells (e.g. HeLa, CHO and NIH-3T3) introduced, for this a receptor z. B. the ecotrope Retrovirus receptor MCAT is stably built into the target cells and makes them permissive for a retrovirus with ecotropic envelope protein. This is for the introduction of Genes or whole cDNA libraries using the retrovirus as Gene transfer vehicle, under S1 conditions. This allows the function of z. B. genes destroyed by mutagenesis restored by complementation become. In this way, genetically coded random peptides can also be used in the Target cells are expressed and certain peptides as inhibitors of the examined Process can be identified. Furthermore, one for the induced expression of the GFP-labeled reporter molecules suitable transactivator (e.g. the tetracycline inducible transactivator "TetON") is used. The mammalian cells are identified with a or several cDNA constructs stably transfected. The receptor enables that Gene transfer e.g. B with retroviruses, the transactivator the regulated expression of Luminophore-labeled reporter molecules for unconventional secretion. By arrival and disabling expression can be a pulse chase experiment (i.e., production of the reporter molecule for a defined period of time followed by the removal of the Expression inducer, which causes the transcription / translation of the reporter gene is switched off. As a result, fate (e.g. the secretion process) of the expressed population of the reporter molecule can be tracked since there is no reporter protein more is produced. This means that the cells used after a no longer contain fluorescence-labeled reporter protein for a certain time.) be carried out in which the entire population of the luminophore reporter is secreted. Thus the inhibition of the process by accumulation of the Reporters detected and single cells with this phenotype via fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) can be isolated.

example 1

Ein Beispiel ist die Neutralisierung von sezernierten, klinisch relevanten Genprodukten, wie zum Beispiel Fibroblast Groth Factor 2 [FGF-2], der für das Tumorwachstum und die Metastasenaussendung essentiell ist. FGF-2 ist ein entscheidener Aktivator der Gefäßneubildung und wird deshalb als angiogener Wachstumsfaktor bezeichnet. In verschiedenen Modellsystemen konnte gezeigt werden, dass Angiogenese ein für Tumorwachstum und Metastasenaussendung essentieller Prozess ist. Deshalb ist die Entwicklung anti-angiogener Wirkstoffe unter Verwendung von FGF-2 als Target- Protein von immenser biomedizinischer Bedeutung. Da der molekulare Mechanismus der zellulären Ausschüttung von FGF-2 unbekannt ist, ist eine gezielte Wirkstoffentwicklung zur Hemmung der FGF-2-abhängigen Angiogenese gegenwärtig allerdings stark erschwert. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt sowohl die Identifizierung der molekularen Maschinerie der FGF-2 Ausschüttung als auch ein Wirkstoff-Screening zur Identifizierung von zellpermeablen, niedermolekularen Inhibitoren der FGF-2-Sekretion und damit von FGF-2-abhängigen Prozessen der Angiogenese.One example is the neutralization of secreted, clinically relevant gene products, such as Fibroblast Groth Factor 2 [FGF-2], which is used for tumor growth and the metastatic transmission is essential. FGF-2 is a key activator of the Vascularization and is therefore referred to as an angiogenic growth factor. In Various model systems have shown that angiogenesis is a Tumor growth and metastatic transmission is an essential process. That is why Development of anti-angiogenic agents using FGF-2 as a target Protein of immense biomedical importance. Because the molecular mechanism the cellular secretion of FGF-2 is unknown, is targeted Drug development to inhibit FGF-2 dependent angiogenesis currently however very difficult. The inventive method allows both Identification of the molecular machinery of the FGF-2 release as well Drug screening for the identification of cell permeable, low molecular weight Inhibitors of FGF-2 secretion and thus of FGF-2-dependent processes of Angiogenesis.

Verwendet werden cDNA-Konstrukte, in denen FGF-2N- bzw. C-terminal mit enhanced green fluorescent protein (eGFP) verknüpft ist (Abb. 1). Die Reporterkonstrukte werden stabil in das Genom von Säugetierzellen (HeLa, CHO und NIH-3T3, Abb. 1) eingebracht, die den ecotropen Retrovirusrezeptor MCAT sowie einen für die induzierte Expression der GFP-markierten Reporter-Moleküle geeigneten Transaktivator stabil exprimieren. In Zellkulturzellen wurde der FGF-2-Export als sowohl konstitutiv und quantitativ beobachtet, was sie zu einem idealen Modellsystem zur Identifizierung der Core-Exportmaschinerie macht. Im ersten Schritt kann somit der Exportvorgang in vivo rekonstituiert werden, wobei die Expressionskontrolle sogenannte Pulse-Chase-Experi mente auf Fluoreszenz-Basis (Abb. 1, unten) erlaubt. Damit kann nach Abschalten (d. h. Entfernung des Induktors Doxycyclin) der Proteinexpression der Sekretionsvorgang über die Verfolgung GFP-abgeleiteter Fluoreszenz in vivo beobachtet werden, d. h. in einer Zelle mit funktionierender unkonventioneller Sekretion wird das GFP-Reporter- Molekül quantitativ sezerniert und die Zellen verlieren ihre Fluoreszenz, da in Abwesenheit von Doxycyclin kein neues Protein synthetisiert wird. Fig. 1 zeigt die Schematische Darstellung der In vivo-Rekonstitution des FGF-2 Sekretionsvorganges. Verwendet werden Säugetierzellen, die mit 3 cDNA Konstrukten stabil transfiziert sind. MCAT erlaubt die Transduktion mit Retroviren, der TetOn Transaktivator die regulierte Expression der GFP-markierten Reportermoleküle für unkonventionelle Sekretion. Durch An- und Abschalten der Expression kann ein Pulse-Chase-Experiment durchgeführt werden, bei dem die gesamte Population des GFP-Reporters sezerniert wird. Somit kann die Hemmung des Prozesses durch Akkumulation des Reporters nachgewiesen werden und Einzelzellen mit diesem Phänotyp via FACS isoliert werden (siehe auch Fig. 2).CDNA constructs are used in which the FGF-2N or C-terminal is linked to enhanced green fluorescent protein (eGFP) ( Fig. 1). The reporter constructs are stably introduced into the genome of mammalian cells (HeLa, CHO and NIH-3T3, Fig. 1), which stably express the ecotropic retrovirus receptor MCAT and a transactivator suitable for the induced expression of the GFP-labeled reporter molecules. In cell culture cells, FGF-2 export has been observed to be both constitutive and quantitative, making it an ideal model system for identifying the core export machinery. In the first step, the export process can be reconstituted in vivo, with the expression control allowing so-called pulse-chase experiments on a fluorescence basis ( Fig. 1, below). After switching off (ie removing the inducer doxycycline) the protein expression, the secretion process can be observed in vivo by monitoring GFP-derived fluorescence, ie in a cell with functioning unconventional secretion the GFP reporter molecule is quantitatively secreted and the cells lose their fluorescence , since no new protein is synthesized in the absence of doxycycline. Fig. 1 shows the schematic representation of the in vivo reconstitution of the FGF-2 secretion process. Mammalian cells that are stably transfected with 3 cDNA constructs are used. MCAT allows transduction with retroviruses, the TetOn transactivator the regulated expression of the GFP-labeled reporter molecules for unconventional secretion. By switching the expression on and off, a pulse-chase experiment can be carried out in which the entire population of the GFP reporter is secreted. Thus the inhibition of the process can be demonstrated by accumulation of the reporter and single cells with this phenotype can be isolated via FACS (see also FIG. 2).

Im zweiten Schritt werden nun Genprodukte identifiziert, die am Sekretionsvorgang von FGF-2 beteiligt sind. Hierzu werden zwei verschiedene Strategien angewendet, die in Fig. 2 zusammengefasst sind. Einerseits werden die Modellzellen unten geeigneten Bedingungen mutagenisiert, so dass es zu Defekten in einzelnen Genen kommt (Abb. 2, linker Arm). CHO-Zellen sind für diese Strategie besonders geeignet, da in diesem Zelltyp die meisten Gene in nur einer Kopie vorkommen. Im Falle von 3T3- und HeLa- Zellen können hingegen nur dominant-negative Mutationen eine Auswirkung haben. Fig. 2 zeigt die Strategie zur Identifizierung von Genen, die an der unkonventionellen Sekretion von FGF-2 beteiligt sind. Dies soll einerseits durch Mutagenese von z. B. CHO-Zellen und anschließender Isolierung von Einzellen (FACS) mit einem Defekt im FGF-2 Export, d. h. das GFP-Reportermolekül akkumuliert intrazellulär (linker Arm). Das defekte Gen wird anschließend über Komplementation mit einer cDNA-Bibliothek identifiziert. Hierzu wird ein retrovirales Gentransfersystem eingesetzt, dessen Vorteile im Text beschrieben sind. Dieses System soll auch zur Identifizierung von cDNAs eingesetzt werden, deren Expression einen dominant-negativen Effekt auf den FGF-2 Export hat (Fig. 2 rechter Arm).In the second step, gene products are now identified that are involved in the secretion process of FGF-2. Two different strategies are used for this, which are summarized in FIG. 2. On the one hand, the model cells are mutagenized under suitable conditions, so that defects in individual genes occur ( Fig. 2, left arm). CHO cells are particularly suitable for this strategy, since most genes are found in just one copy in this cell type. In the case of 3T3 and HeLa cells, however, only dominant-negative mutations can have an effect. Figure 2 shows the strategy for identifying genes involved in the unconventional secretion of FGF-2. This should on the one hand through mutagenesis of z. B. CHO cells and subsequent isolation of single cells (FACS) with a defect in FGF-2 export, ie the GFP reporter molecule accumulates intracellularly (left arm). The defective gene is then identified by complementation with a cDNA library. A retroviral gene transfer system is used for this purpose, the advantages of which are described in the text. This system is also to be used to identify cDNAs whose expression has a dominant-negative effect on the FGF-2 export ( FIG. 2 right arm).

Einzelzellen mit einem Defekt im FGF-2-Export können durch Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) isoliert werden, da das FGF-2-GFP-Reportermolekül unter diesen Bedingungen intrazellulär akkumuliert. Zur Identifizierung des getroffenen Gens wird nun eine cDNA-Bibliothek mit Hilfe eines retroviralen Gentransfersystems (durch die Ausstattung der Zielzellen mit MCAT (s. o.) werden diese permissiv für ein Retrovirus mit ecotropem envelope Protein) in die mutagenisierten Zellen eingeschleust und wiederum nach Einzelzellen selektioniert (FACS), bei denen die intrazelluläre Akkumulation des Reportermoleküls aufgehoben ist (gain of function). Durch Verwendung des retroviralen Vektors können Bedingungen hergestellt werden, unter denen statistisch nur eine cDNA pro Zelle inkorporiert wird. Andererseits werden die cDNAs stabil in das Genom der Zielzellen integriert, weshalb sie durch die Zellvermehrung nicht verloren gehen. Nach Anzucht einer kritischen Zellmenge kann per PCR (mit Hilfe von geeigneten Primern der flankierenden retroviralen Sequenzen) die inserierte cDNA identifiziert werden.Single cells with a defect in FGF-2 export can be activated by fluorescence Cell Sorting (FACS) can be isolated because the FGF-2 GFP reporter molecule is among these Conditions accumulated intracellularly. To identify the gene hit now a cDNA library using a retroviral gene transfer system (by the Equipping the target cells with MCAT (see above) makes them permissive for a retrovirus with ecotropic envelope protein) and introduced into the mutagenized cells again selected for single cells (FACS) in which the intracellular Accumulation of the reporter molecule is canceled (gain of function). By Using the retroviral vector, conditions can be established under which statistically only incorporate one cDNA per cell. On the other hand, the cDNAs are stably integrated into the genome of the target cells, which is why they are Cell proliferation is not lost. After growing a critical amount of cells by PCR (using suitable primers of the flanking retroviral sequences) the inserted cDNA are identified.

In einem alternativen Ansatz (Fig. 2, rechter Arm) soll durch Überexpression von cDNAs (zum Teil in verkürzter Form in der Bibliothek vorliegend) ein Defekt im FGF-2- Export erzeugt werden. Auch hier können Einzelzellen mit Phenotyp über FACS isoliert werden. Die Identifizierung der ursächlichen cDNA erfolgt wie bereits beschrieben über retroviralen Gentransfer von cDNA-Bibliotheken. Das hier geschilderte Verfahren erlaubt Wirkstoffentwicklung zur Hemmung der FGF-2-Sekretion auf zwei Wegen. Einerseits kann über die molekulare Identifizierung der Exportmaschinerie gezielt drug design durchgeführt werden. Andererseits kann das beschriebene Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren in einem automatisierten High Throughput Screening verwendet werden, in dem die Hemmstoff ausgelöste Akkumulation des GFP markierten FGF-2-Moleküls in der Zelle mit Hilfe eines mit einem plate reader ausgestatteten Fluorometer nachgewiesen wird. Letzerer Ansatz kann entweder durch das systematische Austesten von Wirkstoffsammlungen erfolgen. Es kann auch eine genetisch kodierte Peptamer-Bibliothek über retroviralen Gentransfer in die Testzellen eingeschleust und nach inhibitorischen Peptiden gesucht werden. Es kann somit die Struktur eines inhibitorischen Peptides ermittelt werden und als template zur Synthese von strukturverwandten aber membranpermeablen Verbindungen genutzt werden. Letztere können dann wieder in dem hier geschildeten Verfahren (Fig. 1 und 2) getestet werden, bevor sie einem klinischen Test zugeführt werden.In an alternative approach ( FIG. 2, right arm), a defect in the FGF-2 export is to be generated by overexpression of cDNAs (some of which are present in a shortened form in the library). Here too, single cells with a phenotype can be isolated using FACS. As already described, the causal cDNA is identified via retroviral gene transfer from cDNA libraries. The procedure outlined here allows drug development to inhibit FGF-2 secretion in two ways. On the one hand, drug design can be carried out in a targeted manner via the molecular identification of the export machinery. On the other hand, the described method for identifying inhibitors can be used in an automated high-throughput screening in which the accumulation of the GFP-labeled FGF-2 molecule triggered in the inhibitor is detected in the cell with the aid of a fluorometer equipped with a plate reader. The latter approach can be done either by systematically testing drug collections. A genetically encoded peptamer library can also be introduced into the test cells via retroviral gene transfer and the search for inhibitory peptides. The structure of an inhibitory peptide can thus be determined and used as a template for the synthesis of structurally related but membrane-permeable compounds. The latter can then be tested again in the method shown here ( FIGS. 1 and 2) before they are sent to a clinical test.

Example 2 MIF

Bei dem Zytokin MIF handelt es sich um einen Mediator von Entzündungsprozessen, dem eine entscheidende Bedeutung bei bakteriellen Infektionen zukommt. Induziert durch bakterielle Lipopolysaccharide wird MIF von Makrophagen sezerniert, wobei dieser Prozess ähnlich wie bei FGF-2 auf einem unkonventionellen Weg erfolgt. Die Neutralisierung von MIF ist von großer biomedizinischer Bedeutung, da - ähnlich zu FGF-2 - nicht mit schweren Nebenwirkungen zu rechnen ist. Die Identifizierung der molekularen Exportmaschinerie sowie die Entwicklung von Hemmstoffen der MIF- Sekretion kann ohne Modifikationen mit dem oben geschilderten Verfahren durchgeführt werden.The cytokine MIF is a mediator of inflammatory processes, which is of crucial importance in bacterial infections. Induced bacterial lipopolysaccharides secrete MIF from macrophages, whereby this process, similar to FGF-2, takes place in an unconventional way. The Neutralizing MIF is of great biomedical importance because it is similar to FGF-2 - no serious side effects are to be expected. The identification of the molecular export machinery and the development of inhibitors of MIF Secretion can be done without modification using the procedure outlined above be performed.

Example 3 Alzheimer's precursor protein APP

Bei APP handelt es sich um ein nicht essentielles Typ I Transmembran-Protein unbekannter Funktion mit einer Signalsequenz für den klassischen sekretorischen Transportweg, das intrazellulär mehrfach durch proteolytische Spaltungen in der luminalen Domäne sowie der Transmembrandomäne prozessiert wird. Die beteiligten Enzyme werden als alpha, beta- und gamma-Secretase bezeichnet. Im Zusammenhang mit der Alzheimer Krankheit sind die beta- und gamma-Secretase-katalysierten Reaktionen von besonderer Bedeutung, da diese zur Freisetzung und anschließenden Sekretion des sogenannten Abeta₄₀ Peptids führen. Bei Alzheimer Patienten wird die vermehrte Bildung eines längeren Peptids, Aβ_42-43, beobachtet, das man auch als Amyloid-Peptid bezeichnet. Abeta_42-43 hat eine signifikant höhere Tendenz zur Agregation und führt deshalb nach Sekretion zur Bildung sogenannter plaques im Nervengewebe, die mit dem Verlauf der Alzheimer Krankheit korreliert wurden. Da beta- Secretase-Spaltung für die anschliessende gamma-Secretase-Aktivität obligatorisch ist, sind Inhibitoren beider Aktivitäten von großer klinischer Bedeutung. In einer Modifikation des beschriebenen Verfahrens werden deshalb Fusionsproteine aus GFP und APP- Fragmenten verwendet, wobei Hemmstoffe identifiziert werden können, die die Sekretion des Amyloid-Peptids verhindern. Technisch geschieht dies nach dem prinzipiell gleichen Verfahren, in dem niedermolekulare Verbindungen identifiziert werden, die zu einer intrazellulären Akkumulation eines modifizierten GFP-markierten APP-Moleküls führen, d. h. die die extrazelluläre Abeta_42-43-Plaquebildung hemmen.APP is a non-essential type I transmembrane protein of unknown function with a signal sequence for the classic secretory transport path that is processed intracellularly several times by proteolytic cleavages in the luminal domain and the transmembrane domain. The enzymes involved are referred to as alpha, beta and gamma secretase. The beta and gamma-secretase-catalyzed reactions are of particular importance in connection with Alzheimer's disease, since they lead to the release and subsequent secretion of the so-called Abeta ₄₀ peptide. The increased formation of a longer peptide, Aβ _42-43 , also known as amyloid peptide, is observed in Alzheimer's patients. Abeta _42-43 has a significantly higher tendency towards agglomeration and therefore leads to the formation of so-called plaques in the nerve tissue after secretion, which have been correlated with the course of Alzheimer's disease. Since beta-secretase cleavage is mandatory for the subsequent gamma-secretase activity, inhibitors of both activities are of great clinical importance. In a modification of the described method, fusion proteins from GFP and APP fragments are therefore used, it being possible to identify inhibitors which prevent the secretion of the amyloid peptide. Technically, this is done in principle using the same procedure, in which low-molecular compounds are identified which lead to an intracellular accumulation of a modified GFP-labeled APP molecule, ie which inhibit the extracellular Abeta _42-43 plaque formation.

Das erfindungsgemäße Verfahren, stellt eine zuverlässige Methode zur Verfügung, die ein automatisiertes High Throughput Screening zur Identifizierung von Hemmstoffen intrazellulärer Transport-, Prozessierungs- oder Exportmaschinerien erlaubt. Dieses eignet sich prinzipiell für alle sekretorischen Proteine. Ein wesentlicher Vorteil ist, dass bereits die Sekretion solcher Moleküle inhibiert wird. Deshalb ist es notwendig nach spezifischen Hemmstoffen zu suchen, die nur bestimmte Sekretionsprozesse hemmen, wobei deren Funktion nicht essentiell sein darf. Eine technische und wirtschaftliche bedeutende Einsatzmöglichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht nicht zuletzt auch darin, dass mit Hilfe eines solchen "Screening"-Verfahrens aus einer großen Anzahl bereitstehender Stoffe solche heraus selektiert werden können, die spezifisch die zellulären Transport-, Prozessierungs- und Sekretionsprozesse beeinflussen. Diese Stoffe können als Ausgangsmaterial (Leitstruktur) für die Entwicklung pharmakologisch einsetzbarer Substanzen dienen und bieten damit Vorrausetzungen für die Entwicklung alternativer Pharmazeutika zur Diagnose und Therapie, insbesondere bei den aufgezeigten Beispielen wie dem Alzheimer Vorläufer Protein APP, dem angiogenen Wachstumsfaktor FGF-2 oder dem Zytokin MIF. Entsprechende Inhibitoren könnten z. B. zur Vermeidung der bei Alzheimer Patienten beobachteten sezernierten Ablagerungen im Gehirn führen. Durch die Hemmung der FGF-2- bzw. MIF-Ausschüttung könnten Krebs-fördernde Angiogenese (FGF-2) bzw. unerwünschte Entzündungsreaktionen (MIF) blockiert werden. Das Verfahren bietet den Vorteil, dass durch Automatisierung in kurzer Zeit eine extrem hohe Anzahl von potentiellen Inhibitoren getestet werden kann. Außerdem erlaubt es unmittelbar die Analyse von Peptid-abgeleiteten Inhibitoren bezüglich der Membranpermeabilität als Vorbereitung einer klinischen Testphase.The method according to the invention provides a reliable method that Automated high throughput screening to identify inhibitors intracellular transport, processing or export machinery allowed. This is basically suitable for all secretory proteins. A major advantage is that the secretion of such molecules is already inhibited. Therefore it is necessary after to look for specific inhibitors that only inhibit certain secretion processes, their function may not be essential. A technical and economical there is no significant possible application of the method according to the invention finally also in the fact that with the help of such a "screening" procedure from a large number of available substances can be selected from those that specifically the cellular transport, processing and secretion processes influence. These substances can be used as a starting material (lead structure) for the The development of pharmacologically usable substances serve and offer Requirements for the development of alternative pharmaceuticals for diagnosis and Therapy, especially in the examples shown, such as the Alzheimer precursor Protein APP, the angiogenic growth factor FGF-2 or the cytokine MIF. Corresponding inhibitors could e.g. B. to avoid that in Alzheimer's patients observed secreted deposits in the brain. By inhibiting the FGF-2 or MIF release could be cancer-promoting angiogenesis (FGF-2) or block unwanted inflammatory reactions (MIF). The process offers the Advantage that an extremely high number of potential inhibitors can be tested. It also allows the Analysis of peptide-derived inhibitors for membrane permeability as Preparation of a clinical test phase.

Claims

1. A method for identifying and developing substances or substance mixtures which influence cellular transport processes and / or processing processes and / or secretion processes, characterized in that one or more cDNA constructs of molecules to be investigated are linked N- or C-terminally to a luminophore and is stably incorporated and expressed in conjunction with a receptor and a transactivator in the genome of eukaryotic or prokaryotic cells.

2. Substances or substance mixtures according to claim 1, characterized in that the substances or substance mixtures of low molecular weight molecules and / or Macromolecules (e.g. peptides) and / or oligonucleotides and / or oligopeptides or exist.

3. cDNA constructs of molecules to be examined according to claim 1, characterized characterized that these cellular transport processes and / or Processing processes and / or secretion processes are subject to, for example following proteins, the Alzheimer precursor protein APP, the angiogenic Growth factor FGF-2 or the cytokine MIF.

4. Luminophore according to claim 1, characterized in that it is for chemiluminescence and / or fluorescence in a reporter gene assay is suitable for. B. enhanced green fluorescent protein (eGFP).

5. cDNA constructs and luminophore according to claim 3 and 4, characterized in that both N- or C-terminal linked form a reporter construct.

6. Receptor according to claim 1, characterized in that it is stable in the eukaryotic or prokaryotic cells and is permissive for a gene transfer Vehicle makes such. B the ecotropic retrovirus receptor MCAT

7. gene transfer vehicle according to claim 6, characterized in that so under other genes or entire cDNA libraries can be transferred into the cell and thus among other things the function of z. B. genes destroyed by mutagenesis can be restored by complementation and / or also genetically coded random peptides are expressed in the cells and certain peptides as Inhibitors of the process under investigation can be identified, e.g. B a retrovirus with ecotropic envelope protein.

8. Transactivator according to claim 1, characterized in that it is an induced Expression (turning on and / or off) of the reporter construct in a eukaryotic or prokaryotic cells, e.g. B. TetON (tetracycline induced).

9. The method according to claim 1, characterized in that it for carrying out a Screenings, e.g. B. High Thoughput Screening (HTS) is used.

10. Substances or substance mixtures, according to claim 2, according to the method Affect claim 1 and identified in a screening, according to claim 8 become.

11. Substances or substance mixtures, according to claim 9, which serve as lead structures for the Development of pharmacologically usable substances or substance mixtures for the Serve diagnosis or therapy.