DE10117723A1 - Probenträger, insbesondere für biochemische Reaktionen - Google Patents

Abstract

Es wird ein Probenträger (10, 20) mit einer Vielzahl von Reservoiren (13) beschrieben, der aus einer Aufnahmeplatte (10) und einer Einsatzplatte (20) besteht, wobei die Aufnahmeplatte (10) zumindest teilweise aus einem optisch transparenten Material besteht und eine Vielzahl von Ausnehmungen zur Bildung der Reservoire (13) aufweist und die Einsatzplatte (20) eine Vielzahl von Vorsprüngen (21) aufweist, die jeweils eine Membran (22) oder ein Plattenelement tragen und im zusammengesetzten Zustand des Trägers so in die Vertiefungen (13) der Aufnahmeplatte (10) hineinragen, dass die Membran (22) oder das Plattenelement jeweils in der Vertiefung (13) mit Abstand von deren Boden- und Seitenwänden angeordnet ist, wobei die Aufnahmeplatte (10) durch einen Verbund aus einer ebenen Lochplatte (11) und einer ebenen Bodenplatte (12) gebildet ist, die die Lochplatte (11) von einer Seite her verschließt und aus einem Material mit einer derartigen optischen Qualität und Planarität besteht, dass ein störungsfreier Durchtritt des Strahlengangs einer konfokal-optischen Messeinrichtung ermöglicht wird.

Description

Die Erfindung betrifft einen Probenträger mit einer Vielzahl von Kompartimenten, die zur Aufnahme von Lösungen oder Suspen­ sionen biologischer und/oder synthetischer Proben und zur Durchführung von Reaktionen, Messungen, Manipulationen oder dergleichen an den Proben eingerichtet sind. Die Erfindung be­ trifft insbesondere einen Zellkulturen-Träger mit Kultivie­ rungskompartimenten, die zur Aufnahme und Kultivierung biolo­ gischer Zellen in flüssigen Medien eingerichtet sind. Die Er­ findung betrifft auch Mess- und Manipulationsverfahren, die an Proben und/oder dem flüssigen Medium in den Kompartimenten durchgeführt werden.

In der modernen Wirkstoffforschung werden zunehmend Hochdurch­ satztests (High-Throughput-Screening, HTS) verwendet, um die Wechselwirkung von verschiedenen Testsubstanzen mit Targetmo­ lekülen, beispielsweise einem Enzym, zu untersuchen. Beim HTS werden eine Vielzahl von Testsubstanzen in getrennte Probenre­ servoire eines Probenträgers eingebracht. Es erfolgt der Zu­ satz der Komponenten der Untersuchung, z. B. des Enzymtests, gegebenenfalls eine Inkubationsphase und schließlich die mess­ technische Erfassung der Wechselwirkung der Testsubstanzen mit dem Enzym. Es erfolgt beispielsweise eine Fluoreszenzmessung in sämtlichen Probenreservoiren. Mit Blick auf hohe Durchsatz­ raten und einen geringen Substanzverbrauch besteht bei her­ kömmlichen HTS-Probenträgern ein Interesse, möglichst viele Probenreservoire mit möglichst geringen Volumina auf einem ge­ meinsamen Träger anzuordnen.

In der unveröffentlichten deutschen Patentanmeldung DE 199 48 087 wird ein Probenträger beschrieben, der durch ei­ nen Verbund aus einer strukturierten Silikonmatte und einer Trägerplatte gebildet wird. Durch die Strukturierung der Sili­ konmatte werden die Probenreservoire geformt. Der herkömmliche Probenträger ist zwar für HTS-Anwendungen geeignet und in Be­ zug auf die Miniaturisierbarkeit und Handhabbarkeit vorteil­ haft. Es bestehen aber Nachteile in Bezug auf die einge­ schränkte Anzahl durchführbarer Testverfahren (Testassays). Es bestehen insbesondere starke Beschränkungen bei der Kultivie­ rung von Zellen und der Umsetzung von Testassays mit Zellen.

Aus EP 590 513 und EP 239 697 sind Einrichtungen zur Zellkul­ tivierung bekannt, deren Aufbau aus einer Grundplatte 10' mit einer Vielzahl von Reservoiren 11' und Zellkultureinsätzen 20' schematisch in Fig. 10 gezeigt ist. Die Zellkultureinsätze 20' sind mit seitlichen Rändern 21' auf der Oberfläche der Grund­ platte 10' eingehängt. Sie besitzen am Boden jeweils eine Membran, auf der adhärent wachsende Zellen kultivierbar sind. Die Grundplatte 10' besteht aus einem transparenten Kunst­ stoffmaterial, durch das im Bereich der Böden 12' optische Transmissionsmessungen durchgeführt werden.

Die dargestellte Kultivierungseinrichtung besitzt die folgen­ den Nachteile. Die Reservoire 11' besitzen charakteristische Volumina im ml-Bereich. Es ergibt sich ein insbesondere für HTS-Anwendungen unannehmbar hoher Substanzverbrauch. Die Mini­ aturisierbarkeit der Einrichtung ist jedoch beschränkt. Die Zellkultureinsätze besitzen eine spezielle Geometrie, um eine ausreichende Versorgung der Zellen mit Nährstoffen zu gewähr­ leisten. Diese Geometrie erlaubt nicht eine skalierte Umset­ zung in kleinere Dimensionen. Eine direkte Miniaturisierung der herkömmlichen Einrichtungen würde diese z. B. für Trans­ portstudien untauglich machen, da der Abstand zwischen der Au­ ßenwand der Einsätze und der Innenwand der Reservoire so ge­ ring wäre, dass ein Transfer von Flüssigkeiten zwischen be­ nachbarten Reservoiren durch Kapillarkräfte auftreten würde.

Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass die herkömmlichen Kultivierungseinrichtungen nur für einfache optische Transmis­ sionsmessungen durch die transparente Grundplatte 10' geeignet sind. Die Grundplatte 10' aus Spritzguss-Kunststoff ergibt Probleme sowohl in Bezug auf die optische Qualität als auch in Bezug auf die Planarität. Optische konfokale Messverfahren, wie z. B. FCS-Verfahren (Fluoreszenz-Korrelations- Spektroskopie), insbesondere in Verbindung mit HTS, sind an den herkömmlichen Kultivierungseinrichtungen nicht durchführ­ bar.

Wenn bei einem Test im Überstand der kultivierten Zellen ge­ messen werden soll, so muss die Membran, auf der die Kultivie­ rung der Zellen erfolgt, relativ zum Boden der Grundplatte ex­ akt positioniert sein. Nur wenn alle Membranen mit der glei­ chen Genauigkeit positioniert sind, werden die Konzentrations­ verteilungen z. B. der von den Zellen in die Reservoire sekre­ tierten Produkte miteinander vergleichbar. Mit den oben be­ schriebenen, aus Kunststoff hergestellten Kultivierungsein­ richtungen ist die exakte Positionierung der Membranen nicht zu gewährleisten. Eine Miniaturisierung wird dadurch weiter beschränkt. Bei einer Miniaturisierung würden durch das Dimen­ sionsverhältnis des Materials der Trägerplatten zu den Reser­ voiren mechanische Verwerfungen auftreten, die zu einer unein­ heitlichen Geometrie der Reservoire führen würden.

Eine weitere Kultivierungseinrichtung (teilweise in schemati­ scher Schnittansicht in Fig. 11 gezeigt) ist aus EP 902 084 bekannt. 24 Reservoire 11' sind ähnlich wie bei einer Mikroti­ terplatte in einer Grundplatte 10' aus Kunststoff angeordnet. Es ist eine Einsatzplatte 20' vorgesehen, die aus einer Viel­ zahl von lateral miteinander verbundenen Einsätzen besteht. Am Boden jedes Einsatzes ist eine Membran 22' zur Kultivierung der Zellen angeordnet. Dieser Aufbau ist zwar in Bezug auf die Gleichförmigkeit der Membranpositionierung günstiger als die oben beschriebenen Einrichtungen mit einzelnen Einsätzen. Al­ lerdings besitzt er auch Nachteile hinsichtlich der Miniaturi­ sierbarkeit und der Anwendung optisch-konfokaler Messverfah­ ren. Eine ähnliche Anordnung mit Reservoiren, die zu einer ge­ meinsamen Einsatzplatte verbunden sind, ist auch aus US 4 828 386 bekannt.

Die Beschränkungen bei der Durchführung herkömmlicher Testver­ fahren gelten auch bei der Untersuchung synthetischer Proben. Analog zur Erfassung der Wechselwirkung biologischer Zellen mit Wirkstoffen kann eine biochemische Aufgabenstellung bei­ spielsweise darin bestehen, die Wechselwirkung von syntheti­ schen Oberflächenmodifizierten Partikeln (Beads) mit Wirk­ stoffen zu untersuchen.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, einen verbesserten Proben­ träger anzugeben, mit dem die Nachteile herkömmlicher Träger überwunden werden und der insbesondere einen erweiterten An­ wendungsbereich in Bezug auf die am Träger durchführbaren Messverfahren besitzt und einen verringerten Substanzverbrauch ermöglicht. Der neue Probenträger soll insbesondere zur Durch­ führung von HTS-Verfahren geeignet sein. Die Aufgabe der Er­ findung ist es auch, neue Anwendungen von Messverfahren mit Probenträgern bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch einen Probenträger mit den Merkmalen gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Patentansprüchen.

Die Grundidee der Erfindung ist es, eine gattungsgemäße Pro­ benträgereinrichtung mit einer Aufnahmeplatte (Grundplatte) und einer Einsatzplatte, die eine Vielzahl von Probeneinsät­ zen, insbesondere Kultivierungseinsätzen, aufweist, dahinge­ hend weiterzuentwickeln, dass die Aufnahmeplatte als Verbund aus einer Lochplatte und einer Bodenplatte gebildet ist, wobei die Bodenplatte zum im Wesentlichen störungsfreien Durchtritt des Strahlengangs einer konfokal-optischen Messeinrichtung eingerichtet ist. Die Aufnahmeplatte besteht somit zumindest teilweise aus einem transparenten Material. Der Aufbau der Aufnahmeplatte aus zwei Komponenten besitzt mehrere Vorteile, die sich im Rahmen der genannten Aufgabe in Bezug sowohl auf die Miniaturisierbarkeit als auch auf die Durchführung erwei­ terter Messverfahren auswirken. Die Lochplatte kann mit hoher Genauigkeit hergestellt werden. Die völlig gleichartig her­ stellbaren Löcher der Lochplatte bilden die Reservoire (Kom­ partimente) in der Aufnahmeplatte. Die Bodenplatte kann unab­ hängig von der Lochplatte mit der erforderlichen Planarität und optischen Qualität hergestellt werden. Das Merkmal des störungsfreien Durchtritts des Strahlengangs der konfokal- optischen Messeinrichtung charakterisiert die optische Quali­ tät der Bodenplatte, die vorzugsweise aus Glas hergestellt ist. Das Material der Bodenplatte erlaubt einen im Wesentli­ chen störungsfreien Durchtritt der Strahlung, wenn das Materi­ al dafür geeignet ist, dass durch die Bodenplatte hindurch konfokal-optische Messungen durchgeführt werden.

Die Probeneinsätze sind als Vorsprünge der Einsatzplatte ge­ bildet, die im zusammengesetzten Zustand der Aufnahme- und Einsatzplatten in die Reservoire der Lochplatte hineinragen, so dass die an den freien Enden der Vorsprünge angeordneten Membranen (oder Plattenelemente) mit einem vorbestimmten Ab­ stand von der inneren Oberfläche der Bodenplatte angeordnet sind. Die Probeneinsätze und die Dicke der Lochplatte sind vorzugsweise so bemessen, dass der Fokus einer konfokal­ optischen Messeinrichtung auf einer Membran oder in ihrer un­ mittelbaren Umgebung gebildet werden kann. Der Abstand der Membran von der Außenseite der Bodenplatte ist vorzugsweise mindestens so groß wie der Fokalabstand der Messeinrichtung, d. h. vorzugsweise im Bereich von 100 µm bis 2.5 mm, insbesondere 100 µm bis 1 mm. Falls auf der zur Bodenplatte abgewand­ ten Seite der Membran gemessen werden soll, kann auch ein kleinerer Abstand der Membran von der Bodenplatte vorgesehen sein. Zur Erzielung dieser geometrischen Verhältnisse wird die Bodenplatte mit einer geringen Dicke ausgeführt, die vorzugs­ weise kleiner als 500 µm, besonders bevorzugt kleiner als 200 µm ist.

Der erfindungsgemäße Probenträger ist für die Handhabung von biologischen und/oder synthetischen Proben geeignet. Besonders vorteilhaft ist die Anwendung des Probenträgers bei Aufnahme, Kultivierung, Vermessung und Manipulierung biologischer Zel­ len. Der Probenträger wird dann auch als Zellkulturen-Träger bezeichnet. Mit diesem wird erstmalig die Möglichkeit geschaf­ fen, in einer Kultivierungseinrichtung direkt an der Membran, die auch als Kultivierungsmembran bezeichnet wird, oder im Überstand Konfokalmessungen und insbesondere FCS-Messungen durchzuführen.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind durch die Bereitstellung von gegebenenfalls durchbrochenen, konus- oder streifenförmigen Vorsprüngen der Einsatzplatte, an denen jeweils die Membran angeordnet ist, Abstandshaltern und/oder Elektrodeneinrichtungen an den Kultivierungseinsätzen gekenn­ zeichnet. Diese Merkmale ermöglichen besondere Anwendungen des Probenträgers, insbesondere als Zellkulturen-Träger, die im Einzelnen unten erläutert sind.

Die Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. Der Probenträger ist hochgradig miniaturisierbar, ohne dass die Trennung der Proben zwischen den Reservoiren oder die Wirkstoffzufuhr zu den Proben, insbesondere Nährstoffversorgung der Zellen, ein­ geschränkt wird. Es sind konfokale optische Messungen sowohl an den Ober-(Innen-) oder Unter-(Außen-)Seiten der Membranen sowie anwendungsabhängig in definiertem Abstand von den Membranen möglich. Im Träger sind Proben, insbesondere Zellen, einfach und störungsfrei kultivierbar. Die Zahl der pro Memb­ ran zu kultivierenden Zellen kann von rund 10⁶ und höher, die bei herkömmlichen Systemen, z. B. gemäß Fig. 10 erforderlich sind, erfindungsgemäß auf rund 100 bis 5000 vermindert werden. Es ergeben sich Vorteile in Bezug auf die für einen Test benö­ tigte Anzahl von Proben, z. B. von Zellen, sowie den Verbrauch an erforderlichen Assay- und Testsubstanzen. Wenn die Einsätze so bemessen sind, dass die Volumina ober- und unterhalb der Membranen im Wesentlichen gleich sind, ergeben sich z. B. für Transportstudien, bei denen der Transport einer Testsubstanz durch eine auf der Membran vorliegende konfluente Zellschicht verfolgt wird, Vorteile in Bezug auf den Substanzverbrauch und die Konzentration des in die Aufnahmeplatte transportierten Stoffes. Die Miniaturisierung und die Ähnlichkeit der Volumina ober- und unterhalb der Membran ist des Weiteren für Sekreti­ onsassays mit biologischen Zellen besonders vorteilhaft. Bei diesen kann eine geringe Menge der Testsubstanz als Stimulus in die Kultivierungseinsätze auf die dort kultivierten Zellen appliziert werden. Die von den Zellen sekretierten Produkte werden in das vorgelegte Flüssigkeitsvolumen der Aufnahmeplat­ te abgegeben. Durch das geringe Volumen in der Aufnahmeplatte ist die Konzentration der sekretierten Stoffe schon nach kur­ zer Inkubationszeit ausreichend, um ein mit den hochempfindli­ chen optisch-konfokalen Messverfahren detektierbares Signal zu verursachen.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung der beigefügten Zeichnungen. Es zeigen:

Fig. 1, 2 schematische Perspektivansichten von Auf­ nahme- und Einsatzplatten erfindungsgemäßer Probenträger;

Fig. 3 eine schematische Illustration der Proben­ handhabung und Messung an erfindungsgemä­ ßen Probenträger;

Fig. 4 bis 9 schematische Schnittansichten verschiede­ ner Ausführungsformen erfindungsgemäßer Probenträger; und

Fig. 10, 11 Illustrationen herkömmlicher Kultivie­ rungseinrichtungen (Stand der Technik).

Die Erfindung wird im folgenden am Beispiel eines ebenen Trä­ gers beschrieben, bei dem 16 Probenreservoire in geraden Rei­ hen und Spalten angeordnet sind. Die Umsetzung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Anzahl von Reservoiren und diese Geometrie beschränkt, sondern auch mit wesentlich mehr Reser­ voiren mit beliebigen geometrischen Anordnungen und Formen möglich. Die Reservoire werden vorzugsweise entsprechend der Probengeometrie von Mikro- oder Nanotiterplatten angeordnet, besonders bevorzugt sind Anordnungen aus 8.12 = 96 Reservoi­ ren mit einem Reservoirabstand von 9 mm oder Anordnungen aus 12.32 = 384 Reservoiren mit einem Reservoirabstand von 4.5 mm vorgesehen.

Des Weiteren wird im Folgenden die Erfindung unter Bezug auf die Anwendung des erfindungsgemäßen Probenträgers als Zellkul­ turen-Träger mit Kultivierungsmembranen beschrieben. Die An­ wendung des Probenträgers ist jedoch nicht auf biologische Proben beschränkt. In entsprechender Weise können auch synthe­ tische Beads untersucht werden, von denen beispielsweise Mole­ küle abgespalten werden, deren Transport durch die Membran oder ein Plattenelement oder auch durch eine Zellschicht beo­ bachtet wird.

Die Fig. 1 und 2 illustrieren als Teile erfindungsgemäßer Probenträger in Perspektivansicht die Aufnahmeplatte 10 (Fig. 1) und die Einsatzplatte 20 (Fig. 2). Die Aufnahmeplatte 10 besteht aus einer Lochplatte 11 und einer Bodenplatte 12. In der Lochplatte 11 sind durchgehende Ausnehmungen oder Löcher 13 in Matrixanordnung ausgebildet. Die Ausnehmungen 13 bilden im zusammengesetzten Probenträger (siehe z. B. Fig. 3) die Reservoire oder Kompartimente, in denen die Kultivierungsein­ sätze der Einsatzplatte 20 aufgenommen werden. Jede Ausnehmung ist mit einer seitlichen Ausbuchtung 13a versehen, die beim Einführen eines Kultivierungsmediums oder von für das Testsys­ tem erforderlichen Assay-Komponenten als Führung für eine Pi­ petier- oder Dispensiervorrichtung dient.

Entsprechend zu den seitlichen Ausbuchtungen 13a der Aufnahme­ platte 10 können in der oberen Fläche der Einsatzplatte 20 je­ weils am Rand der Vorsprünge 21 Durchtrittsöffnungen vorgese­ hen sein. Die Durchtrittsöffnungen (nicht dargestellt) sind so positioniert, dass im zusammengesetzten Zustand des Probenträ­ gers eine durchgehende, vertikale oder leicht geneigte Verbin­ dungsöffnung zum Inneren der Reservoire gebildet wird. Diese Öffnung ermöglicht das Einsetzen der Pipettier- oder Dispen­ siervorrichtung in die Reservoire im zusammengesetzten Zustand des Probenträgers und/oder die Einführung von Sensoren oder Elektroden. Die Ausbuchtungen 13a mit den (in Fig. 2 nicht illustrierten) Durchtrittsöffnungen können zur Anbringung wei­ terer Messeinrichtungen, insbesondere nach Durchführung einer Kultivierung, vorgesehen sein. In die Ausbuchtungen 13a können beispielsweise Kapillaren zur Durchführung einer Kapillare­ lektrophorese oder Elektroden zur Durchführung von Wider­ standsmessungen eingesetzt werden.

Aus Widerstandsmessungen, die erfindungsgemäß erstmalig an mi­ niaturisierten Systemen durchgeführt werden, kann auf den Kon­ fluenzgrad einer Zellschicht rückgeschlossen werden. Ein relativ hoher Widerstand an der Membran bedeutet einen hohen Kon­ fluenzgrad der Zellschicht. Die Ausbuchtungen 13a sind vor­ zugsweise sämtlich jeweils auf einer Seite der Ausnehmungen 13 angeordnet. Falls die Verwendung einer Pipette, einer Kapilla­ re oder dergleichen nicht vorgesehen ist, kann auf die Aus­ buchtungen 13a verzichtet werden.

Die Lochplatte 11 besteht vorzugsweise aus Kunststoff, z. B. Polycarbonat. Das Kunststoffmaterial kann anwendungsabhängig zumindest teilweise transparent oder nicht-transparent (licht- undurchlässig) sein. Die Lochplatte 11 kann mit einer Metall­ rahmung (nicht dargestellt) ausgestattet sein, die der Stabi­ lisierung und Erhöhung der Planarität der Lochplatte und der Positionierung einerseits der Bodenplatte 12 und andererseits der Einsatzplatte 20 dient. Die Dicke der Lochplatte beträgt beispielsweise 1 bis 5 mm. Alternativ kann die Lochplatte 11 auch aus anderen Kunststoffen, z. B. Polypropylen oder Po­ lystyrol bestehen.

Alternativ können die Lochplatte 11 und/oder die Einsatzplatte 20 mehrkomponentig aufgebaut sein. Im Kunststoffmaterial ist ein plattenförmiger Kern mit den jeweiligen Ausnehmungen vor­ gesehen. Der Kern besteht aus einem relativ zum Kunststoff hö­ her schmelzenden Material, vorzugsweise Metall. Durch den mehrkomponentigen Aufbau kann die Planarität der Teile erhöht werden. Außerdem werden Verformungen des Probenträgers bei Wärmebehandlungen (z. B. Thermostatierungen) vermieden.

Die Bodenplatte 12 besteht vorzugsweise aus Glas. Es wird bei­ spielsweise ein Deckglas mit einer Dicke im Bereich von 150 µm bis 200 µm, z. B. 170 µm, und einer Dickentoleranz von weniger als ±20%, vorzugsweise weniger als ±10%, verwendet. Die Bodenplatte 12 ist aus Übersichtlichkeitsgründen mit einer ü­ berhöhten Dicke eingezeichnet. Die Verwendung von Glas als Bo­ denplatte besitzt den zusätzlichen Vorteil, dass in der Glasplatte ausgeprägte Lichtreflexe gebildet werden können, die zur Autofokus-Einstellung des Mikroskops verwendet werden kön­ nen.

Die Loch- und Bodenplatten 11, 12 werden miteinander adhärent verbunden. Dies erfolgt beispielsweise unter Verwendung eines inerten Klebstoffs oder einer inhärenten Haftfähigkeit der Lochplatte 11.

Die Einsatzplatte 20 bildet ein zur Aufnahmeplatte 10 komple­ mentäres Gegenstück mit einer Vielzahl von Vorsprüngen 21, die entsprechend der Matrixanordnung der Ausnehmungen 13 ausge­ richtet sind. In Fig. 2 ist die im zusammengesetzten Zustand des Probenträgers zur Aufnahmeplatte 10 hin weisende Seite der Einsatzplatte 20 dargestellt. Jeder Vorsprung 21 trägt an sei­ nem freien Enden eine Membran 22. Die Membran ist eben (siehe Fig. 4 bis 7, 9) oder gekrümmt (siehe Fig. 8) ausgebildet und im Wesentlichen parallel zu den Ebenen der Aufnahme- und Einsatzplatten 10, 20 ausgerichtet. Unter im wesentlichen pa­ ralleler Ausrichtung wird hier verstanden, dass die Ebene der Membran anwendungsabhängig parallel oder auch gegenüber der Bodenplatte geringfügig verkippt oder eine in sich gekrümmte Membran relativ zur Bodenplatte so angeordnet ist, dass eine horizontale oder parallele oder geringfügig verkippte Orien­ tierung des gekrümmten Bauteils gegeben ist. Die Einsatzplatte 20 besitzt einen äußeren Rahmen 23, der der Ausrichtung rela­ tiv zur Aufnahmeplatte 10 und der Handhabung der Einsatzplatte 20 dient. Die Einsatzplatte 20 besteht wie die Lochplatte 11 aus einem Kunststoffmaterial, sie wird im Spritzgussverfahren hergestellt.

In Fig. 3 ist ein erfindungsgemäßer Probenträger beispielhaft im Einsatz gezeigt. Der Probenträger liegt in einem Messplatz 30 auf einer Halterung 31, die vorzugsweise in allen Raumrich­ tungen verfahrbar ist und die Bodenseite des Trägers frei lässt. Mit einer Flüssigkeit-Fördereinrichtung 32 (z. B. Pi­ pette, Dispenser oder dergleichen) werden die Reservoire 13 des Probenträgers mit einem oder verschiedenen Kultivierungs­ medien oder mit Assaykomponenten bzw. Testsubstanzen be­ schickt. Die Flüssigkeitsfördereinrichtung 32 kann auch zur Beschickung der Reservoire der Aufnahmeplatte durch die oben beschriebenen Durchtrittsöffnungen und Ausbuchtungen 13a die­ nen. Es ist ein Konfokalmikroskop 33 vorgesehen, das so ange­ ordnet ist, dass sein Strahlengang durch die Bodenplatte 12 in das Innere der Reservoire 13 gerichtet ist. Schließlich kann noch eine weitere Beobachtungseinrichtung 34 für optische Transmissions- oder Fluoreszenzmessungen vorgesehen sein, die wie dargestellt von der Oberseite oder alternativ auch von der Bodenseite her angeordnet sein kann. Am Messplatz 30 kann fer­ ner eine Einrichtung zur optischen Manipulation von Partikeln in den Reservoiren mit optischen Käfigen (Laser tweezer, opti­ sche Pinzette) vorgesehen sein.

Für Konfokalmessungen wie z. B. FCS-Messungen werden vorzugs­ weise die folgenden Messanordnungen verwendet. In einer Grund­ form ist das Mikroskop 33 mit einem Immersionsobjektiv mit ho­ her numerischer Apertur (stark fokussierend, lichtstark) aus­ gestattet. Es erfolgt die Messung unter Verwendung von Immer­ sionsflüssigkeit von unten durch die Bodenplatte 12. Der Ar­ beitsabstand zwischen dem Objektiv und dem Fokus ist vorzugs­ weise kleiner als 1 mm, typischerweise im Bereich von 300 bis 400 µm. Von der Innenseite der Bodenplatte 12 bis zum Fokus ergibt sich ein freier Abstand von rund 150 µm. Dies ermög­ licht vorteilhafterweise eine direkte Messung an Zellen, die auf der Unterseite der Membran nahe der Bodenplatte angeordnet sind, oder in einem definierten Abstand zwischen Zellschicht und Bodenplatte. Fig. 6 zeigt zwei Beispiele von Einsätzen, bei denen die Zellen auf der Unterseite der Membran angeordnet sind. Die Kultivierung auf der Unterseite erfolgt vorzugsweise vor der eigentlichen Probenbehandlung, indem die Einsatzplatte 20 in umgekehrter Ausrichtung als Kultivierungsträger verwen­ det wird. In einer abgewandelten Anordnung erfolgt die Messung von oben ebenfalls mit einem Immersionsobjektiv, wobei die Einsatzplatte 20 mit einem Deckglas abgedeckt ist. In diesem Fall sind besondere Vorkehrungen zur hochgradig parallelen Ausrichtung des Deckglases relativ zur Ebene des Trägers zu treffen. Schließlich kann die Messung alternativ auch von oben ohne ein Deckglas und ohne Immersionsflüssigkeit erfolgen. Weitere Messvorgänge und Testansätze (Assays) werden beispiel­ haft unten erläutert.

In den Fig. 4 bis 9 sind verschiedene Ausführungsformen er­ findungsgemäßer Probenträger illustriert, die sich insbesonde­ re in Bezug auf die Gestaltung der Einsatzplatten unterschei­ den. Einander entsprechende Komponenten sind in den Figuren mit identischen Bezugszeichen versehen.

Fig. 4 illustriert eine Grundform des Trägers mit der Aufnah­ meplatte 10, bestehend aus der Lochplatte 11 und der Boden­ platte 12, und der Einsatzplatte 20 mit den Vorsprüngen 21. Die zylinderförmigen Ausnehmungen 13, 13b, c der Lochplatte 11 bilden die Reservoire, die mit einem Kultivierungsmedium oder einem Testmedium gefüllt sind (der Flüssigkeitsspiegel ist gestrichelt eingezeichnet). Die Vorsprünge 21 besitzen die Form eines Konus oder Kegelstumpfes mit einem sich zum freien Ende der Vorsprünge verjüngenden Querschnitt. An den Enden der Vorsprünge 21 ist jeweils eine Membran 22 angeordnet. Die Membranen bestehen aus den an sich für die Herstellung von po­ rösen Membranen bekannten Materialien, wie z. B. Polycarbonat, und sind an den Enden der Vorsprüngen 21 angeschweißt. Der Durchmesser der Membranen liegt vorzugsweise im Bereich von 10 µm bis 1 mm. Die Membranen besitzen vorzugsweise Porengrö­ ßen im Bereich von 0,3 µm bis 20 µm. Die Zellen 40 können auf einer oder beiden Seiten der Membranen 22 kultiviert sein. Anwendungsabhängig können die Membranen auch durch FCS-taugliche Plattenelemente ersetzt werden.

Bei der in Fig. 5 gezeigten Ausführungsform der Erfindung sind zwischen der Einsatzplatte 20 und der Lochplatte 11 Ab­ standshalter 24 vorgesehen. Die Abstandshalter 24 sind als in­ tegraler Bestandteil der Einsatzplatte 20 auf deren Unterseite oder alternativ auch der Oberseite der Lochplatte 11 ange­ bracht. Sie besitzen eine Dicke von rund 100 bis 1000 µm, z. B. 200 µm. Die Aufgabe der Abstandshalter 24 ist es, ein Wan­ dern des Testmediums zwischen den Reservoiren unter Wirkung von Kapillarkräften zu unterbinden. Die Abstandshalter 24 wer­ den bevorzugt insbesondere bei stark miniaturisierten Ausfüh­ rungsformen der Erfindung angebracht. Eine weitere Funktion der Abstandshalter 24 kann darin bestehen, den Abstand der Membranen 22 von der Innenseite der Bodenplatte 12 und damit den Arbeitsabstand des Konfokalmikroskops einzustellen. Der Abstand der Unterseite der Membranen 22 (oder entsprechender Plattenelemente) von der Außenseite der Bodenplatte 12 liegt z. B. im Bereich von 0.1 bis 2.5 mm und beträgt vorzugsweise weniger als 1 mm.

Die Abstandshalter können auch der vereinfachten Kultivierung von Zellen in der Einsatzplatte dienen. Hierzu kann die Einsatzplatte nach dem Animpfen mit Zellen in einem Behälter mit Medium positioniert werden. Die Abstandshalter stellen si­ cher, dass die Membranen nicht auf dem Boden des Behälters aufliegen und die Nährstoffe des Mediums ungehindert auch durch die Membranen auf die Unterseite der Vorsprünge diffun­ dieren können.

Ein Kriechen des Mediums zwischen den Reservoiren wird auch bei der Gestaltung gemäß Fig. 6 vermieden. Die Lochplatte 11 ist so geformt, dass an den von der Bodenplatte 12 abgewandten Seiten der Ausnehmungen 13 kegelförmige Ausschnitte 14 gebildet werden. Die Neigung der Ausschnitte 14 relativ zur Boden­ platte 12 ist geringer als die Neigung der konusförmigen Vor­ sprünge 21. Des Weiteren ist der senkrechte Abstand der Aufla­ gepunkte 15 der Vorsprünge auf der Lochplatte 11 von der Grundfläche 16 der Einsatzplatte 20 größer als der senkrechte Abstand der Auflagepunkte 15 von der Oberseite der Lochplatte 11. Dadurch wird wie mit den Abstandshaltern 24 zwischen der Lochplatte 11 und der Einsatzplatte 20 eine Lücke gebildet, die ein Wandern des Kultivierungsmediums verhindert.

Die Vorsprünge 21 können, wie in Fig. 7 gezeigt ist, an ihren konusförmig geneigten Seitenflächen Durchtrittsöffnungen 25 aufweisen, die die Flüssigkeitsbewegung in den Reservoiren 13 und insbesondere die Überführung von sekretierten Stoffen von der Innen- zur Außenseite der Vorsprünge 21 fördern. In diesem Fall können die porösen Membranen 22 auch durch undurchlässige Plattenelemente ersetzt werden. Anstelle der Membranen können beispielsweise Glasplatten geringer Dicke vorgesehen sein, die wie die Bodenplatte 12 Konfokalmessungen, wie z. B. FCS- Messungen ermöglichen. Die Durchtrittsöffnungen 25 können ab­ weichend von der Darstellung auch im größeren Abstand von der Membran in einem oberen Bereich der Vorsprünge 21 vorgesehen sein. Die Durchtrittsöffnungen 25 können auch der Durchführung von Pipettenspitzen, Elektroden oder dergleichen dienen.

Auch die in Fig. 8 dargestellte Ausführungsform ermöglicht einen Transport von sekretierten Stoffen auf die Unterseite der hier gekrümmt ausgeführten Membranen 26, die entsprechend durch undurchlässige sphärisch gekrümmte Plattenelemente er­ setzt sein können. Die sphärisch gekrümmten Membranen oder Plattenelemente sind parallel zur Bodenplatte ausgerichtet. Dies bedeutet, dass die gekrümmten Elemente eine im Wesentli­ chen horizontal ausgerichtete Aufnahme bilden. Bei dieser Ges­ taltung sind die Vorsprünge 21 als von der Grundfläche 16 der Einsatzplatte 20 in die Ausnehmungen 13 ragende Streifen ge­ bildet, an deren Enden die Elemente 26 angebracht sind.

Zur Kombination von optischen mit elektrischen Messungen kann erfindungsgemäß vorgesehen sein, dass einzelne oder mehrere Ausnehmungen 13 der Lochplatte 11 und/oder einzelne oder meh­ rere Vorsprünge 21 mit Elektrodeneinrichtungen 50 ausgestattet sind (siehe Fig. 9). Die Elektrodeneinrichtungen 50 umfassen insbesondere streifenförmige Mikroelektroden 51, die zur Be­ aufschlagung mit Manipulations- und/oder Messspannungen mit einer nicht dargestellten Steuereinrichtung verbunden sind. Die Durchführung elektrischer Messungen an Zellen, Zellbe­ standteilen oder Makromolekülen ist an sich aus der Mikrosys­ temtechnik bekannt und wird daher hier im Einzelnen nicht be­ schrieben. Die Mikroelektroden 51 bestehen aus Metall oder Halbleitern. Es können auch Mikroelektroden 51 aus transparen­ ten Schichtmaterialien (z. B. ITO) vorgesehen sein.

Im Folgenden werden Testverfahren (Assays) genannt, die zwar an sich aus dem Stand der Technik bekannt sind, mit besonderen Vorteilen jedoch mit dem erfindungsgemäßen Probenträger imple­ mentiert werden können.

1. HTS-Transportstudien von pharmazeutischen Wirkstoffen

Zur Untersuchung des Transports von Wirkstoffen durch eine Zellschicht (z. B. Epithel- oder Endothelzellen) wird eine Mo­ noschicht der Zellen auf der Unter- oder Oberseite der Membran 22 erzeugt und der Wirkstoff in die obere Kammer 13b (siehe Fig. 4) gegeben. Zum Nachweis des Wirkstoffs in der unteren Kammer 13c wird ein biologisches Assaysystem (z. B. Antikör­ per, ein spezifisches Enzym oder dergleichen) in das Kultivie­ rungsmedium gegeben und dessen charakteristische Fluoreszenz selektiv und mit hoher Empfindlichkeit mit dem FCS-Verfahren detektiert. Bei dieser Anwendung zeigt sich ein wichtiger Vorteil der Erfindung. Mit dem FCS-tauglichen Probenträger können erstmalig Kinetiken des Wirkstofftransports durch Zelischich­ ten aufgenommen und ausgewertet werden, da die Messung direkt im Zellkulturen-Träger erfolgt.

2. Transmigrations-Assays

Gegenstand von Transmigrations-Assays ist die Untersuchung des Transports von Zellen durch Zellschichten (z. B. von Leukozy­ ten durch Endothelzellen) und seiner Abhängigkeit von zusätz­ lichen Wirksubstanzen. Ziel der Tests ist beispielsweise die Suche nach Wirksubstanzen, die den Durchtritt der Zellen durch die Zellschichten unterbinden, was beispielsweise bei Entzün­ dungsprozessen von Bedeutung ist. Für diesen Assay werden vor­ zugsweise Membranen mit Membranporen verwendet, deren Durch­ messer größer als 2 µm, z. B. 3 µm, ist. Auf der Membranen (mit Bezugszeichen 40 in Fig. 4) wird eine Zellschicht kulti­ viert. In die obere Kammer 13b der Ausnehmung 13 werden die zu untersuchende Substanz und die Zellen, deren Durchtritt er­ fasst werden soll, in das Kultivierungsmedium gegeben. Die Zellen (z. B. Leukozyten) sind mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Die in der unteren Kammer eintreffenden Zellen wer­ den z. B. mit dem FCS-Verfahren detektiert. Wiederum ergibt sich als besonderer Vorteil die Möglichkeit der Aufnahme von Kinetiken.

3. Sekretions-Assays

Bei der Untersuchung von Sekretionsprodukten von Zellen nach Induktion durch einen Wirkstoff werden die basolaterale Sekre­ tion und die apikale Sekretion unterschieden. Im ersten Fall werden Zellen auf der Oberseite der Membranen kultiviert und dem von oben zugegebenen Wirkstoff ausgesetzt. Für diese An­ wendung sind insbesondere die Ausführungsformen gemäß den Fig. 7 und 8 geeignet. Zum Nachweis des Sekretionsprodukts in der unteren Kammer wird wiederum ein biologisches Assaysystem (z. B. Antikörper oder ein spezifisches Enzym) in das Kulti­ vierungsmedium gegeben und dessen charakteristische Fluores­ zenz z. B. mit dem FCS-Verfahren detektiert. Im zweiten Fall erfolgt die Kultivierung auf der Unterseite der Membranen.

4. Parakrine Sekretions-Assays

Bei diesem Assay wird ein durch einen Wirkstoff induziertes Sekretionsprodukt eines Zelltyps durch einen in einem defi­ nierten Abstand angeordneten zweiten Zelltyp aufgenommen, der auf das Sekretionsprodukt mit einem charakteristischen Signal (Fluoreszenzsignal) reagiert. Es sind beispielsweise Kultivie­ rungen des ersten Zelltyps auf der Oberseite der Membran und des zweiten Zelltyps auf der Innenseite der Bodenplatte 12 oder des ersten Zelltyps auf der Oberseite und des zweiten Zelltyps auf der Unterseite der Membran vorgesehen.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirkli­ chung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltung den von Bedeutung sein.

Claims (17)

1. Probenträger (10, 20) mit einer Vielzahl von Reservoiren (13), der aus einer Aufnahmeplatte (10) und einer Einsatzplat­ te (20) besteht, wobei die Aufnahmeplatte (10) zumindest teil­ weise aus einem optisch transparenten Material besteht und ei­ ne Vielzahl von Ausnehmungen zur Bildung der Reservoire (13) aufweist und die Einsatzplatte (20) eine Vielzahl von Vor­ sprüngen (21) aufweist, die jeweils eine Membran (22) oder ein Plattenelement tragen und im zusammengesetzten Zustand des Trägers so in die Vertiefungen (13) der Aufnahmeplatte (10) hineinragen, dass die Membran (22) oder das Plattenelement je­ weils in der Vertiefung (13) mit Abstand von deren Boden- und Seitenwänden angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahmeplatte (10) durch einen Verbund aus einer ebenen Lochplatte (11) und einer ebenen Bodenplatte (12) gebildet wird, die die Lochplatte (11) von einer Seite her verschließt und aus einem Material mit einer derartigen optischen Qualität und Planarität besteht, dass ein störungsfreier Durchtritt des Strahlengangs einer konfokal-optischen Messeinrichtung ermög­ licht wird.

2. Probenträger gemäß Anspruch 1, bei dem die Aufnahme- und Einsatzplatten (10, 20) so bemessen sind, dass auf der Membran (22) oder dem Plattenelement oder in deren unmittelbarer Umge­ bung ein Fokus einer konfokal-optischen Messeinrichtung gebil­ det werden kann.

3. Probenträger gemäß Anspruch 2, bei dem die Membran (22) oder das Plattenelement in einem senkrechten Abstand von der Außenseite der Bodenplatte (12) angeordnet ist, der im Bereich von 100 µm bis 2.5 mm, vorzugsweise kleiner 1 mm liegt.

4. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Dicke der Bodenplatte (12) geringer als 500 µm, vor­ zugsweise geringer als 200 µm, ist.

5. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Dickeninhomogenität der Bodenplatte geringer als 20%, vorzugsweise geringer als 10%, ist.

6. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem jeder Vorsprung (21) der Einsatzplatte die Form eines sich von der Ebene der Einsatzplatte zum freien Ende des Vorsprungs verjüngenden Konus besitzt, wobei am Ende des Vorsprungs die Membran (22) angeordnet ist.

7. Probenträger gemäß Anspruch 6, bei dem in der Wand der ko­ nusförmigen Vorsprünge seitliche Austrittsöffnungen (25) vor­ gesehen sind.

8. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 5, bei dem jeder Vorsprung (21) der Einsatzplatte die Form eines von der Ebene der Einsatzplatte abstehenden, in die je­ weilige Vertiefung ragenden Streifens besitzt, an dessen Ende die Membran (26) angeordnet ist.

9. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem jede Vertiefung (13) die Form eines geraden Kreiszylinders besitzt, an dessen freiem, zur Bodenplatte entgegengesetzten Rand jeweils eine Ausbuchtung (13a) zur zeitweiligen Positio­ nierung und Ausrichtung von Manipulations- oder Messeinrich­ tungen vorgesehen ist.

10. Probenträger gemäß Anspruch 9, bei dem die Einsatzplatte (20) Durchtrittsöffnungen aufweist, die im zusammengesetzten Zustand der Aufnahme- und Einsatzplatten (10, 20) freie Ver­ bindungen mit den Ausbuchtungen (13a) bilden.

11. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem zwischen der Bodenplatte (12) und der Einsatzplatte (20) eine Abstandshaltereinrichtung (24) vorgesehen ist, mit der der Abstand der Membran (22) oder dem Plattenelement von der Bodenplatte (12) festgelegt ist.

12. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem jede Vertiefung (13) die Form eines geraden Kreiszylinders besitzt, an dessen freien, zur Bodenplatte entgegengesetzten Rand jeweils ein Ausschnitt (14) zur Bildung eines Abstandes zwischen der Lochplatte (11) und der Einsatzplatte (20) vorge­ sehen ist.

13. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei denen die Vorsprünge (21) und/oder die Innenwände der Reser­ voire (13) mit einer Elektrodeneinrichtung (50) ausgestattet sind.

14. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei denen die Reservoire (13) entsprechend dem Format von Mikro- oder Nanotiterplatten angeordnet sind, wobei vorzugsweise An­ ordnungen aus 96 oder 384 Reservoiren vorgesehen sind.

15. Probenträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, der einen Zellkulturen-Träger bildet.

16. Verfahren zur Untersuchung von Zellen, Zellbestandteilen oder suspendierten oder gelösten Stoffen in den Reservoiren eines Probenträgers gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei denen eine konfokal-mikroskopische Untersuchung, vorzugs­ weise eine FCS-Messung, durchgeführt werden.

17. Verwendung eines Probenträgers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, für HTS-Transportstudien von pharmazeutischen Wirk­ stoffen, Transmigrations-Assays, Sekretions-Assays und/oder parakrine Sekretions-Assays und/oder Studien zur Wechselwir­ kung synthetischer Probenpartikel mit synthetischen und/oder biologischen Testsubstanzen.