DE10116585A1 - Peptide acceptor / tRNA hybrid molecule and its use for the production of codon-specifically arrested translation complexes - Google Patents

Peptide acceptor / tRNA hybrid molecule and its use for the production of codon-specifically arrested translation complexes

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül, seine Verwendung als Substrat für die in vitro Translation einer mRNA zur Bildung von Codon-spezifisch, insbesondere Stopp-Codon-spezifisch arretierten Translationskomplexen. Auf diese Weise kann eine Genotyp-Phänotyp-Kopplung erreicht und/oder eine carboxyterminale Markierung in Proteine eingeführt werden. Die Codon-spezifisch-arretierten Translationskomplexe lassen sich beispielsweise für die selektive spezifische Degradation des 3'-untranslatierten Bereichs der kodierenden mRNA verwenden. Die vorliegende Erfindung eignet sich insbesondere für die Transkriptomanalyse und für in vitro Evolutionsanwendungen.The present invention relates to a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule, its use as a substrate for the in vitro translation of an mRNA to form codon-specific, in particular stop codon-specific, locked translation complexes. In this way, genotype-phenotype coupling can be achieved and / or a carboxy-terminal label can be introduced into proteins. The codon-specifically locked translation complexes can be used, for example, for the selective specific degradation of the 3'-untranslated region of the coding mRNA. The present invention is particularly suitable for transcriptome analysis and for in vitro evolution applications.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül sowie seine Verwendung als Substrat der in vitro Translation einer mRNA zur Bildung von Codon-spezifisch arretierten Translationskomplexen. The present invention relates to a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule as well its use as a substrate for the in vitro translation of an mRNA to form Codon-specifically locked translation complexes.

Die Herstellung einer Verknüpfung zwischen einem Peptid bzw. Protein (Phänotyp) und seiner kodierenden RNA (Genotyp) ist Voraussetzung für zahlreiche in vitro- Evolutionstechniken, wie z. B. die Ribosomen-Display- bzw. die Polysomen-Display- Technologie [Mattheakis et al., 1994; Mattheakis et al., 1996; Jermutus et al., 1998] oder die RNA-fusion-Display-Technologie [WO 98/31700; Roberts, 1999]. Aus einem Gemisch einer Vielzahl derartiger Genotyp-Phänotyp-Fusionen ist es möglich bestimmte Genotyp-Phänotyp-Fusionen aufgrund definierter Eigenschaften ihres Polypeptidanteils von allen übrigen Fusionen abzutrennen (Selektion). Dies wird beispielsweise affinitätschromatographisch über direkte Bindung an einen immobilisierten Liganden erreicht. Die so aus dem ursprünglichen Gemisch selektierte Subpopulation Liganden-bindender Genotyp-Phänotyp-Fusionen (RNA- Protein-Fusionen) läßt sich unter Ausnutzung ihrer Nukleinsäureanteile über Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) amplifizieren und steht damit für eine erneute Selektionsrunde zur Verfügung [detailliert ausgeführt in WO 98/31700]. Der Nukleinsäureanteil erlaubt weiterhin auch eine Identifizierung der Primärsequenz einzelner RNA-Protein-Fusionen, beispielsweise durch Sequenzierungs- oder Hybridiesierungstechniken. Establishing a link between a peptide or protein (phenotype) and its coding RNA (genotype) is a prerequisite for numerous in vitro Evolutionary techniques, such as B. the ribosome display or the polysome display Technology [Mattheakis et al., 1994; Mattheakis et al., 1996; Jermutus et al., 1998] or the RNA fusion display technology [WO 98/31700; Roberts, 1999]. From a A mixture of a large number of such genotype-phenotype fusions is possible certain genotype-phenotype fusions based on defined properties of their Separate the polypeptide portion from all other fusions (selection). this will for example, affinity chromatography via direct attachment to one immobilized ligands reached. The so from the original mixture selected subpopulation of ligand-binding genotype-phenotype fusions (RNA Protein fusions) can be exploited using their nucleic acid content Amplify polymerase chain reaction (PCR) and stands for a new one Selection round available [detailed details in WO 98/31700]. The Nucleic acid content also allows the primary sequence to be identified individual RNA-protein fusions, for example by sequencing or Hybridiesierungstechniken.

Die an der Amplifikation Liganden-bindender Genotyp-Phänotyp-Fusionen beteiligten methodischen Schritte sind im folgenden angeführt: (a) Reverse Transkription der RNA, (b) Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) zur Amplifikation der cDNA unter Verwendung eines Primers, der gleichzeitig einen Promotor, sowie eine geeignete ribosomale Bindungsstelle einführt, (c) in vitro Transkription dieser cDNA zur Herstellung einer kodierenden mRNA und (d) in vitro Translation der zuvor synthetisierten mRNA. The genotype-phenotype fusions that bind to the amplification The methodological steps involved are listed below: (a) Reverse Transcription of the RNA, (b) polymerase chain reaction (PCR) to amplify the cDNA using a primer that is simultaneously a promoter and a introduces appropriate ribosomal binding site, (c) in vitro transcription of this cDNA for the production of a coding mRNA and (d) in vitro translation of the previously synthesized mRNA.

Als Voraussetzung für die Anwendung der oben angeführten in vitro Evolutionstechniken muß - zur Kopplung von Genotyp und Phänotyp - während des Translationsprozesses ein Auseinanderfallen des Polypeptid/mRNA-Komplexes verhindert werden, so daß entweder eine nicht-kovalente Polypeptid/mRNA-Fusion erhalten bleibt und/oder - aufgrund vorhergehender Modifikationen an der kodierenden mRNA - eine kovalente Polypeptid/mRNA-Fusion während des Translationsprozesses erreicht wird. As a prerequisite for using the above in vitro Evolution techniques - to link genotype and phenotype - have to Translation process a disintegration of the polypeptide / mRNA complex can be prevented so that either a non-covalent polypeptide / mRNA fusion is retained and / or - due to previous modifications to the coding mRNA - a covalent polypeptide / mRNA fusion during the Translation process is achieved.

Beispiele für die in vitro Herstellung von nicht kovalenten Polypeptid/mRNA- Fusionen ist die Polysomen-Display- und die Ribosomen-Display-Technologie [Kawasaki GH US 5658754; Mattheakis et al., 1994; Mattheakis et al., 1996; Hanes & Plückthuhn, 1997; Plückthuhn WO 98/48008]. Dabei wid durch die Verwendung einer Stopp-Codon freien mRNA ein Auseinanderfallen des Translationskomplexes (Peptid/Ribosomen/mRNA/tRNA-Komplex) am Ende des Translationprozesses verhindert und der Peptid/Ribosomen/mRNA/tRNA-Komplex ggfs. durch Salzzugabe und Temperaturabsenkung zusätzlich stabilisiert. Examples of the in vitro production of non-covalent polypeptide / mRNA Fusion is the polysome display and the ribosome display technology [Kawasaki GH US 5658754; Mattheakis et al., 1994; Mattheakis et al., 1996; Hanes & Pluckthuhn, 1997; Chicken WO 98/48008]. Thereby wid by the use a stop codon free mRNA a disintegration of the translation complex (Peptide / ribosome / mRNA / tRNA complex) at the end of the translation process prevented and the peptide / ribosome / mRNA / tRNA complex if necessary by adding salt and temperature reduction additionally stabilized.

Ein Beispiel für eine in vitro Evolutionstechnik, bei der es - während des Translationsprozesses - zur Ausbildung kovalenter Polypeptid/mRNA-Fusionen kommt, stellt die von Robert & Szostak (1997) beschriebene RNA-fusion-Display- Technologie dar. Voraussetzung für die Erzeugung von Genotyp/Phänotyp-Fusionen im Rahmen dieser Technologie ist das Vorhandensein einer kovalenten Modifikation am 3'-Ende der kodierenden RNA in Form einer Puromycin-haltigen Linkerstruktur [Roberts & Szostak, 1997, WO 98/31700, DE 196 46 372, WO 98/16636]. Während des Translationsvorgangs stoppt bei Verwendung einer modifizierten RNA das Ribosom am 3'-Ende der RNA am Übergang zum Puromycin-haltigen Linker. Das über den Linker an die kodierende mRNA immobilisierte Puromycin kann dann in die A-Site des Ribosoms eintreten und die bis zu diesem Zeitpunkt transtatierte Peptidkette in einem ribosomal katalysierten Reaktionsschritt übernehmen. Als Ergebnis eines solchen Vorganges entsteht eine kovalente Verknüpfung zwischen einem Peptid und seiner kodierenden mRNA, die über die Wirkung des Puromycins als Akzeptor der wachsenden Peptidkette erreicht wird. Dieser mRNA/Polypeptid- Komplex ist auch nach Abreinigung des Ribosoms über einen weiten Temperatur- und Salzkonzentrationsbereich stabil. An example of an in vitro evolution technique where - during the Translation process - to form covalent polypeptide / mRNA fusions comes, the RNA fusion display described by Robert & Szostak (1997) Technology. Prerequisite for the generation of genotype / phenotype fusions within this technology is the presence of a covalent modification at the 3 'end of the coding RNA in the form of a puromycin-containing linker structure [Roberts & Szostak, 1997, WO 98/31700, DE 196 46 372, WO 98/16636]. While of the translation process stops using a modified RNA Ribosome at the 3 'end of the RNA at the transition to the puromycin-containing linker. The Puromycin immobilized via the linker to the coding mRNA can then be inserted into the Enter the A site of the ribosome and the one transtatiert up to this point Take over the peptide chain in a ribosomally catalyzed reaction step. As The result of such a process is a covalent link between a peptide and its coding mRNA, which have the effect of puromycin is achieved as an acceptor of the growing peptide chain. This mRNA / polypeptide Even after the ribosome has been cleaned off, the complex is and salt concentration range stable.

Der Einsatz der oben genannten Polypeptid/mRNA-Fusions-Technologien ist in der Regel beschränkt auf die Verwendung Stopp-Codon freier RNAs. Bei Verwendung einer Stopp-Codon-haltigen RNA würde es nämlich durch die Release Factor- Wirkung während der Translation zu einer vorzeitigen Ablösung der translatierten Polypeptidkette vom Translationskomplex kommen (durch Stimulation der Hydrolyse der Esterverknüpfung zwischen der tRNA in der P-Site des Ribosoms und dem Carboxyl-Ende der Polypeptidkette), noch bevor es, z. B. im Falle einer Puromycinmodifizierten mRNA, zur Ausbildung einer kovalenten Verknüpfung zwischen dem Polypeptid und seiner kodierenden mRNA kommen kann. The use of the above-mentioned polypeptide / mRNA fusion technologies is in the Usually restricted to the use of stop codons of free RNAs. Using of a stop codon-containing RNA would be released by the release factor Effect during translation to premature replacement of the translated Polypeptide chain come from the translation complex (by stimulating hydrolysis the ester linkage between the tRNA in the P site of the ribosome and the Carboxyl end of the polypeptide chain) even before it, e.g. B. in the case of a Puromycin modified mRNA, to form a covalent link between the Polypeptide and its coding mRNA can come.

Auch im Rahmen der Ribosomen- bzw. Polysomen-Display-Technologie würde das Vorhandensein eines Stopp-Codons innerhalb der RNA zum Auseinanderfallen des Translationskomplexes führen und damit die Bildung eines stabilen Ribosomen/mRNA/tRNA/Peptid-Komplexes nicht zulassen. This would also be the case with ribosome or polysome display technology Presence of a stop codon within the RNA for the disintegration of the Lead translation complex and thus the formation of a stable Ribosome / mRNA / tRNA / peptide complex does not allow.

Deshalb ist die Verwendung zellulärer mRNA für die Herstellung von Polypeptid/mRNA-Verknüpfungen in der Regel erst nach einer aufwendigen Entfernung des Stopp-Codons und des 3'-untranslatierten Bereiches der mRNA möglich. Die RNA-Fusion-Display-Technologie erfordert neben der Entfernung des Stopp-Codons und des 3'-untranslatierten Bereiches der mRNA außerdem als zusätzlichen Schritt die bereits beschriebene Modifikation des 3'-Endes der RNA durch Anfügen des kovalent verknüpften Puromycin-haltigen Linkers. Eine Entfernung des 3'-untranslatierten Bereiches zellulärer mRNA von heterogener Länge, incl. des Stopp-Codons, kann dabei über mehrere methodische Ansätze erreicht werden [beschrieben in WO 00/09737], wie z. B.

  • a) durch eine gerichtete 3' → 5' Degradation der RNA mit Hilfe einer Exoribonuklease,
  • b) durch eine gerichtete 3' → 5 Degradation mit Hilfe einer Exonuklease, wie z. B Exonuklease III bzw. Lambda-Exonuklease auf der Ebene der korrespondierenden cDNA,
  • c) durch die Verwendung zufällig annealender Random-Primer während des Umschreibens zellulärer mRNA in korrespondierende cDNA, wobei es u. a. auch zur Bildung Stopp-Codon-freier RNA kommt.
Therefore, the use of cellular mRNA for the production of polypeptide / mRNA linkages is generally only possible after a time-consuming removal of the stop codon and the 3'-untranslated region of the mRNA. In addition to the removal of the stop codon and the 3'-untranslated region of the mRNA, the RNA fusion display technology also requires, as an additional step, the modification of the 3'-end of the RNA already described by adding the covalently linked puromycin-containing linker. Removal of the 3'-untranslated region of cellular mRNA of heterogeneous length, including the stop codon, can be achieved via several methodological approaches [described in WO 00/09737], such as. B.
  • a) by a directed 3 '→ 5' degradation of the RNA using an exoribonuclease,
  • b) by a directed 3 '→ 5 degradation with the help of an exonuclease, such as. B exonuclease III or lambda exonuclease at the level of the corresponding cDNA,
  • c) by using randomly annealing random primers while rewriting cellular mRNA into corresponding cDNA, which also leads to the formation of stop codon-free RNA.

Diese genannten methodischen Ansätze können jedoch nicht sicherstellen, daß es innerhalb einer komplexen Mischung verschiedener zellulärer mRNAs mit 3'- untranslatierten Bereichen unterschiedlicher Länge zu einer exakten Entfernung des 3'-UTR und des Stopp-Codons kommt, während gleichzeitig der kodierende Bereich der mRNA nahezu vollständig erhalten bleibt. However, these methodological approaches cannot guarantee that it within a complex mixture of different cellular mRNAs with 3'- untranslated areas of different lengths for an exact removal of the 3'-UTR and the stop codon comes while at the same time the coding area the mRNA is almost completely preserved.

Die vorliegende Erfindung beschreibt nun eine Methode, die durch Einsatz einer speziell modifizierten tRNA bzw. eines speziell modifizierten tRNA-analogen Moleküls (im folgenden "Peptidakzeptor-tRNA", "Akzeptor-tRNA" oder "Hybridmolekül" genannt) während der in vitro Translation ein Auseinanderfallen des Translationskomplexes, auch bei der Verwendung einer unmodifizierten, Stopp- Codon und 3'-UTR-haltigen mRNA als Matrize des Translationsvorganges, verhindert. Die Erfindung ermöglicht damit die Herstellung von Codon-arretierten, insbesondere Stopp-Codon-arretierten Translationskomplexen unabhängig von dem Vorhandensein eines Stopp-Codons in der kodierenden mRNA. Die erhältlichen Codon-arretierten Translationskomplexe umfassen die kodierende mRNA, das translatierte Peptid, das Ribosom und das Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül. Bei Verwendung eines Peptidakzeptor/Suppressor-tRNA-Hybridmoleküls wird das durch einen Releasefaktor-abhängigen Terminationsprozess bewirkte Auseinanderfallen des Translationskomplexes verhindert, indem das Hybridmolekül kompetitiv das Eintreten des Releasefaktors in die A-Site des Ribosoms verhindert. The present invention now describes a method using a specially modified tRNA or a specially modified tRNA analog Molecule (hereinafter "peptide acceptor tRNA", "acceptor tRNA" or Called "hybrid molecule") during in vitro translation a disintegration of the Translation complex, even when using an unmodified, stop Codon and 3'-UTR-containing mRNA as a template of the translation process, prevented. The invention thus enables the production of codon-locked, in particular, stop codon-locked translation complexes regardless of that Presence of a stop codon in the coding mRNA. The available ones Codon-locked translation complexes include the coding mRNA, the translated peptide, the ribosome and the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule. at Using a peptide acceptor / suppressor-tRNA hybrid molecule does this by a termination factor-dependent termination process caused disintegration of the translation complex prevented by the hybrid molecule competitively that Prevents the release factor from entering the A site of the ribosome.

Bei der zu verwendenden Peptidakzeptor-tRNA handelt es sich um ein Hybridmolekül, bestehend aus einer tRNA oder einer tRNA-analogen Einheit (im folgenden "tRNA" oder "tRNA-Einheit" genannt) und einer kovalent verknüpften Peptidakzeptor-Einheit. In Analogie zu Aufbau und Funktionsweise einer AminoacyltRNA als Substrat des ribosomalen Translationsprozesses ist die tRNA-Einheit der Peptidakzeptor-tRNA verantwortlich für die Codon-spezifische Bindung der Peptidakzeptor-tRNA während der ribosomalen Proteinsynthese. Bei der tRNA- Einheit handelt es sich erfindungsgemäß vorzugsweise um eine natürlicherweise vorkommende tRNA, eine synthetisch hergestellte tRNA oder eine durch in vitro- Transkription hergestellte tRNA oder ein entsprechendes tRNA-Derivat. Ferner kann die Sequenz der tRNA-Einheit 3'-terminal um vorzugsweise bis zu 20, insbesondere um bis zu 10, 5 oder 3 Nukleotide, vor allem um ein Nukleotid, verkürzt oder um einige, vorzugsweise 1 oder 2 Nukleotide verlängert sein. Die Nukleotidsequenz kann von der Sequenzabfolge natürlicherweise vorkommender tRNAs abweichen. Die tRNA-Einheit kann neben natürlicherweise vorkommenden Nukleotiden auch natürlicherweise nicht vorkommende, künstlich synthetisierte Nukleotidanaloga umfassen. Die tRNA-Einheit kann außerdem modifiziert sein, beispielsweise durch fluorogene, chromogene, radioaktive oder photoreaktive Gruppen. The peptide acceptor tRNA to be used is a Hybrid molecule consisting of a tRNA or a tRNA-analogous unit (im hereinafter called "tRNA" or "tRNA unit") and a covalently linked Peptide acceptor unit. In analogy to the structure and functioning of a AminoacyltRNA as the substrate of the ribosomal translation process is the tRNA unit of the Peptide acceptor tRNA responsible for the codon-specific binding of Peptide acceptor tRNA during ribosomal protein synthesis. With the tRNA According to the invention, the unit is preferably a natural one occurring tRNA, a synthetically produced tRNA or an in vitro Transcription-produced tRNA or a corresponding tRNA derivative. Furthermore, the sequence of the tRNA unit 3'-terminal by preferably up to 20, in particular by up to 10, 5 or 3 nucleotides, especially by one nucleotide, shortened or by some, preferably 1 or 2 nucleotides extended. The nucleotide sequence can deviate from the sequence of naturally occurring tRNAs. In addition to naturally occurring nucleotides, the tRNA unit can also naturally occurring, artificially synthesized nucleotide analogs include. The tRNA unit can also be modified, for example by fluorogenic, chromogenic, radioactive or photoreactive groups.

Die Peptidkzeptor-Einheit der Peptidakzeptor-tRNA ist in Analogie zum Aminosäureanteil einer Aminoacyl-tRNA in der Lage die P-Site-tRNA-verankerte Peptidkette in einer Transpeptidasereaktion unter Ausbildung einer kovalenten Verknüpfung zu übernehmen. Bei der die Verknüpfung ausbildenden funktionellen Gruppe der Peptidakzeptor-Einheit des Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls kann es sich beispielsweise um eine primäre Aminogruppe handeln, die in der Lage ist, mit dem carboxyterminalen Ende der translatierten Peptidkette in der Transpeptidasereaktion unter Spaltung einer Carbonsäureesterbindung eine Säureamidbindung auszubilden. Bei der Peptidakzeptor-Einheit kann es sich beispielsweise um eine Aminosäure, ein Aminosäurederivat oder ein Aminosäure- Analogon oder um Puromycin, ein Puromycin-Derivat oder ein Puromycin-Analogon oder um eine andere organische Verbindung mit einer freien Amiogruppe handeln. Die Peptidakzeptor-Einheit ist mit der tRNA-Einheit des Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmoleküls direkt oder über einen Linker kovalent verknüpft, wobei die kovalente Bindung vorzugsweise weder spontan, noch in einer ribosomal katalysierten Reaktion (z. B. nach Stimulation durch einen Release Faktor) während der in vitro Translation lysiert werden kann. Bei der kovalenten Bindung kann es sich beispielsweise um eine C-C-Bindung, eine Amidbindung, um eine Sulfid- oder Disulfidbindung handeln. The peptide acceptor unit of the peptide acceptor tRNA is analogous to Amino acid portion of an aminoacyl tRNA capable of anchoring the P site tRNA Peptide chain in a transpeptidase reaction to form a covalent one Take over link. In the functional forming the link Group of the peptide acceptor unit of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule can it is, for example, a primary amino group that is able to with the carboxy terminal end of the translated peptide chain in the Transpeptidase reaction with cleavage of a carboxylic acid ester bond Form acid amide bond. The peptide acceptor unit can for example an amino acid, an amino acid derivative or an amino acid Analogue or around puromycin, a puromycin derivative or a puromycin analogue or another organic compound with a free amino group. The peptide acceptor unit is connected to the tRNA unit of the peptide acceptor / tRNA Hybrid molecule covalently linked directly or via a linker, the covalent Binding preferably neither spontaneously nor in a ribosomally catalyzed Response (e.g. after stimulation by a release factor) during in vitro Translation can be lysed. With covalent bonding it can be for example a C-C bond, an amide bond, a sulfide or Act disulfide bond.

Ein Linker wird zur Verknüpfung der Peptidakzeptor-Einheit und der tRNA-Einheit vorzugsweise dann eingesetzt, wenn die tRNA-Einheit 3'-terminal verkürzt ist. Bei dem Linker handelt es sich vorzugsweise um eine organische Verbindung, beispielsweise um eine Kohlenwasserstoffkette oder um eine Polyethylengruppe. A linker is used to link the peptide acceptor unit and the tRNA unit preferably used when the tRNA unit is shortened 3'-terminal. at the linker is preferably an organic compound, for example a hydrocarbon chain or a polyethylene group.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmoleküls ist eine Puromycin-beladene tRNA (Puromycin-tRNA), wobei die tRNA 3'-terminal bevorzugt um ein Nukleotid vekürzt ist, so dass nach Anknüpfung des Puromycins die natürlicherweise anzutreffende Nukleotid-Anzahl der tRNA vorliegt (vgl. Abb. 1 und 2). Bei Puromycin handelt es sich um ein von Streptomyceten produziertes Antibiotikum mit translationsinhibierender Wirkung [Nathans & Neidle, 1963]. Aufgrund seiner auffälligen strukturellen Homologie zu dem 3'-Ende einer Aminoacyl-beladenen tRNA (der homologe Bereich umfaßt das letzte 3'-terminale Nukleotid der tRNA mit daran geknüpfter Aminosäure, vgl. Abb. 2) besitzt Puromycin die Eigenschaft, sequenzunabhängig sowohl den prokaryotischen wie auch den eukaryotischen Translationsprozeß vorzeitig zu terminieren. Puromycin lagert sich unabhängig von der Kodierung der mRNA in die A-Site des Ribosoms und übernimmt mit seiner primären Aminogruppe die bis dahin gebildete Polypeptidkette von der P-Site-tRNA. Dabei entstehen C-terminal verkürzte Peptidfragmente heterogener Länge, die alle über eine carboxyterminale Puromycin- Modifikation verfügen. Erfindungsgemäß kann nun durch die Verknüpfung des Puromycins mit einer tRNA, insbesondere einer Suppressor-tRNA, die Wirkung des Puromycin-Anteils als Peptidakzeptor abhängig von der mRNA-Kodierung gesteuert werden. Im Falle der Verknüpfung mit einer Suppressor-tRNA kommt es Stopp- Codon-abhängig anstelle der translationsterminierenden Wirkung eines Release Faktors zu einer Einlagerung dieses Hybridmoleküls in die A-Site des Ribosoms, so daß die Puromycin-Einheit des Hybridmoleküls in der Lage ist, die Polypeptidkette von der P-Site-tRNA in einer Transpeptidase-Reaktion zu übernehmen. Ein Überlesen und damit eine fortschreitende Verlängerung der Polypeptidkette im Translationsprozeß ist hierbei nicht möglich, weil dies durch die Säureamidbindung zwischen der Nukleotidhälfte und der Aminoacyl-homologen Hälfte des Puromycinanteils der Puromycin-Suppressor-tRNA verhindert wird (vgl. Abb. 2). Im Endzustand dieses Vorgangs erhält man ein über dem Stopp-Codon der kodierenden mRNA arretiertes Ribosom mit einem über die Puromycin-Suppressor- tRNA verankerten Polypeptid voller Länge. A particularly preferred embodiment of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule is a puromycin-loaded tRNA (puromycin tRNA), the tRNA preferably being shortened 3'-terminally by one nucleotide, so that after the puromycin has been linked, the naturally occurring nucleotide number of the tRNA is available (see Fig. 1 and 2). Puromycin is an antibiotic produced by Streptomycetes with a translation-inhibiting effect [Nathans & Neidle, 1963]. Because of its striking structural homology to the 3'-end of an aminoacyl-loaded tRNA (the homologous region comprises the last 3'-terminal nucleotide of the tRNA with the amino acid linked to it, see FIG. 2), puromycin has the property of being both prokaryotic and sequence-independent as well as to prematurely terminate the eukaryotic translation process. Puromycin is stored independently of the coding of the mRNA in the A site of the ribosome and, with its primary amino group, takes over the polypeptide chain formed up to that point from the P site tRNA. This results in C-terminally shortened peptide fragments of heterogeneous length, all of which have a carboxy-terminal puromycin modification. According to the invention, by linking the puromycin to a tRNA, in particular a suppressor tRNA, the effect of the puromycin portion as a peptide acceptor can be controlled depending on the mRNA coding. In the case of the linkage with a suppressor tRNA, depending on the stop codon, instead of the translation-terminating effect of a release factor, this hybrid molecule is incorporated into the A site of the ribosome, so that the puromycin unit of the hybrid molecule is able to Take over polypeptide chain from the P-site tRNA in a transpeptidase reaction. It is not possible to read over and thus progressively extend the polypeptide chain in the translation process because this is prevented by the acid amide bond between the nucleotide half and the aminoacyl-homologous half of the puromycin portion of the puromycin suppressor tRNA (see Fig. 2). In the final state of this process, a ribosome locked over the stop codon of the coding mRNA is obtained with a full-length polypeptide anchored via the puromycin suppressor tRNA.

Eine solche Struktur ist nun Voraussetzung und Grundlage für eine ganze Reihe verschiedener Anwendungen:

  • 1. Ein derart Stopp-Codon-spezifisch verankerter Translationskomplex läßt sich, analog der methodischen Schritte, wie sie in WO 00/09737 dargestellt sind, für eine gezielte Entfernung des 3'-untranslatierten Bereiches der sich im Komplex befindenden mRNA nutzen (Abb. 3):
    • 1. Durch eine gerichtete Degradation der RNA mit Hilfe einer 3' → 5'- Exoribonuklease kann die mRNA von ihrem 3'-Ende in 5'-Richtung bis zu dem Bereich eingekürzt werden, der durch den anliegenden, Stopp-Codon-spezifisch- verankerten Translationskomplex geschützt wird.
    • 2. In einer Reversen Transkriptase-Reaktion läßt sich mit Hilfe eines am 3'-Ende der mRNA hybridisierenden Primers (z. B. ein Poly-A-Tail spezifischer Oligo-(dT)- Primer) die mRNA von ihrem 3'-Ende her in 5'-Richtung soweit in ein partielles mRNA/cDNA-Hybrid überführen, bis die Aktivität der Polymerase durch die Blockade des auf der mRNA aufsitzenden, Stopp-Codon-spezifisch verankerten Translationskomplexes stoppt. Durch anschließende Behandlung der RNA mit einer Doppelstrang-RNA/DNA-abhängigen RNAse (wie z. B. RNase H) läßt sich spezifisch das zuvor revers transkribierte 3'-Ende der RNA entfernen.
    In beiden Fällen ist das Ergebnis einer solchen Behandlung eine mRNA, deren 3'- untranslatierter Bereich fast vollständig bis in die Nähe des Stopp-Codons entfernt ist. Die Größe des verbleibenden Anteils des 3'-UTRs wird dabei durch den Sequenzabschnitt der RNA bestimmt, der durch den angelagerten, Stopp-Codon- spezifisch verankerten Translationskomplex "geschützt" ist. Diese Restsequenz des 3'-UTRs incl. des Stopp-Codons läßt sich anschließend durch Verknüpfung folgender methodischer Schritte [vgl. WO 00/09737] aus der mRNA entfernen: (a) Ankopplung eines RNA-Adaptors (dadurch erfolgt Einführung einer Primer- Bindestelle und einer Erkennungssequenz für ein Typ IIS-Restriktionsenzym); (b) Reverse Transkription der RNA unter Verwendung eines Adaptor-komplementären Primers und Zweitstrangsynthese; (c) Schneiden dieser doppelsträngigen DNA stromauf vom Stopp-Codon durch Inkubation mit einem Typ IIS-Restriktionsenzym (Erkennungssequenz wurde zuvor durch Ankopplung des RNA-Adaptors in die Sequenz eingeführt) (vgl. Abb. 3). Dadurch wird eine Entfernung sowohl des Stopp- Codons als auch des 3'-UTR-Restes auf korrespondierender DNA-Ebene ermöglicht. Anschließend kann die DNA durch in vitro Transkription wieder in RNA überführt werden und steht damit für verschiedene in vitro (oben genannte) oder in vivo Genotyp/Phänotyp-Kopplungstechniken (z. B. Phage-Display, Yeast-Display) in geeigneter Form zur Verfügung.
  • 2. Ein derart Stopp-Codon-spezifisch verankerter Translationskomplex enthält neben dem synthetisierten Polypeptid voller Länge auch die kodierende RNA und stellt damit eine stabile Phänotyp/Genotyp-Verknüpfung dar, wie sie auch Grundlage für die Polysomen-Display und die Ribosomen-Display-Technologie ist. Durch die hier beschriebene alternative Kopplungsstrategie, die auf der Verwendung einer Akzeptor-Suppressor-tRNA (z. B. Puromycin-Suppressor-tRNA) während des Translationsvorganges basiert, ist aber im Gegensatz zur Polysomen- bzw. Ribosomen-Display-Technologie auch die direkte Nutzung Stopp-Codon- und 3'UTR-haltiger mRNA möglich. Auf eine aufwendige Umarbeitung der mRNA zur Entfernung des Stopp-Codons, sowie des 3'-UTRs vor Einsatz in den in vitro Translationsschritt kann deshalb verzichtet werden.
    Durch eine weitere Modifikation im Bereich der Anticodon-Schleife läßt sich die Akzeptor-Suppressor-tRNA zusätzlich so verändern, daß sie zur Herstellung einer kovalenten Verknüpfung zwischen der Akzeptor-Suppressor-tRNA und der mRNA während des Translationsvorganges geeignet ist. Bei der Modifikation handelt es sich dabei beispielsweise um eine photoreaktive Gruppe (z. B. Wybutin), die in der Lage ist, nach Bestrahlung mit Licht geeigneter Wellenlänge eine kovalente Verknüpfung zur mRNA, die während des Translationsvorganges abgelesen wird, auszubilden [Hanna, 1989; Steiner et al., 1984]. Die aktivierende Bestrahlung kann sowohl während als auch nach Beendigung des Translationsvorganges erfolgen. Die photoreaktive Form des Akzeptor-Suppressor-tRNA-Moleküls ist also in der Lage, zwei kovalente Verknüpfungen auszubilden: Eine erste Verknüpfung über die primäre Aminogruppe des Akzeptoranteils mit der translatierten Polypeptidkette und eine zweite Verknüpfung über die photoreaktive Gruppe der tRNA-Hälfte mit der kodierenden mRNA. Damit fungiert die photoreaktive Form der Akzeptor- Suppressor-tRNA als ein kovalent verknüpfendes Bindeglied zwischen kodierendem Genotyp und kodiertem Phänotyp, wobei als kodierender Genotyp eine unmodifizierte mRNA Verwendung finden kann und eine vorhergehende aufwendige Entfernung des 3'-UTRs und/oder des Stopp-Codons, oder eine Modifizierung des 3'-Endes der RNA durch eine Anlagerung eines Puromycin-Linkers damit überflüssig ist. Nach kovalenter Verknüpfung der Peptid-beladenen Akzeptor/tRNA-Einheit mit der mRNA mittels der photoreaktiven Gruppe kann das Ribosom in einer dem Fachmann bekannten Weise entfernt werden, so dass man eine Verbindung (Hybridmolekül) erhält, bei der mRNA (Genotyp) und das von ihr kodierte Polypeptid (Phänotyp) vermittelt durch ein erfindungsgemäßes Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmolekül kovalent miteinander verknüpft sind. Das so erhaltene Hybridmolekül kann beispielsweise, wie zuvor für den arretierten Translationskomplex beschrieben, zur Degradation des 3'-untranslatierten Bereiches der mRNA verwendet werden.
  • 3. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit von Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmolekülen besteht in ihrer Verwendung zur Herstellung von Codon-spezifisch terminierten und gleichzeitig markierten Polypeptiden bzw. Proteinen und Proteinfragmenten. Die Codon-Spezifität wird dabei über den verwendeten tRNA- Anteil (speziell über die Sequenz des Anticodons) der Peptidakzeptor-tRNA während des Translationsvorganges vermittelt. Die Codon-Spezifität der verwendeten Akzeptor-tRNA bestimmt zugleich auch die Länge des während des Translationsvorganges entstehenden Polypeptids bzw. Proteinfragments. Die Verwendung von Stopp-Codon spezifischen Akzeptor-Suppressor-tRNAs im Translationsprozeß führt hierbei zur Entstehung C-terminal markierter Proteine voller Länge.
Such a structure is now a prerequisite and basis for a whole range of different applications:
  • 1. Such a stop codon-specifically anchored translation complex can be used, analogously to the methodical steps as shown in WO 00/09737, for the targeted removal of the 3'-untranslated region of the mRNA located in the complex ( FIG. 3 ):
    • 1. By directional degradation of the RNA with the aid of a 3 '→ 5' exoribonuclease, the mRNA can be shortened from its 3 'end in the 5' direction to the region which is indicated by the stop codon-specific anchored translation complex is protected.
    • 2. In a reverse transcriptase reaction, the mRNA can be removed from its 3 'end with the aid of a primer hybridizing at the 3' end of the mRNA (eg a poly-A-tail-specific oligo (dT) primer) convert it in the 5 'direction into a partial mRNA / cDNA hybrid until the activity of the polymerase stops due to the blockage of the stop codon-specific anchored translation complex located on the mRNA. Subsequent treatment of the RNA with a double-stranded RNA / DNA-dependent RNAse (such as, for example, RNase H) can be used to specifically remove the 3 ′ end of the RNA which was previously reverse transcribed.
    In both cases the result of such a treatment is an mRNA, the 3 'untranslated region of which is almost completely removed up to the vicinity of the stop codon. The size of the remaining portion of the 3'-UTR is determined by the sequence section of the RNA which is "protected" by the attached, codon-specifically anchored translation complex. This residual sequence of the 3'-UTR including the stop codon can then be obtained by linking the following methodological steps [cf. Remove WO 00/09737] from the mRNA: (a) coupling an RNA adapter (this introduces a primer binding site and a recognition sequence for a type IIS restriction enzyme); (b) reverse transcription of the RNA using an adapter-complementary primer and second strand synthesis; (c) Cutting this double-stranded DNA upstream of the stop codon by incubation with a type IIS restriction enzyme (recognition sequence was previously introduced into the sequence by coupling the RNA adapter) (see FIG. 3). This enables both the stop codon and the 3'-UTR residue to be removed at the corresponding DNA level. The DNA can then be converted back into RNA by in vitro transcription and is thus available in a suitable form for various in vitro (above-mentioned) or in vivo genotype / phenotype coupling techniques (e.g. phage display, yeast display) ,
  • 2. Such a stop codon-specific anchored translation complex contains, in addition to the full-length synthesized polypeptide, also the coding RNA and thus represents a stable phenotype / genotype linkage, as is also the basis for the polysome display and the ribosome display technology is. Due to the alternative coupling strategy described here, which is based on the use of an acceptor suppressor tRNA (e.g. puromycin suppressor tRNA) during the translation process, in contrast to the polysome or ribosome display technology, the direct one is also Use of stop codon and 3'UTR-containing mRNA possible. A complex reworking of the mRNA to remove the stop codon and the 3'-UTR before use in the in vitro translation step can therefore be dispensed with.
    By a further modification in the area of the anticodon loop, the acceptor suppressor tRNA can additionally be changed so that it is suitable for establishing a covalent link between the acceptor suppressor tRNA and the mRNA during the translation process. The modification is, for example, a photoreactive group (e.g. wybutin) which is able to form a covalent link to the mRNA, which is read during the translation process, after irradiation with light of suitable wavelength [Hanna, 1989 ; Steiner et al., 1984]. Activating radiation can take place both during and after the translation process has ended. The photoreactive form of the acceptor suppressor tRNA molecule is therefore able to form two covalent linkages: a first link via the primary amino group of the acceptor portion to the translated polypeptide chain and a second link via the photoreactive group of the tRNA half to the coding mRNA. The photoreactive form of the acceptor suppressor tRNA thus functions as a covalently linking link between the coding genotype and the encoded phenotype, it being possible for an unmodified mRNA to be used as the coding genotype and a previous, complex removal of the 3'-UTR and / or the stop codon , or a modification of the 3 'end of the RNA by addition of a puromycin linker is therefore superfluous. After covalently linking the peptide-loaded acceptor / tRNA unit to the mRNA by means of the photoreactive group, the ribosome can be removed in a manner known to the person skilled in the art, so that a compound (hybrid molecule) is obtained in which the mRNA (genotype) and that of their encoded polypeptide (phenotype) is mediated covalently by an inventive peptide acceptor / tRNA hybrid molecule. The hybrid molecule obtained in this way can be used, for example, as described above for the locked translation complex, for the degradation of the 3'-untranslated region of the mRNA.
  • 3. Another possible application of peptide acceptor / tRNA hybrid molecules is their use for the production of codon-specifically terminated and simultaneously labeled polypeptides or proteins and protein fragments. The codon specificity is conveyed via the tRNA portion used (especially via the sequence of the anticodon) of the peptide acceptor tRNA during the translation process. The codon specificity of the acceptor tRNA used also determines the length of the polypeptide or protein fragment that arises during the translation process. The use of stop codon-specific acceptor-suppressor tRNAs in the translation process leads to the formation of full-length C-terminally labeled proteins.

Aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften sind die zuvor genannten erfindungsgemäßen Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküle sowie die unter Verwendung dieser erhältichen Genotpy/Phänotyp-Hybridmoleküle und arretierten Translationskomplexe besonders gut für in vitro-Evolutionsexperimente geeignet, wie sie beispielsweise in WO 98/31700 dargestellt sind. Because of their special properties, the above are Peptide acceptor / tRNA hybrid molecules according to the invention and the under Use of these available genotype / phenotype hybrid molecules and locked Translation complexes particularly well suited for in vitro evolution experiments, as shown for example in WO 98/31700.

Die Markierung der translatierten Proteine besteht in der Akzeptor-tRNA-Einheit, die während des Translationsvorgangs Codon-abhängig auf das bis dahin translatierte Polypeptidfragment kovalent übertragen wird. Erfindungsgemäß läßt sich eine solche einheitliche C-terminale Modifikation mit Hilfe von Akzeptor-spezifischen Antikörpern immunologisch detektieren (bei Verwendung von beispielsweise Puromycin-tRNA Detektion mit Hilfe von Puromycin-spezifischen Antikörpern), oder unter Ausnutzung der anhängenden Nukleinsäure über Hybridisierungsereignisse nachweisen. Bei Verwendung von radioaktiv oder mit chromogenen oder fluorogenen Molekülen markierten Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekülen lässt sich die Markierung entsprechend durch Nachweis der Radioaktivität beziehungsweise spektroskopisch oder spektrometrisch nachweisen. Eine solche C-terminale Modifikation ermöglicht auch eine unkomplizierte und rasch durchführbare Immobilisierung der modifizierten Polypeptide, z. B. an einer Akzeptor-spezifischen Immunmatrix. The labeling of the translated proteins consists in the acceptor tRNA unit that during the translation process codon-dependent on the previously translated Polypeptide fragment is covalently transferred. According to the invention such a uniform C-terminal modification with the help of acceptor-specific Detect antibodies immunologically (when using, for example Puromycin-tRNA detection with the help of Puromycin-specific antibodies), or using the attached nucleic acid via hybridization events prove. When using radioactive or with chromogenic or fluorogenic molecules labeled peptide acceptor / tRNA hybrid molecules can be the marking accordingly by detecting radioactivity respectively detect spectroscopically or spectrometrically. Such a C-terminal Modification also enables an uncomplicated and quick implementation Immobilization of the modified polypeptides, e.g. B. on an acceptor-specific Immune matrix.

Ebenso ist eine Immobilisierung an einer Matrix, die mit einer Nukleinsäure oder einem Nukleinsäurederivat beladen ist, über den tRNA-Anteil des Polypeptids unter Ausnutzung komplementärer Basenpaarungen möglich. Bei einer solchen Matrix kann es sich auch um einen Nukleinsäure-beladenen Chip handeln. Immobilization on a matrix with a nucleic acid or is loaded with a nucleic acid derivative, via the tRNA portion of the polypeptide under Use of complementary base pairings possible. With such a matrix it can also be a nucleic acid-loaded chip.

Eine weitere Nachweismöglichkeit modifizierter Peptide mit anhängender Nukleinsäure kann auch durch Amplifikation des Nukleinsäureanteils nach reverser Transkription und Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) erfolgen. Another possibility of detection of modified peptides with attached Nucleic acid can also be reversed by amplifying the nucleic acid content Transcription and polymerase chain reaction (PCR) take place.

Durch Verwendung einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff, einem Chromophor oder einer radioaktiven Gruppe gekoppelten Akzeptor-tRNA im Translationsprozeß ergibt sich die Möglichkeit zur Codon-spezifischen Markierung von Proteinen bzw. Proteinfragmenten an ihrem C-terminalen Ende. Die markierende Gruppe sollte in diesem Falle bevorzugt über die Akzeptor-Hälfte des Moleküls oder über 3'-terminal gelegene Nukleotide des tRNA-Anteils der Akzeptor-tRNA kovalent gekoppelt sein. Handelt es sich bei diesem tRNA-Anteil beispielsweise um eine Suppressor-tRNA läßt sich im Translationsprozeß eine spezifische Markierung von translatierten Proteinen am natürlichen C-Terminus erreichen. By using one with a fluorescent dye, a chromophore or a radioactive group coupled acceptor tRNA in the translation process the possibility of codon-specific labeling of proteins or Protein fragments at their C-terminal end. The marking group should be in in this case, preferably via the acceptor half of the molecule or via the 3'-terminal located nucleotides of the tRNA portion of the acceptor tRNA can be covalently coupled. If this tRNA portion is, for example, a suppressor tRNA can a specific marking of translated in the translation process Reach proteins at the natural C-terminus.

In Folge eines RNase-Verdaus oder einer Inkubation bei basischem pH, ist es anschließend auch möglich, den tRNA-Anteil des C-terminal modifizierten Polypeptids teilweise oder vollständig abzubauen. Dadurch erhält man ein Polypeptid voller Länge, das C-terminal eine relativ kleine Modifikation in Form eines peptidisch verknüpften Akzeptors oder Akzeptor-Derivats (z. B. mit anhängendem Fluoreszenzfarbstoff) aufweist. Diese Modifikation beeinflußt die physikalischchemischen Eigenschaften des Polypeptids, beispielsweise im Falle eines angekoppelten Puromycins oder Puromycin-Derivats als Akzeptor, nur geringfügig, so daß gängige Proteinanalysemethoden, wie z. B. elektrophoretische (2-D- Gelelektrophorese), oder chromatographische, als Trennmethode auch weiterhin Anwendung finden können. Auch komplexe mRNA-Gemische, wie das Transkriptom einer Zelle, lassen sich auf diese Weise durch die in vitro-Translation in Anwesenheit einer markierten, beispielsweise fluoreszenzmarkierten, Akzeptor-tRNA in korrespondierende Gemische markierter Polypeptide überführen. As a result of RNase digestion or incubation at basic pH, it is subsequently also possible to modify the tRNA portion of the C-terminal Partially or completely degrade the polypeptide. This gives you a Full-length polypeptide, the C-terminal a relatively small modification in the form of a peptidically linked acceptor or acceptor derivative (e.g. with attached Fluorescent dye). This modification affects the physicochemical properties of the polypeptide, for example in the case of a coupled Puromycins or Puromycin derivative as acceptor, only slightly, so that common protein analysis methods such. B. electrophoretic (2-D Gel electrophoresis), or chromatographic, as a separation method Can find application. Even complex mRNA mixtures, such as the transcriptome a cell, can be seen in this way by in vitro translation a labeled, for example fluorescence-labeled, acceptor tRNA in transfer corresponding mixtures of labeled polypeptides.

Für die Analyse unterschiedlicher Transkriptome bzw. ihrer korrespondierenden Gemische fluoreszenzmarkierter Polypeptide können dabei unterscheidbare Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden: So kann zur Analyse des Transkriptoms einer Zellinie vor Behandlung mit einem Wirkstoff oder einer zu testenden Substanz eine Markierung der korrespondierenden Translationsprodukte beispielsweise mit Hilfe eines bestimmten Fluoreszenzfarbstoffs (z. B. Floureszenzfarbstoff "Rot") erfolgen. Dagegen kann zur Analyse des Transkriptoms der Zellinie nach Behandlung mit einem Wirkstoff ein anderer Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Floureszenzfarbstoff "Grün") für die Markierung der korrespondierenden Translationsprodukte verwendet werden. Über die anhängenden, unterscheidbaren Fluoreszenzfarbstoffe lassen sich die Translationsprodukte stets eindeutig dem ursprünglichen Transkriptom zuordnen. Deshalb können die markierten Translationsprodukte mehrerer Transkriptome parallel mit Hilfe gängiger Trennverfahren analysiert werden. So ist es beispielsweise möglich, die markierten Translationsprodukte parallel im Gemisch über 2-dimensionale (2-D)- Gelelektrophorese aufzutrennen. Die im selben Gel aufgetrennten Peptide lassen sich nach Fluoreszenz-Scanning über die spezifisch detektierbaren Fluoreszenzfarbstoffe eindeutig dem ursprünglich kodierenden Transkriptom zuordnen. Dies ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen den Translationsprodukt-Gemischen, die ausgehend von unterschiedlichen Transkriptomen hergestellt wurden, hinsichtlich ihrer qualitativen und quantitaiven Zusammensetzung. Soweit Ladung und Masse der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe vergleichbar sind, sollten nämlich gleiche Peptide, Peptidfragmente bzw. Proteine, unabhängig von ihrem kodierenden Transkriptom, auch gleichermaßen über die 2-D-Gelelektrophorese aufgetrennt werden. Dieser methodische Ansatz erlaubt einen Vergleich (quantitativen und qualitativen) der Translationsprodukte nicht nur von zwei, sondern von mehreren Transkriptomen über ein und dasselbe 2-D-Gel. For the analysis of different transcriptomes or their corresponding ones Mixtures of fluorescence-labeled polypeptides can be distinguished Fluorescent dyes are used: this can be used to analyze the transcriptome a cell line before treatment with an active substance or a substance to be tested marking the corresponding translation products with, for example Using a specific fluorescent dye (e.g. fluorescent dye "red") respectively. In contrast, the cell line can be used to analyze the transcriptome Treatment with an active substance another fluorescent dye (e.g. Fluorescent dye "green") for marking the corresponding Translation products can be used. About the attached, distinguishable Fluorescent dyes are always clear to the translation products assign original transcriptome. Therefore the marked Translation products of several transcriptomes in parallel with the help of common ones Separation processes are analyzed. So it is possible, for example, the marked Translation products in parallel in a mixture via 2-dimensional (2-D) - To separate gel electrophoresis. Leave the peptides separated in the same gel after fluorescence scanning over the specifically detectable Fluorescent dyes clearly the original coding transcriptome assign. This enables a direct comparison between the Translation product mixtures based on different Transcriptomes were produced in terms of their qualitative and quantitative Composition. As far as the load and mass of the used Fluorescent dyes are comparable, namely the same peptides, Peptide fragments or proteins, regardless of their coding transcriptome, can also be separated equally using 2-D gel electrophoresis. This methodological approach allows a comparison (quantitative and qualitative) of Translation products not only from two but from several transcriptomes over one and the same 2-D gel.

Wird anstelle einer Suppressor-tRNA eine andere Codon-spezifische tRNA als Bestandteil des Akzeptor-tRNA-Hybridmoleküls während der Translation eingesetzt und liegt diese im Gemisch mit der natürlichen Codon-spezifischen, Aminosäurebeladenen tRNA vor, wird eine bestimmte mRNA, soweit sie an definierten Positionen innerhalb ihrer kodierenden Sequenz dieses Codon ein- oder mehrmals aufweist, während der Translation in ein Peptid charakteristischer Länge oder ein Peptidgemisch aus Peptiden von charakteristischer Länge überführt. Anzahl und Länge der entstehenden Peptide ist aufgrund der Codon-Sequenz ihrer kodierenden mRNA vorhersagbar. Umgekehrt ist es möglich, einem so erzeugten Gemisch aus Peptiden mit jeweils charakteristischer Länge (z. B. detektierbar nach Gelanalyse in Form eines Fragmentmusters), evtl. in Kombination mit weiteren physikalischchemischen Charakteristika (z. B. Isolelektrischer Punkt, nach Bestimmung über 2-D- Gelelektrophorese) eine bestimmte kodierende Sequenz zuzuordnen. Dies geschieht durch den Vergleich des experimentell zu beobachtenden Ergebnisses mit den aus Sequenzen ableitbaren Ergebnissen - i. d. R. mit Hilfe einer computergestützten Analyse. If a codon-specific tRNA is used instead of a suppressor tRNA Part of the acceptor-tRNA hybrid molecule used during translation and is this mixed with the natural codon-specific, Amino acid-loaded tRNA precedes a specific mRNA, insofar as it is defined on Positions within their coding sequence of this codon one or more times has, during translation into a peptide of characteristic length or a Peptide mixture transferred from peptides of characteristic length. Number and Length of the resulting peptides is due to the codon sequence of their coding mRNA predictable. Conversely, it is possible to make a mixture produced in this way Peptides each with a characteristic length (e.g. detectable after gel analysis in Form of a fragment pattern), possibly in combination with others physicochemical characteristics (e.g. isolelectric point, after determination via 2-D Gel electrophoresis) to assign a specific coding sequence. This happens by comparing the experimentally observed result with the results derived from sequences - i. d. R. with the help of a computer aided analysis.

Die Herstellung von Codon-arretierten Translationskomplexen mittels der erfindungsgemäßen Peptidakzeptor-tRNAs läßt sich in vitro beispielsweise unter Verwendung von unterschiedlichen translationskompetenten Lysaten erreichen, beispielsweise mit Reticulozytenlysat aus Kaninchen, E. coli S30-Extrakten, einem Lysat aus Hefezellen oder einem Extrakt aus Weizenkeimen. The production of codon-locked translation complexes using the Peptide acceptor tRNAs according to the invention can be found in vitro, for example Achieve the use of different translation-competent lysates, for example with rabbit reticulocyte lysate, E. coli S30 extracts, one Lysate from yeast cells or an extract from wheat germ.

Erfindungsgemäß werden hierbei bevorzugt weitere Modifikationen der Zelllysate bzw. ihrer Ursprungszellen durchgeführt, die zu einer Inaktivierung der Release Faktor-Aktivität führen, beispielsweise

  • 1. Inaktivierungen in Folge einer Abreinigung der Release Faktoren aus dem Lysat,
  • 2. Inaktivierungen in Folge einer inaktivierenden Liganden-Bindung (z. B. Anbindung eines Antikörpers) oder
  • 3. Inaktivierungen in Folge der Verwendung von induzierbar inaktivierbaren Mutanten des Release Faktors (z. B. durch Temperaturshift inaktivierbare ts- Mutante des Release-Faktors bzw. der Release Faktoren).
According to the invention, further modifications of the cell lysates or their original cells are preferably carried out, which lead to inactivation of the release factor activity, for example
  • 1. inactivations as a result of cleaning the release factors from the lysate,
  • 2. inactivations as a result of an inactivating ligand binding (eg binding of an antibody) or
  • 3. Inactivations as a result of the use of inducible inactivatable mutants of the release factor (for example ts mutant of the release factor or the release factors which can be inactivated by temperature shift).

Abbildungenpictures

Abb. 1: Schematische Übersicht über den Aufbau eines Peptidakzeptor-tRNA- Hybridmoleküls. Fig. 1: Schematic overview of the structure of a peptide acceptor-tRNA hybrid molecule.

Abb. 2: Schematische Übersicht über die strukturelle Analogie zwischen Puromycin, Puromycin-Suppressor-tRNA und einer Tyrosin-beladenen tRNA (obere Bildhälfte), sowie über die Wirkung von Puromycin (untere Bildhälfte, links) bzw. von Puromycin- Suppressor-tRNA (untere Bildhälfte, rechts). Fig. 2: Schematic overview of the structural analogy between puromycin, puromycin suppressor tRNA and a tyrosine-loaded tRNA (upper half of the picture), as well as the effect of puromycin (lower half of the picture, left) or of puromycin suppressor tRNA ( lower half of the picture, right).

Abb. 3: Schematische Übersicht über den Verlauf einer in vitro Selektion unter Nutzung von nicht kovalenten Fusionen aus mRNA/Puromycin-Suppressor- tRNA/Polypeptid/Ribosom-Komplexen, die sich durch Translation in Gegenwart von Puromycin-Suppressor-tRNA herstellen lassen. Fig. 3: Schematic overview of the course of an in vitro selection using non-covalent fusions from mRNA / puromycin suppressor tRNA / polypeptide / ribosome complexes, which can be produced by translation in the presence of puromycin suppressor tRNA.

Abb. 4: Schematische Übersicht über den Ablauf der Methoden zur Erzeugung einer 3'-UTR- und Stopp-Codon-freien mRNA.

  • 1. Mit Hilfe einer 3' → 5'-Exoribonuklease läßt sich an einem Stopp-Codon- spezifisch arretierten Translationskomplex der 3'-UTR-Bereich der kodierenden RNA von seinem 3'-Ende bis in die Nähe des Stopp-Codons abbauen.
  • 2. Der in 3'-Richtung vom Ribosomenkomplex (Stopp-Codon-spezifisch arretiert) gelegene Bereich der kodierenden RNA läßt sich beispielsweise durch Reverse Transkriptase in ein DNA/RNA-Hybrid überführen. Anschließend kann dieser RNA- Bereich z. B. mit Hilfe von RNase H degradiert werden.
Literatur Hanna MM.
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Crosslinking transfer RNA and messenger RNA at the ribosomal decoding region:
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Totally in vitro protein selection using mRNA-protein fusions and ribosome display.
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RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins.
Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Nov 11; 94(23): 12297-302. Fig. 4: Schematic overview of the sequence of methods for generating a 3'-UTR and stop codon-free mRNA.
  • 1. With the aid of a 3 '→ 5' exoribonuclease, the 3 'UTR region of the coding RNA can be degraded from its 3' end to the vicinity of the stop codon on a translation complex specifically locked in a stop codon.
  • 2. The region of the coding RNA located in the 3 'direction from the ribosome complex (stop codon-specifically locked) can be converted into a DNA / RNA hybrid, for example by reverse transcriptase. Subsequently, this RNA area z. B. be degraded with the help of RNase H.
Literature Hanna MM.
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Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Nov 11; 94 (23): 12297-302.

Claims (32)

1. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül, umfassend a) tRNA oder tRNA-analoge Einheit, die zur Codon-spezifischen Bindung an die mRNA während des Translationsprozesses in der Lage ist, b) Peptidakzeptor-Einheit, die dazu in der Lage ist, in einer Transpeptidasereaktion einen Carbonsäureester unter Ausbildung einer stabilen, kovalenten Bindung zu spalten, wobei die Einheiten (a) und (b) direkt oder über einen Linker kovalent miteinander verknüpft sind. 1. A peptide acceptor / tRNA hybrid molecule comprising a) tRNA or tRNA-analogous unit, which is capable of codon-specific binding to the mRNA during the translation process, b) peptide acceptor unit which is capable of cleaving a carboxylic acid ester in a transpeptidase reaction to form a stable, covalent bond, wherein the units (a) and (b) are covalently linked to one another directly or via a linker. 2. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 1, umfassend a) natürlicherweise vorkommende, synthetisch hergestellte oder durch in vitro- Transkription hergestellte tRNA oder tRNA-Derivat, das auch natürlicherweise nicht vorkommende Nukleotidanaloga umfassen kann, wobei die Sequenz der tRNA 3'-terminal um bis zu 20 Nukleotide verkürzt sein kann, b) Aminosäure, Aminosäurederivat, Puromycin oder Puromycin-Derivat, wobei die Einheit (b) kovalent mit dem 3'-Ende der Einheit (a) verknüpft ist. 2. A peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to claim 1, comprising a) naturally occurring, synthetically produced or by in vitro transcription-produced tRNA or tRNA derivative, which can also include naturally occurring nucleotide analogs, the sequence of the tRNA being 3'-terminally shortened by up to 20 nucleotides, b) amino acid, amino acid derivative, puromycin or puromycin derivative, unit (b) being covalently linked to the 3 'end of unit (a). 3. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Akzeptor-Einheit mit dem 3'-terminalen Nukleotid oder Nukleotidanalogon der tRNA-Einheit in Form einer kovalenten Bindung, insbesondere einer Phosphatesterbindung oder Amidbindung, stabil verknüpft ist. 3. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to claim 1 or 2, characterized characterized in that the acceptor unit with the 3'-terminal nucleotide or Nucleotide analogue of the tRNA unit in the form of a covalent bond, in particular a phosphate ester bond or amide bond, is stably linked. 4. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Akzeptor-Einheit um ein Puromycinmolekül handelt, das über die 5'-Hydroxylgruppe der Zucker-Untereinheit eine Phosphatesterbindung mit dem 3'-terminalen Ende einer tRNA ausbildet. 4. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to claim 3, characterized in that that the acceptor unit is a puromycin molecule which via the 5'-hydroxyl group of the sugar subunit has a phosphate ester bond the 3'-terminal end of a tRNA. 5. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei Komponente (a) um eine Suppressor-tRNA oder ein Suppressor-tRNA-Derivat handelt. 5. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to any one of claims 1 to 4, characterized characterized in that component (a) is a suppressor tRNA or is a suppressor tRNA derivative. 6. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß an die Akzeptor-Untereinheit oder die tRNA-Untereinheit ein Marker kovalent gebunden ist. 6. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to one of claims 1 to 5, characterized characterized in that to the acceptor subunit or the tRNA subunit a marker is covalently bound. 7. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Marker um einen Fluoreszenzfarbstoff, einen Chromophor oder eine radioaktive Gruppe handelt. 7. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to claim 6, characterized in that that the marker is a fluorescent dye, a chromophore or a radioactive group. 8. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich im oder benachbart zum Anticodon-Bereich der tRNA ein kovalent gebundenes photoreaktives Nukleotidanalogon befindet. 8. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to any one of claims 1 to 7, characterized characterized in that in or adjacent to the anticodon region of the tRNA a covalently bound photoreactive nucleotide analog is located. 9. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich 3'-terminal zum Anticodon der tRNA-Einheit ein Wybutin als photoreaktives Nukleotidanalogon befindet. 9. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to claim 8, characterized in that that a 3'-terminal to the anticodon of the tRNA unit is a wybutin photoreactive nucleotide analog is located. 10. Verwendung eines Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Codon-spezifisch arretierten Translationskomplexes. 10. Use of a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to one of the Claims 1 to 9 for the production of a codon-specifically locked Translation complex. 11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Codon-spezifisch arretierten Translationskomplex um einen Stopp-Codonspezifisch arretierten Translationskomplex handelt. 11. Use according to claim 10, characterized in that it is the Codon-specifically locked translation complex by one Stop codon-specific locked translation complex. 12. Verwendung eines Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls nach Anspruch 8 oder 9 zur Herstellung eines arretierten Translationskomplexes, dadurch gekennzeichnet, daß das tRNA-Molekül nach Ausbildung des arretierten Translationskomplexes durch Aktivierung der photoreaktiven Gruppe kovalent an die mRNA gebunden wird. 12. Use of a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to claim 8 or 9 for the production of a locked translation complex, thereby characterized in that the tRNA molecule locked after formation of the Translational complex by activating the photoreactive group the mRNA is bound. 13. Verfahren zur Herstellung eines Hybridmoleküls aus Polypeptid und für das Polypeptid kodierender mRNA, dadurch gekennzeichnet, daß gemäß Anspruch 12 ein arretierter Translationskomplex mit kovalenter Verknüpfung zwischen mRNA und tRNA-Einheit hergestellt wird und das Ribosom anschließend abgetrennt wird. 13. A method for producing a hybrid molecule from polypeptide and for the Polypeptide encoding mRNA, characterized in that according to claim 12 a locked translation complex with covalent link between mRNA and tRNA unit is produced and the ribosome subsequently is separated. 14. Hybridmolekül aus Polypeptid und für das Polypeptid kodierender mRNA, dadurch gekennzeichnet, dass Polypeptid und mRNA über ein Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9 miteinander verbunden sind. 14. hybrid molecule composed of polypeptide and mRNA coding for the polypeptide, characterized in that polypeptide and mRNA via one Peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to one of claims 1 to 9 are interconnected. 15. Hybridmolekül nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül und mRNA über eine photoreaktive Gruppe kovalent miteinander verknüpft sind. 15. Hybrid molecule according to claim 14, characterized in that the Peptide acceptor / tRNA hybrid molecule and mRNA via a photoreactive group are covalently linked. 16. Arretierter Translationskomplex, dadurch gekennzeichnet, daß sich ein codon- spezifisches Peptidakzeptor-tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9 im Ribosom befindet, an dessen Peptidakzeptor-Untereinheit das Polypeptid kovalent gebunden ist. 16. Locked translation complex, characterized in that there is a codon Specific peptide acceptor-tRNA hybrid molecule according to one of claims 1 to 9 is located in the ribosome, the peptide acceptor subunit of which Polypeptide is covalently bound. 17. Arretierter Translationskomplex nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül und mRNA über eine photoreaktive Gruppe kovalent miteinander verknüpft sind. 17. Locked translation complex according to claim 16, characterized in that the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule and mRNA via a photoreactive Group are covalently linked. 18. Verwendung des Hybridmoleküls nach Anspruch 14 oder 15 oder des arretierten Translationskomplexes nach Anspruch 16 oder 17 zur Degradation des 3'- untranslatierten Bereiches der mRNA und/oder zur Entfernung des Stopp- Codons. 18. Use of the hybrid molecule according to claim 14 or 15 or the locked Translation complex according to claim 16 or 17 for degradation of the 3'- untranslated area of the mRNA and / or to remove the stop Codons. 19. Verwendung nach Anspruch 18 wobei die Degradation durch Einsatz einer 3'-5'- Exoribonuklease oder nach Herstellung des komplementären cDNA-Stranges unter Einsatz einer RNA/DNA-Strang-spezifischen RNase, bevorzugt RNase H, erfolgt. 19. Use according to claim 18, wherein the degradation by using a 3'-5'- Exoribonuclease or after preparation of the complementary cDNA strand using an RNA / DNA strand-specific RNase, preferably RNase H, he follows. 20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei zur Entfernung des verbliebenen 3'-UTR und des Stopp-Codons mindestens folgende weitere Schritte durchgeführt werden: a) Ankopplung eines RNA-Adaptors, umfassend eine Primer-Bindestelle und eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, bevorzugt ein Typ IIS- Restriktionsenzym, b) Reverse Transkription der RNA unter Verwendung eines Adaptorkomplementären Primers, c) Degradation der RNA im Bereich des RNA/DNA-Doppelstranghybrids, d) Zweit-DNA-Strang-Synthese, e) Restriktion der doppelsträngigen DNA stromaufwärts vom Stopp-Codon durch ein Restriktionsenzym, bevorzugt durch ein Typ IIS-Restriktionsenzym. 20. Use according to claim 19, wherein at least the following further steps are carried out to remove the remaining 3'-UTR and the stop codon: a) coupling of an RNA adapter comprising a primer binding site and a recognition sequence for a restriction enzyme, preferably a type IIS restriction enzyme, b) reverse transcription of the RNA using an adapter-complementary primer, c) degradation of the RNA in the region of the RNA / DNA double-strand hybrid, d) second DNA strand synthesis, e) Restriction of the double-stranded DNA upstream of the stop codon by a restriction enzyme, preferably by a type IIS restriction enzyme. 21. Verwendung eines Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Codon-spezifischen Markierung von Proteinen und/oder Proteinfragmenten an ihrem carboxyterminalen Ende während ihrer Herstellung durch in vitro-Translation. 21. Use of a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to one of the Claims 1 to 9 for codon-specific labeling of proteins and / or Protein fragments at their carboxy terminal end during their manufacture through in vitro translation. 22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei es sich bei der codon-spezifischen Markierung um eine Stopp-Codon-spezfisiche Markierung handelt. 22. Use according to claim 21, wherein it is the codon-specific Label is a stop codon-specific label. 23. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß nach Herstellung des markierten Proteins bzw. Proteinfragments der tRNA-Teil teilweise oder vollständig abgebaut wird, bevorzugt mittels einer RNase oder durch Inkubation bei basischem pH. 23. Use according to claim 21 or 22, characterized in that after Production of the labeled protein or protein fragment of the tRNA part is partially or completely degraded, preferably by means of an RNase or by incubation at basic pH. 24. Carboxyterminal markiertes Protein erhältlich gemäß einer Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 23. 24. Carboxy terminally labeled protein available according to use according to one of claims 21 to 23. 25. Verfahren zum Nachweis oder zur Reinigung von carboxyterminal markierten Proteinen nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis und/oder die Reinigung durch Akzeptor-spezifisch bindende Moleküle, bevorzugt Akzeptor-spezifische Antikörper und/oder durch Hybridisierung ihres tRNA- Anteils mit einer komplementären Nukleinsäure erfolgt, wobei Antikörper und komplementäre Nukleinsäure auf einer Matrix immobilisiert sein können. 25. Method for the detection or purification of carboxy-terminally labeled Proteins according to claim 24, characterized in that the detection and / or cleaning by acceptor-specific binding molecules is preferred Acceptor-specific antibodies and / or by hybridizing their tRNA Proportion takes place with a complementary nucleic acid, where antibodies and complementary nucleic acid can be immobilized on a matrix. 26. Verfahren zum Nachweis von carboxyterminal markierten Proteinen nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durch reverse Transkription ihres RNA-Anteils und anschließende Amplifikation der cDNA in der Polymerase-Kettenreaktion erfolgt. 26. Method for the detection of carboxy-terminally labeled proteins Claim 24, characterized in that the detection by reverse Transcription of their RNA portion and subsequent amplification of the cDNA in the Polymerase chain reaction takes place. 27. Verfahren zur differentiellen Transkriptomanalyse, folgende Schritte umfassend: a) das Transkriptom von Zellen wird isoliert und gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23 werden C-terminal markierte Proteine und/oder Proteinfragmente synthetisiert, b) das Transkriptom von Zellen nach (a) wird, nachdem die Zellen einem Wirkstoff oder einer zu testenden Substanz ausgesetzt worden waren, isoliert und wie in (a) werden C-terminal markierte Proteine und/oder Proteinfragmente synthetisiert, c) die erhaltenen Protein- und/oder Proteinfragmentgemische werden durch Proteinanalyse, bevorzugt durch 2-dimensionale Gelanalyse, miteinander verglichen. 27. A method for differential transcriptome analysis comprising the following steps: a) the transcriptome of cells is isolated and according to one of claims 21 to 23, C-terminally labeled proteins and / or protein fragments are synthesized, b) the transcriptome of cells according to (a) is isolated after the cells have been exposed to an active ingredient or a substance to be tested and, as in (a), C-terminally labeled proteins and / or protein fragments are synthesized, c) the protein and / or protein fragment mixtures obtained are compared with one another by protein analysis, preferably by 2-dimensional gel analysis. 28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß in (a) und (b) unterschiedlich markierte tRNA-Hybridmoleküle eingesetzt werden und die erhaltenen Protein- und/oder Proteinfragmentgemische parallel elektrophoretisch mit demselben 2-dimensionalen Gel analysiert werden. 28. The method according to claim 27, characterized in that in (a) and (b) differently labeled tRNA hybrid molecules are used and the obtained protein and / or protein fragment mixtures in parallel electrophoretically can be analyzed with the same 2-dimensional gel. 29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß als Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül ein Peptidakzeptor/Suppressor-tRNA- Hybridmolekül verwendet wird und entsprechend vollständige Proteine synthetisiert werden. 29. The method according to claim 27 or 28, characterized in that as Peptide acceptor / tRNA hybrid molecule a peptide acceptor / suppressor tRNA Hybrid molecule is used and correspondingly complete proteins be synthesized. 30. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in vitro unter Verwendung von translationskompetenten Lysaten durchgeführt wird, bevorzugt mit Reticulozytenlysat, E. coli S30-Extrakten und/oder mit Lysat aus Hefezellen. 30. The method or use according to one of the preceding claims, characterized in that the method using in vitro translation-competent lysates is carried out, preferably with Reticulocyte lysate, E. coli S30 extracts and / or with lysate from yeast cells. 31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Release-Faktor- Aktivität in dem Lysat herabgesetzt oder inhibiert wurde, bevorzugt durch Abreicherung des Release-Faktors, durch inaktivierende Ligandenbindung, besonders bevorzugt durch inaktivierende Anbindung eines spezifischen Antikörpers oder durch Verwendung von induzierbar inaktivierbaren Mutanten des Releasefaktors. 31. The method according to claim 30, characterized in that the release factor Activity in which the lysate was reduced or inhibited, preferably by Depletion of the release factor through inactivating ligand binding, particularly preferred by inactivating a specific Antibody or by using inducible inactivatable mutants the release factor. 32. Verwendung eines Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 oder eines Hybridmoleküls gemäß Anspruch 14 oder 15 oder eines arretierten Translationskomplexes gemäß Anspruch 16 oder 17 für in vitro- Evolutionsexperimente. 32. Use of a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to one of the Claims 1 to 9 or a hybrid molecule according to claim 14 or 15 or a locked translation complex according to claim 16 or 17 for in vitro Evolution experiments.
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