DE10116585A1 - Peptide acceptor / tRNA hybrid molecule and its use for the production of codon specific arrested translation complexes - Google Patents

Peptide acceptor / tRNA hybrid molecule and its use for the production of codon specific arrested translation complexes

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DE10116585A1
DE10116585A1 DE2001116585 DE10116585A DE10116585A1 DE 10116585 A1 DE10116585 A1 DE 10116585A1 DE 2001116585 DE2001116585 DE 2001116585 DE 10116585 A DE10116585 A DE 10116585A DE 10116585 A1 DE10116585 A1 DE 10116585A1
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Dirk Boekenkamp
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    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül, seine Verwendung als Substrat für die in vitro Translation einer mRNA zur Bildung von Codon-spezifisch, insbesondere Stopp-Codon-spezifisch arretierten Translationskomplexen. The present invention relates to a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule, its use as a substrate for in vitro translation of an mRNA to the formation of codon specific, in particular stop codon-specific arrested translation complexes. Auf diese Weise kann eine Genotyp-Phänotyp-Kopplung erreicht und/oder eine carboxyterminale Markierung in Proteine eingeführt werden. In this way, a genotype-phenotype coupling may be achieved and / or a carboxy-marker in proteins are introduced. Die Codon-spezifisch-arretierten Translationskomplexe lassen sich beispielsweise für die selektive spezifische Degradation des 3'-untranslatierten Bereichs der kodierenden mRNA verwenden. The specific codon-arrested translation complexes can be used for example for the selective specific degradation of the 3'-untranslated region of the mRNA encoding. Die vorliegende Erfindung eignet sich insbesondere für die Transkriptomanalyse und für in vitro Evolutionsanwendungen. The present invention is particularly suitable for the transcriptome analysis and for in vitro evolution of applications.

Description

  • [0001]
    Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül sowie seine Verwendung als Substrat der in vitro Translation einer mRNA zur Bildung von Codon-spezifisch arretierten Translationskomplexen. The present invention relates to a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule as well as its use as a substrate of the in vitro translation of an mRNA to the formation of codon specific arrested translation complexes.
  • [0002]
    Die Herstellung einer Verknüpfung zwischen einem Peptid bzw. Protein (Phänotyp) und seiner kodierenden RNA (Genotyp) ist Voraussetzung für zahlreiche in vitro- Evolutionstechniken, wie z. The establishment of a link between a peptide or protein (phenotype) and its encoding RNA (genotype) is a prerequisite for many in vitro evolution techniques such. B. die Ribosomen-Display- bzw. die Polysomen-Display- Technologie [Mattheakis et al., 1994; As the ribosome display or polysome display technology [Mattheakis et al., 1994; Mattheakis et al., 1996; . Mattheakis et al, 1996; Jermutus et al., 1998] oder die RNA-fusion-Display-Technologie [WO 98/31700; . Jermutus et al, 1998] or the RNA-fusion display technology [WO 98/31700; Roberts, 1999]. Roberts, 1999]. Aus einem Gemisch einer Vielzahl derartiger Genotyp-Phänotyp-Fusionen ist es möglich bestimmte Genotyp-Phänotyp-Fusionen aufgrund definierter Eigenschaften ihres Polypeptidanteils von allen übrigen Fusionen abzutrennen (Selektion). From a mixture of a plurality of such genotype-phenotype fusions, it is possible certain genotype-phenotype fusions due to defined characteristics of their polypeptide portion separate from all other fusions (selection). Dies wird beispielsweise affinitätschromatographisch über direkte Bindung an einen immobilisierten Liganden erreicht. This is achieved for example by affinity chromatography via direct binding to an immobilized ligand. Die so aus dem ursprünglichen Gemisch selektierte Subpopulation Liganden-bindender Genotyp-Phänotyp-Fusionen (RNA- Protein-Fusionen) läßt sich unter Ausnutzung ihrer Nukleinsäureanteile über Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) amplifizieren und steht damit für eine erneute Selektionsrunde zur Verfügung [detailliert ausgeführt in WO 98/31700]. The thus selected from the original mixture subpopulation ligand-binding genotype-phenotype fusions (RNA- protein fusions) may be taking advantage of their nucleic acid units via polymerase chain reaction (PCR) to amplify and thus available for a new round of selection provided [in detail executed in WO 98/31700]. Der Nukleinsäureanteil erlaubt weiterhin auch eine Identifizierung der Primärsequenz einzelner RNA-Protein-Fusionen, beispielsweise durch Sequenzierungs- oder Hybridiesierungstechniken. The nucleic acid portion still also allows an identification of the primary sequence of individual RNA-protein fusions, for example, by sequencing or Hybridiesierungstechniken.
  • [0003]
    Die an der Amplifikation Liganden-bindender Genotyp-Phänotyp-Fusionen beteiligten methodischen Schritte sind im folgenden angeführt: (a) Reverse Transkription der RNA, (b) Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) zur Amplifikation der cDNA unter Verwendung eines Primers, der gleichzeitig einen Promotor, sowie eine geeignete ribosomale Bindungsstelle einführt, (c) in vitro Transkription dieser cDNA zur Herstellung einer kodierenden mRNA und (d) in vitro Translation der zuvor synthetisierten mRNA. The involved in the amplification of ligand-binding genotype-phenotype fusions methodological steps are set forth below: (a) Reverse transcription of the RNA, (b) polymerase chain reaction (PCR) for amplification of the cDNA using a primer, the same a promoter, and an appropriate ribosome binding site is introduced, (c) in vitro transcription of said cDNA coding for the production of a mRNA and (d) in vitro translation of the previously synthesized mRNA.
  • [0004]
    Als Voraussetzung für die Anwendung der oben angeführten in vitro Evolutionstechniken muß - zur Kopplung von Genotyp und Phänotyp - während des Translationsprozesses ein Auseinanderfallen des Polypeptid/mRNA-Komplexes verhindert werden, so daß entweder eine nicht-kovalente Polypeptid/mRNA-Fusion erhalten bleibt und/oder - aufgrund vorhergehender Modifikationen an der kodierenden mRNA - eine kovalente Polypeptid/mRNA-Fusion während des Translationsprozesses erreicht wird. falling apart of the polypeptide / mRNA complex during the translation process can be prevented, so that either remains a non-covalent polypeptide / mRNA-Fusion and / - as a prerequisite for the application of the cited in vitro evolution techniques must - to couple genotype and phenotype or - because of the previous modifications to the encoding mRNA - a covalent polypeptide / mRNA-Fusion is achieved during the translation process.
  • [0005]
    Beispiele für die in vitro Herstellung von nicht kovalenten Polypeptid/mRNA- Fusionen ist die Polysomen-Display- und die Ribosomen-Display-Technologie [Kawasaki GH US 5658754; Examples of the in vitro production of non-covalent polypeptide / mRNA fusions is the polysome display and ribosome display technology [Kawasaki GH US 5658754; Mattheakis et al., 1994; . Mattheakis et al, 1994; Mattheakis et al., 1996; . Mattheakis et al, 1996; Hanes & Plückthuhn, 1997; Hanes & Plückthuhn, 1997; Plückthuhn WO 98/48008]. Plückthuhn WO 98/48008]. Dabei wid durch die Verwendung einer Stopp-Codon freien mRNA ein Auseinanderfallen des Translationskomplexes (Peptid/Ribosomen/mRNA/tRNA-Komplex) am Ende des Translationprozesses verhindert und der Peptid/Ribosomen/mRNA/tRNA-Komplex ggfs. durch Salzzugabe und Temperaturabsenkung zusätzlich stabilisiert. In this case, wid by the use of a stop codon from falling apart of the translation complex prevents free mRNA (peptide / ribosome / mRNA / tRNA complex) at the end of the translation process and the peptide / ribosome / mRNA / tRNA complex if necessary. By addition of salt and temperature reduction additionally stabilized ,
  • [0006]
    Ein Beispiel für eine in vitro Evolutionstechnik, bei der es - während des Translationsprozesses - zur Ausbildung kovalenter Polypeptid/mRNA-Fusionen kommt, stellt die von Robert & Szostak (1997) beschriebene RNA-fusion-Display- Technologie dar. Voraussetzung für die Erzeugung von Genotyp/Phänotyp-Fusionen im Rahmen dieser Technologie ist das Vorhandensein einer kovalenten Modifikation am 3'-Ende der kodierenden RNA in Form einer Puromycin-haltigen Linkerstruktur [Roberts & Szostak, 1997, WO 98/31700, DE 196 46 372, WO 98/16636]. An example of an in vitro evolution engineering, which is - during the translation process - results in the formation of covalent polypeptide / mRNA fusions represents the by Robert & Szostak (1997) described RNA-fusion-display technology basis for the production of. genotype / phenotype fusions in the context of this technology is the presence of a covalent modification at the 3 'end of the coding RNA in the form of a puromycin-containing linker structure [Roberts & Szostak, 1997, WO 98/31700, DE 196 46 372, WO 98 / 16636]. Während des Translationsvorgangs stoppt bei Verwendung einer modifizierten RNA das Ribosom am 3'-Ende der RNA am Übergang zum Puromycin-haltigen Linker. During the translation process, the ribosome at the 3'-end of the RNA stops when using a modified RNA at the transition to the puromycin-containing linker. Das über den Linker an die kodierende mRNA immobilisierte Puromycin kann dann in die A-Site des Ribosoms eintreten und die bis zu diesem Zeitpunkt transtatierte Peptidkette in einem ribosomal katalysierten Reaktionsschritt übernehmen. The immobilized via the linker to the mRNA encoding puromycin may then enter the A site of the ribosome and assume by this time transtatierte peptide chain in a ribosomal catalyzed reaction step. Als Ergebnis eines solchen Vorganges entsteht eine kovalente Verknüpfung zwischen einem Peptid und seiner kodierenden mRNA, die über die Wirkung des Puromycins als Akzeptor der wachsenden Peptidkette erreicht wird. As a result of such a process results in a covalent linkage between a peptide and its encoding mRNA, which is reached by the effect of puromycin as the acceptor of the growing peptide chain. Dieser mRNA/Polypeptid- Komplex ist auch nach Abreinigung des Ribosoms über einen weiten Temperatur- und Salzkonzentrationsbereich stabil. This mRNA / polypeptide complex is stable even after cleaning of the ribosome over a wide temperature and salt concentration range.
  • [0007]
    Der Einsatz der oben genannten Polypeptid/mRNA-Fusions-Technologien ist in der Regel beschränkt auf die Verwendung Stopp-Codon freier RNAs. The use of the above polypeptide / mRNA-fusion technologies is usually limited to the use stop codon free RNAs. Bei Verwendung einer Stopp-Codon-haltigen RNA würde es nämlich durch die Release Factor- Wirkung während der Translation zu einer vorzeitigen Ablösung der translatierten Polypeptidkette vom Translationskomplex kommen (durch Stimulation der Hydrolyse der Esterverknüpfung zwischen der tRNA in der P-Site des Ribosoms und dem Carboxyl-Ende der Polypeptidkette), noch bevor es, z. Using a stop-codon-containing RNA, it would namely by the release Factor effect during the translation to a premature detachment of the translated polypeptide from the translational complex come (by stimulation of the hydrolysis of the Esterverknüpfung between the tRNA in the P site of the ribosome and the carboxyl end of the polypeptide chain) before it, for. B. im Falle einer Puromycinmodifizierten mRNA, zur Ausbildung einer kovalenten Verknüpfung zwischen dem Polypeptid und seiner kodierenden mRNA kommen kann. As may occur in case of a Puromycinmodifizierten mRNA, to form a covalent linkage between the polypeptide and its encoding mRNA.
  • [0008]
    Auch im Rahmen der Ribosomen- bzw. Polysomen-Display-Technologie würde das Vorhandensein eines Stopp-Codons innerhalb der RNA zum Auseinanderfallen des Translationskomplexes führen und damit die Bildung eines stabilen Ribosomen/mRNA/tRNA/Peptid-Komplexes nicht zulassen. Also as part of the ribosome or polysome display technology, the presence of a stop codon within the RNA would lead to the disintegration of the translation complex and thus the formation of a stable ribosome / mRNA / tRNA / peptide complex not allow.
  • [0009]
    Deshalb ist die Verwendung zellulärer mRNA für die Herstellung von Polypeptid/mRNA-Verknüpfungen in der Regel erst nach einer aufwendigen Entfernung des Stopp-Codons und des 3'-untranslatierten Bereiches der mRNA möglich. Therefore, the use of cellular mRNA for the production of polypeptide / mRNA linkages usually only after an extensive removal of the stop codons and the 3 'untranslated region of the mRNA is possible. Die RNA-Fusion-Display-Technologie erfordert neben der Entfernung des Stopp-Codons und des 3'-untranslatierten Bereiches der mRNA außerdem als zusätzlichen Schritt die bereits beschriebene Modifikation des 3'-Endes der RNA durch Anfügen des kovalent verknüpften Puromycin-haltigen Linkers. The RNA-fusion display technology requires not only the removal of the stop codons and the 3 'untranslated region of the mRNA also as an additional step the modification of the 3'-end of the RNA already described by attaching the covalently linked puromycin-containing linker. Eine Entfernung des 3'-untranslatierten Bereiches zellulärer mRNA von heterogener Länge, incl. des Stopp-Codons, kann dabei über mehrere methodische Ansätze erreicht werden [beschrieben in WO 00/09737], wie z. . Removal of the 3 'untranslated region of cellular mRNA of heterogeneous length, inclusive of the stop codon, thereby can be reached via several methodological approaches [described in WO 00/09737], such. B. B.
    • a) durch eine gerichtete 3' → 5' Degradation der RNA mit Hilfe einer Exoribonuklease, a) by transmitting a 3 '→ 5' degradation of the RNA by means of a exoribonuclease,
    • b) durch eine gerichtete 3' → 5 Degradation mit Hilfe einer Exonuklease, wie z. b) by transmitting a 3 '→ 5 exonuclease degradation by a such. B Exonuklease III bzw. Lambda-Exonuklease auf der Ebene der korrespondierenden cDNA, B exonuclease III or Lambda exonuclease at the level of the corresponding cDNA,
    • c) durch die Verwendung zufällig annealender Random-Primer während des Umschreibens zellulärer mRNA in korrespondierende cDNA, wobei es ua auch zur Bildung Stopp-Codon-freier RNA kommt. c) by the use of randomly annealender random primer during the rewriting of cellular mRNA into corresponding cDNA, wherein there is, inter alia, also for the formation of stop codon-free RNA.
  • [0010]
    Diese genannten methodischen Ansätze können jedoch nicht sicherstellen, daß es innerhalb einer komplexen Mischung verschiedener zellulärer mRNAs mit 3'- untranslatierten Bereichen unterschiedlicher Länge zu einer exakten Entfernung des 3'-UTR und des Stopp-Codons kommt, während gleichzeitig der kodierende Bereich der mRNA nahezu vollständig erhalten bleibt. However, these above methodological approaches can not ensure that it comes within a complex mixture of various cellular mRNAs with 3 'untranslated regions of different length to a precise removal of the 3'-UTR and the stop codon, while the coding region of the mRNA almost remains fully intact.
  • [0011]
    Die vorliegende Erfindung beschreibt nun eine Methode, die durch Einsatz einer speziell modifizierten tRNA bzw. eines speziell modifizierten tRNA-analogen Moleküls (im folgenden "Peptidakzeptor-tRNA", "Akzeptor-tRNA" oder "Hybridmolekül" genannt) während der in vitro Translation ein Auseinanderfallen des Translationskomplexes, auch bei der Verwendung einer unmodifizierten, Stopp- Codon und 3'-UTR-haltigen mRNA als Matrize des Translationsvorganges, verhindert. The present invention now describes a method that by using a specially modified tRNA or a specially modified tRNA analogue molecule (hereinafter referred to as "peptide acceptor tRNA", "acceptor-tRNA" or "hybrid molecule") during in vitro translation a disintegration of the translation complex, even when using an unmodified, stop codon and 3 'UTR containing mRNA as a template of the translation process, is prevented. Die Erfindung ermöglicht damit die Herstellung von Codon-arretierten, insbesondere Stopp-Codon-arretierten Translationskomplexen unabhängig von dem Vorhandensein eines Stopp-Codons in der kodierenden mRNA. The invention thus enables the preparation of codon locked, in particular stop codon-arrested translation complexes irrespective of the presence of a stop codon in the coding mRNA. Die erhältlichen Codon-arretierten Translationskomplexe umfassen die kodierende mRNA, das translatierte Peptid, das Ribosom und das Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül. The available codon-arrested translation complexes include the coding mRNA, the translated peptide, the ribosome and the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule. Bei Verwendung eines Peptidakzeptor/Suppressor-tRNA-Hybridmoleküls wird das durch einen Releasefaktor-abhängigen Terminationsprozess bewirkte Auseinanderfallen des Translationskomplexes verhindert, indem das Hybridmolekül kompetitiv das Eintreten des Releasefaktors in die A-Site des Ribosoms verhindert. When using a peptide acceptor / suppressor tRNA molecule, the hybrid caused by a release factor-dependent Terminationsprozess disintegration of the translation complex is prevented by the hybrid molecule competitively prevents the occurrence of the release factor in the A site of the ribosome.
  • [0012]
    Bei der zu verwendenden Peptidakzeptor-tRNA handelt es sich um ein Hybridmolekül, bestehend aus einer tRNA oder einer tRNA-analogen Einheit (im folgenden "tRNA" oder "tRNA-Einheit" genannt) und einer kovalent verknüpften Peptidakzeptor-Einheit. When to be used tRNA peptide acceptor is a hybrid molecule, consisting of a tRNA or tRNA analog unit (hereinafter "tRNA" or "tRNA unit") and a peptide acceptor covalently bonded unit. In Analogie zu Aufbau und Funktionsweise einer AminoacyltRNA als Substrat des ribosomalen Translationsprozesses ist die tRNA-Einheit der Peptidakzeptor-tRNA verantwortlich für die Codon-spezifische Bindung der Peptidakzeptor-tRNA während der ribosomalen Proteinsynthese. In analogy to construction and operation of an aminoacyl-tRNA as substrate of the ribosomal translation process, the tRNA moiety of the peptide acceptor tRNA is responsible for the codon-specific binding of the peptide acceptor tRNA during the ribosomal protein synthesis. Bei der tRNA- Einheit handelt es sich erfindungsgemäß vorzugsweise um eine natürlicherweise vorkommende tRNA, eine synthetisch hergestellte tRNA oder eine durch in vitro- Transkription hergestellte tRNA oder ein entsprechendes tRNA-Derivat. In the tRNA unit according to the invention is preferably a naturally occurring tRNA, tRNA synthesis, or produced by in vitro transcription or a corresponding tRNA tRNA derivative. Ferner kann die Sequenz der tRNA-Einheit 3'-terminal um vorzugsweise bis zu 20, insbesondere um bis zu 10, 5 oder 3 Nukleotide, vor allem um ein Nukleotid, verkürzt oder um einige, vorzugsweise 1 oder 2 Nukleotide verlängert sein. Further, the sequence of tRNA 3'-terminal unit can be reduced by preferably up to 20, especially up to 10, 5, or 3 nucleotides, especially to a nucleotide or a few, preferably 1 or 2 nucleotides be extended. Die Nukleotidsequenz kann von der Sequenzabfolge natürlicherweise vorkommender tRNAs abweichen. The nucleotide sequence may differ from the naturally occurring sequence order tRNAs. Die tRNA-Einheit kann neben natürlicherweise vorkommenden Nukleotiden auch natürlicherweise nicht vorkommende, künstlich synthetisierte Nukleotidanaloga umfassen. The tRNA unit can not naturally include naturally occurring, artificially synthesized nucleotide next to naturally occurring nucleotides. Die tRNA-Einheit kann außerdem modifiziert sein, beispielsweise durch fluorogene, chromogene, radioaktive oder photoreaktive Gruppen. The tRNA unit may be further modified, for example by fluorogenic, chromogenic, radioactive, or photoreactive groups.
  • [0013]
    Die Peptidkzeptor-Einheit der Peptidakzeptor-tRNA ist in Analogie zum Aminosäureanteil einer Aminoacyl-tRNA in der Lage die P-Site-tRNA-verankerte Peptidkette in einer Transpeptidasereaktion unter Ausbildung einer kovalenten Verknüpfung zu übernehmen. The Peptidkzeptor unit of the peptide acceptor tRNA is to take over in analogy to the amino acid portion of an aminoacyl-tRNA capable of the P-site tRNA-anchored peptide chain in a Transpeptidasereaktion to form a covalent linkage. Bei der die Verknüpfung ausbildenden funktionellen Gruppe der Peptidakzeptor-Einheit des Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls kann es sich beispielsweise um eine primäre Aminogruppe handeln, die in der Lage ist, mit dem carboxyterminalen Ende der translatierten Peptidkette in der Transpeptidasereaktion unter Spaltung einer Carbonsäureesterbindung eine Säureamidbindung auszubilden. Wherein the link forming functional group of the peptide acceptor moiety of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule can be, for example, be a primary amino group that is capable of forming with the carboxy-terminal end of the translated peptide chain in the Transpeptidasereaktion with cleavage of an Carbonsäureesterbindung an acid amide , Bei der Peptidakzeptor-Einheit kann es sich beispielsweise um eine Aminosäure, ein Aminosäurederivat oder ein Aminosäure- Analogon oder um Puromycin, ein Puromycin-Derivat oder ein Puromycin-Analogon oder um eine andere organische Verbindung mit einer freien Amiogruppe handeln. When said peptide unit may be, for example, an amino acid, an amino acid derivative or an amino acid analogue or to puromycin, puromycin, a derivative or an analogue or puromycin to another organic compound having a free Amiogruppe. Die Peptidakzeptor-Einheit ist mit der tRNA-Einheit des Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmoleküls direkt oder über einen Linker kovalent verknüpft, wobei die kovalente Bindung vorzugsweise weder spontan, noch in einer ribosomal katalysierten Reaktion (z. B. nach Stimulation durch einen Release Faktor) während der in vitro Translation lysiert werden kann. The peptide acceptor moiety is linked to the tRNA moiety of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule directly or through a linker covalently, wherein the covalent bond is preferably not spontaneously, even in a ribosomal catalyzed reaction (z. B. after stimulation by a release factor) in vitro translation can be lysed during the. Bei der kovalenten Bindung kann es sich beispielsweise um eine CC-Bindung, eine Amidbindung, um eine Sulfid- oder Disulfidbindung handeln. In the covalent bond may, for example, a carbon-carbon bond, an amide bond to act a sulfide or disulfide bond.
  • [0014]
    Ein Linker wird zur Verknüpfung der Peptidakzeptor-Einheit und der tRNA-Einheit vorzugsweise dann eingesetzt, wenn die tRNA-Einheit 3'-terminal verkürzt ist. A linker is preferably used to link the peptide acceptor unit and the tRNA unit when the unit tRNA 3'-terminal is shortened. Bei dem Linker handelt es sich vorzugsweise um eine organische Verbindung, beispielsweise um eine Kohlenwasserstoffkette oder um eine Polyethylengruppe. The linker is preferably an organic compound, for example, a hydrocarbon chain or a polyethylene group.
  • [0015]
    Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmoleküls ist eine Puromycin-beladene tRNA (Puromycin-tRNA), wobei die tRNA 3'-terminal bevorzugt um ein Nukleotid vekürzt ist, so dass nach Anknüpfung des Puromycins die natürlicherweise anzutreffende Nukleotid-Anzahl der tRNA vorliegt (vgl. Abb. 1 und 2). A particularly preferred embodiment of the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule is a puromycin-loaded tRNA (puromycin-tRNA), wherein the at tRNA 3'-terminal preferably vekürzt by one nucleotide, so that, after attachment of the puromycin naturally encountered nucleotide number of tRNA is present (see. Fig. 1 and 2). Bei Puromycin handelt es sich um ein von Streptomyceten produziertes Antibiotikum mit translationsinhibierender Wirkung [Nathans & Neidle, 1963]. In puromycin is a produced by Streptomyces antibiotic translationsinhibierender effect [Nathan & Neidle, 1963]. Aufgrund seiner auffälligen strukturellen Homologie zu dem 3'-Ende einer Aminoacyl-beladenen tRNA (der homologe Bereich umfaßt das letzte 3'-terminale Nukleotid der tRNA mit daran geknüpfter Aminosäure, vgl. Abb. 2) besitzt Puromycin die Eigenschaft, sequenzunabhängig sowohl den prokaryotischen wie auch den eukaryotischen Translationsprozeß vorzeitig zu terminieren. Due to its striking structural homology to the 3 'end of an aminoacyl-charged tRNA (the homologous region comprises the last 3' terminal nucleotide of the tRNA with knotted thereon amino acid. See Fig. 2) has puromycin the characteristic sequence independent of both the prokaryotic to schedule as well as the eukaryotic translation process prematurely. Puromycin lagert sich unabhängig von der Kodierung der mRNA in die A-Site des Ribosoms und übernimmt mit seiner primären Aminogruppe die bis dahin gebildete Polypeptidkette von der P-Site-tRNA. Puromycin deposited independent of the coding of the mRNA in the A site of the ribosome and takes over with its primary amino group of the previously formed polypeptide chain of the P-site tRNA. Dabei entstehen C-terminal verkürzte Peptidfragmente heterogener Länge, die alle über eine carboxyterminale Puromycin- Modifikation verfügen. This produces C-terminal truncated peptide fragments of heterogeneous length, all of which have a carboxy-terminal puromycin modification. Erfindungsgemäß kann nun durch die Verknüpfung des Puromycins mit einer tRNA, insbesondere einer Suppressor-tRNA, die Wirkung des Puromycin-Anteils als Peptidakzeptor abhängig von der mRNA-Kodierung gesteuert werden. According to the invention can now be controlled as a function of the peptide acceptor mRNA encoding by linking the puromycin with a tRNA, particularly a suppressor tRNA, the effect of the puromycin moiety. Im Falle der Verknüpfung mit einer Suppressor-tRNA kommt es Stopp- Codon-abhängig anstelle der translationsterminierenden Wirkung eines Release Faktors zu einer Einlagerung dieses Hybridmoleküls in die A-Site des Ribosoms, so daß die Puromycin-Einheit des Hybridmoleküls in der Lage ist, die Polypeptidkette von der P-Site-tRNA in einer Transpeptidase-Reaktion zu übernehmen. In the case of linkage with a suppressor tRNA it comes stop codon-dependent instead of translationsterminierenden action of a release factor to an intercalation of this hybrid molecule into the A site of the ribosome, so that the puromycin moiety of the hybrid molecule is capable of the to take polypeptide chain of the P-site tRNA in a transpeptidase reaction. Ein Überlesen und damit eine fortschreitende Verlängerung der Polypeptidkette im Translationsprozeß ist hierbei nicht möglich, weil dies durch die Säureamidbindung zwischen der Nukleotidhälfte und der Aminoacyl-homologen Hälfte des Puromycinanteils der Puromycin-Suppressor-tRNA verhindert wird (vgl. Abb. 2). A read-through and thus a progressive extension of the polypeptide chain in the translation process is not possible here, because this is prevented by the acid amide bond between the Nukleotidhälfte and the aminoacyl-homologous half of Puromycinanteils puromycin suppressor tRNA (see. Fig. 2). Im Endzustand dieses Vorgangs erhält man ein über dem Stopp-Codon der kodierenden mRNA arretiertes Ribosom mit einem über die Puromycin-Suppressor- tRNA verankerten Polypeptid voller Länge. During the final stage of this process gives a above the stop codon of the coding mRNA arretiertes ribosome with an anchored on the puromycin suppressor tRNA full-length polypeptide.
  • [0016]
    Eine solche Struktur ist nun Voraussetzung und Grundlage für eine ganze Reihe verschiedener Anwendungen: Such a structure is now the prerequisite and basis for a whole range of different applications:
    • 1. Ein derart Stopp-Codon-spezifisch verankerter Translationskomplex läßt sich, analog der methodischen Schritte, wie sie in WO 00/09737 dargestellt sind, für eine gezielte Entfernung des 3'-untranslatierten Bereiches der sich im Komplex befindenden mRNA nutzen ( Abb. 3): 1. Such a stop codon-specific translational anchored complex can be analogous to the methodological steps, as illustrated in WO 00/09737, for a selective removal of the 3 'untranslated region of the mRNA that are available in the complex use (Fig. 3 ):
      • 1. Durch eine gerichtete Degradation der RNA mit Hilfe einer 3' → 5'- Exoribonuklease kann die mRNA von ihrem 3'-Ende in 5'-Richtung bis zu dem Bereich eingekürzt werden, der durch den anliegenden, Stopp-Codon-spezifisch- verankerten Translationskomplex geschützt wird. 1. By a directed degradation of RNA using a 3 '→ 5' exoribonuclease, the mRNA can be shortened from its 3 'end in the 5' direction to the region, the spezifisch- stop codon by the appended, translation anchored complex is protected.
      • 2. In einer Reversen Transkriptase-Reaktion läßt sich mit Hilfe eines am 3'-Ende der mRNA hybridisierenden Primers (z. B. ein Poly-A-Tail spezifischer Oligo-(dT)- Primer) die mRNA von ihrem 3'-Ende her in 5'-Richtung soweit in ein partielles mRNA/cDNA-Hybrid überführen, bis die Aktivität der Polymerase durch die Blockade des auf der mRNA aufsitzenden, Stopp-Codon-spezifisch verankerten Translationskomplexes stoppt. 2. In a reverse transcriptase reaction can be by means of a hybridizing at the 3 'end of the mRNA primer (. Such as a poly-A-tail specific oligo (dT) - primer) the mRNA of its 3' end forth extent converted in the 5 'direction in a partial mRNA / cDNA hybrid, until the activity of the polymerase seated by blocking the mRNA at the stops stop codon-specific translational anchored complex. Durch anschließende Behandlung der RNA mit einer Doppelstrang-RNA/DNA-abhängigen RNAse (wie z. B. RNase H) läßt sich spezifisch das zuvor revers transkribierte 3'-Ende der RNA entfernen. Subsequent treatment of the RNA with a double stranded RNA / DNA dependent RNAse (such. As RNase H) can be specifically remove the above reverse transcribed 3 'end of the RNA.
      In beiden Fällen ist das Ergebnis einer solchen Behandlung eine mRNA, deren 3'- untranslatierter Bereich fast vollständig bis in die Nähe des Stopp-Codons entfernt ist. In both cases, the result of such treatment is a mRNA whose 3 'untranslated region is almost completely removed to the vicinity of the stop codon. Die Größe des verbleibenden Anteils des 3'-UTRs wird dabei durch den Sequenzabschnitt der RNA bestimmt, der durch den angelagerten, Stopp-Codon- spezifisch verankerten Translationskomplex "geschützt" ist. The size of the remaining portion of the 3 'UTR is determined by the sequence segment of RNA that is "protected" by the annealed, stop codon specifically anchored translation complex. Diese Restsequenz des 3'-UTRs incl. des Stopp-Codons läßt sich anschließend durch Verknüpfung folgender methodischer Schritte [vgl. This residue sequence of the 3 'UTRs incl. The stop codon subsequently be linked by the following methodological steps [see. WO 00/09737] aus der mRNA entfernen: (a) Ankopplung eines RNA-Adaptors (dadurch erfolgt Einführung einer Primer- Bindestelle und einer Erkennungssequenz für ein Typ IIS-Restriktionsenzym); Remove WO 00/09737] from the mRNA: (a) coupling of an RNA adapter (this is done the introduction of a primer binding site and a recognition sequence for a type IIS restriction enzyme); (b) Reverse Transkription der RNA unter Verwendung eines Adaptor-komplementären Primers und Zweitstrangsynthese; (B) Reverse transcription of the RNA using an adapter primer and complementary second strand synthesis; (c) Schneiden dieser doppelsträngigen DNA stromauf vom Stopp-Codon durch Inkubation mit einem Typ IIS-Restriktionsenzym (Erkennungssequenz wurde zuvor durch Ankopplung des RNA-Adaptors in die Sequenz eingeführt) (vgl. Abb. 3). (c) cutting this double-stranded DNA upstream of the stop codon by incubation with a type IIS restriction enzyme (recognition sequence was previously introduced by coupling of the RNA in the adapter sequence) (see. Fig. 3). Dadurch wird eine Entfernung sowohl des Stopp- Codons als auch des 3'-UTR-Restes auf korrespondierender DNA-Ebene ermöglicht. This enables removal of both of the stop codons and the 3'-UTR residue to corresponding DNA level. Anschließend kann die DNA durch in vitro Transkription wieder in RNA überführt werden und steht damit für verschiedene in vitro (oben genannte) oder in vivo Genotyp/Phänotyp-Kopplungstechniken (z. B. Phage-Display, Yeast-Display) in geeigneter Form zur Verfügung. Subsequently, the DNA can be converted by in vitro transcription back into RNA and thus stands for various in vitro (above) or in vivo genotype / phenotype coupling techniques (for. Example, phage display, yeast display) in a suitable form ,
    • 2. Ein derart Stopp-Codon-spezifisch verankerter Translationskomplex enthält neben dem synthetisierten Polypeptid voller Länge auch die kodierende RNA und stellt damit eine stabile Phänotyp/Genotyp-Verknüpfung dar, wie sie auch Grundlage für die Polysomen-Display und die Ribosomen-Display-Technologie ist. 2. Such a stop codon specifically anchored Translation complex contains the synthesized full-length polypeptide, the coding RNA and therefore constitutes a stable phenotype / genotype-linking, as well as the basis for the polysome display and ribosome display technology is. Durch die hier beschriebene alternative Kopplungsstrategie, die auf der Verwendung einer Akzeptor-Suppressor-tRNA (z. B. Puromycin-Suppressor-tRNA) während des Translationsvorganges basiert, ist aber im Gegensatz zur Polysomen- bzw. Ribosomen-Display-Technologie auch die direkte Nutzung Stopp-Codon- und 3'UTR-haltiger mRNA möglich. The described here alternative coupling strategy based on the use of an acceptor suppressor tRNA (z. B. puromycin suppressor tRNA) developed during the translation process, but in contrast to Polysomen- or ribosome display technology, the direct use stop codon and 3'UTR-containing mRNA possible. Auf eine aufwendige Umarbeitung der mRNA zur Entfernung des Stopp-Codons, sowie des 3'-UTRs vor Einsatz in den in vitro Translationsschritt kann deshalb verzichtet werden. A complicated revision of the mRNA for the removal of the stop codons and the 3 'UTR prior to use in the in vitro translation step can therefore be omitted.
      Durch eine weitere Modifikation im Bereich der Anticodon-Schleife läßt sich die Akzeptor-Suppressor-tRNA zusätzlich so verändern, daß sie zur Herstellung einer kovalenten Verknüpfung zwischen der Akzeptor-Suppressor-tRNA und der mRNA während des Translationsvorganges geeignet ist. By a further modification in the region of the anticodon loop, the acceptor suppressor tRNA can be changed in addition so that it is suitable for the production of a covalent linkage between the acceptor suppressor tRNA and the mRNA during the translation process. Bei der Modifikation handelt es sich dabei beispielsweise um eine photoreaktive Gruppe (z. B. Wybutin), die in der Lage ist, nach Bestrahlung mit Licht geeigneter Wellenlänge eine kovalente Verknüpfung zur mRNA, die während des Translationsvorganges abgelesen wird, auszubilden [Hanna, 1989; In the modification, these are for example a photoreactive group (z. B. Wybutin) which is capable upon irradiation with light of a suitable wavelength, a covalent linkage to the mRNA, which is read during the translation process to form [Hanna 1989 ; Steiner et al., 1984]. Steiner et al., 1984]. Die aktivierende Bestrahlung kann sowohl während als auch nach Beendigung des Translationsvorganges erfolgen. The activating radiation can be carried out both during and after termination of the translation process. Die photoreaktive Form des Akzeptor-Suppressor-tRNA-Moleküls ist also in der Lage, zwei kovalente Verknüpfungen auszubilden: Eine erste Verknüpfung über die primäre Aminogruppe des Akzeptoranteils mit der translatierten Polypeptidkette und eine zweite Verknüpfung über die photoreaktive Gruppe der tRNA-Hälfte mit der kodierenden mRNA. The photo-reactive form of the acceptor suppressor tRNA molecule is thus able to form two covalent linkages: a first link via the primary amino group of the Akzeptoranteils with the translated polypeptide chain and a second link via the photo-reactive group of the tRNA half with the coding mRNA. Damit fungiert die photoreaktive Form der Akzeptor- Suppressor-tRNA als ein kovalent verknüpfendes Bindeglied zwischen kodierendem Genotyp und kodiertem Phänotyp, wobei als kodierender Genotyp eine unmodifizierte mRNA Verwendung finden kann und eine vorhergehende aufwendige Entfernung des 3'-UTRs und/oder des Stopp-Codons, oder eine Modifizierung des 3'-Endes der RNA durch eine Anlagerung eines Puromycin-Linkers damit überflüssig ist. Thus, the photoreactive form of acceptor suppressor tRNA acts as a covalently verknüpfendes link between kodierendem genotype and encoded phenotype, wherein the encoding genotype can find an unmodified mRNA use and 3'-UTRs a previous complex removal and / or the stop codon or modification of the 3 'end of RNA by an attachment of a puromycin linker is thus superfluous. Nach kovalenter Verknüpfung der Peptid-beladenen Akzeptor/tRNA-Einheit mit der mRNA mittels der photoreaktiven Gruppe kann das Ribosom in einer dem Fachmann bekannten Weise entfernt werden, so dass man eine Verbindung (Hybridmolekül) erhält, bei der mRNA (Genotyp) und das von ihr kodierte Polypeptid (Phänotyp) vermittelt durch ein erfindungsgemäßes Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmolekül kovalent miteinander verknüpft sind. After covalent linking of the peptide-loaded acceptor / tRNA unit with the mRNA by means of the photoreactive group, the ribosome may be removed in a manner known to the expert, so that a compound (chimeric molecule) obtained at the mRNA (genotype) and of their encoded polypeptide (phenotype) mediated by an inventive peptide acceptor / tRNA hybrid molecule are covalently linked. Das so erhaltene Hybridmolekül kann beispielsweise, wie zuvor für den arretierten Translationskomplex beschrieben, zur Degradation des 3'-untranslatierten Bereiches der mRNA verwendet werden. The hybrid molecule thus obtained can, for example, be used as described above for the locked translation complex for degradation of the 3'-untranslated region of the mRNA.
    • 3. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit von Peptidakzeptor/tRNA- Hybridmolekülen besteht in ihrer Verwendung zur Herstellung von Codon-spezifisch terminierten und gleichzeitig markierten Polypeptiden bzw. Proteinen und Proteinfragmenten. 3. Another application of peptide acceptor / tRNA hybrid molecules is their use for producing codon-specifically terminated and at the same labeled polypeptides or proteins and protein fragments. Die Codon-Spezifität wird dabei über den verwendeten tRNA- Anteil (speziell über die Sequenz des Anticodons) der Peptidakzeptor-tRNA während des Translationsvorganges vermittelt. The codon-specificity is in this case (specifically, on the sequence of the anticodon) mediated by the used portion of the peptide acceptor tRNA-tRNA during translation process. Die Codon-Spezifität der verwendeten Akzeptor-tRNA bestimmt zugleich auch die Länge des während des Translationsvorganges entstehenden Polypeptids bzw. Proteinfragments. The codon-specificity of the tRNA acceptor used also determined at the same time the length of the polypeptide or protein fragment produced during the translation process. Die Verwendung von Stopp-Codon spezifischen Akzeptor-Suppressor-tRNAs im Translationsprozeß führt hierbei zur Entstehung C-terminal markierter Proteine voller Länge. The use of stop codon specific acceptor suppressor tRNA in the translation process leads to the creation of this C-terminal labeled full-length proteins.
  • [0017]
    Aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften sind die zuvor genannten erfindungsgemäßen Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküle sowie die unter Verwendung dieser erhältichen Genotpy/Phänotyp-Hybridmoleküle und arretierten Translationskomplexe besonders gut für in vitro-Evolutionsexperimente geeignet, wie sie beispielsweise in WO 98/31700 dargestellt sind. Because of their special properties, the peptide acceptor aforementioned inventive / tRNA hybrid molecules and particularly well suited using these erhältichen Genotpy / phenotype hybrid molecules and arrested translation complexes in vitro evolution experiments, as shown for example in WO 98/31700 are.
  • [0018]
    Die Markierung der translatierten Proteine besteht in der Akzeptor-tRNA-Einheit, die während des Translationsvorgangs Codon-abhängig auf das bis dahin translatierte Polypeptidfragment kovalent übertragen wird. The labeling of the translated proteins is the acceptor tRNA unit, which is transmitted during the translation process codon covalently depending on the previously translated polypeptide. Erfindungsgemäß läßt sich eine solche einheitliche C-terminale Modifikation mit Hilfe von Akzeptor-spezifischen Antikörpern immunologisch detektieren (bei Verwendung von beispielsweise Puromycin-tRNA Detektion mit Hilfe von Puromycin-spezifischen Antikörpern), oder unter Ausnutzung der anhängenden Nukleinsäure über Hybridisierungsereignisse nachweisen. According to the invention allows such a single C-terminal modification with the aid of acceptor-specific antibodies detect immunologically detected (using for example, puromycin tRNA detection with the aid of puromycin-specific antibodies), or taking advantage of the appended nucleic acid via hybridization events. Bei Verwendung von radioaktiv oder mit chromogenen oder fluorogenen Molekülen markierten Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekülen lässt sich die Markierung entsprechend durch Nachweis der Radioaktivität beziehungsweise spektroskopisch oder spektrometrisch nachweisen. When using labeled radioactively or with chromogenic or fluorogenic peptide acceptor molecules / tRNA hybrid molecules that provide the mark corresponding by detecting the radioactivity or detected spectroscopically or spectrometrically. Eine solche C-terminale Modifikation ermöglicht auch eine unkomplizierte und rasch durchführbare Immobilisierung der modifizierten Polypeptide, z. Such C-terminal modification also allows an uncomplicated and rapid immobilization of the viable modified polypeptides, for example. B. an einer Akzeptor-spezifischen Immunmatrix. B. at a acceptor-specific immune matrix.
  • [0019]
    Ebenso ist eine Immobilisierung an einer Matrix, die mit einer Nukleinsäure oder einem Nukleinsäurederivat beladen ist, über den tRNA-Anteil des Polypeptids unter Ausnutzung komplementärer Basenpaarungen möglich. Similarly, a immobilisation on a matrix which is loaded with a nucleic acid or nucleic acid derivative, it is possible through the tRNA component of the polypeptide, utilizing complementary base pairing. Bei einer solchen Matrix kann es sich auch um einen Nukleinsäure-beladenen Chip handeln. With such a matrix can also be a nucleic acid-loaded chip.
  • [0020]
    Eine weitere Nachweismöglichkeit modifizierter Peptide mit anhängender Nukleinsäure kann auch durch Amplifikation des Nukleinsäureanteils nach reverser Transkription und Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) erfolgen. A further possibility of detection of modified peptides with attached nucleic acid can also be carried out by amplification of the nucleic acid content by means of reverse transcription and polymerase chain reaction (PCR).
  • [0021]
    Durch Verwendung einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff, einem Chromophor oder einer radioaktiven Gruppe gekoppelten Akzeptor-tRNA im Translationsprozeß ergibt sich die Möglichkeit zur Codon-spezifischen Markierung von Proteinen bzw. Proteinfragmenten an ihrem C-terminalen Ende. By using a coupled with a fluorescent dye, a chromophore, or a radioactive group acceptor tRNA in the translation process provides the possibility for the codon-specific labeling of proteins and protein fragments at their C-terminal end. Die markierende Gruppe sollte in diesem Falle bevorzugt über die Akzeptor-Hälfte des Moleküls oder über 3'-terminal gelegene Nukleotide des tRNA-Anteils der Akzeptor-tRNA kovalent gekoppelt sein. The labeling moiety should be covalently coupled, in this case preferably on the acceptor half of the molecule or across the 3'-terminal nucleotides of the preferred tRNA portion of the acceptor tRNA. Handelt es sich bei diesem tRNA-Anteil beispielsweise um eine Suppressor-tRNA läßt sich im Translationsprozeß eine spezifische Markierung von translatierten Proteinen am natürlichen C-Terminus erreichen. If it is in this tRNA fraction, for example, a suppressor tRNA may be in the translation process a specific labeling of translated proteins to the natural C-terminus reach.
  • [0022]
    In Folge eines RNase-Verdaus oder einer Inkubation bei basischem pH, ist es anschließend auch möglich, den tRNA-Anteil des C-terminal modifizierten Polypeptids teilweise oder vollständig abzubauen. In consequence of a RNase digestion or incubation at basic pH, it is also possible then to reduce the tRNA portion of the C-terminal modified polypeptide partially or completely. Dadurch erhält man ein Polypeptid voller Länge, das C-terminal eine relativ kleine Modifikation in Form eines peptidisch verknüpften Akzeptors oder Akzeptor-Derivats (z. B. mit anhängendem Fluoreszenzfarbstoff) aufweist. Thereby, a full-length polypeptide, the C-terminal is obtained a relatively small modification in the form of a peptide-linked acceptor or acceptor derivative having (z. B. with an attached fluorescent dye). Diese Modifikation beeinflußt die physikalischchemischen Eigenschaften des Polypeptids, beispielsweise im Falle eines angekoppelten Puromycins oder Puromycin-Derivats als Akzeptor, nur geringfügig, so daß gängige Proteinanalysemethoden, wie z. This modification affects the physicochemical properties of the polypeptide, for example in the case of coupled puromycin or puromycin derivative as the acceptor, only slightly, so that common protein analysis methods, such as. B. elektrophoretische (2-D- Gelelektrophorese), oder chromatographische, als Trennmethode auch weiterhin Anwendung finden können. B. electrophoretic (2-D gel electrophoresis) or chromatographic continue to apply as a separation method. Auch komplexe mRNA-Gemische, wie das Transkriptom einer Zelle, lassen sich auf diese Weise durch die in vitro-Translation in Anwesenheit einer markierten, beispielsweise fluoreszenzmarkierten, Akzeptor-tRNA in korrespondierende Gemische markierter Polypeptide überführen. MRNA complex mixtures, such as the transcriptome of a cell can, in this way by in vitro translation in the presence of a labeled, e.g., fluorescently labeled, transfer acceptor tRNA in corresponding mixtures of labeled polypeptides.
  • [0023]
    Für die Analyse unterschiedlicher Transkriptome bzw. ihrer korrespondierenden Gemische fluoreszenzmarkierter Polypeptide können dabei unterscheidbare Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden: So kann zur Analyse des Transkriptoms einer Zellinie vor Behandlung mit einem Wirkstoff oder einer zu testenden Substanz eine Markierung der korrespondierenden Translationsprodukte beispielsweise mit Hilfe eines bestimmten Fluoreszenzfarbstoffs (z. B. Floureszenzfarbstoff "Rot") erfolgen. thereby distinguishable fluorescent dyes can be used for the analysis of different transcriptomes and their corresponding mixtures of fluorescently labeled polypeptides: Thus, for the analysis of the transcriptome of a cell line prior to treatment with a drug or a substance to be tested, a mark of the corresponding translation products, for example, using a particular fluorescent dye (e.g. take place. B. fluorescent dye "Red"). Dagegen kann zur Analyse des Transkriptoms der Zellinie nach Behandlung mit einem Wirkstoff ein anderer Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Floureszenzfarbstoff "Grün") für die Markierung der korrespondierenden Translationsprodukte verwendet werden. In contrast, the cell line can be used for analysis of the transcriptome after treatment with a drug, another fluorescent dye (z. B. fluorescent dye "green") are used for the marking of the corresponding translation products. Über die anhängenden, unterscheidbaren Fluoreszenzfarbstoffe lassen sich die Translationsprodukte stets eindeutig dem ursprünglichen Transkriptom zuordnen. the translation products on the pendant, distinguishable fluorescent dyes can be always clearly assigned to the original transcriptome. Deshalb können die markierten Translationsprodukte mehrerer Transkriptome parallel mit Hilfe gängiger Trennverfahren analysiert werden. Therefore, the labeled translation products of several transcriptomes can be analyzed in parallel with the aid of conventional separation methods. So ist es beispielsweise möglich, die markierten Translationsprodukte parallel im Gemisch über 2-dimensionale (2-D)- Gelelektrophorese aufzutrennen. Thus, it is possible, for example, the labeled translation products in parallel in a mixture with 2-dimensional (2-D) - separating gel electrophoresis. Die im selben Gel aufgetrennten Peptide lassen sich nach Fluoreszenz-Scanning über die spezifisch detektierbaren Fluoreszenzfarbstoffe eindeutig dem ursprünglich kodierenden Transkriptom zuordnen. The separated on the same gel peptides can be clearly assigned to the originally coding transcriptome by fluorescence scanning on the specific detectable fluorescent dyes. Dies ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen den Translationsprodukt-Gemischen, die ausgehend von unterschiedlichen Transkriptomen hergestellt wurden, hinsichtlich ihrer qualitativen und quantitaiven Zusammensetzung. This enables a direct comparison between the translation product mixtures which have been prepared from different transcriptomes, with respect to quality and quantitaiven composition. Soweit Ladung und Masse der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe vergleichbar sind, sollten nämlich gleiche Peptide, Peptidfragmente bzw. Proteine, unabhängig von ihrem kodierenden Transkriptom, auch gleichermaßen über die 2-D-Gelelektrophorese aufgetrennt werden. As far as the charge and mass of the fluorescent dyes used are comparable, namely, should the same peptides, peptide fragments or proteins, regardless of their coding transcriptome, are also equally separated on 2-D gel electrophoresis. Dieser methodische Ansatz erlaubt einen Vergleich (quantitativen und qualitativen) der Translationsprodukte nicht nur von zwei, sondern von mehreren Transkriptomen über ein und dasselbe 2-D-Gel. This methodological approach allows a comparison (qualitative and quantitative) of the translation products not only of two, but of several transcriptomes on one and the same 2-D gel.
  • [0024]
    Wird anstelle einer Suppressor-tRNA eine andere Codon-spezifische tRNA als Bestandteil des Akzeptor-tRNA-Hybridmoleküls während der Translation eingesetzt und liegt diese im Gemisch mit der natürlichen Codon-spezifischen, Aminosäurebeladenen tRNA vor, wird eine bestimmte mRNA, soweit sie an definierten Positionen innerhalb ihrer kodierenden Sequenz dieses Codon ein- oder mehrmals aufweist, während der Translation in ein Peptid charakteristischer Länge oder ein Peptidgemisch aus Peptiden von charakteristischer Länge überführt. Is used instead of a suppressor tRNA another codon-specific tRNA as part of the acceptor-tRNA hybrid molecule during translation and located in front in the mixture with the natural codon-specific amino acid laden tRNA, is a specific mRNA, so far as it in defined positions mono- within their coding sequence of this codon or more times comprises, during translation transferred to a peptide characteristic length or a peptide mixture of peptides of the characteristic length. Anzahl und Länge der entstehenden Peptide ist aufgrund der Codon-Sequenz ihrer kodierenden mRNA vorhersagbar. Number and length of the resulting peptides is predictable due to the codon sequence of their encoding mRNA. Umgekehrt ist es möglich, einem so erzeugten Gemisch aus Peptiden mit jeweils charakteristischer Länge (z. B. detektierbar nach Gelanalyse in Form eines Fragmentmusters), evtl. in Kombination mit weiteren physikalischchemischen Charakteristika (z. B. Isolelektrischer Punkt, nach Bestimmung über 2-D- Gelelektrophorese) eine bestimmte kodierende Sequenz zuzuordnen. Conversely, it is possible, a so-generated mixture of peptides, each with a characteristic length (z. B. detectable after gel analysis in the form of a fragment pattern), possibly Isoelectric in combination with other physico-chemical characteristics (eg. B. point, as determined via 2 D gel electrophoresis) assigning a particular coding sequence. Dies geschieht durch den Vergleich des experimentell zu beobachtenden Ergebnisses mit den aus Sequenzen ableitbaren Ergebnissen - id R. mit Hilfe einer computergestützten Analyse. This is done by comparing the experimentally observed results with the results derived from sequences - usually by means of a computer-assisted analysis.
  • [0025]
    Die Herstellung von Codon-arretierten Translationskomplexen mittels der erfindungsgemäßen Peptidakzeptor-tRNAs läßt sich in vitro beispielsweise unter Verwendung von unterschiedlichen translationskompetenten Lysaten erreichen, beispielsweise mit Reticulozytenlysat aus Kaninchen, E. coli S30-Extrakten, einem Lysat aus Hefezellen oder einem Extrakt aus Weizenkeimen. The preparation of codon-arrested translation complexes using the inventive peptide acceptor-tRNAs can be achieved, for example reticulocyte lysate from rabbit, E. coli S30 extracts, a lysate from yeast cells or an extract from wheat germ in vitro, for example using different translation competent lysates.
  • [0026]
    Erfindungsgemäß werden hierbei bevorzugt weitere Modifikationen der Zelllysate bzw. ihrer Ursprungszellen durchgeführt, die zu einer Inaktivierung der Release Faktor-Aktivität führen, beispielsweise According to the invention, other modifications of the cell lysates or their cells of origin are carried out here, leading to inactivation of the release factor activity, for example,
    • 1. Inaktivierungen in Folge einer Abreinigung der Release Faktoren aus dem Lysat, 1. inactivation as a result of cleaning of the release factors from the lysate,
    • 2. Inaktivierungen in Folge einer inaktivierenden Liganden-Bindung (z. B. Anbindung eines Antikörpers) oder 2. inactivations in sequence an inactivating ligand binding (eg. B. connection of an antibody), or
    • 3. Inaktivierungen in Folge der Verwendung von induzierbar inaktivierbaren Mutanten des Release Faktors (z. B. durch Temperaturshift inaktivierbare ts- Mutante des Release-Faktors bzw. der Release Faktoren). 3. inactivation resulting from the use of inducible inactivatable mutants of the release factor (e.g., as by temperature shift inactivatable ts mutant of the release factor or the release factors).
    Abbildungen pictures
  • [0027]
    Abb. 1: Schematische Übersicht über den Aufbau eines Peptidakzeptor-tRNA- Hybridmoleküls. Fig. 1: Schematic overview of the structure of a peptide acceptor tRNA hybrid molecule.
  • [0028]
    Abb. 2: Schematische Übersicht über die strukturelle Analogie zwischen Puromycin, Puromycin-Suppressor-tRNA und einer Tyrosin-beladenen tRNA (obere Bildhälfte), sowie über die Wirkung von Puromycin (untere Bildhälfte, links) bzw. von Puromycin- Suppressor-tRNA (untere Bildhälfte, rechts). Fig. 2: Schematic overview of the structural analogy between puromycin, puromycin suppressor tRNA and a tyrosine charged tRNA (upper half), as well as about the effect of puromycin (lower half of the figure, left) or (of puromycin suppressor tRNA lower half, right).
  • [0029]
    Abb. 3: Schematische Übersicht über den Verlauf einer in vitro Selektion unter Nutzung von nicht kovalenten Fusionen aus mRNA/Puromycin-Suppressor- tRNA/Polypeptid/Ribosom-Komplexen, die sich durch Translation in Gegenwart von Puromycin-Suppressor-tRNA herstellen lassen. Fig. 3: Schematic overview of the course of an in vitro selection with the use of non-covalent fusions of mRNA / puromycin suppressor tRNA / polypeptide / ribosome complexes which may be produced by translation in the presence of puromycin suppressor tRNA.
  • [0030]
    Abb. 4: Schematische Übersicht über den Ablauf der Methoden zur Erzeugung einer 3'-UTR- und Stopp-Codon-freien mRNA. Fig. 4: Schematic overview of the sequence of methods for generating a 3'-UTR and stop codon-free mRNA.
    • 1. Mit Hilfe einer 3' → 5'-Exoribonuklease läßt sich an einem Stopp-Codon- spezifisch arretierten Translationskomplex der 3'-UTR-Bereich der kodierenden RNA von seinem 3'-Ende bis in die Nähe des Stopp-Codons abbauen. 1. Using a 3 '→ 5' exoribonuclease of the 3'-UTR region of the coding RNA from its 3 'end can degrade to the vicinity of the stop codon to a stop codon specific arrested translation complex.
    • 2. Der in 3'-Richtung vom Ribosomenkomplex (Stopp-Codon-spezifisch arretiert) gelegene Bereich der kodierenden RNA läßt sich beispielsweise durch Reverse Transkriptase in ein DNA/RNA-Hybrid überführen. 2. The 3 'direction from the ribosome complex (stop-codon-specific locked) region of the coding RNA preferred can be converted for example by reverse transcriptase in a DNA / RNA hybrid. Anschließend kann dieser RNA- Bereich z. Subsequently, the RNA region z. B. mit Hilfe von RNase H degradiert werden. B. be degraded by using RNase H.
    Literatur Hanna MM. Literature Hanna MM.
    Photoaffinity cross-linking methods for studying RNA-protein interactions. Photoaffinity cross-linking methods for studying RNA-protein interactions.
    Methods Enzymol. Methods Enzymol. 1989; 1989; 180: 383-409. 180: 383-409.
    Jermutus L, Ryabova LA, Pluckthun A. Jermutus L, Ryabova LA, Pluckthun A.
    Recent advances in producing and selecting functional proteins by using cell-free translation. Recent advances in Producing and Selecting functional proteins by using cell-free translation.
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    Proc Natl Acad Sci USA. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Sep 13; 1994 September 13; 91 (19): 9022-6. 91 (19): 9022-6.
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    Steiner G, Luhrmann R, Kuechler E. Steiner G, R Luhrmann, Kuechler E.
    Crosslinking transfer RNA and messenger RNA at the ribosomal decoding region: Crosslinking transfer RNA and messenger RNA at the ribosomal decoding region:
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Claims (32)

  1. 1. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül, umfassend 1. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule comprising
    a) tRNA oder tRNA-analoge Einheit, die zur Codon-spezifischen Bindung an die mRNA während des Translationsprozesses in der Lage ist, a) tRNA or tRNA analog unit to the codon-specific binding to the mRNA during translation process capable of
    b) Peptidakzeptor-Einheit, die dazu in der Lage ist, in einer Transpeptidasereaktion einen Carbonsäureester unter Ausbildung einer stabilen, kovalenten Bindung zu spalten, b) peptide acceptor unit, which is capable of cleaving a Carbonsäureester to form a stable, covalent bond in a Transpeptidasereaktion,
    wobei die Einheiten (a) und (b) direkt oder über einen Linker kovalent miteinander verknüpft sind. wherein the units (a) and (b) directly or covalently linked to one another via a linker.
  2. 2. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 1, umfassend 2. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule of claim 1 comprising
    a) natürlicherweise vorkommende, synthetisch hergestellte oder durch in vitro- Transkription hergestellte tRNA oder tRNA-Derivat, das auch natürlicherweise nicht vorkommende Nukleotidanaloga umfassen kann, wobei die Sequenz der tRNA 3'-terminal um bis zu 20 Nukleotide verkürzt sein kann, a) naturally occurring, synthetically produced or produced by in vitro transcription tRNA or tRNA derivative may also comprise not naturally occurring nucleotide analogs, wherein the sequence of the 3'-terminal tRNA may be reduced by up to 20 nucleotides,
    b) Aminosäure, Aminosäurederivat, Puromycin oder Puromycin-Derivat, b) amino acid, amino acid derivative, or puromycin puromycin derivative
    wobei die Einheit (b) kovalent mit dem 3'-Ende der Einheit (a) verknüpft ist. the unit (b) is covalently linked to the 3'-end of the unit (a).
  3. 3. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Akzeptor-Einheit mit dem 3'-terminalen Nukleotid oder Nukleotidanalogon der tRNA-Einheit in Form einer kovalenten Bindung, insbesondere einer Phosphatesterbindung oder Amidbindung, stabil verknüpft ist. 3. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule of claim 1 or 2, characterized in that the acceptor moiety is stably linked to the 3 'terminal nucleotide or nucleotide analog of the tRNA-unit in the form of a covalent bond, in particular a Phosphatesterbindung or amide bond.
  4. 4. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Akzeptor-Einheit um ein Puromycinmolekül handelt, das über die 5'-Hydroxylgruppe der Zucker-Untereinheit eine Phosphatesterbindung mit dem 3'-terminalen Ende einer tRNA ausbildet. 4. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to claim 3, characterized in that it is a Puromycinmolekül is in the acceptor unit that forms on the 5'-hydroxyl group of the sugar subunit a Phosphatesterbindung with the 3'-terminal end of a tRNA ,
  5. 5. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei Komponente (a) um eine Suppressor-tRNA oder ein Suppressor-tRNA-Derivat handelt. 5. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to any one of claims 1 to 4, characterized in that wherein component (a) is a suppressor tRNA or a suppressor tRNA derivative.
  6. 6. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß an die Akzeptor-Untereinheit oder die tRNA-Untereinheit ein Marker kovalent gebunden ist. 6. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to any one of claims 1 to 5, characterized in that a marker is covalently bound to the acceptor subunit or tRNA subunit.
  7. 7. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Marker um einen Fluoreszenzfarbstoff, einen Chromophor oder eine radioaktive Gruppe handelt. 7. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to claim 6, characterized in that it is the marker is a fluorescent dye, a chromophore, or a radioactive group.
  8. 8. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich im oder benachbart zum Anticodon-Bereich der tRNA ein kovalent gebundenes photoreaktives Nukleotidanalogon befindet. 8. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to any one of claims 1 to 7, characterized in that a covalently bonded photoreactive nucleotide analogue is located adjacent to the anticodon region of the tRNA in or.
  9. 9. Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich 3'-terminal zum Anticodon der tRNA-Einheit ein Wybutin als photoreaktives Nukleotidanalogon befindet. 9. peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to claim 8, characterized in that the 3'-terminal is a Wybutin as photoreactive nucleotide analogue to the anticodon of the tRNA unit.
  10. 10. Verwendung eines Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Codon-spezifisch arretierten Translationskomplexes. 10. Use of a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to any one of claims 1 to 9 for preparing a codon specific arrested translation complex.
  11. 11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Codon-spezifisch arretierten Translationskomplex um einen Stopp-Codonspezifisch arretierten Translationskomplex handelt. 11. Use according to claim 10, characterized in that it is in the locked Codonspezifisch translation complex to a stop Codonspezifisch arrested translation complex.
  12. 12. Verwendung eines Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls nach Anspruch 8 oder 9 zur Herstellung eines arretierten Translationskomplexes, dadurch gekennzeichnet, daß das tRNA-Molekül nach Ausbildung des arretierten Translationskomplexes durch Aktivierung der photoreaktiven Gruppe kovalent an die mRNA gebunden wird. 12. Use of a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to claim 8 or 9 for producing a locked translation complex, characterized in that the tRNA molecule is bonded after forming the locked translation complex by activation of the photoreactive group covalently bound to the mRNA.
  13. 13. Verfahren zur Herstellung eines Hybridmoleküls aus Polypeptid und für das Polypeptid kodierender mRNA, dadurch gekennzeichnet, daß gemäß Anspruch 12 ein arretierter Translationskomplex mit kovalenter Verknüpfung zwischen mRNA und tRNA-Einheit hergestellt wird und das Ribosom anschließend abgetrennt wird. 13. A process for the preparation of a hybrid molecule of polypeptide and the polypeptide encoding mRNA, characterized in that a locked translation complex with covalent linkage between mRNA and tRNA unit is prepared according to claim 12 and the ribosome is then separated.
  14. 14. Hybridmolekül aus Polypeptid und für das Polypeptid kodierender mRNA, dadurch gekennzeichnet, dass Polypeptid und mRNA über ein Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9 miteinander verbunden sind. 14. The chimeric molecule of polypeptide and the polypeptide encoding mRNA, characterized in that the polypeptide mRNA and are connected to each other via a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to any one of claims 1 to 9.
  15. 15. Hybridmolekül nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül und mRNA über eine photoreaktive Gruppe kovalent miteinander verknüpft sind. 15. The chimeric molecule of claim 14, characterized in that the peptide acceptor / tRNA and mRNA hybrid molecule are linked via a photoreactive group covalently to each other.
  16. 16. Arretierter Translationskomplex, dadurch gekennzeichnet, daß sich ein codon- spezifisches Peptidakzeptor-tRNA-Hybridmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9 im Ribosom befindet, an dessen Peptidakzeptor-Untereinheit das Polypeptid kovalent gebunden ist. 16. locked translation complex, characterized in that a codon-specific peptide acceptor tRNA hybrid molecule according to any one of claims 1 to 9 is located in the ribosome, at the peptide acceptor subunit, the polypeptide is covalently bound.
  17. 17. Arretierter Translationskomplex nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül und mRNA über eine photoreaktive Gruppe kovalent miteinander verknüpft sind. 17. locked translation complex according to claim 16, characterized in that the peptide acceptor / tRNA and mRNA hybrid molecule are linked via a photoreactive group covalently to each other.
  18. 18. Verwendung des Hybridmoleküls nach Anspruch 14 oder 15 oder des arretierten Translationskomplexes nach Anspruch 16 oder 17 zur Degradation des 3'- untranslatierten Bereiches der mRNA und/oder zur Entfernung des Stopp- Codons. 18. Use of the hybrid molecule of claim 14 or 15 or the locked translation complex according to claim 16 or 17 for the degradation of the 3'-untranslated region of the mRNA and / or for the removal of the stop codons.
  19. 19. Verwendung nach Anspruch 18 wobei die Degradation durch Einsatz einer 3'-5'- Exoribonuklease oder nach Herstellung des komplementären cDNA-Stranges unter Einsatz einer RNA/DNA-Strang-spezifischen RNase, bevorzugt RNase H, erfolgt. 19. Use according to claim 18 wherein the degradation by use of a 3'-5 'exoribonuclease, or after production of the complementary strand cDNA using an RNA / DNA strand-specific RNase preferably, RNase H, is carried out.
  20. 20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei zur Entfernung des verbliebenen 3'-UTR und des Stopp-Codons mindestens folgende weitere Schritte durchgeführt werden: 20. Use according to claim 19, wherein are carried out to remove the remaining 3'-UTR and the stop codon at least the following further steps:
    a) Ankopplung eines RNA-Adaptors, umfassend eine Primer-Bindestelle und eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, bevorzugt ein Typ IIS- Restriktionsenzym, a) coupling of an RNA adapter comprising a primer-binding site and a recognition sequence for a restriction enzyme, preferably a type IIS restriction enzyme,
    b) Reverse Transkription der RNA unter Verwendung eines Adaptorkomplementären Primers, b) reverse transcription of RNA using a primer Adaptorkomplementären,
    c) Degradation der RNA im Bereich des RNA/DNA-Doppelstranghybrids, c) degradation of RNA in the region of the RNA / DNA duplex hybrid,
    d) Zweit-DNA-Strang-Synthese, d) a second DNA strand synthesis,
    e) Restriktion der doppelsträngigen DNA stromaufwärts vom Stopp-Codon durch ein Restriktionsenzym, bevorzugt durch ein Typ IIS-Restriktionsenzym. e) the double-stranded DNA restriction upstream of the stop codon by a restriction enzyme, preferably by a type IIS restriction enzyme.
  21. 21. Verwendung eines Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Codon-spezifischen Markierung von Proteinen und/oder Proteinfragmenten an ihrem carboxyterminalen Ende während ihrer Herstellung durch in vitro-Translation. 21. Use of a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to any one of claims 1 to 9 for codon specific labeling of proteins and / or protein fragments on their carboxy-terminal end during their production by in vitro translation.
  22. 22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei es sich bei der codon-spezifischen Markierung um eine Stopp-Codon-spezfisiche Markierung handelt. 22. Use according to claim 21, wherein there is a stop codon spezfisiche mark at the codon-specific marker.
  23. 23. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß nach Herstellung des markierten Proteins bzw. Proteinfragments der tRNA-Teil teilweise oder vollständig abgebaut wird, bevorzugt mittels einer RNase oder durch Inkubation bei basischem pH. 23. Use according to claim 21 or 22, characterized in that the tRNA-part is partially or completely degraded after the preparation of the labeled protein or protein fragment, preferably by means of an RNase or by incubation at basic pH.
  24. 24. Carboxyterminal markiertes Protein erhältlich gemäß einer Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 23. 24 carboxy terminal tagged protein obtainable by a use according to any of claims 21 to 23rd
  25. 25. Verfahren zum Nachweis oder zur Reinigung von carboxyterminal markierten Proteinen nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis und/oder die Reinigung durch Akzeptor-spezifisch bindende Moleküle, bevorzugt Akzeptor-spezifische Antikörper und/oder durch Hybridisierung ihres tRNA- Anteils mit einer komplementären Nukleinsäure erfolgt, wobei Antikörper und komplementäre Nukleinsäure auf einer Matrix immobilisiert sein können. 25. A method for the detection or purification of carboxyl-terminal tagged proteins according to claim 24, characterized in that the detection and / or purification by acceptor-specific binding molecules, preferably acceptor-specific antibodies and / or by hybridization with a portion of its tRNA complementary nucleic acid, whereby antibody and complementary nucleic acid may be immobilized on a matrix.
  26. 26. Verfahren zum Nachweis von carboxyterminal markierten Proteinen nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durch reverse Transkription ihres RNA-Anteils und anschließende Amplifikation der cDNA in der Polymerase-Kettenreaktion erfolgt. 26. A method for the detection of labeled proteins carboxy-terminal according to claim 24, characterized in that the detection is carried out by reverse transcription of their RNA portion and subsequent amplification of the cDNA in the polymerase chain reaction.
  27. 27. Verfahren zur differentiellen Transkriptomanalyse, folgende Schritte umfassend: 27. A method for differential transcriptome analysis, comprising the steps of:
    a) das Transkriptom von Zellen wird isoliert und gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23 werden C-terminal markierte Proteine und/oder Proteinfragmente synthetisiert, a) the transcriptome of cells is isolated and according to one of claims 21 to 23 labeled proteins and / or protein fragments are C-terminal synthesized
    b) das Transkriptom von Zellen nach (a) wird, nachdem die Zellen einem Wirkstoff oder einer zu testenden Substanz ausgesetzt worden waren, isoliert und wie in (a) werden C-terminal markierte Proteine und/oder Proteinfragmente synthetisiert, b) the transcriptome of cells according to (a) after the cells a drug or a substance to be tested had been exposed and isolated as in (a) C-terminal tagged proteins and / or protein fragments to be synthesized,
    c) die erhaltenen Protein- und/oder Proteinfragmentgemische werden durch Proteinanalyse, bevorzugt durch 2-dimensionale Gelanalyse, miteinander verglichen. c) the protein obtained and / or protein fragment mixtures by protein analysis, preferably by 2-dimensional gel analysis, were compared.
  28. 28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß in (a) und (b) unterschiedlich markierte tRNA-Hybridmoleküle eingesetzt werden und die erhaltenen Protein- und/oder Proteinfragmentgemische parallel elektrophoretisch mit demselben 2-dimensionalen Gel analysiert werden. 28. The method according to claim 27, characterized in that differently labeled tRNA hybrid molecules are used in (a) and (b), and the obtained protein and / or protein fragment mixtures are analyzed by electrophoresis in parallel with the same 2-dimensional gel.
  29. 29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß als Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmolekül ein Peptidakzeptor/Suppressor-tRNA- Hybridmolekül verwendet wird und entsprechend vollständige Proteine synthetisiert werden. 29. The method according to claim 27 or 28, characterized in that a peptide acceptor / suppressor tRNA hybrid molecule is used as the peptide acceptor / tRNA hybrid molecule, and accordingly complete proteins are synthesized.
  30. 30. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in vitro unter Verwendung von translationskompetenten Lysaten durchgeführt wird, bevorzugt mit Reticulozytenlysat, E. coli S30-Extrakten und/oder mit Lysat aus Hefezellen. 30. A method or use according to any one of the preceding claims, characterized in that the process in vitro using translation is performed by competent lysates, preferably with reticulocyte lysate, E. coli S30 extracts and / or with lysate from yeast cells.
  31. 31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Release-Faktor- Aktivität in dem Lysat herabgesetzt oder inhibiert wurde, bevorzugt durch Abreicherung des Release-Faktors, durch inaktivierende Ligandenbindung, besonders bevorzugt durch inaktivierende Anbindung eines spezifischen Antikörpers oder durch Verwendung von induzierbar inaktivierbaren Mutanten des Releasefaktors. 31. The method according to claim 30, characterized in that the release factor was reduced activity in the lysate or inhibited, preferably by depletion of the release factor, by inactivating ligand binding, particularly preferably inducible by inactivating connection of a specific antibody or by using deactivatable mutants of the release factor.
  32. 32. Verwendung eines Peptidakzeptor/tRNA-Hybridmoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 oder eines Hybridmoleküls gemäß Anspruch 14 oder 15 oder eines arretierten Translationskomplexes gemäß Anspruch 16 oder 17 für in vitro- Evolutionsexperimente. 32. Use of a peptide acceptor / tRNA hybrid molecule according to any one of claims 1 to 9, or a hybrid molecule according to claim 14 or 15, or a locked translation complex according to claim 16 or 17 for in vitro evolution experiments.
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