DE10116101A1

DE10116101A1 - New nucleic acid construct, useful for transforming microorganism for fermentation, contains sequences for increased production and transport of sulfite

Info

Publication number: DE10116101A1
Application number: DE2001116101
Authority: DE
Inventors: Ute Donalies; Ulf Stahl
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2002-10-10
Anticipated expiration: 2021-03-31
Also published as: DE10116101B4

Abstract

Nucleic acid construct (A) that contains: (i) at least one partial sequence (I) encoding a protein or enzyme (Ia) that increases sulfite formation in a microorganism; and (ii) a partial sequence (II) encoding a protein or enzyme (IIa) that increases export of sulfite from the cell, is new. Independent claims are also included for the following: (1) microorganisms that include (A); and (2) method for preparing microorganisms of (1).

Description

Field of the Invention

Die Erfindung betrifft ein Nukleinsäurekonstrukt mit zumindest einer für ein die Sulfitbildung in einem Mikroorganismus erhöhendes Protein oder Enzym codierenden Teilsequenz, ein hiermit transformierter Mikroorganismus, die Herstellung eines solchen Mikroorganismus sowie Verwendungen solcher Mikroorganismen.The invention relates to a nucleic acid construct at least one for sulfite formation in one Microorganism-increasing protein or enzyme coding Partial sequence, a microorganism transformed with it, the production of such a microorganism and Uses of such microorganisms.

Background of the Invention

Nukleinsäurekonstrukte und Mikroorganismen des eingangs genannten Aufbaus finden weitverbreitete Anwendung im Bereich der Lebensmitteltechnologie, und zwar im Rahmen solcher Herstellungsverfahren, die mit Gärverfahrenstufen arbeiten. Hier sind insbesondere das Bäckereiwesen, das Brauwesen sowie das Winzerwesen zu nennen. Folgend werden weitere Hintergünde exemplarisch anhand des Brauwesens näter erläutert.Nucleic acid constructs and microorganisms at the entrance mentioned construction find widespread use in Area of food technology, in the context of such manufacturing processes with fermentation stages work. Here in particular are the bakery industry, the Brewery and winemaking. Be following other backgrounds using the brewing system as an example explained later.

Im abgefüllten Bier kann es nach einiger Zeit, in Abhängigkeit von den Lagerbedingungen, zur Ausbildung eines Alterungsgeschmackes kommen. Für diesen Alterungsgeschmack sind vor allem Carbonyle, die durch Oxidation von Bierinhaltstoffen entstehen, verantwortlich. After some time in the bottled beer, it can Dependence on storage conditions, for training of an aging taste. For this The taste of aging is mainly due to carbonyls Oxidation of beer contents arise, responsible.

Sulfit spielt eine wichtige Rolle für die Geschmacksstabilität. Es wirkt als Antioxidans und bildet Komplexe mit Carbonylen. Diese Sulfit-Carbonyl-Komplexe sind geschmacklich nicht mehr relevant. Sulfit gelangt während der Gärung als Zwischenprodukt des Hefestoff wechsels ins Bier. Da ein Zusatz von Schwefeldioxid zum Bier aufgrund des Reinheitsgebotes nicht erlaubt ist, sind modifizierte Hefestämme wünschenswert, die eine erhöhte Sulfitproduktion aufweisen.Sulfite plays an important role in that Flavor stability. It acts as an antioxidant and forms Complexes with carbonyls. These sulfite-carbonyl complexes are no longer relevant in terms of taste. Sulfite arrives during fermentation as an intermediate product of the yeast into beer. Since an addition of sulfur dioxide to the Beer is not allowed due to the Purity Law modified yeast strains desirable, which increased Have sulfite production.

Die Oxidation von Bierinhaltstoffen erfolgt über einen radikalischen Mechanismus. Dabei wird Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert. Bei dieser Reaktion wirken Schwermetallspuren katalytisch. In Fenton-Reaktionen reagieren Metallionen mit dem Wasserstoffperoxid, es entstehen Hydroxylionen und Hydroxylradikale. Letztere sind außerordentlich reaktiv. Sie können aus höheren Alkoholen Wasserstoff abstrahieren und so oxidative Reaktionen einleiten. Sulfit wirkt als Radikalfänger und ist dadurch in der Lage sauerstoffaktivierte Radikalreaktionen zu verhindern. Außerdem kann Sulfit mit flüchtigen Carbonylverbindungen Komplexe bilden. Da diese Komplexe nicht stabil sind, liegt ein Gleichgewicht zwischen freiem Sulfit, gebundenem Sulfit und freien Carbonylen vor.The oxidation of beer contents takes place via a radical mechanism. This turns oxygen into Reduced hydrogen peroxide. Act in this reaction Heavy metal traces catalytic. In Fenton reactions metal ions react with the hydrogen peroxide, it hydroxyl ions and hydroxyl radicals are formed. Latter are extremely reactive. You can from higher Alcohols abstract hydrogen and so oxidative Initiate reactions. Sulfite acts as a radical scavenger and is therefore able to activate oxygen To prevent radical reactions. In addition, sulfite can volatile carbonyl compounds form complexes. This one Complexes are not stable, there is a balance between free sulfite, bound sulfite and free Carbonylene before.

Sulfit ist ein Zwischenprodukt bei der Biosynthese schwefelhaltiger Aminosäuren. Es entsteht durch Reduktion von Sulfat, das aus der Würze aufgenommen wird. Die Sulfitbildung beginnt mit der Aufnahme von Sulfat, das über einen aktiven Transportmechanismus (Permeasen) aus der Würze in die Zelle gelangt. Vor der Reduktion muß das Sulfat aktiviert werden. Diese Aktivierung erfolgt enzymatisch (ATP-Sulfurylase und Adenosin-5'-phosphosulfat (APS)-Kinase) in zwei Schritten unter Verbrauch von zwei Molekülen ATP. Das aktivierte Sulfat wird enzymatisch (Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat(PAPS)-Reduktase) zu Sulfit und weiter zu Sulfid reduziert (Sulfitreduktase), welches für die Biosynthese der schwefelhaltigen Aminosäuren Methionin und Cystein verwendet wird. Dieser Stoffwechselweg wird auf zwei Ebenen reguliert. Zum einen liegt eine Kontrolle der Enzymaktivität vor, die durch Substrat- oder Feedbackhemmung, d. h. Rückkopplungshemmung durch nachfolgende Produkte, erfolgt. Zum anderen wird die Genexpression reguliert. Die Regulation erfolgt entsprechend dem Bedarf an schwefelhaltigen Aminosäuren. Methionin hemmt als Endprodukt die Bildung vieler Enzyme dieses Biosyntheseweges. Dementsprechend verläuft die Sulfitbildung und -ausscheidung während der Gärung in vier Phasen. In der ersten Phase wird kein Sulfit ausgeschieden, da die Expression der Enzyme der Sulfatreduktion durch Methionin in der Würze reprimiert ist. In der zweiten Phase wird Sulfat reduziert. Durch das Zellwachstum ist ein verstärkter Bedarf an Aminosäuren bedingt. Daher wird das gebildete Sulfit zum größten Teil zu Sulfid reduziert und für die Biosynthese der schwefelhaltigen Aminosäuren verbraucht. Es wird kaum Sulfit ausgeschieden. In der dritten Phase kommt es zu einer verstärkten Sulfitausscheidung, da das Hefewachstum stoppt und damit der Aminosäurenbedarf sinkt. In der letzten Phase ist der vergärbare Extrakt annähernd verbraucht. Der Stoffwechsel und damit die Sulfitbildung verlangsamt sich und kommt zum Stillstand.Sulfite is an intermediate in biosynthesis sulfur-containing amino acids. It is created through reduction of sulfate, which is absorbed from the wort. The Sulfite formation begins with the absorption of sulfate, the via an active transport mechanism (permeases) the wort reaches the cell. Before the reduction, that must Sulfate can be activated. This activation takes place enzymatic (ATP sulfurylase and adenosine 5'-phosphosulfate (APS) kinase) in two steps using two Molecules ATP. The activated sulfate becomes enzymatic (Phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) reductase) Sulfite and further reduced to sulfide (sulfite reductase), which is responsible for the biosynthesis of the sulfur-containing Amino acids methionine and cysteine are used. This Metabolic pathway is regulated on two levels. On the one hand there is a control of enzyme activity by Inhibition of substrate or feedback, d. H. Feedback inhibition through subsequent products. On the other hand, the Regulates gene expression. The regulation takes place according to the need for sulfur-containing amino acids. As an end product, methionine inhibits the formation of many enzymes this biosynthetic pathway. Accordingly, the Sulphite formation and excretion during fermentation in four Phases. In the first phase there is no sulfite excreted because the expression of the enzymes of Sulfate reduction repressed by methionine in the wort is. In the second phase, sulfate is reduced. By the Cell growth is an increased need for amino acids conditionally. Therefore, the sulfite formed for the most part reduced to sulfide and for the biosynthesis of sulfur-containing amino acids. It will hardly be Excreted sulfite. In the third phase it happens an increased sulfite excretion, because the yeast growth stops and thus the amino acid requirement decreases. In the In the last phase, the fermentable extract is approximate consumed. The metabolism and thus the formation of sulfite slows down and comes to a standstill.

Schwefeldioxid bzw. Sulfit spielt die folgende Rolle bei der Bieralterung. Im Bier liegt ein Gleichgewicht zwischen freien Carbonylen, Carbonyl-Sulfit-Komplexen und freiem Sulfit vor. Die Carbonyle stehen im Gleichgewicht mit ih ren korrespondierenden Alkoholen. Der Einfluß des Schwe feldioxids auf die Geschmacksstabilität muß unter zwei Gesichtspunkten betrachtet werden: Die Wirkung während der Gärung bzw. während der Lagerung. Während der Gärung wer den viele Würzecarbonyle zu den entsprechenden korrespon dierenden Alkoholen reduziert. Das gebildete Schwefeldi oxid kann durch Komplexbildung mit diesen Carbonylen ihre Reduktion behindern. So können die Carbonyle in Form von Sulfit-Komplexen ins fertige Bier gelangen. Nach Aufspal tung der Komplexe tragen sie zum Alterungsgeschmack bei. Normalerweise beginnt die Sulfitausscheidung aber verzö gert und die Reduktion der Würzecarbonyle findet sehr schnell statt. Deshalb kann man davon ausgehen, daß zu dem Zeitpunkt an dem Sulfit ausgeschieden wird, bereits üben wiegend die reduzierten Formen vorliegen und eine Sulfit- Würzecarbonyl-Komplexbildung kaum noch erfolgt. Während der Lagerung wirkt sich das im Bier enthaltene Sulfit po sitiv auf die Geschmacksstabilität aus. Durch die Komplex bildung des Sulfits mit geschmacksaktiven Carbonylen wird das Auftreten eines Alterungsgeschmackes verzögert. Sulfur dioxide or sulfite plays the following role of beer aging. In beer there is a balance between free carbonyls, carbonyl sulfite complexes and free Sulfite before. The carbonyls are in balance with them corresponding alcohols. The influence of the Schwe field dioxide on the taste stability must be under two Considerations are considered: The effect during the Fermentation or during storage. During fermentation who the many wort carbonyls to the corresponding correspon reducing alcohols. The formed Schwefeldi oxide can form by complexing with these carbonyls Hinder reduction. So the carbonyls in the form of Get sulfite complexes into the finished beer. After Aufspal The complexes contribute to the taste of aging. Usually the sulfite excretion starts with delay gert and the reduction of wort carbonyls takes place very quickly instead. Therefore one can assume that the Practice the point at which sulfite is excreted the reduced forms are present and a sulfite Wort carbonyl complex formation hardly takes place. While the sulfite po contained in the beer affects storage sitiv on the taste stability. Through the complex formation of sulfite with flavor-active carbonyls the appearance of an aging taste is delayed.

State of the art

Eine Erhöhung der Sulfitausscheidung kann auf mehreren Wegen erreicht werden. Zum einen kann im Hefestoffwechsel die Sulfitbildung verstärkt, zum anderen die weitere Umsetzung des Sulfits verhindert oder eingeschränkt werden.An increase in sulfite excretion can be due to several Because of being reached. Firstly, in yeast metabolism the sulfite formation intensifies, on the other hand the further Conversion of the sulfite prevented or restricted become.

Aus der Literaturstelle DE 199 23 950 ist es bekannt, eine Verstärkung der Sulfitbildung durch Einbringen von zusätzlichen Kopien derjenigen Gene zu bewerkstelligen, deren Genprodukte regulativ an der Sulfitbildung beteiligt sind. Im Einzelnen ist beschrieben, daß eine Überexpression der Hefe Gene MET14 und MET16 unter Kontrolle der HSP26- und HSP30-Promotoren in Hefestämmen zu einer erhöhten Bildung von Sulfit im Rahmen einer Gärverfahrenstufe führt. Das Genprodukt von MET16 ist die PAPS-Reduktase, die die Reduktion des aktivierten Sulfats zum Sulfit bewirkt. Das Genprodukt von MET14 ist die APS Kinase. Es wurde insbesondere gezeigt, daß MET14 einen starken Einfluß hat. Dessen Genprodukt scheint einen geschwindigkeitsbestimmmenden Schritt, bei der biochemischen Sulfatreduktion zu Sulfit zu katalysieren. Die insofern bekannten Maßnahmen führen nicht nur zu Erhöhung der Sulfitkonzentration an sich, sondern zudem zu einer Erhöhung in einer späten Wachstumsphase der Mikroorganismen, wodurch eine störende (frühe) Komplexbildung zwischen Sulfit und Würzecarbonylen vermieden wird. Vielmehr kann Sulfit gleichsam konserviert und in das Endprodukt übertragen werden, wo es die gewünschte Alterungsstabilität durch Einfang von Radikalen und Carbonylen bewirkt. Nachteilig ist allerdings, daß eine Erhöhung der Sulfitkonzentration in einer Zelle durch Wirkung von nachgeschalteten Sulfitreduktasen gleichsam konterkariert werden können mit den Ergebnis, daß die Sulfitkonzentration im Endprodukt trotz der Erhöhung der Sulfitbildung nicht befriedigend ist. Zudem stört die auch sich erhöhende Bildung von Sulfid in beachtlichem Maße.From the document DE 199 23 950 it is known a Enhancement of sulfite formation by introducing to make additional copies of those genes whose gene products are involved in the regulation of sulfite formation are. It is described in detail that a Overexpression of the yeast genes MET14 and MET16 under Control of the HSP26 and HSP30 promoters in yeast strains to an increased formation of sulfite in the context of a Fermentation process stage leads. The gene product of MET16 is the PAPS reductase, which is the reduction of the activated sulfate to sulfite. The gene product of MET14 is the APS kinase. In particular, MET14 has been shown to have a has a strong influence. Its gene product seems one speed determining step at which biochemical sulfate reduction to catalyze sulfite. The measures known in this respect not only lead to Increase in the sulfite concentration itself, but also to an increase in a late growth phase of the Microorganisms, causing a disruptive (early) Complex formation between sulfite and wort carbonyls is avoided. Rather, sulfite can be preserved as it were and transferred to the final product where it is the Desired aging stability through radical capture and carbonyls. The disadvantage, however, is that an increase in the sulfite concentration in a cell Effect of downstream sulfite reductases as it were can be counteracted with the result that the Sulfite concentration in the final product despite the increase in Sulfite formation is unsatisfactory. It also bothers increasing formation of sulfide to a considerable extent.

Bezüglich weiterführender Informationen zur Klonierung, zur Sequenz sowie der Regulierung von MET14 wird beispielsweise auf die Literaturstelle Korch, Ch. et al., Mol Gen Genet., 229: 96-108 (1991) verwiesen.For more information on cloning, sequence and regulation of MET14 for example to the reference Korch, Ch. et al., Mol Gen Genet., 229: 96-108 (1991).

Aus der Literaturstelle Park, H. et al. Yeast, 16: 881-888 (2000) ist ein Gen bekannt, welches für ein Plasma Membran Protein, SSU1, codiert, das Sulfit aus einer Zelle ausschleust. Dies wird vor dem Hintergrund beschrieben, daß Sulfit potentiell zelltoxisch ist und daher wünschenswerterweise aus einer Zelle entfernt wird. Weiterhin ist beschrieben, daß Saccharomyces cerevisiae, welche mit einer Mehrzahl von SSU1 Kopien oder mit einem dominanten Allel (FZF1-4) eines Transkriptionsaktivators transformiert ist, Sulfit in erhöhtem Ausmaß in den extrazellulären Raum ausschüttet.From the Park, H. et al. Yeast, 16: 881-888 (2000) a gene is known which is for a plasma membrane Protein, SSU1, encodes the sulfite from a cell ausschleust. This is described against the background that sulfite is potentially cell toxic and therefore is desirably removed from a cell. It is also described that Saccharomyces cerevisiae, which with a plurality of SSU1 copies or with one dominant allele (FZF1-4) of a transcription activator is transformed to an increased extent in the sulfite extracellular space.

Technical problem of the invention

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Nukleinsäurekonstrukt anzugeben, mittels welchem Mikroorganismen zum Einsatz in lebensmitteltechnischen Gärverfahrenstufen erzeugt werden können, die zu einer erhöhten Sulfitkonzentration in dem das Endprodukt bildenden Lebensmittel führen.The invention is based on the technical problem Specify nucleic acid construct, by means of which Microorganisms for use in food technology Fermentation process stages can be generated that lead to a increased sulfite concentration in which the final product lead educational foods.

Basics of the invention

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt mit zumindest einer für ein die Sulfitbildung in einem Mikroorganismus erhöhendes Protein oder Enzym codierenden ersten Teilsequenz und mit einer für ein den Transport von Sulfit aus einer Zelle erhöhendes Protein oder Enzym codierenden zweiten Teilsequenz.The invention teaches to solve this technical problem a nucleic acid construct with at least one for one Protein increasing sulfite formation in a microorganism or enzyme coding first partial sequence and with a for the transport of sulfite from a cell increasing protein or enzyme encoding second Subsequence.

Mit einem solchen Konstrukt lassen sich gentechnisch Mikroorganismen erstellen, bei welchen einerseits (in einer späten Wachstumsphase) vermehrt Sulfit gebildet wird, und andererseits das Sulfit praktisch unmittelbar nach seiner Bildung aus der Zelle ausgeschleust und so einer störenden Einwirkung von Sulfit-Reduktasen entzogen wird. Hierbei findet auch keine Verschiebung zu einer früheren Sulfitbildung statt, wie im Falle einer (zum Ausschleusen alternativen) Inhibierung von Sulfit-Reduktase zu beobachten ist. Im Ergebnis lassen sich Lebensmittel, insbesondere Bier, herstellen, die einen hohen Gehalt an Sulfit aufweisen, ohne das Sulfit dem Lebensmittel zugesetzt zu werden braucht. Man erhält ein lange Zeit alterungsstabiles, insbesondere geschmackstabiles, Lebensmittel.With such a construct can be genetically engineered Create microorganisms, on the one hand (in a late growth phase) sulfite is increasingly formed and, on the other hand, the sulfite practically immediately ejected from the cell after its formation and such withdrawn from the interference of sulfite reductases becomes. There is also no shift to one earlier sulfite formation takes place, as in the case of a (for Discharge alternative) inhibition of Sulfite reductase can be observed. Leave in the result produce foods, especially beer, that have a high sulfite content without the sulfite needs to be added to the food. You get a long time stable, especially stable taste, food.

Weiterhin lehrt die Erfindung einen Mikroorganismus, in welchen ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurenkonstrukt eingeschleust ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Mikroorganismus, wobei das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt in einen natürlichen oder modifizierten Basis-Mikroorganismus eingeschleust wird. Hinsichtlich des Mikroorganismus ist anzumerken, daß dieser vorzugsweise ausschließlich mit Genen des Basis-Mikroorganismus gebildet sein kann, wobei die an sich natürlicherweise in dem Basis-Mikroorganismus vorkommenden Gene bzw. deren Teilsequenzen oder Promotorsequenzen lediglich anders zueinander potitioniert sind. Dies gilt insbesondere hinsichtlich der Anordnung von Promotorsequenzen, welche fremde Promotoren in dem Sinne sein können, daß sie zwar in dem Mikroorganismus in einem (anderen) Gen natürlicherweise vorkommen, nunmehr jedoch Teil eines Gens bilden, in welchem sie natürlicherweise nicht vorkommen. In einer solchen Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus nicht um einen gentechnisch veränderten Mikroorganismus, da keinerlei artfremden Sequenzen oder Teilsequenzen exprimiert werden.The invention further teaches a microorganism in which a nucleic acid construct according to the invention is introduced, and a method of manufacture of such a microorganism, the inventive Nucleic acid construct into a natural or modified basic microorganism is introduced. With regard to the microorganism, it should be noted that this preferably exclusively with genes of Base microorganism can be formed, the at naturally in the base microorganism occurring genes or their partial sequences or Promoter sequences merely potentiated differently from one another are. This applies in particular to the arrangement of promoter sequences which foreign promoters in the Senses can be that they are in the microorganism occur naturally in another gene, now however form part of a gene in which they do not occur naturally. In one Embodiment is the invention Microorganism is not a genetically modified one Microorganism, since no foreign sequences or Partial sequences are expressed.

Schließlich lehrt die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus zur Herstellung von Lebensmitteln oder Getränken, welche mittels zumindest einer Gärverfahrenstufe erhältlich sind, wobei der Mikroorganismus in der Gärverfahrenstufe eingesetzt wird.Finally, the invention teaches the use of a Microorganism according to the invention for the production of Food or beverages, which means at least a fermentation process stage are available, the Microorganism is used in the fermentation process stage.

Preferred embodiments of the invention

Zweckmäßigerweise weist das Nukleinsäurekonstrukt eine die erste Teilsequenz und/oder die zweite Teilsequenz kontrol lierenden Promotorsequenz, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "HSP-Gene, SSA-Gene, HSP26, HSP30, YPG1, HXK1, MOL1 (TH14), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4, HSP12, HSP78, HSP104, ADH1, ADH2, PGK und GAP", auf. Es versteht sich, daß zum Zwecke der Transkription beider Teilsequen zen auch mehrere Promotor eingerichtet sein können. Die zweite Teilsequenz wird vorzugsweise von der geneigenen Promotorsequenz kontrolliert.The nucleic acid construct expediently has one first partial sequence and / or the second partial sequence control promoter sequence, preferably selected from the Group consisting of "HSP genes, SSA genes, HSP26, HSP30, YPG1, HXK1, MOL1 (TH14), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4, HSP12, HSP78, HSP104, ADH1, ADH2, PGK and GAP ", on. It understands yourself that for the purpose of transcribing both partial sequences Several promoters can also be set up. The second partial sequence is preferably from the gene Promoter sequence controlled.

Bevorzugterweise ist die erste Teilsequenz ausgewählt aus der Gruppe der Hefegene bestehend aus "MET14, MET16, von vorstehenden Genen verschiedene Gene, welche für ein Poly peptid mit APS-Kinase und/oder PAPS-Reduktase Aktivität codieren und Homologe oder Allele solcher Gene", vorzugs weise aus Saccharomyces cerevisiae. Höchstvorzugsweise handelt es sich um MET14, optional zusätzlich MET16, aus Saccharomyces cerevisiae.The first partial sequence is preferably selected from the group of yeast genes consisting of "MET14, MET16, from above genes different genes, which for a poly peptide with APS kinase and / or PAPS reductase activity encode and homologs or alleles of such genes ", preferably from Saccharomyces cerevisiae. Most preferably, it is MET14, optionally also MET16 Saccharomyces cerevisiae.

Die zweite Teilsequenz ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe der Hefegene bestehend aus "SSU1, FZF1, FZF1-4, von vorstehenden Genen verschiedene Gene, welche für ein den Sulfittransport aus einer Zelle codierendes Protein oder eines Transskriptionsaktivator eines solchen Proteins co dieren, und Homologe oder Allele solcher Gene", vorzugs weise aus Saccharomyces cerevisiae. The second partial sequence is preferably selected from the Group of yeast genes consisting of "SSU1, FZF1, FZF1-4, from above genes different genes, which for a Protein coding for sulfite transport from a cell or a transcriptional activator of such a protein co dieren, and homologs or alleles of such genes ", preferred from Saccharomyces cerevisiae.

Die zweite Teilsequenz und/oder die Promotorsequenz können jeweils unabhängig voneinander in einer Kopie oder einer Mehrzahl von Kopien eingerichtet sein. Die erste Teilse quenz, die zweite Teilsequenz und/oder die Promotorsequenz können durch Substition, Insertion, Deletion, Inversion und/oder Addition modifiziert sein.The second partial sequence and / or the promoter sequence can each independently in a copy or one A plurality of copies can be set up. The first part sequence, the second partial sequence and / or the promoter sequence can by substitution, insertion, deletion, inversion and / or addition modified.

Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt kann in linea rer oder zirkulärer Form, vorliegen, in ersterem Falle vorzugsweise durch endständige Gruppen gegen Abbau durch DNasen oder RNasen geschützt.A nucleic acid construct according to the invention can be in linea rer or circular form, in the former case preferably by terminal groups against degradation DNases or RNases protected.

Ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus ist bevorzugterweise eine Hefe oder ein Bakterium, vorzugsweise ein Hefestamm der Gattung Saccharomyces, Brettanomyces oder Kluyveromy ces, höchstvorzugsweise eine Art ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Saccharomyces cerevisiae, ober- oder unter gärige Brauhefen, Weinhefen, Sekthefen, Sakehefen, Sher ryhefen, Brennereihefen, oder Bäckereihefen". Die Sequen zen des Nukleinsäurekonstrukts können in episomaler Form oder in das Genom integriert vorliegen. Letzteres ist aus Gründen der stabilen Transformation bevorzugt.A microorganism according to the invention is preferred a yeast or a bacterium, preferably a yeast strain the genus Saccharomyces, Brettanomyces or Kluyveromy ces, most preferably a species selected from the group consisting of "Saccharomyces cerevisiae, above or below fermented brewing yeast, wine yeast, champagne yeast, sake yeast, Sher ry yeast, distillery yeast, or bakery yeast ". The sequences Zen of the nucleic acid construct can be in episomal form or be integrated into the genome. The latter is over Preferred for stable transformation.

Es können im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Lebensmittels mehrere unterschiedliche erfindungsgemäße Mikroorganismen, optional zusammen mit hiervon verschiedenen (natürlichen oder modifizierten) Mikroorganismen, eingesetzt werden.Within the scope of a method according to the invention Making a food several different microorganisms according to the invention, optionally together with different (natural or modified) Microorganisms are used.

Zur Kontrolle einer Transformation kann in einem erfin dungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt ein üblicher Selekti onsmarker eingerichtet sein. Ein Beispiel für einen Selektionsmarker ist URA3 für eine Selektion auf einem Minimalmedium ohne Uracil. Es ist möglich, nach einer Se lektion den Selektionsmarker aus dem Mikroorganismus wie der zu entfernen. Nach der Selektion mit einem Selektions marker können selektierte Klone einer Nachseleketion un terworfen werden, wobei die selektierten Klone sowie un transformierte Mikroorganismen gleicher Art einer Bestim mung der Sulfitbildung unterworfen werden, wobei die Be stimmung gemäß den folgenden Beispielen erfolgt, und wobei solche Klone nachselektiert werden, deren Sulfitbildung um zumindest einen Faktor 2, vorzugsweise zumindest einen Faktor 8, höchstvorzugsweise zumindest einen Faktor 10, höher als jene der untransformierten Mikroorganismen ist.To control a transformation can be invented nucleic acid construct according to the invention is a customary selecti be set up on markers. An example of one The selection marker is URA3 for a selection on one Minimal medium without uracil. It is possible after a Se lesson the selection marker from the microorganism like the remove. After the selection with a selection markers can select selected clones from a post-selection be thrown, the selected clones and un transformed microorganisms of the same kind of a determ tion of sulfite formation, the loading is done according to the following examples, and wherein such clones are re-selected, their sulfite formation around at least a factor of 2, preferably at least one Factor 8, most preferably at least a factor 10, is higher than that of the untransformed microorganisms.

Vorzugsweise werden Promotorsequenzen eingesetzt, die un abhängig von der Aminosäurenzusammensetzung des Mediums, in welchen die Mikroorganismen kultiviert werden, sind.Promoter sequences which un depending on the amino acid composition of the medium, in which the microorganisms are cultivated.

definitions

Die Bezeichnungen Sulfit und SO₂ werden in den zusammenhän gen der Erfindung als Synonyme verwendet.The terms sulfite and SO ₂ are used interchangeably in the invention as synonyms.

Ein Gen weist eine codierende Region, beispielsweise die erste oder zweite Teilsequenz und eine Promotorsequenz auf. Es können auch funktionslose Sequenzen enthalten bzw. zwischengeschaltet sein.A gene has a coding region, for example that first or second partial sequence and a promoter sequence on. It can also contain functionless sequences or be interposed.

Ein Nukleinsäurekonstrukt bezeichnet eine Gesamtsequenz, welche keiner in einem natürlicherweise vorkommenden Mi kroorganismus identisch gleicht. Es kann sich insbesondere um ein künstlich erzeugtes Plasmid handeln. A nucleic acid construct denotes an entire sequence, which none in a naturally occurring Mi Croorganism is identical. It can be particular is an artificially generated plasmid.

Bezüglich der Sequenzinformation zu im Rahmen der Erfin dung eingesetzten ersten Teilsequenzen und/oder Promotor sequenzen wird hiermit auf die Literaturstelle DE 199 23 950 A1 verwiesen und deren Offenbarungsgehalt insofern in den Offenbarungsgehalt dieser Beschreibung inkorporiert. Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus können natürliche und/oder künstliche und/oder fremde Pro motoren eingesetzt werden. Natürlich bezeichnet in dem betreffenden Mikroorganismus natürlicherweise vorkommende Sequenzen. Künstlich bezeichnet in keinem natürlichen Mi kroorganismus vorkommende Sequenzen. Fremd bezeichnet na türlicherweise in Mikroorganismen anderer Art vorkommende Sequenzen.Regarding the sequence information in the context of the Erfin used first partial sequences and / or promoter is hereby referred to the reference DE 199 23 950 A1 referenced and their disclosure content in incorporated the disclosure content of this description. For the production of a microorganism according to the invention can be natural and / or artificial and / or foreign Pro motors are used. Of course referred to in the microorganism in question naturally occurring Sequences. Artificially designated in no natural Mi sequences occurring in the microorganism. Foreign called na naturally occurring in other types of microorganisms Sequences.

Bezüglich der Sequenzinformation zu im Rahmen der Erfin dung eingesetzten zweiten Teilsequenzen und/oder Promotor sequenzen wird hiermit auf die Literaturstelle Hoon Park et al., Yeast, 16: 881-888 (2000) verwiesen und deren Of fenbarungsgehalt sowie die darin genannten Literaturstel len insofern in den Offenbarungsgehalt dieser Beschreibung inkorporiert. Es werden vorzugsweise nur solche zweite Teilsequenzen eingesetzt, die nicht zu einer verstärkten Apotose führen.Regarding the sequence information in the context of the Erfin used second partial sequences and / or promoter sequences is hereby referenced in the Hoon Park reference et al., Yeast, 16: 881-888 (2000) and their Of content and the literature cited therein len in this respect in the disclosure content of this description incorporated. It is preferably only such second ones Partial sequences used that do not result in an amplified Lead apotosis.

Der Ausdruck des Proteins umfaßt im Rahmen der Erfindung auch Polypeptide.The expression of the protein includes within the scope of the invention also polypeptides.

Transport von Sulfit aus einer Zelle bezeichnet den Durch tritt von SO₃ ^2- oder HSO₃ ^- Ionen durch eine äußere Zellme bran. Eine Erhöhung des Transportes bezeichnet eine Trans portrate durch die Zellmembran eines gentechnisch verän derten Mikroorganismus bei definiertem Konzentrationsgefälle über die Zellmembran, welche größer als die Transportrate in einem gentechnisch nicht verän derten Mikroorganismus gleicher Art ist. Die Erhöhung der Transportrate beträgt vorzugsweise mehr als ein Faktor 1,10, höchstvorzugsweise mehr als 2,00, idealerweise mehr als 10,00.Transport of sulfite from a cell refers to the passage of SO ₃ ^2- or HSO ₃ ^- ions by an outer Zellme bran. An increase in transport means a transport rate through the cell membrane of a genetically modified microorganism at a defined concentration gradient across the cell membrane, which is greater than the transport rate in a non-genetically modified microorganism of the same type. The increase in the transport rate is preferably more than a factor of 1.10, most preferably more than 2.00, ideally more than 10.00.

Eine Promotorsequenz kann bis zu 1000 Basenpaare und mehr vor dem Transkriptionsstart umfassen. Eine Promotorsequenz kann zwischen regulierenden Elementen auch nicht regulie rende Bereiche umfassen. Bevorzugterweise werden verzögert angeschaltete Promotoren eingesetzt, wie beispielsweise HSP26 HSP30. Verzögert angeschaltete Promotoren sind sol che, die eine Transkription in der stationären Wachs tumsphase, im letzten Drittel der exponentiellen Wachs tumsphase, und/oder bei 60% bis 90% der in einer Wachs tumsphase erreichbaren maximalen Zellzahl, initiieren, i. e. maximal 30%, vorzugsweise maximal 10%, der maximal erreichbaren Sulfitkonzentration wird vor den genannten Zeitpunkten eingestellt. Zur Bestimmung von Sulfit bzw. SO₂ wird beispielsweise auf die Literaturstelle Grant, Anal. Chem., 19: 345-346 (1947) oder das per 30.03.2001 vertrie bene enzymatische Testkit "TC-SULFIT" der Firma r-Biopharm verwiesen.A promoter sequence can include up to 1000 base pairs and more before the start of transcription. A promoter sequence can also encompass non-regulatory regions between regulatory elements. Promoters that are switched on with a delay, such as HSP26 HSP30, are preferably used. Delayed promoters are those that initiate transcription in the stationary growth phase, in the last third of the exponential growth phase, and / or at 60% to 90% of the maximum cell number achievable in a growth phase, ie a maximum of 30%, preferably a maximum of 10%, the maximum achievable sulfite concentration is set before the times mentioned. For the determination of sulfite or SO ₂ , reference is made, for example, to Grant, Anal. Chem., 19: 345-346 (1947) or the enzymatic test kit "TC-SULFIT" sold by 30.03.2001 from r-Biopharm.

Die Erfindung umfaßt auch den Einsatz von Teilsequenzen, die beispielsweise nicht für MET14 codieren, jedoch zur Expression eines (anderen) Proteins führen, welche trotz der strukturellen Unterschiede mindestens die gleiche Ak tivität von MET14 entwickeln. Entsprechendes gilt in aller Allgemeinheit für die erste und die zweite Teilsequenz sowie die Promotorsequenz. Als zu einem Gen homologe Gene sind solche Gene bezeichnet, die für Proteine codieren, deren Aminosäurensequenz zu zumindest 60%, vorzugsweise zu zumindest 80%, höchstvorzugsweise zu zumindest 95%, der Sequenz des Genes, zu dem Homologie besteht, gleichen.The invention also includes the use of partial sequences, which, for example, do not code for MET14, but for Expression of a (different) protein, which despite the structural differences at least the same Ak Develop the activity of MET14. The same applies to everything Generality for the first and the second partial sequence as well as the promoter sequence. As genes homologous to a gene are those genes that code for proteins, whose amino acid sequence is at least 60%, preferably at at least 80%, most preferably at least 95% of the Sequence of the gene to which homology exists are the same.

Wenn ein erfindungsgemäßes Konstrukt einen Transkriptions aktivator umfaßt, so genügt es mitunter, das hierdurch aktivierbare Gen nicht einzuführen, sofern es natürlicher weise in dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus vorliegt. Wenn dagegen kein Transkriptionsaktivator eingesetzt wird, so muß eine Mehrzahl von Kopien des Gens eingesetzt wer den, i. e. der erfindungsgemäße Mikroorganismus enthält letztendlich eine Mehrzahl von diesen (natürlichen und/o der künstlichen und/oder fremden) Genen.If a construct according to the invention is a transcription activator includes, it is sometimes sufficient to do this do not introduce activatable gene, provided it is more natural is present in the microorganism according to the invention. If, on the other hand, no transcription activator is used, so a plurality of copies of the gene must be inserted the, i. e. contains the microorganism according to the invention ultimately a majority of these (natural and / o the artificial and / or foreign) genes.

Eine modifizierte Sequenz ist in zumindest einem Nukleotid verändert.A modified sequence is in at least one nucleotide changed.

Das Einschleusen eines Nukleinsäurekonstrukts kann nach allen dem Fachmann vertrauten Methoden, beispielsweise Transformation, Transfektion, Lipofektion, Konjugation oder Kreuzung erfolgen. In letzterem Fall ist das Nuklein säurekonstrukt bereits in das Genom eines (anderen) Mikro organismus integriert.A nucleic acid construct can be introduced after all methods familiar to the person skilled in the art, for example Transformation, transfection, lipofection, conjugation or crossing. In the latter case, that's the nucleus acid construct already in the genome of a (different) micro organism integrated.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Aus führungsformen darstellenden Beispielen näher erläutert.In the following, the invention is based on only Aus examples illustrating management forms explained in more detail.

example 1 Preparation of a plasmid according to the invention

Folgend wird die Klonierung eines erfindungsgemäßen Plas mids beschrieben. Als Ausgangsplasmid wurde YEP358 (siehe Myers, A. M., Tzagoloff, A., Kinney, D. M., Lusty, C. J. (1986): Yeast shuttle and integrative vectors with multi ple cloning sites suitable for construction of lacZ fusi ons. Gene 45, 299-310) eingesetzt. Aus dem replikativen Vektor YEP358 wurde über Restriktion mit PvuII und darauf folgende Selbstligation das lacZ Gen entfernt. Das resul tierende Plasmid wird mit YEP358-2 bezeichnet und ist in der Fig. 1 dargestellt.The cloning of a plasmid according to the invention is described below. YEP358 (see Myers, AM, Tzagoloff, A., Kinney, DM, Lusty, CJ (1986): Yeast shuttle and integrative vectors with multi ple cloning sites suitable for construction of lacZ fusi ons. Gene 45, 299-310 ) used. The lacZ gene was removed from the replicative vector YEP358 by restriction with PvuII and subsequent self-ligation. The resulting plasmid is designated YEP358-2 and is shown in FIG. 1.

Das SSU1-Gen, die codierende Sequenz (CDS) des MET14-Gens sowie der HSP26-Promotor wurden über PCR hergestellt. Durch die Primer wurden Fragmente mit folgenden endständi gen Restriktionsschnittstellen erzeugt:
The SSU1 gene, the coding sequence (CDS) of the MET14 gene and the HSP26 promoter were produced by PCR. Fragments with the following terminal restriction sites were generated by the primers:

SSU1 (promoter and CDS): BamHI / EcoRI
HSP26 promoter: EcoRI / NcoI
- MET14 (CDS): NcoI / HindIII

Als Primer wurden eingesetzt:
MET14 A: 5'-CACCCATGGCTACTAATATTACTTG-3'
MET14 E: 5'-TATAAGCTTGCAAGCTCGGTTGAACAC-3'
HSP26 A: 5'-GGGGAATTCCAGTAGAAGGACATCGTTG-3'
HSP26 E: 5'-GGGAAGCTTGCCATGGTAATTTGTTTAGTTTGTTTG-3'
SSUI A 5'-CGGATCCAACAAGCCGACCCCTC-3'
SSUI E 5'-GGAATTCCTACATGAAATGCTTGCCATG-3' The following were used as primers:
MET14 A: 5'-CACCCATGGCTACTAATATTACTTG-3 '
MET14 E: 5'-TATAAGCTTGCAAGCTCGGTTGAACAC-3 '
HSP26 A: 5'-GGGGAATTCCAGTAGAAGGACATCGTTG-3 '
HSP26 E: 5'-GGGAAGCTTGCCATGGTAATTTGTTTAGTTTGTTTG-3 '
SSUI A 5'-CGGATCCAACAAGCCGACCCCTC-3 '
SSUI E 5'-GGAATTCCTACATGAAATGCTTGCCATG-3 '

Die PCR-Reaktion wurde gemäß dem folgenden Programm durchgeführt:
The PCR reaction was carried out according to the following program:

Die PCR Fragmente wurden in das Plasmid YEP358-2 folgen dermaßen kloniert:
The PCR fragments were cloned into the plasmid YEP358-2 as follows:

1. The HSP26 promoter was over Ncol in the cloning plasmid pBluescript SK (+) (Stratagene) before the co dating sequence of the MET14 gene cloned.
2. The newly formed HSP26 / MET14 fragment was cut out of the Bluescript vector via EcoRI / HindIII and ligated into the plasmid YEP358-2. The plasmid obtained in this way is called YEP26-14 and is shown in FIG. 2.
3. The SSU1 gene was cloned into the plasmid YEP358-2 via BamHI / EcoRI. The plasmid thus obtained is called YEPS1 and is shown in FIG. 3.
4. The HSP26 / MET14 fragment was excised from the Bluescript vector via XhoI / BamHI and cloned into the plasmid YEPS1 via SalI / BamHI (XhoI and SalI produce the same overhanging ends). The plasmid thus obtained is called YEPS1 / 26-14 and is shown in FIG. 4.

Example 2 Production of an inventive microorganism

Es wurde der folgende Stamm transformiert:
The following strain was transformed:

Die Hefe wurden durch Elektroporation (siehe Becker, D. M., Guarente, L. (1991): High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Meth. Enzymol. 194, 182-187) mit dem Plasmid YEPS1/26-14 transformiert. Die Selektion er folgt auf Minimalmedium ohne Uracil (URA3 als Selektions marker). Die erhaltenen Mikroorganismen werden L3/YEPS1/26-14 genannt.The yeast was made by electroporation (see Becker, D. M., Guarente, L. (1991): High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Meth. Enzymol. 194, 182-187) with the plasmid YEPS1 / 26-14 transformed. The selection he follows minimal medium without uracil (URA3 as selection marker). The microorganisms obtained are L3 / YEPS1 / 26-14 called.

Example 3 Production of comparison microorganisms.

Es wurde in einem dem Beispiel 2 identischen Weise gear beitet, mit der Ausnahme, daß Transformation jeweils mit den Plasmiden YEP358-2, YEP26-14 oder YEPS1 erfolgte. So wurden Mikroorganismen erhalten, die weder Überexpression von MET14 noch von SSU1 zeigten (L3/YEP358-2), Mikroorga nismen, die Überexpression von MET1 nicht jedoch von SSU1 zeigten (L3/YEP26-14) und Mikroorganismen, die Überexpres sion von SSU1, nicht jedoch von MET14 zeigten (L3/YEPS1). Weiterhin wurde zu Vergleichszwecken der untransformierte Stamm (L3) eingesetzt. It was geared in a manner identical to Example 2 works with the exception that transformation with the plasmids YEP358-2, YEP26-14 or YEPS1. So microorganisms were obtained which were neither overexpression from MET14 still from SSU1 (L3 / YEP358-2) showed, Mikroorga nisms, the overexpression of MET1 but not of SSU1 showed (L3 / YEP26-14) and microorganisms that overexpress SSU1, but not MET14 (L3 / YEPS1). Furthermore, the untransformed was used for comparison purposes Strain (L3) used.

Example 4 Carrying out measurements for sulfite formation with microorganisms.

Mit den Mikroorganismen aus den Beispielen 2 und 3 wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt.With the microorganisms from Examples 2 and 3 carried out the following investigations.

Verschiedene erfindungsgemäße Klone aus der Selektion nach Beispiel 2 wurden in B-Medium (siehe Cherst, H., Surdin- Kerjan, Y. (1992): Genetic analysis of a new mutation con ferring cysteine auxotrophy in Saccharomyces cerevisiae: updating of the sulfur metabolism pathway. Genetics 130, 51-58) angezogen und auf ihr Sulfitbildungsvermögen gete stet. Aus einer Übernachtkultur wurden je 20 ml B-Medium mit einer OD600 nm = 0,5 angeimpft und bei 30°C aerob ge schüttelt. Nach 24 h wurde die OD600 nm und das Sulfit im Kulturüberstand gemessen. Die Sulfitmessung erfolgte mit einem enzmatischen Sulfit-Test-Kit (Fa. r-Biopharm). In der Fig. 5 erkennt man, daß erhaltenen Klone durchweg eine beachtlich erhöhte Sulfitbildung zeigten. Die Erhö hung varierte zwischen einem Faktor von ca. 3-4 bis zu mehr als 10. In der Fig. 6 sind Mittelwerte der drei be sten Klone der Fig. 5 dargestellt.Various clones according to the invention from the selection according to Example 2 were in B medium (see Cherst, H., Surdin-Kerjan, Y. (1992): Genetic analysis of a new mutation with ferring cysteine auxotrophy in Saccharomyces cerevisiae: updating of the sulfur metabolism pathway.Genetics 130, 51-58) and their sulfite formation ability was determined. 20 ml of B medium were inoculated with an OD600 nm = 0.5 from an overnight culture and shaken aerobically at 30 ° C. After 24 h the OD600 nm and the sulfite in the culture supernatant were measured. The sulfite measurement was carried out using an enzmatic sulfite test kit (from r-Biopharm). In Fig. 5 it can be seen that clones obtained consistently showed a considerably increased sulfite formation. The increase varied between a factor of approx. 3-4 up to more than 10. In FIG. 6, mean values of the three best clones of FIG. 5 are shown.

Mit einem ausgewählten erfindungsgemäßen Klon wurden Gär versuche durchgeführt und mit Gärversuchen verglichen, die mit Mikroorganismen aus dem Beispiel 3 durchgeführt worden waren. Die Gärversuche wurden in Erlenmeyerkolben mit Gär aufsätzen durchgeführt Die Gärung erfolgte in je 250 ml B-Medium bzw. Würze. Es wurde aus einer Übernachtkultur eine Ausgangszellzahl von 1.107 Zellen/ml eingestellt. Zu den Probenahmezeiten wurde die OD600 nm und der pH-Wert gemessen, die Zellen abzentrifugiert und die Probenüber stände für die Sulfitmessungen bei -20°C aufbewahrt. With a selected clone according to the invention, fermentation attempts carried out and compared with fermentation tests, the with microorganisms from Example 3 were. The fermentation tests were carried out in Erlenmeyer flasks with fermentation The fermentation took place in 250 ml B medium or wort. It grew out of an overnight culture an initial cell number of 1,107 cells / ml was set. To the sampling times were the OD600 nm and the pH measured, the cells centrifuged and the samples over Stands for sulfite measurements kept at -20 ° C.

Es zeigt sich aus der Fig. 7, daß durch Überexpression von MET14 in Kombination mit SSU1 die Mikroorganismen bzw. Hefen die 4-10fache Sulfitmenge bilden können. Die Stämme, die nur entweder MET14 oder SSUI überexprimieren, zeigen dagegen eine deutlich schwächere bzw. keine Erhöhung in der Sulfitbildung im Vergleich zu dem erfindungsgemäßen Stamm, der beide Gene überexprimieren. Da das MET14-Gen unter der Kontrolle eines Promoters ist, der unabhängig von der Aminosäurezusammensetzung des Mediums funktio niert, ist die von den Hefen gebildete Sulfitmenge (pro Zellzahl) in B-Medium und in Würze vergleichbar.It can be seen from FIG. 7 that the overexpression of MET14 in combination with SSU1 enables the microorganisms or yeasts to form 4-10 times the amount of sulfite. The strains which only overexpress either MET14 or SSUI, on the other hand, show a significantly weaker or no increase in sulfite formation compared to the strain according to the invention which overexpresses both genes. Since the MET14 gene is under the control of a promoter that functions independently of the amino acid composition of the medium, the amount of sulfite formed by the yeast (per cell number) in B medium and in wort is comparable.

Claims

1. Nucleic acid construct with at least one for one Pro-increasing sulfite formation in a microorganism tein or enzyme coding first partial sequence and with one for the transport of sulfite from a cell increasing protein or enzyme encoding second Subsequence.

2. Nucleic acid construct according to claim 1 with at least one the first part sequence and / or the second part sequence-controlling promoter sequence, preferably selected from the group consisting of "HSP genes, SSA- Genes, HSP26, HSP30, YPG1, HXK1, MOL1 (TH14), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4, HSP12, HSP78, HSP104, ADH1, ADH2, PGK and GAP ".

3. Nucleic acid construct according to claim 1 or 2, wherein the the first partial sequence is selected from the group of Yeast genes consisting of "MET 14, MET 16, from above the genes different genes, which for APS kinase un encode d / or PAPS reductase activity, and homologs or alleles of such genes ", preferably from saccharomy ces cerevisiae, most preferably MET14, optional to additionally MET16, from Saccharomyces cerevisiae.

4. nucleic acid construct according to one of claims 1 to 3, wherein the second partial sequence is selected from the Group of yeast genes consisting of "SSU1, FZF1, FZF1-4, genes different from the above genes, which for a coding for sulfite transport from a cell Protein or a transcriptional activator of a sol Chen encode protein, and homologs or alleles sol cher genes ", preferably from Saccharomyces cerevisiae.

5. Nucleic acid construct according to one of claims 1 to 4, where the first partial sequence, the second partial sequence and / or the promoter sequence each independently other in one copy or a plurality of copies are set up.

6. nucleic acid construct according to one of claims 1 to 5, where the first partial sequence, the second partial sequence and / or the promoter sequence by substitution, insert on, deletion, inversion and / or addition modified is.

7. Nucleic acid construct according to one of claims 1 to 6 in linear or circular form.

8. Microorganism in which a nucleic acid construct is introduced according to one of claims 1 to 7.

9. A microorganism according to claim 8, which is a yeast or a bacterium, preferably a yeast strain of the genus Saccharomyces, Brettanomyces or Kluyveromyces, most preferably a species selected from the group consisting of "Saccharomyces cerevisiae, upper or bottom-fermented brewing yeast, wine yeast, champagne yeast, sake yeast, Sherry yeast, distillery yeast, or bakery yeast ".

10. Microorganism according to claim 8 or 9, wherein the Se sequences of the nucleic acid construct in episomal form or be integrated into the genome.

11. Process for the preparation of a microorganism one of claims 8 to 10, wherein the nucleic acid constructed according to one of claims 1 to 7 in one natural or modified basic microorganism is smuggled in.

12. Use of a microorganism according to one of the An sayings 8 to 10 for the production of food or Beverages obtained using at least one fermentation process stage are available, the microorganism in the Fermentation process stage is used.

13. Use according to claim 12, wherein several under different microorganisms according to one of claims 8 to 10, optionally together with different ones Microorganisms are used.