DE10112107A1 - Preparing L-amino acids, particularly L-threonine, for use in pharmaceutical and in food industries, comprises employing the microorganisms of the Enterobacteriaceae family for fermentation in which the poxB gene is attenuated - Google Patents

Preparing L-amino acids, particularly L-threonine, for use in pharmaceutical and in food industries, comprises employing the microorganisms of the Enterobacteriaceae family for fermentation in which the poxB gene is attenuated

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Abstract

Fermentative preparation of L-amino acids, particularly L-threonine, comprises fermentation of the microorganisms of the Enterobacteriaceae family which produce the desired L-amino acids and in which the poxB gene or nucleotide sequences which code for it are attenuated, preferably eliminated. The fermentative preparation of L-amino acids, particularly L-threonine, comprises: (a) fermentation of the microorganisms of the Enterobacteriaceae family which produce the desired L-amino acids and in which the poxB gene of nucleotide sequences which code for it are attenuated, preferably eliminated; (b) concentration of the L-amino acid in the medium or in the cells of the bacteria; and (c) isolation of the L-amino acid. Independent claims are also included for the following: (1) a microorganism of the Enterobacteriaceae family which produces L-amino acids in which the poxB gene or nucleotide sequences which code for it are attenuated, particularly eliminated, and which have a resistance to alpha -amino- beta -hydroxyvaleric acid and optionally a compensatable partial need for L-isoleucine; (2) the Escherichia coli K-12 strain MG244 DELTA posB deposited at the Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany) under number DSM 13762; (3) plasmid pMAK705 DELTA poxB which contains parts of the 5' and 3' region of the poxB gene comprising a sequence of 1454 base pairs (bp), given in the specification; (4) plasmids pMW218gdhA and pMW219rhtC fully described in the specification; (5) an isolated polynucleotide from microorganisms of the Enterobacteriaceae family containing a polynucleotide sequence which codes for the 5' and 3' region of the poxB gene comprising a sequence of 1448 bp, given in the specification, as a constituent of plasmids for position-specific mutagenesis of the poxB gene; and (6) a strain of the Enterobacteriaceae family, which produces L-threonine and contains a mutation in the poxB gene corresponding to a defined 1448 bp sequence, given in the specification.

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, L- Lysin und L-Valin, unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae, in denen das poxB-Gen abgeschwächt wird.This invention relates to a method of fermentative Production of L-amino acids, in particular L-threonine, L- Lysine and L-valine, using family strains Enterobacteriaceae in which the poxB gene is weakened becomes.

Stand der TechnikState of the art

L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, L-Lysin und L- Valin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.L-amino acids, especially L-threonine, L-lysine and L- Valine, found in human medicine and in the pharmaceutical industry, in the food industry and especially in animal nutrition application.

Es ist bekannt L-Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli (E. coli) und Serratia marcescens, herzustellen. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.L-amino acids are known from fermentation of strains the Enterobacteriaceae, especially Escherichia coli (E. coli) and Serratia marcescens. Because of the great importance is constantly attached to the improvement of Manufacturing process worked. process improvements can take fermentation measures such. B. Stirring and supply of oxygen, or the composition of the Culture media such as B. the sugar concentration during the Fermentation, or processing to product form, by z. B. ion exchange chromatography, or the intrinsic Performance characteristics of the microorganism itself affect.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie z. B. L-Threonin produzieren.To improve the performance characteristics of this Microorganisms become methods of mutagenesis, selection and mutant selection applied. This way you get Strains resistant to antimetabolites such as B. that Threonine analog α-amino-β-hydroxyvaleric acid (AHV) or are auxotrophic for regulatory metabolites and L-amino acids such as B. Produce L-threonine.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäuren produzierender Stämme der Familie Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion untersucht.Methods of recombinant DNA technology for strain improvement L-  Strains of the family producing amino acids Enterobacteriaceae used by individual Amino acid biosynthesis genes amplified and the impact examined for production.

Aufgabe der ErfindungObject of the invention

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, L-Lysin und L-Valin, bereitzustellen.The inventors set themselves the task of creating new ones Measures to improve the fermentative production of L- Amino acids, in particular L-threonine, L-lysine and L-valine, provide.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits L- Threonin produzieren, und in denen die für das Enzym Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.2.2) kodierende Nukleotidsequenz (poxB-Gen) abgeschwächt wird.The invention relates to a method for fermentative production of L-amino acids, in particular L-threonine, using microorganisms from the Family Enterobacteriaceae, which in particular already L- Produce threonine, and those for the enzyme Pyruvate oxidase (EC 1.2.2.2) coding nucleotide sequence (poxB gene) is weakened.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym (Protein) oder Gen inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.The term "weakening" describes in this Context the reduction or elimination of intracellular activity of one or more enzymes (Proteins) in a microorganism caused by the corresponding DNA can be encoded, for example by uses a weak promoter or a gene or allele, that for a corresponding enzyme with a low Activity coded or the corresponding enzyme (protein) or gene inactivated and, if necessary, these measures combined.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:
The process is characterized in that the following steps are carried out:

  • a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen zumindest das poxB-Gen abgeschwächt wird, a) Fermentation of family microorganisms Enterobacteriaceae, in which at least the poxB gene is weakened  
  • b) Anreicherung der entsprechenden L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, undb) Enrichment of the corresponding L-amino acid in the Medium or in the cells of the microorganisms Family Enterobacteriaceae, and
  • c) Isolieren der gewünschten L-Aminosäure.c) isolating the desired L-amino acid.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, gegebenenfalls Stärke, gegebenenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.The microorganisms that are the subject of the present L-amino acids from glucose, Sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, optionally starch, optionally cellulose or Make glycerin and ethanol. It is a matter of Representatives of the Enterobacteriaceae family, selected from the genera Escherichia, Erwinia, Providencia and Serratia. The genera Escherichia and Serratia are prefers. In the genus Escherichia is particularly Kind Escherichia coli and in the genus Serratia especially the species Serratia marcescens.

Geeignete, insbesondere L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132.Suitable, in particular L-threonine-producing strains of the genus Escherichia, in particular of the type Escherichia coli, are for example
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetic MG442
Escherichia coli VNIIgenetics M1
Escherichia coli VNIIgenetics 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132.

Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens sind beispielsweise
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000. Suitable strains of the genus Serratia, in particular of the species Serratia marcescens, which produce L-threonine are, for example
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000.

L-Threonin produzierende Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt, unter anderen, ein oder mehrere der genetischen bzw. phänotypischen Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β- Hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α- Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valin-Analoga wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedürftigkeit für L-Methionin, gegebenenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin, Bedürftigkeit für meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich Threonin-haltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L- Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L- Valin, Empfindlichkeit gegenüber Fluoropyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung, Verstärkung des Threonin-Operons, Verstärkung der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I bevorzugt der feed back resistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Aspartatsemialdehyd- Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat- Carboxylase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genproduktes, Verstärkung des RhtC-Genproduktes, Verstärkung des YfiK- Genproduktes, Verstärkung einer Pyruvat-Carboxylase, und Abschwächung der Essigsäurebildung. L-threonine-producing strains from the Enterobacteriaceae preferably have, among others or more of the genetic or phenotypic traits selected from the group: resistance to α-amino-β- Hydroxyvaleric acid, resistance to thialysine, resistance against ethionine, resistance against α-methylserine, resistance against diamino succinic acid, resistance against α- Aminobutyric acid, resistance to borrelidine, resistance against rifampicin, resistance to valine analogues such as for example valine hydroxamate, resistance to Purine analogs such as 6-dimethylaminopurine, Need for L-methionine, partial and if necessary Compensable need for L-isoleucine, need for meso-diaminopimelic acid, auxotrophy related Dipeptides containing threonine, resistance to L-threonine, Resistance to L-homoserine, resistance to L-lysine, Resistance to L-methionine, resistance to L- Glutamic acid, resistance to L-aspartate, resistance to L-leucine, resistance to L-phenylalanine, resistance to L-serine, resistance to L-cysteine, resistance to L- Valine, sensitivity to fluoropyruvate, defective Threonine dehydrogenase, optionally ability to Sucrose utilization, enhancement of the threonine operon, Enhancement of homoserine dehydrogenase I aspartate kinase I prefers the feed back resistant form, reinforcement of the Homoserine kinase, enhancement of threonine synthase, Enhancement of the aspartate kinase, possibly the feed back resistant form, reinforcement of aspartate semialdehyde Dehydrogenase, enhancement of phosphoenolpyruvate Carboxylase, optionally the feed-back-resistant form, Enhancement of phosphoenolpyruvate synthase, enhancement transhydrogenase, enhancement of the RhtB gene product, Enhancement of the RhtC gene product, enhancement of the YfiK Gene product, enhancement of a pyruvate carboxylase, and Attenuation of acetic acid formation.  

Es wurde gefunden, daß Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae nach Abschwächung, insbesondere Ausschaltung des für die Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.2.2) kodierenden poxB-Gens in verbesserter Weise L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin produzieren.It has been found that family microorganisms Enterobacteriaceae after weakening, in particular Switching off for pyruvate oxidase (EC 1.2.2.2) encoding poxB gene in an improved manner L-amino acids, especially produce L-threonine.

Darüber hinaus wurde gefunden, daß Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae nach Abschwächung, insbesondere Ausschaltung des für die Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.2.2) kodierenden poxB-Gens geringere Konzentrationen des unerwünschten Nebenproduktes Essigsäure bilden.In addition, it was found that microorganisms of the Enterobacteriaceae family after weakening, especially Switching off for pyruvate oxidase (EC 1.2.2.2) encoding poxB gene lower concentrations of undesirable by-product form acetic acid.

Die Nukleotidsequenz des poxB-Gens von Escherichia coli wurde von Grabau und Cronan (Nucleic Acids Research. 14 (13), 5449-5460 (1986)) publiziert und kann ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997)) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli unter der Accession Number AE000188 entnommen werden. Die Nukleotidsequenz des poxB-Gens von Escherichia coli ist in SEQ ID No. 1 und die Aminosäuresequenz des dazugehörigen Genproduktes in SEQ ID No. 2 dargestellt.The nucleotide sequence of the poxB gene from Escherichia coli was developed by Grabau and Cronan (Nucleic Acids Research. 14 (13), 5449-5460 (1986)) and can also be the by Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997)) published genome sequence of Escherichia coli under the Accession number AE000188. The The nucleotide sequence of the poxB gene from Escherichia coli is shown in SEQ ID No. 1 and the corresponding amino acid sequence Gene product in SEQ ID No. 2 shown.

Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen poxB-Gene können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des poxB-Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.The poxB genes described in the specified passages can be used according to the invention. Can continue Alleles of the poxB gene that result from the Degeneracy of the genetic code or through Functionally neutral sense mutations result.

Zur Erzielung einer Abschwächung können beispielsweise die Expression des poxB-Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Enzymproteins herabgesetzt bzw. ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.For example, to achieve a weakening Expression of the poxB gene or the catalytic Properties of the enzyme protein reduced or turned off. If necessary, both measures be combined.

Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung, durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression oder auch durch Antisense-RNA Technik erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem beispielsweise bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), bei Carrier und Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999), Franch und Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164 (2000)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie beispielsweise dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).The reduction in gene expression can be reduced by appropriate Culture management, through genetic modification (mutation) of the Signal structures of gene expression or through  Antisense RNA technology is used. Signal structures of the Gene expression is, for example, repressor genes, Activator genes, operators, promoters, attenuators, Ribosome binding sites, the start codon and terminators. The person skilled in the art will find information on this among other things for example at Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)) by Carrier and Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999), Franch and Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164 (2000)) and in well-known textbooks of genetics and Molecular biology such as the textbook by Knippers ("Molecular Genetics", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) or that of Winnacker ("Genes and Clones", VCH publishing company, Weinheim, Germany, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 5511-5515 (1998), Wente und Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.Mutations that lead to a change or reduction in the lead catalytic properties of enzyme proteins are known from the prior art. Examples are the Works by Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 5511-5515 (1998), Wente and Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991). Summary Representations can be found in well-known textbooks of genetics and Molecular biology such as B. that of Hagemann ("General Genetics ", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) become.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), die dazu führen, daß falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.Transitions, transversions, Insertions and deletions are considered. In dependence of the effect of amino acid exchange on the Enzyme activity is caused by false sense mutations ("missense mutations ") or nonsense mutations" spoken. Insertions or deletions of at least a base pair in a gene lead to Frame shift mutations,  which lead to the incorporation of wrong amino acids or the translation is terminated prematurely. Deletions of multiple codons typically result in one complete loss of enzyme activity. Instructions for Generation of such mutations are part of the prior art Technology and can be known textbooks of genetics and Molecular biology such as B. Knippers' textbook ("Molecular Genetics", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), that of Winnacker ("Gene and Clones ", VCH publishing company, Weinheim, Germany, 1990) or that of Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Ein Beispiel für ein Plasmid, mit Hilfe dessen das poxB-Gen von Escherichia coli durch ortsspezifische Mutagenese abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet werden kann, ist das Plasmid pMAK705ΔpoxB (Fig. 1). Es enthält neben Resten von Polylinkersequenzen lediglich einen Teil der 5'- und einen Teil der 3'-Region des poxB-Gens. Ein 340 bp langer Abschnitt der Kodierregion fehlt (Deletion). Die Sequenz dieser für die Mutagenese des poxB-Gens einsetzbaren DNA ist in SEQ ID No. 3 dargestellt.An example of a plasmid by means of which the poxB gene from Escherichia coli can be attenuated, in particular switched off, by site-specific mutagenesis is the plasmid pMAK705ΔpoxB ( FIG. 1). In addition to residues of polylinker sequences, it contains only part of the 5 'and part of the 3' region of the poxB gene. A 340 bp section of the coding region is missing (deletion). The sequence of this DNA, which can be used for the mutagenesis of the poxB gene, is shown in SEQ ID No. 3 shown.

Die Deletionsmutation des poxB-Gens kann durch Gen- bzw. Allelaustausch in geeignete Stämme eingebaut werden.The deletion mutation of the poxB gene can be Allele exchange can be built into suitable strains.

Eine gebräuchliche Methode ist die von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)) beschriebene Methode des Genaustauschs mit Hilfe eines konditional replizierenden pSC101-Derivates pMAK705. Andere im Stand der Technik beschriebene Methoden wie beispielsweise die von Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)) oder die von Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)) können gleichfalls benutzt werden. A common method is that of Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)) described method of gene exchange using a conditionally replicating pSC101 derivative pMAK705. Other methods described in the prior art such as for example, that of Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)) or that of Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)) can also be used.  

Nach erfolgtem Austausch liegt in dem betreffenden Stamm die in SEQ ID No. 4 dargestellte Form des ΔpoxB-Allels vor, die ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist.After the exchange has taken place, it lies in the trunk concerned those in SEQ ID No. 4 presented form of the ΔpoxB allele, which is also the subject of the invention.

Es ist ebenfalls möglich, Mutationen im poxB-Gen oder Mutationen, die die Expression des poxB-Gens betreffen, durch Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.It is also possible to find mutations in the poxB gene or Mutations affecting the expression of the poxB gene by conjugation or transduction into different strains to convict.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des poxB-Gens ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid- Phosphat zu verstärken.It can also be used for the production of L-amino acids, especially L-threonine with strains of the family Enterobacteriaceae may be beneficial in addition to Weakening the poxB gene one or more enzymes of the known threonine biosynthetic pathway or enzymes of anaplerotic metabolism or enzymes for the Production of reduced nicotinamide adenine dinucleotide To reinforce phosphate.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.The term "reinforcement" describes in this context the increase in the intracellular activity of one or several enzymes or proteins in a microorganism that can be encoded by the appropriate DNA by using for example the number of copies of the gene or genes increases, uses a strong promoter or a gene that for a corresponding enzyme or protein with a high Activity encodes and, if necessary, these measures combined.

So können beispielsweise gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
For example, one or more of the genes selected from the group can be used simultaneously

  • - das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon (US-A-4,278,765),- that for aspartate kinase, homoserine dehydrogenase, encoding homoserine kinase and threonine synthase thrABC-Operon (US-A-4,278,765),
  • - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE-A-198 31 609), - The pyc gene coding for the pyruvate carboxylase (DE-A-198 31 609),  
  • - das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps- Gen (Molecular and General Genetics 231: 332 (1992)),The pps coding for the phosphoenolpyruvate synthase Gen (Molecular and General Genetics 231: 332 (1992)),
  • - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen (Gene 31: 279-283 (1984)),- The coding for the phosphoenolpyruvate carboxylase ppc gene (Gene 31: 279-283 (1984)),
  • - die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),The genes coding for the transhydrogenase pntA and pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
  • - das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB (EP-A-0 994 190),- the gene that mediates homoserine resistance rhtB (EP-A-0 994 190),
  • - das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo- Gen (DE 100 34 833.5),- that for the malate: mqo- encoding quinone oxidoreductase Gene (DE 100 34 833.5),
  • - das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC (EP-A-1 013 765),- the gene mediating threonine resistance rhtC (EP-A-1 013 765),
  • - das für den Threoninexport kodierende thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum (DE 100 26 494.8) und- The thrE gene coding for threonine export from Corynebacterium glutamicum (DE 100 26 494.8) and
  • - das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983))- the gdhA gene coding for glutamate dehydrogenase (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983))

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.amplified, especially overexpressed.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des poxB-Gens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
Furthermore, it can be advantageous for the production of L-amino acids, in particular L-threonine, in addition to the attenuation of the poxB gene, one or more of the genes selected from the group

  • - das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen (Ravnikar und Somerville, Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),- the tdh gene coding for threonine dehydrogenase (Ravnikar and Somerville, Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
  • - das für die Malat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.37) kodierende mdh-Gen (Vogel et al., Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)), - that for malate dehydrogenase (E.C. 1.1.1.37) coding mdh gene (Vogel et al., Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)),  
  • - das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA),- the gene product of the open reading frame (orf) yjfA (National Center for Accession Number AAC77180 Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA),
  • - das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) und- the gene product of the open reading frame (orf) ytfP (National Center for Accession Number AAC77179 Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) and
  • - das für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (Medina et al. (Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990))- That for the enzyme phosphoenolpyruvate carboxykinase coding pckA gene (Medina et al. (Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990))

abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.weaken, in particular switch off or To decrease expression.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des poxß-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).It can also be used for the production of L-amino acids, L-threonine in particular may be advantageous in addition to Attenuation of the poxß gene undesirable side reactions (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms ", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch - Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.The microorganisms produced according to the invention can in batch process (batch cultivation), in fed batch (Feed process) or in the repeated fed batch process (repetitive feed process) can be cultivated. A Summary of known cultivation methods are in the Textbook by Chmiel (Bioprocess Engineering 1. Introduction to Bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.The culture medium to be used must be in a suitable manner The requirements of the respective tribes meet. descriptions of culture media of various microorganisms are in "Manual of Methods for General Bacteriology" of the  American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981) included.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und gegebenenfalls Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.Sugar and carbohydrates such as z. B. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, Molasses, starch and possibly cellulose, oils and fats such as B. soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, Fatty acids such as B. palmitic acid, stearic acid and Linoleic acid, alcohols such as B. glycerin and ethanol and organic acids such as B. acetic acid can be used. These substances can be used individually or as a mixture become.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.Organic nitrogen-containing can be used as the nitrogen source Compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, Malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, Ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate can be used. The nitrogen sources can be used individually or as a mixture.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.Phosphoric acid, Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts are used. The culture medium must continue to salts of metals included, such as B. magnesium sulfate or iron sulfate, the are necessary for growth. Finally, you can essential growth substances such as amino acids and vitamins in addition to the substances mentioned above. Suitable precursors can also be used in the culture medium be added. The feedstocks mentioned can be used for Culture added in the form of a unique approach or appropriately fed during cultivation become.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L- Aminosäuren bzw. L-Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.Basic compounds are used to control the pH of the culture such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or Ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid  or sulfuric acid used in a suitable manner. to Antifoam agents such as z. B. fatty acid polyglycol esters. to Maintaining the stability of plasmids can do that Medium suitable selectively acting substances such. B. Antibiotics to be added. To aerobic conditions maintain oxygen or oxygen containing gas mixtures such. B. Air into culture entered. The temperature of the culture is usually at 25 ° C to 45 ° C and preferably at 30 ° C to 40 ° C. The Culture continues until a maximum of L- Has formed amino acids or L-threonine. That goal will usually within 10 hours to 160 hours reached.

Die Analyse von L-Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.The analysis of L-amino acids can be done by Anion exchange chromatography with subsequent Ninhydrin derivatization take place, as in Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190), or it can be done by reversed phase HPLC, such as in Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

Eine Reinkultur des Escherichia coli K-12 Stammes DHSα/pMAK705 wurde am 12. September 2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag als DSM 13720 hinterlegt.A pure culture of the Escherichia coli K-12 strain DHSα / pMAK705 was on September 12, 2000 at the German Collection for microorganisms and cell cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) according to the Budapest Treaty as DSM 13720 deposited.

Eine Reinkultur des Escherichia coli K-12 Stammes MG442ΔpoxB wurde am 02. Oktober 2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag als DSM 13762 hinterlegt.A pure culture of the Escherichia coli K-12 strain MG442ΔpoxB was with the German on October 2nd, 2000 Collection for microorganisms and cell cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) according to the Budapest Treaty as DSM 13762 deposited.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, wie z. B. L-Threonin, L- Isoleucin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin.The method according to the invention is used for fermentative purposes Production of L-amino acids, such as B. L-threonine, L-  Isoleucine, L-valine, L-methionine, L-homoserine and L-lysine, especially L-threonine.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The present invention is described below with reference to Exemplary embodiments explained in more detail.

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung werden nach Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wird, wenn nicht anders beschrieben, nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, USA (1989) 86: 2172-2175) durchgeführt.The isolation of plasmid DNA from Escherichia coli as well all restriction, Klenow and alkaline techniques Phosphatase treatment are according to Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). The transformation of Escherichia coli, unless otherwise stated, according to Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, USA (1989) 86: 2172-2175).

Die Bebrütungstemperatur bei der Herstellung von Stämmen und Transformanten ist 37°C. Bei dem Genaustauschververfahren nach Hamilton et. al werden Temperaturen von 30°C und 44°C verwendet.The incubation temperature in the manufacture of strains and transformants is 37 ° C. In which Gene exchange method according to Hamilton et. al be Temperatures of 30 ° C and 44 ° C are used.

Beispiel 1example 1 Konstruktion der Deletionsmutation des poxB-GensConstruction of the deletion mutation of the poxB gene

Teile der 5'- und 3'-Region des poxB-Gens werden aus Escherichia coli K12 unter Anwendung der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) sowie synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nukletidsequenz des poxB- Gens in E. coli K12 MG1655 (SEQ ID No. 1) werden folgende PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
Parts of the 5 'and 3' region of the poxB gene are amplified from Escherichia coli K12 using the polymerase chain reaction (PCR) and synthetic oligonucleotides. Starting from the nucletide sequence of the poxB gene in E. coli K12 MG1655 (SEQ ID No. 1) the following PCR primers are synthesized (MWG Biotech, Ebersberg, Germany):

Die für die PCR eingesetzte chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA wird nach Herstellerangaben mit "Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ca. 500 Basenpaare (bp) grosses DNA-Fragment aus der 5'-Region des poxB-Gens (mit poxB1 bezeichnet) und ein ca. 750 bp grosses DNA-Fragment aus der 3'-Region des poxB-Gens (mit poxB2 bezeichnet) kann mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit der Taq-DNA-Polymerase (Gibco-BRL, Eggenstein, Deutschland) amplifiziert werden. Die PCR-Produkte werden den Herstellerangaben entsprechend jeweils mit dem Vektor pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in den E. coli Stamm TOP10F' transformiert.The chromosomal E. coli K12 MG1655 used for the PCR According to the manufacturer, DNA is labeled "Qiagen Genomic-tips 100 / G "(QIAGEN, Hilden, Germany) isolated. An approx. 500 Base pairs (bp) large DNA fragment from the 5 'region of the poxB gene (designated poxB1) and an approximately 750 bp in size DNA fragment from the 3 'region of the poxB gene (with poxB2 ) with the specific primers under Standard PCR conditions (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) with the Taq DNA polymerase (Gibco-BRL, Eggenstein, Germany) are amplified. The PCR products are according to the manufacturer's instructions, each with the vector pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Netherlands) ligated and into the E. coli strain TOP10F ' transformed.

Die Selektion Plasmid tragender Zellen erfolgt auf LB Agar, der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt ist. Nach der Plasmid DNA Isolierung wird der Vektor pCR2.1TOPOpoxB1 mit den Restriktionsenzymen Ech136II und XbaI gespalten und das poxB1-Fragment nach der Auftrennung im 0,8%igen Agarosegel mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pCR2.1TOPOpoxB2 wird nach der Plasmid DNA Isolierung mit den Enzymen EcoRV und XbaI gespalten und mit dem isolierten poxB1-Fragment ligiert. Der E. coli Stamm DH5α wird mit dem Ligationsansatz transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt ist, selektioniert. Nach der Plasmid DNA Isolierung werden durch die Kontrollspaltung mit den Enzymen HindIII und XbaI solche Plasmide nachgewiesen, in denen die in SEQ ID No. 3 dargestellte mutagene DNA Sequenz kloniert vorliegt. Eines der Plasmide wird als pCR2.1TOPOΔpoxB bezeichnet. Plasmid-carrying cells are selected on LB agar, which is mixed with 50 µg / ml ampicillin. According to the plasmid DNA isolation, the vector pCR2.1TOPOpoxB1 with the Restriction enzymes Ech136II and XbaI cleaved and that poxB1 fragment after separation in 0.8% agarose gel with the help of the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) isolated. The vector pCR2.1TOPOpoxB2 becomes after the plasmid DNA isolation with the enzymes EcoRV and XbaI cleaved and ligated to the isolated poxB1 fragment. The E. coli strain DH5α is used with the ligation approach transformed and plasmid-bearing cells on LB agar, which 50 µg / ml ampicillin is added. To the plasmid DNA isolation are by the Control cleavage with the HindIII and XbaI enzymes Plasmids detected in which the in SEQ ID No. 3 mutagenic DNA sequence shown is cloned. One the plasmid is called pCR2.1TOPOΔpoxB.  

Beispiel 2Example 2 Konstruktion des Austauschvektors pMAK705ΔpoxBConstruction of the exchange vector pMAK705ΔpoxB

Das in Beispiel 1 beschriebene poxB-Allel wird aus dem Vektor pCR2.1TOPOΔpoxB nach der Restriktion mit den Enzymen HindIII und XbaI und Auftrennung im 0,8%igen Agarosegel isoliert und mit dem Plasmid pMAK705 (Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622), das mit den Enzymen HindIII und XbaI verdaut wurde, ligiert. Der Ligationsansatz wird in DH5α transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 20 µg/ml Chloramphenicol versetzt ist, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung wird nach Plasmid DNA Isolierung und Spaltung mit den Enzymen HindIII und XbaI nachgewiesen. Der entstandene Austauschvektor pMAK705ΔpoxB (= pMAK705deltapoxB) ist in Fig. 1 dargestellt.The poxB allele described in Example 1 is isolated from the vector pCR2.1TOPOΔpoxB after restriction with the enzymes HindIII and XbaI and separation in a 0.8% agarose gel and with the plasmid pMAK705 (Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622), which was digested with the enzymes HindIII and XbaI, ligated. The ligation mixture is transformed into DH5α and plasmid-carrying cells are selected on LB agar which has been mixed with 20 μg / ml chloramphenicol. Successful cloning is demonstrated after plasmid DNA isolation and cleavage with the enzymes HindIII and XbaI. The resulting exchange vector pMAK705ΔpoxB (= pMAK705deltapoxB) is shown in Fig. 1.

Beispiel 3Example 3 Ortsspezifische Mutagenese des poxB-Gens in dem E. coli Stamm MG442Site-specific mutagenesis of the poxB gene in the E. coli Strain MG442

Der L-Threonin produzierende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentschrift US-A-4,278,765 beschrieben und bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) als CMIM B-1628 hinterlegt.The L-threonine producing E. coli strain MG442 is in the Patent US-A-4,278,765 and in the Russian National Industrial Collection Microorganisms (VKPM, Moscow, Russia) as CMIM B-1628 deposited.

Für den Austausch des chromosomalen poxB-Gens gegen das Plasmid-kodierte Deletionskonstrukt wird MG442 mit dem Plasmid pMAK705ΔpoxB transformiert. Der Genaustausch erfolgt mit dem von Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) beschriebenen Selektionsverfahren und wird durch Standard-PCR-Methoden (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotid Primern verifiziert:
MG442 is transformed with the plasmid pMAK705ΔpoxB to replace the chromosomal poxB gene with the plasmid-encoded deletion construct. The gene exchange takes place with that of Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) and is verified by standard PCR methods (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) with the following oligonucleotide primers:

Der erhaltene Stamm wird als MG442ΔpoxB bezeichnet.The strain obtained is designated MG442ΔpoxB.

Beispiel 4Example 4 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442ΔpoxBProduction of L-threonine with the MG442ΔpoxB strain

MG442ΔpoxB wird auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung vermehrt: 3,5 g/l Na2HPO4.2H2O, 1,5 g/l KH2PO4, 1 g/l NH4Cl, 0,1 g/l MgSO4.7H2O, 2 g/l Glucose, 20 g/l Agar. Die Bildung von L-Threonin wird in batch Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeierkolben enthalten sind, überprüft. Dazu wird 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4.7H2O, 15 g/l CaCO3, 20 g/l Glucose beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. 250 µl dieser Vorkultur werden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4.7H2O, 0,03 g/l FeSO4.7H2O, 0,018 g/l MnSO4.1H2O, 30 g/l CaCO3, 20 g/l Glucose) überimpft und für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.MG442ΔpoxB is grown on minimal medium with the following composition: 3.5 g / l Na 2 HPO 4 .2H 2 O, 1.5 g / l KH 2 PO 4 , 1 g / l NH 4 Cl, 0.1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 2 g / l glucose, 20 g / l agar. The formation of L-threonine is checked in batch cultures of 10 ml, which are contained in 100 ml Erlenmeier flasks. 10 ml of preculture medium of the following composition are added: 2 g / l yeast extract, 10 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 1 g / l KH 2 PO 4 , 0.5 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 15 Inoculated g / l CaCO 3 , 20 g / l glucose and incubated for 16 hours at 37 ° C. and 180 rpm on an ESR incubator from Kühner AG (Birsfelden, Switzerland). 250 μl of this preculture are dissolved in 10 ml of production medium (25 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 2 g / l KH 2 PO 4 , 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 0.03 g / l FeSO 4 .7H 2 O, 0.018 g / l MnSO 4 .1H 2 O, 30 g / l CaCO 3 , 20 g / l glucose) and inoculated at 37 ° C for 48 hours. After the incubation, the optical density (OD) of the culture suspension is checked using an LP2W photometer from Dr. Lange (Berlin, Germany) at a measuring wavelength of 660 nm.

Anschließend wird die Konzentration an gebildetem L- Threonin im steril filtrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt.Then the concentration of L- Threonine in a sterile filtered culture supernatant with a Amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) by ion exchange chromatography and post-column reaction with ninhydrin detection.

In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt. Table 1 shows the result of the test.  

Tabelle 1 Table 1

Beispiel 5Example 5 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442ΔpoxB/pMW218gdhAProduction of L-threonine with the strain MG442ΔpoxB / pMW218gdhA 5.1 Amplifizierung und Klonierung des gdhA-Gens5.1 Amplification and cloning of the gdhA gene

Das Glutamat-Dehydrogenase-Gen aus Escherichia coli K12 wird unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert.The glutamate dehydrogenase gene from Escherichia coli K12 is carried out using the polymerase chain reaction (PCR) as well as synthetic oligonucleotides amplified.

Ausgehend von der Nukleotidsequenz für das gdhA-Gen in E. coli K12 MG1655 (GenBank: Accession Nr. AE000270 und Nr. AE000271) werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
Starting from the nucleotide sequence for the gdhA gene in E. coli K12 MG1655 (GenBank: Accession No. AE000270 and No. AE000271), PCR primers are synthesized (MWG Biotech, Ebersberg, Germany):

Die für die PCR eingesetzte chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA wird nach Herstellerangaben mit "QIAGEN Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ca. 2150 bp großes DNA-Fragment, das den gdhA-Kodierbereich und ca. 350 bp 5'-flankierende und ca. 450 bp 3'-flankierende Sequenzen umfaßt, kann mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al.: PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit der Pfu-DNA Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird in das Plasmid pCR2.1TOPO kloniert und in den E. coli Stamm TOP10 transformiert (Invitrogen, Leek, Niederlande, Produktbeschreibung TOPO TA Cloning Kit, Cat. No. K4500-01). Die erfolgreiche Klonierung wird durch Spaltung des Plasmids pCR2.1TOPOgdhA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und EcoRV nachgewiesen. Dazu wird die Plasmid DNA mittels des "QIAprep Spin Plasmid Kits" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert und nach der Spaltung in einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt.The chromosomal E. coli K12 MG1655 used for the PCR According to the manufacturer, DNA is labeled "QIAGEN Genomic-tips 100 / G "(QIAGEN, Hilden, Germany). An approx. 2150 bp large DNA fragment covering the gdhA coding area and approx. 350 bp 5'-flanking and approx. 450 bp 3'-flanking Sequences can be added with the specific primers Standard PCR conditions (Innis et al .: PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) with the Pfu-DNA polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) are amplified. The PCR product is in the  Plasmid pCR2.1TOPO cloned and into the E. coli strain TOP10 transformed (Invitrogen, Leek, Netherlands, Product description TOPO TA Cloning Kit, Cat. No. K4500-01). Successful cloning is achieved by splitting the Plasmids pCR2.1TOPOgdhA with the restriction enzymes EcoRI and EcoRV proven. The plasmid DNA is used for this of the "QIAprep Spin Plasmid Kit" (QIAGEN, Hilden, Germany) isolated and after the split in one 0.8% agarose gel separated.

5.2 Klonierung des gdhA-Gens in den Plasmidvektor pMW2185.2 Cloning of the gdhA gene in the plasmid vector pMW218

Das Plasmid pCR2.1TOPOgdhA wird mit dem Enzym EcoRI gespalten, der Spaltungsansatz im 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt und das 2,1 kbp große gdhA-Fragment mit Hilfe des "OIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Das Plasmid pMW218 (Nippon Gene, Toyama, Japan) wird mit dem Enzym EcoRI gespalten und mit dem gdhA-Fragment ligiert. Der E. coli Stamm DH5α wird mit dem Ligationsansatz transformiert und pMW218 tragende Zellen durch Ausplattieren auf LB Agar (Lennox, Virology 1955, 1: 190), der mit 20 µg/ml Kanamycin versetzt ist, selektioniert.The plasmid pCR2.1TOPOgdhA is made with the enzyme EcoRI split, the split in the 0.8% agarose gel separated and the 2.1 kbp gdhA fragment with the help the "OIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Hilden, Germany) isolated. The plasmid pMW218 (Nippon Gene, Toyama, Japan) is cleaved with the enzyme EcoRI and with ligated to the gdhA fragment. The E. coli strain DH5α is with transformed the ligation approach and pMW218 carrying Cells by plating on LB agar (Lennox, Virology 1955, 1: 190), which is mixed with 20 µg / ml kanamycin, selected.

Die erfolgreiche Klonierung des gdhA-Gens kann nach der Plasmid DNA-Isolierung und Kontrollspaltung mit EcoRI und EcoRV nachgewiesen werden. Das Plasmid wird als pMW218gdhA (Fig. 2) bezeichnet.The successful cloning of the gdhA gene can be demonstrated after plasmid DNA isolation and control cleavage with EcoRI and EcoRV. The plasmid is named pMW218gdhA ( Fig. 2).

5.3 Herstellung des Stammes MG442ΔpoxB/pMW218gdhA5.3 Production of strain MG442ΔpoxB / pMW218gdhA

Der in Beispiel 3 erhaltene Stamm MG442ΔpoxB und der Stamm MG442 werden mit dem Plasmid pMW218gdhA transformiert und Transformanten auf LB-Agar selektioniert, der mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert ist. Auf diese Weise entstehen die Stämme MG442ΔpoxB/pMW218gdhA und MG442/pMW218gdhA. The strain MG442ΔpoxB obtained in Example 3 and the strain MG442 are transformed with the plasmid pMW218gdhA and Transformants selected on LB agar containing 20 µg / ml Kanamycin is supplemented. In this way, the Strains MG442ΔpoxB / pMW218gdhA and MG442 / pMW218gdhA.  

5.4 Herstellung von L-Threonin5.4 Production of L-threonine

Die Herstellung von L-Threonin durch die Stämme MG442ΔpoxB/pMW218gdhA und MG442/pMW218gdhA wird wie in Beispiel 4 beschrieben geprüft. Das Minimalmedium und das Vorkulturmedium werden bei diesen beiden Stämmen zusätzlich mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert.The production of L-threonine by the strains MG442ΔpoxB / pMW218gdhA and MG442 / pMW218gdhA becomes as in Example 4 described tested. The minimal medium and that Pre-culture medium is additional with these two strains supplemented with 20 µg / ml kanamycin.

In Tabelle 2 ist das Ergebnis des Versuches zusammengefasst.Table 2 shows the result of the experiment summarized.

Tabelle 2 Table 2

Beispiel 6Example 6 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442ΔpoxB/pMW219rhtCProduction of L-threonine with the strain MG442ΔpoxB / pMW219rhtC 6.1 Amplifizierung des rhtC-Gens6.1 Amplification of the rhtC gene

Das rhtC-Gen aus Escherichia coli K12 wird unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz für das rhtC-Gen in E. coli K12 MG1655 (GenBank: Accession Nr. AE000458, Zakataeva et al. (FEBS Letters 452, 228-232 (1999)) werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
The rhtC gene from Escherichia coli K12 is amplified using the polymerase chain reaction (PCR) and synthetic oligonucleotides. Starting from the nucleotide sequence for the rhtC gene in E. coli K12 MG1655 (GenBank: Accession No. AE000458, Zakataeva et al. (FEBS Letters 452, 228-232 (1999)), PCR primers are synthesized (MWG Biotech, Ebersberg, Germany):

Die für die PCR eingesetzte chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA wird nach Herstellerangaben mit "QIAGEN Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ca. 800 bp großes DNA-Fragment kann mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al.: PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit der Pfu-DNA Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden.The chromosomal E. coli K12 MG1655 used for the PCR According to the manufacturer, DNA is labeled "QIAGEN Genomic-tips 100 / G "(QIAGEN, Hilden, Germany) isolated. An approx. 800 bp large DNA fragment can with the specific primers under standard PCR conditions (Innis et al .: PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) with Pfu-DNA polymerase (Promega Corporation, Madison, USA).

6.2 Klonierung des rhtC-Gens in den Plasmidvektor pMW2196.2 Cloning of the rhtC gene in the plasmid vector pMW219

Das Plasmid pMW219 (Nippon Gene, Toyama, Japan) wird mit dem Enzym SmaI gespalten und mit dem rhtC-PCR-Fragment ligiert. Der E. coli Stamm DH5α wird mit dem Ligationsansatz transformiert und pMW219 tragende Zellen auf LB Agar, der mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert ist, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung kann nach der Plasmid DNA-Isolierung und Kontrollspaltung mit KpnI, HindIII und NcoI nachgewiesen werden. Das Plasmid pMW219rhtC ist in Fig. 3 dargestellt.The plasmid pMW219 (Nippon Gene, Toyama, Japan) is cleaved with the enzyme SmaI and ligated with the rhtC-PCR fragment. The E. coli strain DH5α is transformed with the ligation mixture and cells carrying pMW219 are selected on LB agar which is supplemented with 20 μg / ml kanamycin. Successful cloning can be demonstrated after plasmid DNA isolation and control cleavage with KpnI, HindIII and NcoI. The plasmid pMW219rhtC is shown in Fig. 3.

6.3 Herstellung des Stammes MG442ΔpoxB/pMW219rhtC6.3 Preparation of strain MG442ΔpoxB / pMW219rhtC

Der in Beispiel 3 erhaltene Stamm MG442ΔpoxB und der Stamm MG442 werden mit dem Plasmid pMW219rhtC transformiert und Transformanten auf LB-Agar selektioniert, der mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert ist. Auf diese Weise entstehen die Stämme MG442ΔpoxB/pMW219rhtC und MG442/pMW219rhtC.The strain MG442ΔpoxB obtained in Example 3 and the strain MG442 are transformed with the plasmid pMW219rhtC and Transformants selected on LB agar containing 20 µg / ml Kanamycin is supplemented. In this way, the Strains MG442ΔpoxB / pMW219rhtC and MG442 / pMW219rhtC.

6.4 Herstellung von L-Threonin6.4 Production of L-threonine

Die Herstellung von L-Threonin durch die Stämme MG442ΔpoxB/pMW219rhtC und MG442/pMW219rhtC wird wie in Beispiel 4 beschrieben geprüft. Das Minimalmedium und das Vorkulturmedium werden bei diesen beiden Stämmen zusätzlich mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert.The production of L-threonine by the strains MG442ΔpoxB / pMW219rhtC and MG442 / pMW219rhtC is as in Example 4 described tested. The minimal medium and that  Pre-culture medium is additional with these two strains supplemented with 20 µg / ml kanamycin.

In Tabelle 3 ist das Ergebnis des Versuches zusammengefasst.Table 3 shows the result of the experiment summarized.

Tabelle 3 Table 3

Beispiel 7Example 7 Ortsspezifische Mutagenese des poxB-Gens in dem E. coli Stamm TOC21RSite-specific mutagenesis of the poxB gene in the E. coli Strain TOC21R

Der L-Lysin produzierende E. coli Stamm pDA1/TOC21R ist in der Patentanmeldung F-A-2511032 beschrieben und bei der Collection Nationale de Culture de Microorganisme (CNCM, Institut Pasteur, Paris, Frankreich) unter der Nummer I-167 hinterlegt. Der Stamm und der plasmidfreie Wirt sind ebenfalls bei Dauce-Le Reverend et al. (European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 15 : 227-231 (1982)) unter der Bezeichnung TOCR21/pDA1 beschrieben.The L-lysine-producing E. coli strain pDA1 / TOC21R is in described in patent application F-A-2511032 and at Collection Nationale de Culture de Microorganisme (CNCM, Institut Pasteur, Paris, France) under number I-167 deposited. The stem and the plasmid-free host are also in Dauce-Le Reverend et al. (European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 15: 227-231 (1982)) under the designation TOCR21 / pDA1.

Von Stamm pDA1/TOC21R wird nach Kultur im Antibiotika­ freien LB-Medium für ungefähr sechs Generationen ein Derivat isoliert, das das Plasmid pDA1 nicht mehr enthält. Der entstandene Stamm ist Tetracyclin-sensitiv und wird als TOC21R bezeichnet. From strain pDA1 / TOC21R is after culture in antibiotics free LB medium for about six generations Isolated derivative that no longer contains the plasmid pDA1. The resulting strain is sensitive to tetracycline and is called Designated TOC21R.  

Für den Austausch des chromosomalen poxB-Gens gegen das Plasmid-kodierte Deletionskonstrukt wird TOC21R mit dem Plasmid pMAK705ΔpoxB (Beispiel 2) transformiert. Der Genaustausch erfolgt mit dem von Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) beschriebenen Selektionsverfahren und wird durch Standard-PCR-Methoden (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotid Primern verifiziert:
To replace the chromosomal poxB gene with the plasmid-encoded deletion construct, TOC21R is transformed with the plasmid pMAK705ΔpoxB (example 2). The gene exchange takes place with that of Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) and is verified by standard PCR methods (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) with the following oligonucleotide primers:

Der erhaltene Stamm wird als TOC21RΔpoxB bezeichnet.The strain obtained is referred to as TOC21RΔpoxB.

Beispiel 8Example 8 Herstellung von L-Lysin mit dem Stamm TOC21RΔpoxBProduction of L-lysine with the strain TOC21RΔpoxB

Die Bildung von L-Lysin durch die Stämme TOC21RΔpoxB und TOC21R wird in batch Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeierkolben enthalten sind, überprüft. Dazu wird 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0, 5 g/l MgSO4.7H2O, 15 g/l CaCO3, 20 g/l Glucose beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. 250 µl dieser Vorkultur werden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4.7H2O, 0,03 g/l FeSO4.7H2O, 0,018 g/l MnSO4.1H2O, 30 g/l CaCO3, 20 g/l Glucose, 25 mg/l L-Isoleucin und 5 mg/l Thiamin) überimpft und für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.The formation of L-lysine by the strains TOC21RΔpoxB and TOC21R is checked in batch cultures of 10 ml, which are contained in 100 ml Erlenmeier flasks. 10 ml of preculture medium with the following composition are added: 2 g / l yeast extract, 10 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 1 g / l KH 2 PO 4 , 0.5 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 15 Inoculated g / l CaCO 3 , 20 g / l glucose and incubated for 16 hours at 37 ° C. and 180 rpm on an ESR incubator from Kühner AG (Birsfelden, Switzerland). 250 μl of this preculture are dissolved in 10 ml of production medium (25 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 2 g / l KH 2 PO 4 , 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 0.03 g / l FeSO 4 .7H 2 O, 0.018 g / l MnSO 4 .1H 2 O, 30 g / l CaCO 3 , 20 g / l glucose, 25 mg / l L-isoleucine and 5 mg / l thiamine) and inoculated for 72 hours at 37 ° C incubated. After the incubation, the optical density (OD) of the culture suspension is checked using an LP2W photometer from Dr. Lange (Berlin, Germany) at a measuring wavelength of 660 nm.

Anschließend wird die Konzentration an gebildetem L-Lysin im steril filtrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt.Then the concentration of L-lysine formed in a sterile filtered culture supernatant with a  Amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) by ion exchange chromatography and post-column reaction with ninhydrin detection.

In Tabelle 4 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.Table 4 shows the result of the test.

Tabelle 4 Table 4

Beispiel 9Example 9 Ortsspezifische Mutagenese des poxB-Gens in dem E. coli Stamm B-1288Site-specific mutagenesis of the poxB gene in the E. coli Strain B-1288

Der L-Valin produzierende E. coli Stamm AJ 11502 ist in der Patentschrift US-A-4391907 beschrieben und bei dem National Center for Agricultural Utilization Research (Peoria, Illinois, USA) als NRRL B-12288 hinterlegt.The L-valine producing E. coli strain AJ 11502 is in the US-A-4391907 and to the National Center for Agricultural Utilization Research (Peoria, Illinois, USA) as NRRL B-12288.

Von Stamm AJ 11502 wird nach Kultur im Antibiotika-freien LB-Medium für ungefähr sechs Generationen ein plasmidfreies Derivat isoliert. Der entstandene Stamm ist Ampicillin­ sensitiv und wird als AJ11502kur bezeichnet.From strain AJ 11502 is antibiotic-free after culture LB medium is plasmid-free for approximately six generations Derivative isolated. The resulting strain is ampicillin sensitive and is called AJ11502kur.

Für den Austausch des chromosomalen poxB-Gens gegen das Plasmid-kodierte Deletionskonstrukt wird AJ11502kur mit dem Plasmid pMAK705ΔpoxB (Siehe Beispiel 2) transformiert. Der Genaustausch erfolgt mit dem von Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) beschriebenen Selektionsverfahren und wird durch Standard-PCR-Methoden (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotid Primern verifiziert:
For the exchange of the chromosomal poxB gene against the plasmid-encoded deletion construct, AJ11502kur is transformed with the plasmid pMAK705ΔpoxB (see example 2). The gene exchange takes place with that of Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) and is verified by standard PCR methods (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) with the following oligonucleotide primers:

Der erhaltene Stamm wird als AJ11502kurΔpoxB bezeichnet. Aus Stamm NRRL B-12288 wird das in der Patentschrift US-A-4391907 beschriebene Plasmid isoliert, welches die genetische Information bezüglich der Valin-Produktion trägt. Der Stamm AJ11502kurΔpoxB wird mit diesem Plasmid transformiert. Eine der erhaltenen Transformanten wird als B-12288ΔpoxB bezeichnet.The strain obtained is referred to as AJ11502kurΔpoxB. From strain NRRL B-12288 that becomes in the patent US-A-4391907 isolated plasmid which the genetic information related to valine production wearing. The strain AJ11502kurΔpoxB is using this plasmid transformed. One of the transformants obtained is called B-12288ΔpoxB.

Beispiel 10Example 10 Herstellung von L-Valin mit dem Stamm B-12288ΔpoxBProduction of L-valine with the strain B-12288ΔpoxB

Die Bildung von L-Valin durch die Stämme B-12288ΔpoxB und NRRL B-12288 wird in batch Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeierkolben enthalten sind, überprüft. Dazu wird 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4.7H2O, 15 g/l CaCO3, 20 g/l Glucose und 50 mg/l Ampicillin beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. 250 µl dieser Vorkultur werden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4.7H2O, 0,03 g/l FeSO4.7H2O, 0,018 g/l MnSO4.1H2O, 30 g/l CaCO3, 20 g/l Glucose, 5 mg/l Thiamin und 50 mg/l Ampicillin) überimpft und für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.The formation of L-valine by the strains B-12288ΔpoxB and NRRL B-12288 is checked in batch cultures of 10 ml, which are contained in 100 ml Erlenmeier flasks. 10 ml of preculture medium of the following composition are added: 2 g / l yeast extract, 10 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 1 g / l KH 2 PO 4 , 0.5 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 15 Inoculated g / l CaCO 3 , 20 g / l glucose and 50 mg / l ampicillin and incubated for 16 hours at 37 ° C. and 180 rpm on an ESR incubator from Kühner AG (Birsfelden, Switzerland). 250 μl of this preculture are dissolved in 10 ml of production medium (25 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 2 g / l KH 2 PO 4 , 1 g / l MgSO 4 .7H 2 O, 0.03 g / l FeSO 4 .7H 2 O, 0.018 g / l MnSO 4 .1H 2 O, 30 g / l CaCO 3 , 20 g / l glucose, 5 mg / l thiamine and 50 mg / l ampicillin) and inoculated for 72 hours at 37 ° C incubated. After the incubation, the optical density (OD) of the culture suspension is checked using an LP2W photometer from Dr. Lange (Berlin, Germany) at a measuring wavelength of 660 nm.

Anschließend wird die Konzentration an gebildetem L-Valin im steril filtrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt.Then the concentration of L-valine formed in a sterile filtered culture supernatant with a  Amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) by ion exchange chromatography and post-column reaction with ninhydrin detection.

In Tabelle 5 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.Table 5 shows the result of the test.

Tabelle 5 Table 5

Beschreibung der FigurenDescription of the figures

Fig. 1 pMAK705ΔpoxB (= pMAK705deltapoxB) Fig. 1 pMAK705ΔpoxB (= pMAK705deltapoxB)

Fig. 2 pMW218gdhA Figure 2 pMW218gdhA

Fig. 3 pMW219rhtC Figure 3 pMW219rhtC

Längenangaben sind als ca. -Angaben aufzufassen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:
cat: Chloramphenicolresistenzgen
rep-ts: temperatursensitive Replikationsregion des Plasmides pSC101
poxB1: Teil der 5'-Region des poxB-Gens
poxB2: Teil der 3'-Region des poxB-Gens
kan: Kanamycinresistenzgen
gdhA: Glutamat-Dehydrogenase-Gen
rhtC: Threoninresistenz vermittelndes GenLength specifications are to be understood as approx. The abbreviations and designations used have the following meaning:
cat: chloramphenicol resistance gene
rep-ts: temperature-sensitive replication region of the plasmid pSC101
poxB1: part of the 5 'region of the poxB gene
poxB2: part of the 3 'region of the poxB gene
kan: Kanamycin resistance gene
gdhA: glutamate dehydrogenase gene
rhtC: Threonine resistance mediating gene

Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme haben folgende Bedeutung:
BamHI: Restriktionsendonuklease aus Bacillus amyloliquefaciens
BglII: Restriktionsendonuklease aus Bacillus globigii
ClaI: Restriktionsendonuklease aus Caryphanon latum
Ecl136II Restriktionsendonuklease aus Enterobacter cloacae RFL136 (= Ecl136)
EcoRI: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
EcoRV: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
HindIII: Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae
KpnI: Restriktionsendonuklease aus Klebsiella pneumoniae
PstI: Restriktionsendonuklease aus Providencia stuartii
PvuI: Restriktionsendonuklease aus Proteus vulgaris
SacI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces achromogenes
SalI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces albus
SmaI: Restriktionsendonuklease aus Serratia marcescens
XbaI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas badrii
XhoI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas holcicola The abbreviations for the restriction enzymes have the following meaning:
BamHI: restriction endonuclease from Bacillus amyloliquefaciens
BglII: restriction endonuclease from Bacillus globigii
ClaI: restriction endonuclease from Caryphanon latum
Ecl136II restriction endonuclease from Enterobacter cloacae RFL136 (= Ecl136)
EcoRI: restriction endonuclease from Escherichia coli
EcoRV: restriction endonuclease from Escherichia coli
HindIII: restriction endonuclease from Haemophilus influenzae
KpnI: restriction endonuclease from Klebsiella pneumoniae
PstI: Restriction endonuclease from Providencia stuartii
PvuI: Proteus vulgaris restriction endonuclease
SacI: restriction endonuclease from Streptomyces achromogenes
SalI: restriction endonuclease from Streptomyces albus
SmaI: restriction endonuclease from Serratia marcescens
XbaI: restriction endonuclease from Xanthomonas badrii
XhoI: restriction endonuclease from Xanthomonas holcicola

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims (19)

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:
  • a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen man zumindest das poxB-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen abschwächt, insbesondere ausschaltet,
  • b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
  • c) Isolieren der L-Aminosäure.
1. A process for the fermentative production of L-amino acids, characterized in that the following steps are carried out:
  • a) fermentation of the desired L-amino acid-producing microorganisms of the Enterobacteriaceae family in which at least the poxB gene or nucleotide sequences coding therefor are weakened, in particular switched off,
  • b) accumulation of the L-amino acid in the medium or in the cells of the bacteria, and
  • c) isolating the L-amino acid.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß L-Threonin, L-Valin oder L-Lysin hergestellt wird.2. The method according to claim 1, characterized characterized that L-threonine, L-valine or L-lysine is produced. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt.3. The method according to claim 1, characterized characterized that you have microorganisms uses, in which one also additional genes of Biosynthetic pathway of the desired L-amino acid strengthened. 4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.4. The method according to claim 1, characterized characterized that you have microorganisms uses in which the metabolic pathways at least are partially turned off, which is the formation of the reduce the desired L-amino acid. 5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression des (der) Polynukleotides (e), das (die) für das poxB-Gen kodiert (kodieren) abschwächt, insbesondere ausschaltet. 5. The method according to claim 1, characterized characterized in that the expression of the polynucleotide (s) for the poxB gene encodes (encode) weakens, in particular off.   6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die regulatorischen und/oder katalytischen Eigenschaften des Polypeptids (Enzymprotein) verringert, für das das Polynukleotid poxB kodiert.6. The method according to claim 1, characterized characterized in that the regulatory and / or catalytic properties of the polypeptide (enzyme protein) for which the Polynucleotide encoded poxB. 7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren Mikroorganismen der Familie Enterobactericeae fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:
  • 1. 7.1 das für die Aspartatkinase, die Homoserin- Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon,
  • 2. 7.2 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc- Gen,
  • 3. 7.3 das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps-Gen,
  • 4. 7.4 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen,
  • 5. 7.5 die für die Transhydrogenase kodierende Gene pntA und pntB,
  • 6. 7.6 das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB,
  • 7. 7.7 das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen,
  • 8. 7.8 das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC,
  • 9. 7.9 das für den Threoninexport kodierende thrE-Gen, und
  • 10. 7.10 das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen
verstärkt, insbesondere überexprimiert.7. The method according to claim 1, characterized in that for the production of L-amino acids, microorganisms of the Enterobactericeae family are fermented, in which one or more of the genes selected from the group:
  • 1. 7.1 the thrABC operon coding for aspartate kinase, homoserine dehydrogenase, homoserine kinase and threonine synthase,
  • 2. 7.2 the pyc gene coding for the pyruvate carboxylase,
  • 3. 7.3 the pps gene coding for the phosphoenolpyruvate synthase,
  • 4. 7.4 the ppc gene coding for the phosphoenolpyruvate carboxylase,
  • 5. 7.5 the genes pntA and pntB coding for the transhydrogenase,
  • 6. 7.6 the gene which mediates homoserine resistance rhtB,
  • 7. 7.7 the mqo gene coding for the malate: quinone oxidoreductase,
  • 8. 7.8 the gene mediating threonine resistance rhtC,
  • 9. 7.9 the thrE gene coding for threonine export, and
  • 10. 7.10 the gdhA gene coding for glutamate dehydrogenase
amplified, especially overexpressed. 8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:
  • 1. 8.1 das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh- Gen,
  • 2. 8.2 das für die Malat-Dehydrogenase kodierende mdh- Gen,
  • 3. 8.3 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA,
  • 4. 8.4 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP, und
  • 5. 8.5 das für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen,
abschwächt, insbesondere ausschaltet oder die Expression verringert.8. The method according to claim 1, characterized in that for the production of L-amino acids, microorganisms of the Enterobacteriaceae family are fermented, in which one or more of the genes selected from the group:
  • 1. 8.1 the tdh gene coding for the threonine dehydrogenase,
  • 2. 8.2 the mdh gene coding for malate dehydrogenase,
  • 3. 8.3 the gene product of the open reading frame (orf) yjfA,
  • 4. 8.4 the gene product of the open reading frame (orf) ytfP, and
  • 5. 8.5 the pckA gene coding for the enzyme phosphoenolpyruvate carboxykinase,
attenuates, in particular switches off or the expression decreases. 9. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Threonin den Stamm MG442ΔpoxB transformiert mit dem Plasmid pMW218gdhA, dargestellt in Fig. 2, einsetzt.9. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the strain MG442ΔpoxB transformed with the plasmid pMW218gdhA, shown in Fig. 2, is used to produce L-threonine. 10. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Threonin den Stamm MG442ΔpoxB transformiert mit dem Plasmid pMW219rhtC, dargestellt in Fig. 3, einsetzt. 10. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the strain MG442ΔpoxB transformed with the plasmid pMW219rhtC, shown in Fig. 3, is used to produce L-threonine. 11. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Lysin den Stamm TOC21RΔpoxB einsetzt.11. The method according to claim 1 or 2, characterized characterized that one for manufacturing of L-lysine uses the strain TOC21RΔpoxB. 12. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Valin den Stamm B-12288ΔpoxB einsetzt.12. The method according to claim 1 or 2, characterized characterized that one for manufacturing of L-valine uses strain B-12288ΔpoxB. 13. L-Aminosäuren produzierende Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen das poxB-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet sind, die eine Resistenz gegen α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure und gegebenenfalls eine kompensierbare partielle Bedürftigkeit für L- Isoleucin aufweisen.13. Family L-amino acid producing microorganisms Enterobacteriaceae, in which the poxB gene or for it coding nucleotide sequences are weakened, are turned off in particular, which is a resistance against α-amino-β-hydroxyvaleric acid and optionally a compensable partial need for L- Have isoleucine. 14. Escherichia coli K-12 Stamm MG442ΔpoxB hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) unter der Nr. DSM 13762.14. Escherichia coli K-12 strain MG442ΔpoxB deposited with the German Collection for Microorganisms and Cell cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) under No. DSM 13762. 15. Plasmid pMAK705ΔpoxB, das Teile der 5'- und der 3'-Region des poxB-Gens, entsprechend SEQ ID No. 3, enthält, dargestellt in Fig. 1.15. Plasmid pMAK705ΔpoxB, which parts the 5 'and 3' region of the poxB gene, corresponding to SEQ ID No. 3, shown in FIG. 1. 16. Plasmid pMW218gdhA dargestellt in Fig. 2.16. Plasmid pMW218gdhA shown in Fig. 2. 17. Plasmid pMW219rhtC dargestellt in Fig. 3.17. Plasmid pMW219rhtC shown in Fig. 3. 18. Isoliertes Polynukleotid aus Mikroorganismen der Familie Enterobactericeae, enthaltend eine für die 5'- und 3'-Region des poxB-Gens kodierende Polynukleotidsequenz dargestellt in SEQ ID No. 4 insbesondere geeignet als Bestandteil von Plasmiden für die ortsspezifische Mutagenese des poxB-Gens.18. Isolated polynucleotide from microorganisms of the Family Enterobactericeae, containing one for the 5'- and coding for the 3 'region of the poxB gene Polynucleotide sequence shown in SEQ ID No. 4 particularly suitable as a component of plasmids for the site-specific mutagenesis of the poxB gene. 19. L-Threonin produzierende Stämme der Familie Enterobacteriaceae, enthaltend eine Mutation im poxB- Gen entsprechend SEQ ID No. 4.19. L-threonine-producing strains of the family Enterobacteriaceae, containing a mutation in the poxB Gene corresponding to SEQ ID No. 4th
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