DE10112002A1

DE10112002A1 - New de novo protein domain, useful for purification of recombinant proteins by affinity chromatography, includes tag attached to an alpha helix to ensure accessibility

Info

Publication number: DE10112002A1
Application number: DE2001112002
Authority: DE
Inventors: Stephan Diekmann; Anja Roecker; Renata Basch; Peter Steinruecke; Oliver Hill; Alexander Hillisch
Original assignee: IMB Institut fur Molekulare Biotechnologie eV
Current assignee: IMB Institut fur Molekulare Biotechnologie eV
Priority date: 2001-03-13
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2002-10-02

Abstract

De novo protein domain (I) for purifying recombinant protein (II) by affinity chromatography comprising: (i) an amino acid (aa) tag sequence that binds specifically to the chromatography column; (ii) an aa sequence with a helical secondary structure (helix); and (iii) an aa sequence connecting tag and helix (linker), is new. Independent claims are also included for the following: (1) DNA sequence (III) that encodes (I); and (2) method for affinity chromatographic purification of (II).

Description

Die Erfindung betrifft eine Proteindomäne für die Verwendung in der Reinigung von rekombinanten Proteinen mittels Affinitätschromatographie sowie ein Verfahren zur Reinigung von rekombinanten Proteinen mittels Affinitätschromatographie.The invention relates to a protein domain for use in the purification of recombinant proteins using affinity chromatography and a method for Purification of recombinant proteins using affinity chromatography.

Im Bereich der Proteom-Analyse, d. h. der Analyse des gesamten Protein-Expressionsmusters einer Zelle, eines Organismus oder einer Körperflüssigkeit unter genau definierten Bedingungen, ist es erforderlich, daß eine Vielzahl von Proteinen mit hohem Probendurchsatz untersucht wird. Eine wesentliche Voraussetzung für die funktionelle Analyse von exprimierten Proteinen ist deren effiziente und möglichst automatisierte Aufreinigung. Zu diesem Zweck kann an das rekombinante Protein (Zielprotein) durch Genfusion eine Proteindomäne angefügt werden, die eine nachfolgende Reinigung mittels Affinitätschromatographie ermöglicht. Man unterscheidet "echte" Fusionsproteine, bestehend aus heterologen Proteinen bzw. Proteindomänen, von Proteinen mit sog. Tags, d. h. kurzen, endständigen Peptiden. Die Reinigung erfolgt, indem das Fusionspartner-Protein bzw. ein Tag an das Zielprotein angefügt wird und die Affinität dieser Sequenz zu einem spezifischen Liganden für die Reinigung des Fusionsproteins ausgenützt wird (J.-S. Kim und R. T. Raines, Anal. Biochem. 1994, 219, 165-166; N. K. Harakas, Protein purification process engineering. Biospecific affinity chromatography, Humana Press Inc., Totowa, N. J. 1994, 256-316).In the field of proteome analysis, i.e. H. analysis of the entire protein expression pattern a cell, an organism or a body fluid under precisely defined Conditions, it is required that a variety of proteins with high sample throughput is examined. An essential requirement for the functional analysis of expressed proteins is their efficient and as automated as possible purification. To For this purpose, the recombinant protein (target protein) can be linked to a gene fusion Protein domains can be added, which are used for subsequent purification Affinity chromatography enables. A distinction is made between "real" fusion proteins from heterologous proteins or protein domains, from proteins with so-called tags, d. H. short, terminal peptides. The cleaning is done by the fusion partner protein or a day is added to the target protein and the affinity of this sequence for a specific one Ligands for the purification of the fusion protein is used (J.-S. Kim and R. T. Raines, Anal. Biochem. 1994, 219, 165-166; N.K. Harakas, Protein purification process engineering. Biospecific affinity chromatography, Humana Press Inc., Totowa, N.J. 1994, 256-316).

Beispiele für Fusionspartner-Proteine/Ligand-Systeme sind Glutathion-S-Transferase (GST)/Glutathion (D. B. Smith und K. S. Johnson, Gene 1988, 67, 31-40), Staphylokokken- Protein A/Immunoglobulin G (C. Ljungquist at al., Eur. J. Biochem. 1989, 186, 536-569), Streptavitin/Biotin (US-Patentanmeldung 85/01901) sowie Streptokokken-Protein G/Albumin (P.-A. Nygren at al., J. Mol. Recognit. 1988, 1, 69-74).Examples of fusion partner proteins / ligand systems are glutathione-S-transferase (GST) / glutathione (DB Smith and KS Johnson, Gene 1988 , 67 , 31-40 ), staphylococcal protein A / immunoglobulin G (C. Ljungquist at al ., Eur. J. Biochem. 1989, 186, 536-569), streptavitin / biotin (US patent application 85/01901) and streptococcal protein G / albumin (P.-A. Nygren at al., J. Mol. Recognit. 1988, 1, 69-74).

Die vorstehend beschriebenen Systeme sind jedoch nicht gleichermaßen effizient, da die Fusionspartner-Proteine mit 10 bis 40 kDa sehr groß sind und somit nur geringe Ausbeuten bei der Reinigung der Fusionsproteine erreicht werden (J. Nilsson at al., Protein Expression and Purification 1997, 11, 1-16) und ferner die häufige Notwendigkeit der Entfernung dieser Fusionspartner-Proteine durch proteolytische Spaltung nachteilig ist (C. Ljungquist at al., siehe oben).However, the systems described above are not equally efficient, since the fusion partner proteins with 10 to 40 kDa are very large and thus only low yields are achieved in the purification of the fusion proteins (J. Nilsson at al., Protein Expression and Purification 1997 , 11 , 1-16 ) and the frequent need to remove these fusion partner proteins by proteolytic cleavage is disadvantageous (C. Ljungquist at al., See above).

Eine besondere Art der Affinitätschromatographie, die nicht auf biospezifischen Erkennungsmechanismen beruht, ist die von Porath eingeführte immobilisierte Metallchelat- Affinitätschromatographie (IMAC) (J. Porath at al., Nature 1975, 258, 598-599). Bei diesem Chromatographietyp ist eine Metall-chelatierende Gruppe, meist Imidodiessigsäure, Nitrilodiessigsäure oder Tris(carboxymethyl)ethylendiamin am Säulenmaterial immobilisiert. Ein multivalentes Übergangsmetall-Ion wird so gebunden, daß eine oder mehrere Koordinationsbindungen für eine Wechselwirkung mit basischen Gruppen von Proteinen zur Verfügung stehen. Einige oberflächengebundene Aminosäuren in Proteinen, vor allem Histidinreste, binden spezifisch an die freien Koordinationsplätze. Für die Selektivität der Bindungen ist die vom Metall abhängige Geometrie der Koordinationsbindungen entscheidend. Die am häufigsten eingesetzten Metalle sind Cu²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, Co²⁺, Fe²⁺ oder Fe³⁺.A special type of affinity chromatography, which is not based on biospecific recognition mechanisms, is the immobilized metal chelate affinity chromatography (IMAC) introduced by Porath (J. Porath at al., Nature 1975 , 258 , 598-599 ). In this type of chromatography, a metal chelating group, usually imidodiacetic acid, nitrilodiacetic acid or tris (carboxymethyl) ethylenediamine, is immobilized on the column material. A multivalent transition metal ion is bound so that one or more coordination bonds are available for an interaction with basic groups of proteins. Some surface-bound amino acids in proteins, especially histidine residues, bind specifically to the free coordination sites. The metal-dependent geometry of the coordination bonds is decisive for the selectivity of the bonds. The most commonly used metals are Cu ²⁺ , Ni ²⁺ , Zn ²⁺ , Co ²⁺ , Fe ²⁺ or Fe ³⁺ .

Das häufigste Einsatzgebiet der IMAC ist die schnelle Isolierung rekombinanter Proteine, bei denen eine meist sehr kurze Aminosäuresequenz, wie Poly-Arg, Poly-Glu oder Poly-His eingeführt worden ist. Durch diese sog. Tags können Proteine als Inclusion Bodies und auch häufig als native Proteine erhalten werden, da die endständigen Tags die Struktur bzw. Faltung der Proteine nur selten beeinflussen.The most common area of application for IMAC is the rapid isolation of recombinant proteins which usually have a very short amino acid sequence, such as poly-arg, poly-glu or poly-his has been introduced. Through these so-called tags, proteins can be used as inclusion bodies and also are often obtained as native proteins because the terminal tags have the structure or Seldom affect protein folding.

Für die Expression mit einem His-Tag stehen Vektorsysteme zur Verfügung, die eine Expression durch starke Promotoren ermöglichen. Die Reinigung des Proteins erfolgt nach Zellaufschluß mittels Metall-Chelatchromatographie über Nickel-Komplex-Säulenmaterial, durch das Histidin-Reste über Nickel-Ionen gebunden werden. Die Elution erfolgt durch Zugabe von Imidazol, welches das Histidin-enthaltende Protein kompetitiv aus dem Komplex verdrängt. Als Alternative zu Imidazol kann die Elution auch durch Zugabe von Puffern mit niedrigem pH (< 5) erfolgen. Bei diesem pH ist der Imidazolring des Histidins protoniert und kann keinen Komplex mehr mit den Nickel-Ionen bilden.For the expression with a His tag, vector systems are available, the one Enable expression by strong promoters. The protein is cleaned after Cell disruption using metal chelate chromatography over nickel complex column material, through which histidine residues are bound via nickel ions. The elution takes place through Addition of imidazole, which competitively removes the histidine-containing protein from the complex repressed. As an alternative to imidazole, elution can also be carried out by adding buffers low pH (<5). At this pH, the imidazole ring of histidine is protonated and can no longer form a complex with the nickel ions.

Verschiedene Genfusions-Systeme unter Verwendung von Polyhistidin-Tags, die entweder N- oder C-terminal angebracht sind und aus aufeinanderfolgenden Histidin-Resten bestehen, binden selektiv an immobilisierte Ni²⁺-Ionen eines chelatierenden Harzes wie IDA (Imminodiessigsäure) oder NTA (Nitrilodiessigsäure) (J. Nilsson et al., siehe oben; E. Hochuli et al., Bio/Technology 1988, 6, 1321-1325). IDA weist lediglich eine dreizähnige Chelator-Gruppe auf und bindet deshalb Metall-Ionen nicht besonders fest. Unter Verwendung von NTA kann dieses Problem gelöst werden, da die vierzähnige chelatierende Gruppe vier von sechs Stellen der Nickel-Koordinationssphäre besetzt und folglich das Metall stark gebunden ist (J. Crowe et al., 6xHis-Ni-NTA chromatography as a superior technique in recombinant protein expression/purification, Humana Press Inc., Totowa, N. J., 1994, Seiten 371-387).Various gene fusion systems using polyhistidine tags, which are either N- or C-terminally attached and which consist of successive histidine residues, bind selectively to immobilized Ni ²⁺ ions of a chelating resin such as IDA (imminodiacetic acid) or NTA (nitrilodiacetic acid) ) (J. Nilsson et al., See above; E. Hochuli et al., Bio / Technology 1988 , 6 , 1321-1325 ). IDA only has a tridentate chelator group and therefore does not bind metal ions particularly well. This problem can be solved using NTA, since the tetradentate chelating group occupies four out of six sites in the nickel coordination sphere and consequently the metal is strongly bound (J. Crowe et al., 6xHis-Ni-NTA chromatography as a superior technique in recombinant protein expression / purification, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 1994, pages 371-387).

Nachteilig an den aus dem Stand der Technik bekannten Tags ist jedoch, daß die die Tags umfassenden N- bzw. C-Termini der zu reinigenden Proteine im Inneren der gefalteten Proteinen verborgen sein können. In diesem Fall kann die freie Zugänglichkeit der Tags in nativen Proteinen durch die Tertiärstruktur des Proteins eingeschränkt sein, was in einer verminderten Affinität zur Matrix der Chromatographiesäule resultiert. So können etwa 30% von rekombinant exprimierten Proteinen aus diesem Grund nur schwer oder generell nicht aufgereinigt werden. Um diese Probleme zu überwinden, sind denaturierende Bedingungen oder längere Kontaktzeiten erforderlich (J. Crowe et al., siehe oben). Folglich führen die niedrigen Affinitäten von derartigen His-getaggten Proteinen zu einem vorzeitigen Elutionsverhalten. Dies hat wiederum häufig eine Coelution mit Verunreinigungen in Form von Proteinen der Expressionssysteme zur Folge, weshalb nachfolgend weitere chromatographische Reinigungsschritte erforderlich sind.A disadvantage of the tags known from the prior art, however, is that the tags comprehensive N or C termini of the proteins to be purified inside the folded Proteins can be hidden. In this case, the free accessibility of the tags in native proteins may be restricted by the tertiary structure of the protein, which results in a reduced affinity for the matrix of the chromatography column results. So about 30% of recombinantly expressed proteins for this reason only with difficulty or generally not be cleaned up. To overcome these problems are denaturing conditions or longer contact times required (J. Crowe et al., see above). Consequently, the lead low affinities of such His-tagged proteins for premature Elution. This in turn often has a co-elution with contaminants in the form of proteins of the expression systems, which is why further below chromatographic purification steps are required.

Es besteht somit ein Bedarf an Tags für die Fusion mit einem zu reinigenden Zielprotein, wobei die Affinität des Tags zu einer Matrix die Reinigung des Fusionsproteins erlaubt und gleichzeitig die Tags in nativen Proteinen für eine Reinigung mittels Affinitätschromatographie unabhängig von der Tertiärstruktur des Zielproteins uneingeschränkt zugänglich sind.There is therefore a need for tags for fusion with a target protein to be purified, the affinity of the tag for a matrix allowing the fusion protein to be purified and at the same time the tags in native proteins for cleaning by means of Affinity chromatography independent of the tertiary structure of the target protein are fully accessible.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist folglich die Bereitstellung eines Verfahrens zur Aufreinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie, das die Nachteile des Standes der Technik überwindet und insbesondere effizient und automatisierbar ist. Ferner ist es eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz bereitzustellen, die für die Anfügung an ein zu reinigendes Zielprotein geeignet ist und aufgrund verbesserter Bindungseigenschaften an eine Matrix einer Chromatographiesäule eine schnelle, effiziente und möglichst automatisierte Aufreinigung der Proteine mit hoher Ausbeute mittels Affinitätschromatographie gewährleistet.The object of the present invention is therefore to provide a method for Purification of proteins using affinity chromatography, which has the disadvantages of the state technology overcomes and in particular is efficient and automatable. It is also a essential object of the present invention to provide an amino acid sequence which is suitable for attachment to a target protein to be purified and because of improved Binding properties to a matrix of a chromatography column a fast, efficient and, as far as possible, automated purification of the proteins with a high yield Affinity chromatography guaranteed.

Weitere Aufgaben ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.Further tasks result from the following description.

Obengenannte Aufgaben werden erfindungsgemäß durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst.According to the invention, the above-mentioned tasks are achieved by the features of the independent Claims resolved.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen definiert.Advantageous configurations are defined in the subclaims.

Erfindungsgemäß wird eine de novo-Proteindomäne mit hervorragenden Bindungseigenschaften an das Material einer Affinitätschromatographiesäule bereitgestellt. Fusionsproteine aus dem zu reinigenden rekombinanten Protein und der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne können schnell, effizient und automatisierbar mit hoher Ausbeute mittels Affinitätschromatographie gereinigt werden.According to the invention, a de novo protein domain with excellent Binding properties to the material of an affinity chromatography column are provided. Fusion proteins from the recombinant protein to be purified and the invention de novo protein domain can be fast, efficient and automatable with high yield be purified using affinity chromatography.

Die erfindungsgemäße de novo-Proteindomäne umfaßt insbesondere folgende strukturelle Elemente bzw. Module:
The de novo protein domain according to the invention comprises in particular the following structural elements or modules:

a) an amino acid sequence specific to the material of a chromatography column binds (hereinafter also referred to as the tag sequence),
b) an amino acid sequence with a helical secondary structure (hereinafter also as Helix sequence), and
c) an amino acid sequence that connects the amino acid sequences of a) and b) (im hereinafter also referred to as the linker sequence).

Unter de novo-Proteindomäne wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Proteindomäne verstanden, die de novo, d. h. von Beginn an neu synthetisiert wurde. Die Proteindomäne, insbesondere die Helix-Sequenz kann basierend auf Strukturdaten von natürlichen Proteinen, die beispielsweise Kristallstrukturen und/oder NMR-Strukturen entnommen werden, durch de novo-Synthese hergestellt werden. Es handelt sich jedoch bei der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne und insbesondere auch bei der Helix- Sequenz in jedem Fall um eine künstliche Aminosäuresequenz, die in dieser Form nicht durch eine natürliche DNA-Sequenz kodiert wird.A de novo protein domain is used in the context of the present invention Protein domain understood, the de novo, d. H. was synthesized from the beginning. The Protein domain, in particular the helix sequence, can be based on structural data from natural proteins, for example crystal structures and / or NMR structures be removed, are produced by de novo synthesis. However, it is about the de novo protein domain according to the invention and in particular also in the helix In any case, the sequence is an artificial amino acid sequence that cannot be represented in this form a natural DNA sequence is encoded.

Die erfindungsgemäße de novo-Proteindomäne (im folgenden auch als de novo-Protein-Tag oder de novo-Helixprotein bezeichnet) übertrifft hinsichtlich ihrer Bindungseigenschaften an das Material einer Chromatographie-Säule alle aus dem Stand der Technik bekannten His- Tag-Proteine. Ein Fusionsprotein, umfassend das zu reinigende rekombinante Protein und das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße de novo-Protein-Tag, eluiert erst dann von einer Matrix, wenn die Elution herkömmlich getaggter, beispielsweise (His)₆- bzw. (His)₁₀- getaggter Proteine und sämtlicher Verunreinigungen abgeschlossen ist.The de novo protein domain according to the invention (hereinafter also referred to as de novo protein tag or de novo helix protein) surpasses all His tag proteins known from the prior art in terms of their binding properties to the material of a chromatography column. A fusion protein comprising the recombinant protein to be purified and the de novo protein tag according to the invention described above only elutes from a matrix when the elution of conventionally tagged, for example (His) ₆ - or (His) ₁₀ - tagged proteins and all contamination is complete.

Diese exzellenten Affinitätseigenschaften des erfindungsgemäßen de novo-Protein-Tags erlauben eine schnelle und leicht handhabbare Proteinreinigung in lediglich einem Reinigungsschritt nahezu bis zur Homogenität des zu reinigenden Proteins. Aufgrund dieser hervorragenden Bindungseigenschaften bzw. des selektiven Elutionsverhaltens von Fusionsproteinen, die das erfindungsgemäße de povo-Protein-Tag umfassen, ist eine effiziente und automatisierte Aufreinigung von rekombinanten Zielproteinen möglich. Somit ist u. a. bei der Proteom-Analyse nach der Etablierung eines Vektorsystems zur Expression von biologisch bzw. medizinisch relevanten Fusionsproteinen mit der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne eine automatisierbare Anzucht, Reinigung und Charakterisierung der Zielproteine gewährleistet.These excellent affinity properties of the de novo protein tag according to the invention allow fast and easy-to-use protein purification in just one Purification step almost to the homogeneity of the protein to be purified. Based on these excellent binding properties and the selective elution behavior of Fusion proteins comprising the de povo protein tag of the invention is one efficient and automated purification of recombinant target proteins possible. Consequently is u. a. in the proteome analysis after the establishment of a vector system for expression of biologically or medically relevant fusion proteins with the de novo protein domain an automatable cultivation, cleaning and characterization of the Guaranteed target proteins.

Die Tag-Sequenz besteht vorzugsweise aus identischen Aminosäuren, die, insbesondere aufgrund von Ladungen in den Seitenketten der Aminosäuren, spezifisch an die Matrix der Chromatographiesäule binden. Falls das Säulenmaterial ein Nickelsalz ist, beispielsweise Nickel-Nitrilotriessigsäure, (Ni-NTA) ist die Tag-Sequenz vorzugsweise eine Poly-His- Sequenz. Bei anderen Säulenmaterialien kann auch ein Poly-Arg-, Poly-Lys-, Poly-Asp bzw. Poly-Glu-Sequenz und dergleichen mit Vorteil verwendet werden. Um die Bindungsaffinität an das Säulenmaterial nicht negativ zu beeinflussen, umfaßt die Tag-Sequenz vorzugsweise sechs bis zehn Aminosäuren, besonders bevorzugt sechs bis zehn Histidine.The tag sequence preferably consists of identical amino acids, which, in particular due to charges in the side chains of the amino acids, specific to the matrix of the Bind the chromatography column. If the column material is a nickel salt, for example Nickel nitrilotriacetic acid, (Ni-NTA) the tag sequence is preferably a poly His Sequence. For other column materials, a poly-arg, poly-lys, poly-asp or Poly-Glu sequence and the like can be used with advantage. The binding affinity to not adversely affect the column material, preferably includes the tag sequence six to ten amino acids, particularly preferably six to ten histidines.

Als Tag-Sequenzen können alternativ auch antigene Determinanten eingesetzt werden. Derartige Epitop-Tag-Sequenzen stellen jedoch in der Regel keine bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.Alternatively, antigenic determinants can also be used as tag sequences. However, such epitope tag sequences are generally not preferred Embodiments of the present invention.

Um die außergewöhnlich hohe Bindungsaffinität der Tag-Sequenz der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne zu gewährleisten, ist es ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung, daß die erfindungsgemäße Proteindomäne einen definierten helikalen, insbesondere α-helikalen Sekundärstrukturbereich umfaßt. Durch diesen definierten Sekundärstrukturbereich der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne wird gewährleistet, daß die Tag-Sequenz unabhängig von der Tertiärstruktur des zu reinigenden Proteins für eine Wechselwirkung mit dem Material der Chromatographie-Säule frei zugänglich ist. Als Sekundärstrukturelement ist deshalb eine Helix, insbesondere eine α-Helix gegenüber einem β-Faltblatt bevorzugt, da die räumliche Ausdehnung einer Helix in eine definierte Richtung erfolgt und ferner eine zuverlässigere Faltung der synthetischen Sequenz erfolgt. To the exceptionally high binding affinity of the tag sequence of the invention Ensuring de novo protein domain is an essential feature of the present Invention that the protein domain according to the invention has a defined helical, in particular comprises α-helical secondary structure region. Defined by this The secondary structure area of the de novo protein domain according to the invention is guaranteed that the tag sequence is independent of the tertiary structure of the protein to be purified for one Interaction with the material of the chromatography column is freely accessible. As The secondary structure element is therefore a helix, in particular an α-helix compared to one β-sheet preferred because of the spatial extent of a helix in a defined direction and there is also a more reliable folding of the synthetic sequence.

Vorzugsweise faltet sich der helikale Teil der erfindungsgemäßen Proteindomäne spontan in seine definierte Konformation. So wird sichergestellt, daß nahezu unter allen Bedingungen die Tag-Sequenz dem umgebenden Bulk-Medium gut zugänglich bleibt. Beispielsweise umfaßt die Helix-Sequenz der erfindungsgemäßen Proteindomäne helikale Leucin-Zipper- Domänen.The helical part of the protein domain according to the invention preferably folds spontaneously its defined conformation. This ensures that almost under all conditions the tag sequence remains easily accessible to the surrounding bulk medium. For example comprises the helix sequence of the protein domain according to the invention helical leucine zipper Domains.

Die Helix-Sequenz der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne umfaßt vorzugsweise etwa mindestens 10 bis etwa 60 Aminosäuren, kann aber auch bis zu 100 oder mehr Aminosäuren umfassen. Zur Versteifung von langen Helices werden bevorzugt Prolin-Reste in die Helix-Sequenz eingebaut.The helix sequence of the de novo protein domain according to the invention preferably comprises about at least 10 to about 60 amino acids, but can also be up to 100 or more Include amino acids. Proline residues are preferred for stiffening long helices built into the helix sequence.

Bei einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Helix-Sequenz wird das hydrophobe Proteinrückgrat durch Valin- und Leucin-Reste gebildet. Ebenso ist es bevorzugt, daß Serin-, Glutamat-, Aspartat- und Arginin-Reste in die Helix-Sequenz eingeführt werden, um ein bestimmtes Ladungsmuster zu erzeugen. Ferner kann es bevorzugt sein, einen aromatischen Rest, insbesondere einen Tryptophan-Rest in die erfindungsgemäße Proteindomäne, vorzugsweise in die Helix-Sequenz einzuführen, um eine leichte UV-Detektion des Fusionsproteins zu ermöglichen. Die Einführung von Cystein-Resten kann vorteilhaft sein, um eine definierte kovalente chemische Modifizierung des erfindungsgemäßen de novo- Protein-Tags zu ermöglichen, wie beispielsweise die Markierung mit Fluoreszenz- Farbstoffen.In a particularly preferred embodiment of the helix sequence, the hydrophobic Protein backbone formed by valine and leucine residues. It is also preferred that serine, Glutamate, aspartate and arginine residues are introduced into the helix sequence to generate certain charge pattern. It may also be preferred to use an aromatic one Residue, in particular a tryptophan residue in the protein domain according to the invention, preferably in the helix sequence to facilitate easy UV detection of the To allow fusion protein. The introduction of cysteine residues can be advantageous for a defined covalent chemical modification of the de novo Enable protein tags, such as labeling with fluorescent Dyes.

Durch die de novo-Synthese der Helix-Sequenz wird sichergestellt, daß sich keine Protease- Schnittstellen in der Helix-Sequenz befinden, die bei einer im nachfolgenden beschriebenen, häufig bevorzugten proteolytischen Abspaltung der erfindungsgemäßen de novo- Proteindomäne von dem zu reinigenden Protein nach der chromatographischen Reinigung zu unerwünschten Nebenprodukten führt. The de novo synthesis of the helix sequence ensures that no protease Interfaces are located in the helix sequence, which are described in a Frequently preferred proteolytic cleavage of the de novo Protein domain from the protein to be purified after chromatographic purification leads to undesirable by-products.

Die Linker-Sequenz zwischen der Tag-Sequenz und der Helix-Sequenz ist eine Aminosäure- Sequenz aus beliebigen Aminosäuren, vorzugsweise aus 5 bis 10 Aminosäuren, die dazu dient, eine hohe Flexibilität der Tag-Sequenz und somit eine hohen Bindungskapazität an die Affinitätsmatrix zu gewährleisten. Diese Flexibilität wird bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dadurch noch weiter erhöht, daß die Linker- Sequenz von jeweils mindestens einem Glycin-Rest flankiert ist.The linker sequence between the tag sequence and the helix sequence is an amino acid Sequence from any amino acids, preferably from 5 to 10 amino acids, to this serves a high flexibility of the tag sequence and thus a high binding capacity to the Ensure affinity matrix. This flexibility is preferred in one Embodiment of the present invention further increased in that the linker Sequence is flanked by at least one glycine residue.

Besonders bevorzugt umfaßt das erfindungsgemäße de novo-Protein-Tag ferner eine Endoprotease-Schnittstelle, so daß die de novo-Proteindomäne von dem zu reinigenden Protein entfernt werden kann. Bei dieser Ausführungsform setzt sich das Fusionsprotein, umfassend das zu reinigende Protein sowie die de novo-Proteindomäne, aus den folgenden Modulen in dieser Reihenfolge zusammen: zu reinigendes Protein, Protease-Schnittstelle, Helix-Sequenz, Linker-Sequenz, Tag-Sequenz.The de novo protein tag according to the invention particularly preferably further comprises one Endoprotease interface, so that the de novo protein domain of the one to be purified Protein can be removed. In this embodiment, the fusion protein comprising the protein to be purified and the de novo protein domain, from the following Modules together in this order: protein to be purified, protease interface, Helix sequence, linker sequence, tag sequence.

Die Endoprotease-Schnittstelle wird ausgewählt aus dem Fachmann geläufigen Schnittstellen für Serin-, Cystein, Aspartat- und Metall-Proteasen, wie beispielsweise Elastase, Trypsin, Chymotripsin, Calpaine und dergleichen. Vorzugsweise ist die Protease-Schnittstelle eine spezifische Schnittstelle für eine IgA-Protease und umfaßt besonders bevorzugt die Sequenz PTPPTP. Die Verwendung einer Prolin-reichen Protease-Schnittstelle ermöglicht, daß die Schnittstelle für Endoproteasen stets gut zugänglich bleibt.The endoprotease interface is selected from interfaces familiar to the person skilled in the art for serine, cysteine, aspartate and metal proteases, such as elastase, trypsin, Chymotripsin, calpaine and the like. The protease interface is preferably one specific interface for an IgA protease and particularly preferably comprises the sequence PTPPTP. The use of a proline-rich protease interface enables the Interface for endoproteases always remains easily accessible.

Vorzugsweise wird die Protease-Schnittstelle von jeweils mindestens einem Glycin-Rest flankiert, was beträchtlich zu einer hohen Flexibilität und damit Zugänglichkeit der Protease- Schnittstelle beiträgt.The protease interface is preferably each of at least one glycine residue flanked, which considerably increases the flexibility and thus accessibility of the protease Interface contributes.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA-Sequenz, die für die vorstehend beschriebene erfindungsgemäße de novo-Proteindomäne kodiert. Another object of the present invention is a DNA sequence for encoded de novo protein domain according to the invention described above.

Bei einem weiteren wesentlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung eines rekombinanten Proteins mittels Affinitätschromatographie bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte:
In a further essential aspect of the present invention, a method for purifying a recombinant protein by means of affinity chromatography is provided, comprising the following steps:

a) insertion of the DNA sequence according to the invention described above into one Expression vector comprising a gene encoding the recombinant target protein;
b) transformation and cultivation of the transformed cells;
c) cell disruption of the harvested cells;
d) loading the soluble protein fraction on a chromatography column;
e) optionally removing non-specifically bound proteins by washing steps; and
f) if necessary, the recombinant protein is split off from the de novo Protein domain.

Bei einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in Schritt a) anstelle der erfindungsgemäßen künstlichen DNA-Sequenz, die für die vorstehend beschriebene erfindungsgemäße de novo-Proteindomäne kodiert, eine DNA-Sequenz in den für das rekombinante Zielprotein kodierenden Expressionsvektor insertiert werden, die neben den für die Module Tag-Sequenz, Linker-Sequenz und gegebenenfalls Protease- Schnittstellen-Sequenz kodierenden Bereichen eine natürlich vorkommende, für eine Helix- Sequenz kodierenden DNA-Sequenz enthält. Gegebenenfalls kann eine derartige natürlich vorkommende DNA-Sequenz auch eine für eine Tag-Sequenz, Linker-Sequenz und/oder gegebenenfalls für eine Protease-Schnittstellen-Sequenz kodierende DNA-Sequenz umfassen. Derartige natürlich vorkommende, für Helix-Sequenzen kodierende DNA-Sequenzen sind dem Fachmann ohne weiteres beispielsweise durch Durchsuchen von Proteinstrukturen aus Proteinstruktur-Datenbanken nach entsprechenden Helix-Bereichen zugänglich. In an alternative embodiment of the method according to the invention, step a) instead of the artificial DNA sequence according to the invention, for the above described de novo protein domain according to the invention encodes a DNA sequence in the expression vector coding for the recombinant target protein are inserted, in addition to for the modules tag sequence, linker sequence and, if applicable, protease Interfaces sequence coding areas a naturally occurring, for a helix Contains sequence encoding DNA sequence. If necessary, such a course occurring DNA sequence also one for a tag sequence, linker sequence and / or optionally encoding a DNA sequence coding for a protease interface sequence. Such naturally occurring DNA sequences coding for helix sequences are to the person skilled in the art, for example, by searching protein structures Protein structure databases accessible according to corresponding helix areas.

Schließlich ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne zur Aufreinigung von rekombinanten Proteinen, insbesondere zur Aufreinigung von biologisch bzw. medizinisch relevanten Proteinen bei der Proteomanalyse.Finally, another object of the present invention is the use of the de novo protein domain according to the invention described above for the purification of recombinant proteins, especially for the purification of biological or medical relevant proteins in proteome analysis.

Im folgenden wird eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die Entwicklung, Expression und Analyse eines Proteins mit exzellenter Affinität an Ni-NTA beschrieben:
Die erfindungsgemäße Proteindomäne umfasst in dieser bevorzugten Ausführungsform drei Elemente: (i) ein aminoterminales (His)₆-Tag, (ii) einen Linker bzw. Spacer und (iii) eine α- helikale Verlängerung (siehe Abb. 1).A particularly preferred embodiment of the present invention, the development, expression and analysis of a protein with excellent affinity for Ni-NTA is described below:
In this preferred embodiment, the protein domain according to the invention comprises three elements: (i) an amino-terminal (His) ₆ tag, (ii) a linker or spacer and (iii) an α-helical extension (see FIG. 1).

Die hohe Bindungsaffinität des (His)₆-Tags an das Ni-NTA-Harz beruht auf der gezielten Auswahl der die Primärstruktur dieser Proteindomäne bildenden Aminosäuren. Die gesamte Proteinkonformation und die eingeführten Glycin-Reste, die sich an den Enden des Spacers zwischen dem Tag und der Helix befinden, sind für die räumliche Flexibilität verantwortlich. Somit ist das aminoterminale (His)₆-Tag so frei zugänglich, daß es fest an eine Ni-NTA- Matrix binden kann.The high binding affinity of the (His) ₆ tag to the Ni-NTA resin is based on the targeted selection of the amino acids that form the primary structure of this protein domain. The overall protein conformation and the introduced glycine residues, which are located at the ends of the spacer between the tag and the helix, are responsible for the spatial flexibility. Thus, the amino terminal (His) ₆ tag is so freely accessible that it can bind firmly to a Ni-NTA matrix.

Um die gute Zugänglichkeit einer Protease-Schnittstelle zu veranschaulichen, die sich bei einer Verwendung der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne zur Reinigung von rekombinanten Proteinen zwischen dem zu reinigenden Protein und der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne befinden würde, enthält in dieser speziellen Ausführungsform der Spacer eine eindeutige IgA-Protease-Schnittstelle (P. Steinrücke et al., Anal. Biochem 2000, 286, im Druck). In order to illustrate the good accessibility of a protease interface which would be located between the protein to be purified and the de novo protein domain according to the invention if the de novo protein domain according to the invention were used for the purification of recombinant proteins, the spacer contains one in this specific embodiment unique IgA protease interface (P. Steinrücke et al., Anal. Biochem 2000 , 286 , in press).

Die Proteinkonzentration des gereinigten Proteins wurde auf der Basis des einzigen in der de novo-Sequenz vorkommenden Tip 60-Rests bestimmt (Daten nicht gezeigt): eine Lösung von 1 mg/ml des gereinigten Proteins zeigte eine Absorption von 0,50 bei A₂₈₀. Das am C- Terminus der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne angeordnete Cys 92 wurde für eine definierte S-Alkylierung des Proteins mit Fluoreszenzfarbstoffen, wie beispielsweise Tetramethylrhodamin für ein Protease-Assay (P. Steinrücke et al., siehe oben) und Protein- Protein-Wechselwirkungsuntersuchungen verwendet.The protein concentration of the purified protein was determined based on the only Tip 60 residue present in the de novo sequence (data not shown): a solution of 1 mg / ml of the purified protein showed an absorption of 0.50 at A ₂₈₀ . The Cys 92 located at the C-terminus of the de novo protein domain according to the invention was used for a defined S-alkylation of the protein with fluorescent dyes, such as, for example, tetramethylrhodamine for a protease assay (P. Steinrücke et al., See above) and protein-protein Interaction studies used.

Basierend auf Strukturdaten der helikalen Gruppe des DNA-bindenden Transkriptionsfaktors c-Jun (F. K. Junius et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 13663-13667) wurde die helikale Konformation dieser besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne durch Computer-Modelling entworfen. Dabei minimierten repetitive Aminosäure-Sequenzen von sich wiederholenden Heptameren das Risiko der Einführung von ungewünschten proteolytischen Schnittstellen.Based on structural data from the helical group of the DNA-binding transcription factor c-Jun (F.K. Junius et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 13663-13667) became the helical Conformation of this particularly preferred embodiment of the de Novo protein domain designed by computer modeling. Repetitive minimized Amino acid sequences from repeating heptamers introduce the risk of unwanted proteolytic interfaces.

Das synthetische Gen wurde durch PCR unter Verwendung von überlappenden Oligonukleotiden und einem Satz von ineinander gefügten Primern synthetisiert (siehe Beispiele). Die Verwendung des Kodons wurde an eine Expression in E coli angepaßt (D. P. Williams et al., Nucleic Acids Res. 1988, 16, 10453-10467). Ein 315-bp DNA-Fragment bildete ein 10,5 kDa-Protein, das fest an Ni-NTA bindet.The synthetic gene was overlapped by PCR using Oligonucleotides and a set of nested primers synthesized (see Examples). The use of the codon was adapted for expression in E. coli (D.P. Williams et al., Nucleic Acids Res. 1988, 16, 10453-10467). A 315 bp DNA fragment formed a 10.5 kDa protein that binds tightly to Ni-NTA.

Das so erhaltene Helix-Protein wurde aus dem klaren Lysat unter nativen Bedingungen gereinigt. Aufgrund der zweifachen Zelllyse, einschließlich der Zugabe von auf 60°C erwärmtem PBS, befanden sich nach der Zentrifugation ungefähr 30-50% der erfindungsgemäßen Proteindomäne im Überstand. Die feste Assoziierung zwischen dem (His)₆-Tag der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne und dem Ni-NTA-Harz erlaubte eine Imidazol-Konzentration in dem Säulen-Equilibrierungspuffer von mindestens 20 mM. Somit flossen nahezu alle Verunreinigungen durch oder wurden auf einfache Weise während eines Imidazol-Gradienten von 0 bis 300 mM ausgewaschen (siehe Abb. 3, B I, Bahn 4 - 6). Im Gegensatz zu den meisten His-getaggten Proteinen, die in Puffern mit Imidazol- Konzentrationen von 80 mM bis 120 mM eluieren (A. Hoffmann und R. G. Roeder, Nucleic Acids Res. 1991, 19, 6337-6338), begann die Eluierung des erfindungsgemäßen Helix- Protein-Tags erst bei einer Imidazol-Konzentration von 250 mM (siehe Abb. 2, B I, Bahn 6) und endete bei 1,0 M Imidazol (siehe Abb. 2, B II, Bahn 9). Dieses Eluierungsverhalten der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne führte zu einer homogenen Reinigung des Proteins in lediglich einem Reinigungsschritt (siehe Abb. 2, B II).The helix protein thus obtained was purified from the clear lysate under native conditions. Due to the double cell lysis, including the addition of PBS heated to 60 ° C., about 30-50% of the protein domain according to the invention were in the supernatant after centrifugation. The firm association between the (His) ₆ tag of the de novo protein domain according to the invention and the Ni-NTA resin allowed an imidazole concentration in the column equilibration buffer of at least 20 mM. Thus flowed almost all the impurities by or gradient of imidazole was from 0 to 300 mM washed out (see Figure 3, BI, lane 4. - 6) in a simple manner during a. In contrast to most His-tagged proteins, which elute in buffers with imidazole concentrations of 80 mM to 120 mM (A. Hoffmann and RG Roeder, Nucleic Acids Res. 1991, 19, 6337-6338), the elution of the invention began Helix protein tags only at an imidazole concentration of 250 mM (see Fig. 2, BI, lane 6 ) and ended at 1.0 M imidazole (see Fig. 2, B II, lane 9 ). This elution behavior of the de novo protein domain according to the invention led to a homogeneous purification of the protein in only one purification step (see Fig. 2, B II).

Zum Vergleich des Reinigunsgverhaltens der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne mit einem gewöhnlichen His-getaggten Protein wurde eine (His)₁₀-Pyrophophatase auf dieselbe Ni-NTA-Säule aufgegeben. Auf die selbe Weise wie die erfindungsgemäße de novo- Proteindomäne wurde die (His)₁₀-Pyrophophatase in ausreichenden Mengen durch heterologe Expression in E. coli produziert. Das Molekulargewicht ist mit 19 kDa im selben Bereich und enthält eine Protease-Schnittstelle (T. Hansen, Charakterisierung, Struktur und Thermostabilität der cytosolischen Pyrophosphatase aus Sulfolobus acidocaldarius, Doktorarbeit, Medizinische Universität zu Lübeck, Institut für Biochemie (1998)). Die Abb. 3 zeigt das Eluierungs-Verhalten der (His)₁₀-Pyrophophatase beginnend bei 200 mM (siehe Abb. 3, B, Bahn 3) und endend bei 400 mM Imidazol (siehe Abb. 3, B, Bahn 8).To compare the purification behavior of the de novo protein domain according to the invention with an ordinary His-tagged protein, a (His) ₁₀ pyrophophase was applied to the same Ni-NTA column. In the same way as the de novo protein domain according to the invention, the (His) ₁₀ pyrophophase was produced in sufficient quantities by heterologous expression in E. coli. The molecular weight of 19 kDa is in the same range and contains a protease interface (T. Hansen, characterization, structure and thermostability of the cytosolic pyrophosphatase from Sulfolobus acidocaldarius, doctoral thesis, Medical University of Lübeck, Institute of Biochemistry ( 1998 )). Fig. 3 shows the elution behavior of the (His) ₁₀ pyrophophase starting at 200 mM (see Fig. 3, B, lane 3 ) and ending at 400 mM imidazole (see Fig. 3, B, lane 8 ).

Die Konstruktion, Expression und Reinigung der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen synthetischen (His)₆-getaggten helikalen de novo-Proteindomäne zeigte, daß diese Proteindomäne hervorragend geeignet für eine der am häufigsten verwendeten Reinigungstechniken für rekombinante Proteine, das (His)₆/Ni-NTA-System, ist. Die Affinität der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne an Ni-NTA-Harz ist weitaus größer als die Wechselwirkung zwischen den meisten Antikörpern und Antigenen (J. Crowe et al., siehe oben) und erlaubt stringente Bedingungen für das Auswaschen von Hintergrundverunreinigungen. Die gut definierten strukturellen Komponenten der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne, nämlich vorzugsweise das flexible (His)₆-Tag, der Spacer und das α-helikale Strukturelement, führen zu einem wesentlich verbesserten Bindungsverhalten an die Ni-NTA-Matrix.The construction, expression and purification of the synthetic (His) ₆ -tagged helical de novo protein domain according to the invention described above showed that this protein domain is outstandingly suitable for one of the most frequently used purification techniques for recombinant proteins, the (His) ₆ / Ni-NTA- System, is. The affinity of the de novo protein domain according to the invention for Ni-NTA resin is far greater than the interaction between most antibodies and antigens (J. Crowe et al., See above) and allows stringent conditions for the washing out of background contaminants. The well-defined structural components of the de novo protein domain according to the invention, namely preferably the flexible (His) ₆ tag, the spacer and the α-helical structural element, lead to a significantly improved binding behavior to the Ni-NTA matrix.

Während His-getaggte Proteine üblicherweise mit Imidazol-Konzentrationen bis 120 mM eluieren (A. Hoffmann und R. G. Roeder, siehe oben), eluierte das Vergleichsprotein (His)₁₀- Pyrophophatase bei 200-400 mM Imidazol. Diese verglichen mit dem normalen Verhalten erhöhte Affinität an die Ni-NTA-Matrix ist wahrscheinlich durch die 10 Histidin-Reste des Tags begründet.While His-tagged proteins usually elute with imidazole concentrations up to 120 mM (A. Hoffmann and RG Roeder, see above), the comparative protein (His) ₁₀ - pyrophophatase eluted at 200-400 mM imidazole. This increased affinity for the Ni-NTA matrix compared to normal behavior is probably due to the 10 histidine residues of the day.

Die starke Affinität des erfindungsgemäßen de novo-Protein-Tags resultiert jedoch sogar in einem Elutionsverhalten im Bereich von 300 mM bis 1,0 M Imidazol. Verunreinigende E. coli-Proteine wurden bis 200 mM Imidazol coeluiert. Aufgrund der stringenten Waschbedingungen konnten die Verunreinigungen leicht entfernt werden, was zu einer homogenen Proteinreinigung in lediglich einem Reinigungsschritt führt. Folglich wurde die erfindungsgemäße de novo-Proteindomäne bei wesentlich höheren Imidazol-Konzentrationen eluiert als E. coli-Verunreinigungen, gewöhnliche His-getaggte Proteine, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind (A. Hoffmann und G. R. Roeder, siehe oben) und selbst als das Vergleichsprotein (His)₁₀-Pyrophophatase mit einem verbesserten Bindungsverhalten an Ni- NTA.However, the strong affinity of the de novo protein tag according to the invention even results in an elution behavior in the range from 300 mM to 1.0 M imidazole. Contaminating E. coli proteins were coeluted up to 200 mM imidazole. Due to the stringent washing conditions, the impurities could be easily removed, which leads to homogeneous protein purification in just one cleaning step. Consequently, the de novo protein domain according to the invention was eluted at significantly higher concentrations of imidazole than E. coli impurities, conventional His-tagged proteins as described in the prior art (A. Hoffmann and GR Roeder, see above) and even as the comparison protein (His) ₁₀ pyrophophase with an improved binding behavior to Ni-NTA.

Die Bindung von His-getaggten Proteinen wird nicht durch die Konformation des His-Tags beeinflußt, was im Gegensatz zu anderen Reinigungssystemen wie Enzym/Substrat- oder Antigen/Antikörper-Reaktionen, die Proteinreinigung unter stark denaturierenden Bedingungen erlaubt. The binding of His-tagged proteins is not due to the conformation of the His-Tag affects what unlike other cleaning systems such as enzyme / substrate or Antigen / antibody reactions, protein purification under strongly denaturing Conditions allowed.

Die außergewöhnlich hohe Affinität eines His-Tags oder einer anderen Aminosäuresequenz mit hoher Affinität an das Material der Chromatographiesäule der erfindungsgemäßen de novo-Proteindomäne wird erfindungsgemäß durch einen Linker und eine strukturell gut definierte helikale Sekundärstruktur gewährleistet. Der helikale Teil des erfindungsgemäßen de novo-Proteins faltet sich spontan in seine definierte Konformation. Somit wird sichergestellt, daß unter nahezu allen Bedingungen das Tag dem umgebenden Bulk-Medium frei zugänglich bleibt. Die bevorzugte Einführung von Glycin-Resten an den Seiten der Linker-Sequenz trägt wesentlich zu einer hohen Molekularflexibilität und somit zu einer hohen Bindungskapazität an die Affinitätsmatrix bei. Die bevorzugte Verwendung von Prolin-reichen Protease-Schnittstellen gewährleistet, daß auch die Schnittstelle für Endoproteasen gut zugänglich bleibt. Während etwa 30% aller His-getaggten Proteine eine mäßige bis schwache Affinität an eine Ni-NTA-Matrix zeigen, weist die erfindungsgemäße de novo-Proteindomäne mit einem His-Tag eine sehr hohe Affinität an Ni-NTA auf. Somit ist die erfindungsgemäße de novo-Proteindomäne für zahlreiche Anwendungen in der Molekularbiologie, Biochemie und Biotechnologie geeignet.The exceptionally high affinity of a His tag or other amino acid sequence with high affinity for the material of the chromatography column of the de Novo protein domain is structurally good according to the invention by a linker and a defined helical secondary structure guaranteed. The helical part of the invention de novo protein folds spontaneously into its defined conformation. Thus ensures that the tag is in bulk in almost all conditions remains freely accessible. The preferred introduction of glycine residues on the sides of the Linker sequence contributes significantly to a high molecular flexibility and thus to one high binding capacity to the affinity matrix. The preferred use of Proline-rich protease interfaces ensure that the interface for Endoproteases remains easily accessible. While about 30% of all His-tagged proteins are one show moderate to weak affinity for a Ni-NTA matrix, the de novo protein domain with a His tag has a very high affinity for Ni-NTA. So is the de novo protein domain according to the invention for numerous applications in the Molecular biology, biochemistry and biotechnology suitable.

Die Erfindung wird im folgenden durch Beispiele beschrieben, die die Erfindung jedoch nicht einschränken.The invention is described below by examples, but the invention is not limit.

example 1 Design of a helix protein

Ein α-helikales Protein wurde unter Verwendung einer Silicon Graphics Indigo 2- Arbeitsstation mit dem Biopolymer-Modul des SYBYL 6.4-Softwarepakets von Tripos entwickelt. Als biologischer Prototyp wurden die Daten des c-Jun-Proteins verwendet (F. K. Junius et al., siehe oben). Die Gesamtstruktur des synthetisch hergestellten de novo- Proteins ist eine helikale Gruppe aus zwei helikalen Zipper-Domänen mit einem hydrophoben Rückgrat aus Valin und Leucin an den Positionen a und d der sich wiederholenden heptameren abcdefg-Sequenz. Serin-Reste besetzen die Positionen b und c, während an den Positionen e, f und g geladene Aminosäuren wie Glutamat, Aspartat und Arginin oder Serin- Reste eingeführt wurden, um ein bestimmtes Ladungsmuster zu erzeugen.An α-helical protein was isolated using a Silicon Graphics Indigo 2- Workstation with the biopolymer module of the SYBYL 6.4 software package from Tripos developed. The data of the c-Jun protein was used as a biological prototype (F.K. Junius et al., See above). The overall structure of the synthetically produced de novo Proteins is a helical group of two helical zipper domains with a hydrophobic one Backbone of valine and leucine at positions a and d of the repeating ones heptameric abcdefg sequence. Serine residues occupy positions b and c, while at the Positions e, f and g charged amino acids such as glutamate, aspartate and arginine or serine Residues were introduced to create a specific charge pattern.

An Position 60 wurde ein Tryptophan-Rest zur Gewährleistung einer einfachen UV-Detektion des de novo-Proteins eingeführt. Cys 92 erlaubte eine definierte kovalente chemische Modifikation wie beispielsweise die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen. Das (His)₆-Tag für die schnelle Affinitätsreinigung und weitere Immobilisierungs-Versuche wurde an das aminoterminale Ende des Proteins angefügt. Zwischen dem His-Tag und der α-Helix, wurde eine eindeutige Schnittstelle für die IgA-Protease (PTPPTP) eingeführt, so daß das His-Tag von dem Protein entfernt werden kann. Die IgA-Protease-Schnittstelle ist von zwei Glycin- Resten flankiert, so daß eine hohe Flexibilität des Tags und der Protease-Schnittstelle gewährleistet ist.At position 60 , a tryptophan residue was introduced to ensure easy UV detection of the de novo protein. Cys 92 allowed a defined covalent chemical modification such as labeling with fluorescent dyes. The (His) ₆ tag for rapid affinity purification and further immobilization attempts was added to the amino terminal end of the protein. A clear interface for the IgA protease (PTPPTP) was introduced between the His tag and the α helix so that the His tag can be removed from the protein. The IgA protease interface is flanked by two glycine residues, so that a high flexibility of the tag and the protease interface is guaranteed.

Example 2 Synthesis of the gene cassettes for the helix protein

Die 315 bp-Gen-Kassette für ein Helix-Protein gemäß Beispiel 1 wurde vom 3'-Ende durch schrittweise PCR-Amplifizierung von 3'-überlappenden DNA-Fragmenten synthetisiert (P. Steinrücke et a., siehe oben). Die Überlappe wurden verwendet, um einen Satz von spezifischen ineinandergefügten Primern für die PCR-Amplifizierung des Zwischenprodukts abzuleiten. In allen Fällen wurde ein reverser Downstream-Primer, umfassend die EcoRI- Stelle als Downstream-Primer verwendet (P. Steinrücke et al., siehe oben). Eindeutige Restriktionsstellen wurden für die weitere Subklonierung eingefügt. Das endgültige Fragment wurde mit NcoI und EcoRI verdaut und in einen pRSETSD-Vektor insertiert (R. Schoepfer, Gene 1993, 124, 83-85). Als Wirtsstamm Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen) verwendet. Die Sequenz des richtigen Klons wurde durch DNA-Sequenzierung auf einem Licor 4000 Sequenzer verifiziert. The 315 bp gene cassette for a helix protein according to Example 1 was synthesized from the 3 'end by step-wise PCR amplification of 3' overlapping DNA fragments (P. Steinrücke et a., See above). The overlaps were used to derive a set of specific interleaved primers for the PCR amplification of the intermediate. In all cases, a reverse downstream primer comprising the EcoRI site was used as the downstream primer (P. Steinrücke et al., See above). Unique restriction sites were inserted for further subcloning. The final fragment was digested with NcoI and EcoRI and inserted into a pRSETSD vector (R. Schoepfer, Gene 1993 , 124 , 83-85 ). Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) used as host strain. The sequence of the correct clone was verified by DNA sequencing on a Licor 4000 sequencer.

Example 3 Expression of the helix protein

Die Expression des synthetischen Gens aus Beispiel 2 mit dem T7-Promoter war effizient. Die Kulturen wuchsen über Nacht in Luria-Medium (100 µg/ml Ampicillin) bei 37°C und wurden anschließend zentrifugiert, in frischem Luria-Medium wieder suspendiert und bei 28°C angezogen, bis ein A₆₀₀ von 0,7 bis 0.9 erreicht wurde. Nach der Induktion durch Zugabe von IPTG bis auf eine Endkonzentration von 2 mM wurden die Zellen bei 37°C für 3 bis 4 h bis zum Erreichen der späten logaritmischen Phase gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und bei -80°C gelagert.The expression of the synthetic gene from Example 2 with the T7 promoter was efficient. The cultures grew overnight in Luria medium (100 µg / ml ampicillin) at 37 ° C and were then centrifuged, resuspended in fresh Luria medium and grown at 28 ° C until an A ₆₀₀ reached 0.7 to 0.9 has been. After induction by adding IPTG to a final concentration of 2 mM, the cells were grown at 37 ° C. for 3 to 4 hours until the late logarithmic phase was reached. The cells were harvested by centrifugation and stored at -80 ° C.

Die Zellen wurden durch Behandlung mit flüssigem Stickstoff und anschließendem Mörsern zerstört. Das Material wurde in PBS resuspendiert, für 10 Minuten mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert. Das Sediment wurde wieder in auf 60°C erwärmtem PBS suspendiert, mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert.The cells were treated with liquid nitrogen followed by mortar destroyed. The material was resuspended in PBS, sonicated for 10 minutes and centrifuged. The sediment was resuspended in PBS heated to 60 ° C. with Treated with ultrasound and centrifuged.

Comparative experiment 1 Construction, expression and purification of pyrophosphatase

Die Konstruktion, Expression und Reinigung der Pyrophosphatase wurde wie in T. Hansen, siehe oben, beschrieben, durchgeführt.The construction, expression and purification of the pyrophosphatase was carried out as in T. Hansen, see above, performed.

Example 4 Elution from a Ni-NTA column

Der klare Überstand, der das Helix-Protein enthielt, wurde vor der Aufgabe auf eine Ni-NTA- Säule (Ni-NTA von Invitrogen, Niederlande) durch einen 1,2 µm-Filter gefiltert. Die Säule war mit 100 mM Natriumphosphat, 200 mM NaCl, 20 mM Imidazol bei pH 7,5 equilibriert. The clear supernatant, which contained the helix protein, was loaded onto a Ni-NTA Filtered column (Ni-NTA from Invitrogen, The Netherlands) through a 1.2 µm filter. The pillar was equilibrated with 100 mM sodium phosphate, 200 mM NaCl, 20 mM imidazole at pH 7.5.

Die Trennung von E. coli-Proteinen und die Elution des erfindungsgemäßen Helix-Proteins aus Beispiel 3 wurde unter Verwendung eines kontinuierlichen Gradienten bis zu einer Konzentration von 1,0 mM Imidazol durchgeführt (siehe Abb. 2 und 3). Imidazol trägt zur Absorption bei 280 nm bei (siehe Abb. 4). Somit zeigen die Elutionsdiagramme in den Abb. 2 und 3 einen Anstieg in der Absorption mit steigender Imidazolkonzentration auch in Abwesenheit des Proteins.The separation of E. coli proteins and the elution of the helix protein according to the invention from Example 3 was carried out using a continuous gradient to a concentration of 1.0 mM imidazole (see FIGS. 2 and 3). Imidazole contributes to absorption at 280 nm (see Fig. 4). Thus, the elution diagrams in Figs. 2 and 3 show an increase in absorption with increasing imidazole concentration even in the absence of the protein.

Zum Vergleich wurde die Pyrophosphatase aus Vergleichsbeispiel 1 (25 mg/ml) auf eine Ni- NTA-Säule (Invitrogen, Niederlande) aufgegeben, die auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben, equilibriert wurde. Die Elution wurde unter Verwendung eines kontinuierlichen Gradienten bis zu einer Konzentration von 1 M Imidazol durchgeführt. Die Elutionsfraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert.For comparison, the pyrophosphatase from Comparative Example 1 (25 mg / ml) was applied to a Ni NTA column (Invitrogen, Netherlands) abandoned in the same manner as above was described, equilibrated. Elution was carried out using a continuous Gradients up to a concentration of 1 M imidazole are performed. The elution fractions were analyzed by SDS-PAGE.

Example 5 SDS-PAGE analysis

Alle Elutionsfraktionen aus Beispiel 4 wurden durch SDS-PAGE (15% Acrylamid) unter Verwendung von 0,025 M Tris, 0,192 M Glycin, und 0,1% SDS als Elektrophoresepuffer analysiert. Die Proben wurden mit Probenpuffer (50 mM Tris, 10% Mercaptoethanol, 10% Glycin, 0,01% Bromophenol blau, 2% SDS) 1 : 1 verdünnt. Die Elektrophorese wurde unter Verwendung eines Mini-Protean II^TM-Systems (Bio Rad) durchgeführt, und die Gele wurden mit Serva Blue R-250 angefärbt. All elution fractions from Example 4 were analyzed by SDS-PAGE (15% acrylamide) using 0.025 M Tris, 0.192 M glycine, and 0.1% SDS as electrophoresis buffer. The samples were diluted 1: 1 with sample buffer (50 mM Tris, 10% mercaptoethanol, 10% glycine, 0.01% bromophenol blue, 2% SDS). Electrophoresis was performed using a Mini-Protean II ^™ system (Bio Rad) and the gels were stained with Serva Blue R-250.

pictures Fig. 1

a) Schematic diagram of the structural elements of an embodiment of the de novo helix protein according to the invention (G: glycine residues)
b) amino acid sequence of the de novo helix protein according to the invention
Italics: flanking glycine residues (G)
Fat: IgA protease site (PTPPTP)
Underlined: heptamer abcdefg sequence (efg are degenerate)

Fig. 2

A) Purification of the de novo protein according to the invention (from E. coli cell extract) on Ni NTA. The absorption (AU at 280 nm, left side) and the imidazole Gradient (M, thin line, right) against the elution volume (ml). The Helix protein according to the invention eluted in the range from 300 mM to 1.0 M imidazole.
B) (B) I SDS-PAGE analysis of the purification of the de novo protein domain according to the invention lane 1 : E. coli cell extract, supernatant; Lane M: marker ("Pro Sieve, biozyme; the size of the marker proteins is indicated on the right side of B II), lanes 2 + 3: flow, lanes 4-6 : elution of the protein according to the invention and contaminating proteins, imidazole Gradient 0 to 300 mM. Lane 4 : 0.040 M imidazole; Lane 5: 0.250 M imidazole; Lane 6 : 0.310 M imidazole.
C) (B) II lanes 1-3 , 4-9 : elution fractions of the de novo helix protein according to the invention, imidazole gradient 400 mM to 1.0 M, lane M: marker ("Pro Sieve, Biozym; the size of the Marker proteins are shown on the right). Lane 1 : 0.350 M imidazole; Lane 2 : 0.400 M imidazole; Lane 3 : 0.525 M imidazole; Lane 4 : 0.600 M imidazole; Lane 5 : 0.625 M imidazole; Lane 6 : 0.680 M imidazole; lane 7 : 0.750 M imidazole; lane 8 : 0.875 M imidazole; lane 9 : 1.00 M imidazole.

Fig. 3

A) Purification of (His) 6 pyrophosphatase from E. coli cell extract on Ni-NTA. The pyrophosphatase eluted in the range of 200 mM to 400 mM imidazole.
B) SDS-PAGE analysis of the elution behavior of pyrophophatase
Lane 1 : cleaned sample prior to Ni-NTA column cleaning; Lane 2 : flow; Lane M: ("Pro Sieve, Biozym; the size of the marker proteins is shown on the right).
Lanes 3-9 : The elution fractions of pyrophosphatase in the imidazole range of 200-400 mM. Lane 3 : 0.260 M imidazole; Lane 4 : 0.280 M imidazole; Lane 5 : 0.350 M imidazole; Lane 6 : 0.390 M imidazole; Lane 7 : 0.410 M imidazole; Lane 8 : 0.450 M imidazole; Lane 9 : 0.550 M imidazole.

Fig. 4

Absorptionsspektrum (AU) einer Imidazollösung (300 mM) aufgetragen gegen die Wellenlänge (nm) zeigt eine deutliche Absorption von Imidazol bei 280 nm.Absorption spectrum (AU) of an imidazole solution (300 mM) plotted against the Wavelength (nm) shows a clear absorption of imidazole at 280 nm.

Claims

1. A de novo protein domain for use in the purification of recombinant proteins using affinity chromatography, comprising:

a) an amino acid sequence that binds specifically to the material of a chromatography column (tag sequence);
b) an amino acid sequence with a helical secondary structure (helix sequence); and
c) an amino acid sequence that connects the amino acid sequences of a) and b) (linker sequence).

2. Protein domain according to claim 1, characterized in that the tag sequence consists of identical amino acids.

3. Protein domain according to claim 1 or 2, characterized in that the tag sequence comprises 6 to 10 amino acids.

4. Protein domain according to claim 2 or 3, characterized in that the tag sequence is a poly-His sequence, in particular a (His) _6-10 sequence.

5. Protein domain according to one of claims 1 to 4, characterized in that the helix sequence comprises leucine zipper domains.

6. Protein domain according to one of claims 1 to 5, characterized in that the helix sequence comprises 10 to 60 amino acids.

7. Protein domain according to one of claims 1 to 6, characterized in that the helix sequence has an aromatic residue, in particular a tryptophan residue and / or a cysteine residue.

8. Protein domain according to one of claims 1 to 7, characterized in that it additionally comprises an interface for proteases.

9. protein domain according to claim 8, characterized in that the protease interface is an interface for the IgA Is protease.

10. protein domain according to claim 9, characterized in that the protease interface comprises the sequence PTPPTP.

11. Protein domain according to one of claims 1 to 10, characterized in that the linker sequence and / or the protease interface of is flanked in each case at least one glycine residue.

12. DNA sequence for a protein domain according to any one of claims 1 to 11 coded.

13. A method for purifying a recombinant protein using affinity chromatography, comprising the following steps:

a) insertion of the DNA sequence according to claim 12 into an expression vector which comprises a gene coding for the recombinant protein;
b) transformation and cultivation of the transformed cells;
c) cell disruption of the harvested cells;
d) loading the soluble protein fraction on a chromatography column;
e) optionally removing unspecifically bound proteins by washing steps;
f) optionally cleaving the recombinant protein from the protein domain according to one of claims 1 to 11.

14. The method according to claim 13, characterized in that in step a) instead of the DNA sequence according to claim 12 DNA sequence is inserted in addition to that for the module tag sequence, linker sequence and, if appropriate, regions coding for protease interface sequence occurring DNA sequence coding for a helix sequence.

15. The method according to claim 14, characterized in that the naturally occurring DNA sequence is one for a day Sequence, linker sequence and / or optionally for a protease interface sequence encoding DNA sequence.

16. Use of the protein domain according to one of claims 1 to 11 for Purification of recombinant proteins using affinity chromatography.