DE102005011579B4

DE102005011579B4 - Affinity tags for protein purification, its production and use, and methods for purifying a protein

Info

Publication number: DE102005011579B4
Application number: DE200510011579
Authority: DE
Inventors: Dr. Ueffing Marius; Dr. Glöckner Christian Johannes
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschung De
Priority date: 2005-03-14
Filing date: 2005-03-14
Publication date: 2011-12-15
Anticipated expiration: 2025-03-15
Also published as: DE102005011579A1

Abstract

Affinitätsmarker enthaltend eine Hämagglutininepitop-Domäne (HA-Domäne), die mindestens ein HA-Tag enthält, und eine Streptavidinbindungs-Domäne (Strep-Domäne), die mindestens zwei Strep-Tags enthält.Affinity markers containing a hemagglutinine epitope domain (HA domain) which contains at least one HA tag, and a streptavidin binding domain (strep domain) which contains at least two strep tags.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Affinitätsmarker enthaltend eine HA-Domäne und eine Strep-Domäne, ein Protein oder einen Proteinkomplex enthaltend den Affinitätsmarker, eine Nukleinsäure kodierend für den Affinitätsmarker, einen Vektor enthaltend diese Nukleinsäure, ein Verfahren zur Herstellung des Proteins, ein Verfahren zur Aufreinigung eines Proteins sowie die Verwendung des Affnitätsmarkers zur Aufreinigung gemäß dem Patentansprüchen.The present invention relates to an affinity tag containing an HA domain and a Strep domain, a protein or a protein complex containing the affinity tag, a nucleic acid encoding the affinity tag, a vector containing this nucleic acid, a method for producing the protein, a method for purification a protein and the use of the affinity tag for purification according to the claims.

In vielen Bereichen der Industrie und Forschung werden heutzutage reine oder sogar hochreine Produkte benötigt, da die Qualität der Produkte oft durch deren Reinheitsgrad bestimmt wird. Dies betrifft sowohl Stoffe, die aus der Natur isoliert, chemisch synthetisiert oder durch biotechnologische Verfahren hergestellt werden. So finden neben den klassisch isolierten oder hergestellten Stoffen z. B. auch Proteine inzwischen eine zunehmende Verwendung in einer Vielzahl von industriellen Produkten und Verfahren. Sie werden beispielsweise als Arzneimittel, für diagnostische oder auch wissenschaftliche Zwecke eingesetzt. Darüber hinaus werden sie auch in vielen Bereichen des täglichen Lebens wie z. B. als Nahrungsergänzungsmittel, als Zusatzstoffe in der Lebensmittelindustrie, wie z. B. als Backhilfsmittel oder in der Käseherstellung, aber auch beispielsweise in der Papierherstellung, im Hygienebereich oder in Waschmitteln eingesetzt. Hochreine Proteine sind überdies für analytische Verfahren z. B. zur Strukturaufklärung erforderlich.In many areas of industry and research nowadays pure or even high-purity products are needed because the quality of the products is often determined by their degree of purity. This concerns both substances that are isolated from nature, chemically synthesized or produced by biotechnological processes. Thus, in addition to the classically isolated or manufactured substances z. For example, proteins have become increasingly popular in a variety of industrial products and processes. They are used, for example, as pharmaceuticals, for diagnostic or even scientific purposes. In addition, they are also used in many areas of daily life such. B. as dietary supplements, as additives in the food industry, such as. B. used as baking aids or in cheese production, but also for example in papermaking, in the hygiene sector or in detergents. Highly pure proteins are also suitable for analytical methods z. B. required for structural elucidation.

Oft ist es erforderlich, die aus der Natur isolierten, chemisch synthetisierten oder auch biotechnologisch hergestellten Stoffe nach der Gewinnung weiter aufzureinigen, um das Produkt in dem gewünschten Reinheitsgrad zu erhalten. Daher besteht ein wachsender Bedarf an geeigneten Aufreinigungsverfahren. Chemisch synthetisierte Produkte werden hierbei z. B. von Nebenprodukten, noch vorhandenen Ausgangsstoffen, Katalysatoren oder Lösungsmitteln getrennt. Bei der Herstellung von Produkten mittels biotechnologischer Verfahren werden im Allgemeinen Zellen gentechnisch so verändert, dass sie das interessierende Produkt, häufig ein Protein, produzieren. Diese Zellen werden für gewöhnlich in komplexen Zellkulturmedien gezüchtet, die Nährstoffquellen und z. B. Wachstumsfaktoren enthalten. Daher ist es erforderlich, das interessierende Produkt von sowohl den Bestandteilen des Zellkulturmediums als auch den restlichen Zellbestandteilen zu trennen.Often it is necessary to further purify the naturally isolated, chemically synthesized or biotechnologically produced substances after extraction in order to obtain the product in the desired degree of purity. Therefore, there is an increasing demand for suitable purification processes. Chemically synthesized products are z. As by-products, remaining starting materials, catalysts or solvents. In the production of products by biotechnological methods, cells are generally genetically engineered to produce the product of interest, often a protein. These cells are usually grown in complex cell culture media, the nutrient sources and z. B. contain growth factors. Therefore, it is necessary to separate the product of interest from both the constituents of the cell culture medium and the remaining cell constituents.

Bisher ist eine Reihe von Verfahren bekannt, mit denen Produkte von anderen Bestandteilen getrennt werden können. Hierbei macht man sich in der Regel die unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften der Bestandteile einer aufzureinigenden Probe zu Nutze. Klassische Verfahren der Aufreinigung und der Isolierung schließen beispielsweise Extraktion, Fällung, Rekristallisierung, Filtration, Zentrifugation, Wäsche und Trocknung ein. Darüber hinaus werden die Trennverfahren und -prinzipien der Adsorption, Chromatographie oder des Ionenaustauschs eingesetzt. Für chromatographische Verfahren sind unterschiedliche Säulenmaterialien vorhanden, die es erlauben, die Aufreinigung an das bestimmte Produkt, das aufzureinigen ist, anzupassen, wobei die unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten der einzelnen Bestandteile, die z. B. in der Ladungsgröße oder Hydrophobizität begründet sind, ausgenutzt werden.So far, a number of methods are known, with which products can be separated from other components. This usually makes use of the different physical and chemical properties of the constituents of a sample to be purified. Conventional purification and isolation methods include, for example, extraction, precipitation, recrystallization, filtration, centrifugation, washing and drying. In addition, the separation methods and principles of adsorption, chromatography or ion exchange are used. For chromatographic processes, there are different column materials which allow the purification to be adapted to the particular product to be purified, the different migration rates of the individual components, e.g. B. in the charge size or hydrophobicity, be exploited.

Besonders geeignet ist die Affinitätschromatographie, bei der ein Produkt, in der Regel ein Protein, auf Grund seiner Affinität für einen Bindungspartner abgetrennt und so gereinigt wird. Hierzu wurden inzwischen so genannte Tags entwickelt, welche z. B. an ein zu reinigendes Protein gebunden werden. Das Tag besitzt eine Affinität für einen bestimmten Bindungspartner; diese kann für die Affinitätschromatographie verwendet werden. Solche Tags sind universell einsetzbar und können an verschiedene Moleküle gebunden werden. Hierdurch ist es möglich, unterschiedliche Moleküle, insbesondere Proteine, mit dem selben Aufreinigungsverfahren zu reinigen. Das Verfahren muss somit nicht an das jeweilige Produkt speziell angepasst werden.Particularly suitable is affinity chromatography, in which a product, usually a protein, is separated on the basis of its affinity for a binding partner and thus purified. For this purpose, so-called tags have been developed, which z. B. be bound to a protein to be purified. The tag has an affinity for a particular binding partner; this can be used for affinity chromatography. Such tags are universally applicable and can be bound to different molecules. This makes it possible to purify different molecules, in particular proteins, with the same purification method. The process therefore does not have to be specially adapted to the respective product.

Insbesondere um Proteine zu analysieren und zu reinigen ist heute die Technik der Affinitätsmarkierung, d. h. das Anfügen eines Markers oder Tags an ein Protein durch molekularbiologische Techniken, ein häufig angewandtes Verfahren. Dabei wird die Primärsequenz eines beliebigen Proteins mit Hilfe rekombinanter Techniken um einige wenige Aminosäuren erweitert. Ausschlaggebend ist das Vorhandensein eines spezifischen und hochaffinen Bindungsmoleküls, z. B. eines Antikörpers, mit bekannter Erkennungssequenz.In particular, to analyze and purify proteins today is the technique of affinity labeling, d. H. the attachment of a marker or tag to a protein by molecular biology techniques, a commonly used method. The primary sequence of any protein is extended by a few amino acids using recombinant techniques. Decisive is the presence of a specific and high-affinity binding molecule, eg. As an antibody, with known recognition sequence.

Bisher ist eine Reihe von (Affinitäts-)Tags bzw. (Affinitäts-)Markern bekannt. Diese werden für gewöhnlich nach ihrer Größe in 3 Klassen eingeteilt: kleine Tags besitzen maximal 12, mittlere maximal 60 und große mehr als 60 Aminosäuren. Zu den kleinen Tags zählen das Arg-Tag, das His-Tag, das Strep-Tag, das Flag-Tag, das T7-Tag, das V5-Peptid-Tag und das c-Myc-Tag. Die mittelgroßen Tags enthalten das S-Tag, das HAT-Tag, das Calmodulin-Bindepeptid, das Chitin-Bindepeptid und einige Zellulose-Bindedomänen. Letztere können bis zu 189 Aminosäuren enthalten und gelten dann wie das GST- und MBP-Tag als große Affinitäts-Tags.So far, a number of (affinity) tags or (affinity) markers are known. These are usually classified into 3 classes according to their size: small tags have a maximum of 12, a maximum of 60 and a large more than 60 amino acids. Small tags include the Arg tag, the His tag, the Strep tag, the Flag tag, the T7 tag, the V5 peptide tag, and the c-Myc tag. The medium-sized tags contain the S-tag, the HAT tag, the calmodulin-binding peptide, the chitin-binding peptide and some cellulose-binding domains. The latter can contain up to 189 amino acids and then, like the GST and MBP tag, are considered as large affinity tags.

Um besonders reine Proteine herzustellen, wurden so genannte Double-Tags oder Tandem-Tags entwickelt. Hierbei werden die Proteine über zwei getrennte Chromatographie-Schritte aufgereinigt, wobei jeweils die Affinität eines ersten und dann eines zweiten Tags ausgenutzt wird. Ein Beispiel eines solchen Expressionssystems ist in WO 00/09716 offenbart. Bei diesem Verfahren werden Biomolekül- und/oder Proteinkomplexe mit zwei verschiedenen Affinitäts-Tags fusioniert, von denen einer eine IgG-Bindungsdomäne des Staphylococcus-Proteins A enthält. In der Praxis hat sich für Hefen ein solches TAP-System (Tandem Affinity Purification System) etabliert, welches aus der Kombination eines Calmodulin bindenden Peptids und eines Protein A Tags besteht, wobei zwischen den beiden Komponenten eine Schnittstelle für TEV-Protease (Protease aus dem „Tabacco Etch Virus”) liegt. In order to produce particularly pure proteins, so-called double-tags or tandem tags were developed. Here, the proteins are purified via two separate chromatography steps, wherein the affinity of a first and then a second tag is utilized in each case. An example of such an expression system is in WO 00/09716 disclosed. In this method, biomolecule and / or protein complexes are fused to two different affinity tags, one of which contains an IgG-binding domain of staphylococcal protein A. In practice, such a TAP system (Tandem Affinity Purification System) has been established for yeasts, which consists of the combination of a calmodulin binding peptide and a protein A tag, wherein between the two components an interface for TEV protease (protease from the "Tabacco Etch Virus").

Das derzeit erhältliche TAP-System hat im Wesentlichen drei Nachteile:The currently available TAP system has essentially three disadvantages:

1. Größe1st size

Das oben beschriebene TAP-Tag ist ca. 21 kDa groß. Je größer das Tag ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass das Tag die Funktion des zu reinigenden Moleküls beeinträchtigt. Daher werden im Allgemeinen möglichst kleine Tags bevorzugt. Darüber hinaus besteht die Gefahr, dass das Tag vom Zielmolekül abgespalten oder proteolytisch verdaut wird.The TAP tag described above is about 21 kDa. The larger the day, the greater the likelihood that the day will affect the function of the molecule to be purified. Therefore, tags that are as small as possible are generally preferred. In addition, there is a risk that the tag will be cleaved from the target molecule or digested proteolytically.

2. Mögliche Interferenzen2. Possible interference

Häufig kommt es bei Expression des markierten Zielmoleküls in einer Zelle zwischen den Tag-Komponenten und den zellulären Proteinen im Säugertierzellsystem zu Wechselwirkungen. Bei Expression in Zellen höherer Organismen, insbesondere Tieren, kann das Calmodulin-Bindepeptid mit anderen Calcium bindenden Proteinen Wechselwirkungen eingehen. Durch die Wechselwirkung mit anderen Proteinen kann das Calmodulin nicht mehr an den Bindungspartner binden, wodurch die Aufreinigung gestört wird.Frequently, expression of the labeled target molecule in a cell interacts between the tag components and the cellular proteins in the mammalian cell system. When expressed in cells of higher organisms, especially animals, the calmodulin-binding peptide can interact with other calcium-binding proteins. By interacting with other proteins, the calmodulin can no longer bind to the binding partner, which interferes with the purification.

3. Abhängigkeit von der Calciumkonzentration3. Dependence on the calcium concentration

Damit das Calmodulin bindende Peptid an das Calmodulin im Trägermaterial binden kann, ist eine definierte Calciumkonzentration erforderlich. Viele Puffersysteme, insbesondere für Zellkulturen, verwenden Calciumfänger wie z. B. EDTA oder EGTA. Diese in den Puffer vorhandenen Bestandteile können ebenfalls die Aufreinigung beeinträchtigen.For the calmodulin-binding peptide to bind to the calmodulin in the carrier material, a defined calcium concentration is required. Many buffer systems, in particular for cell cultures, use calcium scavengers such. B. EDTA or EGTA. These components present in the buffer can also affect the purification.

Folglich war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen verbesserten Affinitätsmarker bereitzustellen.Accordingly, it was an object of the present invention to provide an improved affinity tag.

Diese Aufgabe wurde gelöst durch einen Affinitätsmarker gemäß Patentanspruch 1 enthaltend eine Hämagglutininepitop-Domäne (HA-Domäne), die mindestens ein HA-Tag enthält, und eine Streptavidinbindungs-Domäne (Strep-Domäne), die mindestens zwei Strep-Tags enthält.This object has been achieved by an affinity tag according to claim 1 comprising a hemagglutinin epitope domain (HA domain) containing at least one HA tag, and a streptavidin binding domain (Strep domain) containing at least two strep tags.

Ein Affinitätsmarker ist ein Molekül, das Domänen aufweist, die an spezifische Bindungspartner mit hoher Affinität binden können. Ein erfindungsgemäßer Affinitätsmarker weist eine HA-Domäne und eine Strep-Domäne auf. Diese Domänen besitzen jeweils eine hohe Affinität für eine geeignete Matrix, welche mit dem spezifischen Bindungspartner bedeckt ist. In Falle der HA-Domäne beruht das Trennprinzip auf der spezifischen Bindung zwischen dem/n HA-Tags) und z. B. einem spezifischen Anti-HA-Antikörper. Im Falle der Strep-Domäne beruht das Trennprinzip auf der spezifischen Bindung zwischen dem/n Strep-Tag(s) und z. B. Streptavidin, Strep-Tactin oder einem spezifischen Antikörper.An affinity tag is a molecule that has domains that can bind to specific binding partners with high affinity. An affinity tag according to the invention has an HA domain and a Strep domain. These domains each have a high affinity for a suitable matrix which is covered with the specific binding partner. In the case of the HA domain, the separation principle is based on the specific binding between the HA tags) and z. A specific anti-HA antibody. In the case of the Strep domain, the separation principle is based on the specific binding between the Strep tag (s) and z. As streptavidin, Strep-Tactin or a specific antibody.

Die HA-Domäne enthält ein HA-Tag, welches ein Epitop aus dem Hämagglutinin-Protein des Influenza-Virus darstellt. Hämagglutinine sind Substanzen mit der Fähigkeit, Erythrozyten zu agglutinieren. Das Influenza-Hämagglutinin ist ein transmembranales Oberflächen-Antigen, das in Form von Spikes aus der sphärischen Lipid-Hülle herausragt. Das Hämagglutinin in der Membran des Influenza-Virus ermöglicht es dem Virus, in empfängliche Wirtszellen einzudringen.The HA domain contains an HA tag, which is an epitope of the influenza virus hemagglutinin protein. Hemagglutinins are substances with the ability to agglutinate erythrocytes. Influenza hemagglutinin is a transmembrane surface antigen that sticks out of the spherical lipid shell in the form of spikes. The hemagglutinin in the influenza virus membrane allows the virus to invade susceptible host cells.

Das Epitop aus dem Influenza-Virus stellt einen Teil des Hämagglutinin-Proteins dar, welcher vorzugsweise mindestens 8 aufeinander folgende Aminosäuren, weiter bevorzugt mindestens 10, 11 oder 12, noch weiter bevorzugt mindestens 15 und am meisten bevorzugt mindestens 20 Aminosäuren des genannten Proteins enthält. Vorzugsweise stammt das genannte Epitop aus einem Teil des Hämagglutinin-Proteins, welcher sich im dem Virus an der Oberfläche befindet und so auch im Virus einer Bindung zugänglich ist. Der Teil des Hämagglutinin-Proteins sollte so gewählt sein, dass eine spezifische Bindung an ihn möglich ist, d. h. die Sequenz sollte möglichst spezifisch für das Hämagglutinin-Protein und möglichst selten oder vorzugsweise nicht in anderen Proteinen vorhanden sein.The influenza virus epitope constitutes part of the hemagglutinin protein which preferably contains at least 8 contiguous amino acids, more preferably at least 10, 11 or 12, even more preferably at least 15 and most preferably at least 20 amino acids of said protein. Preferably, said epitope is derived from a portion of the hemagglutinin protein which is located in the virus at the surface and thus is also susceptible to binding in the virus. The part of the hemagglutinin protein should be chosen so that a specific binding to it is possible, ie the sequence should be as specific as possible for the hemagglutinin protein and as rare as possible or preferably not present in other proteins.

Ein stärker bevorzugtes Epitop enthält die oder besteht aus der Sequenz YPYDVPDYA (SEQ ID Nr.: 1). Gegen dieses Epitop sind eine Reihe von monoklonalen Antikörpern beschrieben und verfügbar, z. B. der monoklonale Antikörper 12CA5 (Kolodziej and Young, 1991, Methods Enzymol. 194: 508–519; Chen et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 6508–6512). Weitere Antikörper sind z. B. in DE19643314 beschrieben.A more preferred epitope contains or consists of the sequence YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 1). Against this epitope a number of monoclonal antibodies are described and available, e.g. For example, the monoclonal antibody 12CA5 (Kolodziej and Young, 1991, Methods Enzymol 194: 508-519, Chen et al, 1993, Proc Natl Acad Sci., 90: 6508-6512). Other antibodies are z. In DE19643314 described.

Umfasst von dem Begriff HA-Tag sind auch modifizierte HA-Tags, die von den oben beschriebenen HA-Tags, insbesondere dem Tag mit der Sequenz YPYDVPDYA durch Aminosäure-Insertion, -Deletion oder -Substitution abgeleitet sind.Included in the term HA tag are also modified HA tags derived from the HA tags described above, in particular the tag with the sequence YPYDVPDYA by amino acid insertion, deletion or substitution.

Vorzugsweise ist ein modifiziertes HA-Tag ein HA-Tag gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn die Affinität eines Antikörpers gegenüber dem modifizierten Epitop maximal 100-fach, vorzugsweise maximal 50-fach, weiter bevorzugt maximal 30-fach und noch weiter bevorzugt maximal 10-fach niedriger ist als gegenüber dem nicht-modifizierten Epitop.Preferably, a modified HA tag is an HA tag according to the present invention when the affinity of an antibody for the modified epitope is at most 100 times, preferably at most 50 times, more preferably at most 30 times, and even more preferably at most 10 times is lower than that of the unmodified epitope.

Für gewöhnlich besitzen die Antikörper für die Epitope eine Affinität von ca. 10⁷ bis 10⁸ (mol/l)^–1. Es sind jedoch auch Antikörper mit Affinitäten von bis zu 10¹⁰ (mol/l)^–1 beschrieben. Daher beträgt die Affinität eines für das Epitop oder modifizierte Epitop spezifischen Antikörper vorzugsweise mindestens ca. 10⁵ (mol/l)^–1, weiter bevorzugt mindestens ca. 10⁶ (mol/l^–1, noch weiter bevorzugt mindestens ca. 10⁷ (mol/l)^–1, sogar noch weiter bevorzugt mindestens ca. 10⁸ (mol/l)^–1 und am meisten bevorzugt mindestens ca. 10⁹ (mol/l)^–1. Verfahren zur Bestimmung von Affinitätskonstanten sowie Geschwindigkeitskonstanten von Antikörpern sind im Stand der Technik gut bekannt. Beispielsweise kann dies durch biospezifische Interaktionsanalyse mittels BIAcore (Pharmacia Biosensor) erfolgen. Das Verfahren ist beispielsweise in DE19643314 beschrieben.Usually, the antibodies for the epitopes have an affinity of about 10 ⁷ to 10 ⁸ (mol / l) ^-1 . However, antibodies with affinities of up to 10 ¹⁰ (mol / l) ^{-1 are also} described. Therefore, the affinity of an antibody specific for the epitope or modified epitope is preferably at least about 10 ⁵ (mol / l) ^-1 , more preferably at least about 10 ⁶ (mol / l ^-1 , even more preferably at least about 10 ⁷ ( mol / l) ^-1 , even more preferably at least about 10 ⁸ (mol / l) ^-1 and most preferably at least about 10 ⁹ (mol / l) ^-1 . Methods for determining affinity constants and rate constants of antibodies For example, this can be done by biospecific interaction analysis using BIAcore (Pharmacia Biosensor) DE19643314 described.

Wenn Aminosäure-Substitutionen vorgenommen werden, sind konservative Aminosäure-Substitutionen bevorzugt. Bei konservativen Aminosäure-Austauschen werden Aminosäuren gleicher Art ausgetauscht, z. B. eine basische Aminosäure gegen eine andere basische Aminosäure (K, R, H), eine Aminosäure mit aromatischer Seitenkette gegen eine andere Aminosäure mit einer aromatischen Seitenkette (F, Y, W) oder eine Aminosäure mit aliphatischer Seitenkette gegen eine andere mit aliphatischer Seitenkette (G, A, V, L, I).When amino acid substitutions are made, conservative amino acid substitutions are preferred. In conservative amino acid substitutions, amino acids of the same kind are exchanged, e.g. For example, one basic amino acid against another basic amino acid (K, R, H), one aromatic side chain amino acid against another amino acid with an aromatic side chain (F, Y, W), or one aliphatic side chain amino acid versus another aliphatic side chain one (G, A, V, L, I).

Bei Aminosäure-Deletionen wird eine oder mehrere Aminosäure vorzugsweise am C- oder N-terminalen Ende des Epitops entfernt. Bei Aminosäure-Additionen werden zusätzliche Aminosäuren eingefügt. Vorzugsweise sind dies solche Aminosäuren, die sich im Hinblick auf z. B. Größe und Ladung von den umliegenden Aminosäuren nicht wesentlich unterscheiden, also Aminosäuren gleicher Art – wie oben definiert – sind.For amino acid deletions, one or more amino acids are preferably removed at the C- or N-terminal end of the epitope. For amino acid additions, additional amino acids are inserted. Preferably, these are those amino acids that are with respect to z. B. size and charge of the surrounding amino acids are not significantly different, so amino acids of the same kind - as defined above - are.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Sequenz des modifizierten Epitops mindestens 65%, weiter bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 85% Sequenzidentität mit dem wie oben definierten Epitop, insbesondere dem Epitop YPYDVPDYA, auf.In a preferred embodiment, the sequence of the modified epitope has at least 65%, more preferably at least 75% and most preferably at least 85% sequence identity with the epitope as defined above, in particular the epitope YPYDVPDYA.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind maximal 3, weiter bevorzugt maximal 2 und am meisten bevorzugt maximal 1 Aminosäure durch Insertion, Deletion oder Substitution verändert.In another preferred embodiment, at most 3, more preferably at most 2, and most preferably at most 1 amino acid are altered by insertion, deletion or substitution.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die HA-Domäne nicht nur 1 HA-Tag, sondern mindestens 2, 3, 4 oder 5 HA-Tags. Die einzelnen HA-Tags sind wie oben definiert. Sie können identisch oder unterschiedlich sein. Vorzugsweise handelt es sich um mindestens 2, 3, 4 oder 5 HA-Tags der Sequenz YPYDVPDYA.In another preferred embodiment, the HA domain contains not only 1 HA tag but at least 2, 3, 4 or 5 HA tags. The individual HA tags are as defined above. They can be identical or different. Preferably, it is at least 2, 3, 4 or 5 HA tags of the sequence YPYDVPDYA.

Wenn die HA-Domäne 2 oder mehr HA-Tags aufweist, können die einzelnen HA-Tags unmittelbar aufeinander folgen oder über einen Linker, den HA-Linker, verbunden sein. Bei dem Linker kann es sich um jeden geeigneten Linker, insbesondere einen Linker aus Aminosäureresten, handeln.If the HA domain has 2 or more HA tags, the individual HA tags may be immediately adjacent to each other or linked via a linker, the HA linker. The linker may be any suitable linker, especially a linker of amino acid residues.

Bevorzugte HA-Linker sind kurze Peptid-Linker bestehend aus maximal 10, weiter bevorzugt maximal 8, noch weiter bevorzugt maximal 6, 5, 4, 3 oder 2 und am meisten bevorzugt maximal 1 Aminosäurerest. Vorzugsweise ist jeder dieser Aminosäurereste ein Glycinrest. Noch weiter bevorzugt enthält oder besteht die HA-Domäne aus mehreren, insbesondere 3 nicht-modifizierten HA-Tags, die jeweils über einen Glycinrest verbunden sind. Beispielsweise handelt es sich bei diesem nicht-modifizierten HA-Tag um die Sequenz YPYDVPDYA. Sogar noch weiter bevorzugt enthält oder besteht die HA-Domäne aus der Sequenz YPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYA (3 identische YPYDVPDYA-Sequenzen, die jeweils – wie durch die Unterstreichung angezeigt – über einen Glycin-HA-Linker verbunden sind; SEQ ID Nr.: 2).Preferred HA linkers are short peptide linkers consisting of a maximum of 10, more preferably a maximum of 8, even more preferably a maximum of 6, 5, 4, 3 or 2, and most preferably a maximum of 1 amino acid residue. Preferably, each of these amino acid residues is a glycine residue. Even more preferably, the HA domain contains or consists of several, in particular 3 unmodified HA tags which are each connected via a glycine residue. For example, this unmodified HA tag is the sequence YPYDVPDYA. Even more preferably, the HA domain contains or consists of the sequence YPYDVPDYA G YPYDVPDYA G YPYDVPDYA (3 identical YPYDVPDYA sequences, each linked via a glycine HA linker, as indicated by the underline, SEQ ID NO: 2).

Ein weiterer Bestandteil des Affinitätsmarkers ist die Strep-Domäne. Die Strep-Domäne enthält mindestens 2 Strep-Tags. In einer Ausführungsform enthält die Strep-Domäne mindestens 3, 4, 5 oder 6 Strep-Tags. Wenn die Strep-Domäne 2 Strep-Tags enthält handelt es sich um ein Di-Strep-Tag, enthält sie mehr als 2 Strep-Tags handelt es sich um ein Multi-Strep-Tag. Die Di- oder Multi-Strep-Tags sind insbesondere zur kooperativen Bindung an jeweils ein einziges Streptavidintetramer oder Streptavidindimer fähig. Durch kooperative Bindung wird eine verstärkte Bindung der Strep-Domäne an einen Streptavidin-Rezeptor erreicht. Die Di- und Multi-Strep-Tags auf Streptavidin-Basis sind näher in DE 10113776 beschrieben.Another component of the affinity tag is the Strep domain. The Strep domain contains at least 2 Strep tags. In one embodiment, the strep domain contains at least 3, 4, 5, or 6 strep tags. If the Strep domain contains 2 Strep tags it is a Di Strep tag that contains more than 2 Strep tags it is a Multi Strep tag. The di- or multi-strep tags are particularly capable of cooperative binding to a single streptavidin-tetramer or streptavidin-dimer. Cooperative binding results in enhanced binding of the Strep domain to a streptavidin receptor. The streptavidin-based di- and multi-strep tags are closer in DE 10113776 described.

Jedes Strep-Tag beinhaltet mindestens die Sequenz Histidin-Prolin-Xaa-, wobei Xaa entweder Glutamin, Asparagin oder Methionin darstellt. Die Strep-Tags enthalten folglich die Sequenzen Histidin-Prolin-Glutamin, Histidin-Prolin-Asparagin und/oder Histidin-Prolin-Methionin.Each Strep tag contains at least the sequence histidine-proline-Xaa, where Xaa is either glutamine, asparagine or methionine. The strep tags thus contain the sequences histidine-proline-glutamine, histidine-proline-asparagine and / or histidine-proline-methionine.

Ein bevorzugtes Strep-Tag ist ein Strep-Tag der Sequenz WSHPQFEK (SEQ ID Nr. 3) oder ein Derivat hiervon. Ein Derivat wird durch Aminosäure-Insertion, -Deletion und/oder -Substitution erhalten, wobei diese wie oben für die HA-Domäne beschrieben definiert sind. Vorzugsweise ist ein Derivat des Strep-Tag ein Strep-Tag gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn die Affinität eines Bindungspartner gegenüber dem Derivat maximal 100-fach, vorzugsweise maximal 50-fach, weiter bevorzugt maximal 30-fach und noch weiter bevorzugt maximal 10-fach niedriger ist als gegenüber dem nicht-modifizierten Strep-Tag der Sequenz WSHPQFEK.A preferred Strep tag is a Strep tag of the sequence WSHPQFEK (SEQ ID NO: 3) or a derivative thereof. A derivative is obtained by amino acid insertion, deletion and / or substitution, these being defined as described above for the HA domain. Preferably, a derivative of the strep tag is a strep tag according to the present invention when the affinity of a binding partner to the derivative is at most 100 times, preferably at most 50 times, more preferably at most 30 times, and even more preferably at most 10 times is lower than the unmodified Strep tag of the sequence WSHPQFEK.

Für gewöhnlich besitzt jedes Strep-Tag eine Affinität (K_D) von ca. 10^–5 bis ca. 10^–6 mol/l für das Streptavidin auf. Daher beträgt die Affinität eines Strep-Tags für einen spezifische Bindungspartner vorzugsweise mindestens ca. 10^–3 mol/l, weiter bevorzugt mindestens ca. 10^–4 mol/l, noch weiter bevorzugt mindestens ca. 10^–5 mol/l, sogar noch weiter bevorzugt mindestens ca. 10^–6 mol/l und am meisten bevorzugt mindestens ca. 10^–7 mol/l. Die Affinität der Derivate kann an Hand des Tests, der in DE19641876 (siehe dort Beispiel 5) beschrieben ist, durchgeführt werdenUsually, each Strep tag has an affinity (K _D ) of about 10 ^-5 to about 10 ^-6 mol / L for streptavidin. Therefore, the affinity of a Strep tag for a specific binding partner is preferably at least about 10 ^-3 mol / L, more preferably at least about 10 ^-4 mol / L, even more preferably at least about 10 ^-5 mol / L, even more more preferably at least about 10 ^-6 mol / L, and most preferably at least about 10 ^-7 mol / L. The affinity of the derivatives can be determined by the test described in DE19641876 (see Example 5) is described performed

Wenn Aminosäure-Substitutionen vorgenommen werden, sind konservative Aminosäure-Substitutionen (wie oben definiert) bevorzugt. Bei Aminosäure-Deletionen wird eine oder mehrere Aminosäuren vorzugsweise am C- oder N-terminalen Ende der Sequenz entfernt. Bei Aminosäure-Additionen werden zusätzliche Aminosäuren eingefügt. Vorzugsweise sind dies solche Aminosäuren, die sich im Hinblick auf z. B. Größe und Ladung von den umliegenden Aminosäuren nicht wesentlich unterscheiden, d. h. Aminosäuren gleicher Art, wie für konservative Aminosäureaustausche weiter oben definiert.When amino acid substitutions are made, conservative amino acid substitutions (as defined above) are preferred. For amino acid deletions, one or more amino acids are preferably removed at the C- or N-terminal end of the sequence. For amino acid additions, additional amino acids are inserted. Preferably, these are those amino acids that are with respect to z. B. size and charge of the surrounding amino acids do not differ significantly, d. H. Amino acids of the same kind as defined above for conservative amino acid substitutions.

Hierbei ist die Sequenz des Derivats zu mindestens 62%, weiter bevorzugt mindestens 75%, noch weiter bevorzugt mindestens 85% identisch mit der Sequenz WSHPQFEK.Here, the sequence of the derivative is at least 62%, more preferably at least 75%, even more preferably at least 85% identical to the sequence WSHPQFEK.

Die 2 oder mehr Strep-Tags der Strep-Domäne können unmittelbar aufeinander folgen oder über einen Linker, den Strep-Linker, verbunden sein. Bei dem Linker kann es sich um jeden geeigneten Linker, insbesondere einen Linker aus Aminosäureresten, handeln.The Strep domain 2 or more Strep tags may be immediately adjacent to each other or linked through a linker, the Strep linker. The linker may be any suitable linker, especially a linker of amino acid residues.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Linker ein Linker bestehend aus einer Aminosäurekette, wobei der Linker jede beliebige Aminosäure enthalten kann. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform besteht der Strep-Linker aus 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder maximal 20 Aminosäurereste (siehe auch DE10113776 ). Bevorzugte Aminosäurereste sind solche, die die Bindung des Strep-Tags and den jeweiligen Bindungspartner, z. B. das Streptavidin, nicht behindern. Bevorzugt sind daher kleine und/oder ungeladene Aminosäurereste. Beispiele für geeignete Aminosäuren sind Glycin und Serin. Besonders bevorzugt sind Strep-Linker auf Glycin-Basis, d. h. Linker die zu mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 50%, weiter bevorzugt mindestens 75%, noch weiter bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 100% aus Glycin bestehen. Auch bevorzugt sind Linker aus Aminosäureketten, die zu mindestens 80% oder sogar zu 100% aus Glycin- und Serinresten oder aus Glycin- und Alaninresten bestehen. Noch weiter bevorzugt sind diese Strep-Linker auf Glycin-Basis, wenn sie mindestens 8, 10 oder 12 Aminosäurereste enthalten. Sogar noch weiter bevorzugt sind die Strep-Linker, die die Sequenzen (G)₈, (G)₁₂, GAGA, (GAGA)₂, (GAGA)₃, (GGGS)₂ und/oder (GGGS)₃ enthalten oder daraus bestehen.In a preferred embodiment, the linker is a linker consisting of an amino acid chain, wherein the linker may contain any amino acid. In a further preferred embodiment, the Strep linker consists of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or maximum 20 amino acid residues (see also DE10113776 ). Preferred amino acid residues are those which inhibit the binding of the strep tag to the respective binding partner, e.g. As the streptavidin, not hinder. Therefore, small and / or uncharged amino acid residues are preferred. Examples of suitable amino acids are glycine and serine. Particularly preferred are glycine-based Strep linkers, ie, linkers which are at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 75%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 100% glycine. Also preferred are linkers of amino acid chains which consist of at least 80% or even 100% of glycine and serine residues or of glycine and alanine residues. Even more preferred are these glycine-based Strep linkers if they contain at least 8, 10 or 12 amino acid residues. Even more preferred are the Strep linkers containing or consisting of the sequences (G) ₈ , (G) ₁₂ , GAGA, (GAGA) ₂ , (GAGA) ₃ , (GGGS) ₂ and / or (GGGS) ₃ ,

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Strep-Domäne 2, 3 oder 4 Strep-Tags, besonders bevorzugt 2 oder 4 Strep-Tags und am meisten bevorzugt 2 Strep-Tags, vorzugsweise Strep-Tags der Sequenz WSHPQFEK. In a preferred embodiment, the Strep domain contains 2, 3, or 4 Strep tags, more preferably 2 or 4 Strep tags, and most preferably 2 Strep tags, preferably Strep tags of the sequence WSHPQFEK.

Stark bevorzugte Strep-Domänen beinhalten oder bestehen aus den folgenden Sequenzen WSHPQFEK-(X)_n-WSHPQFEK (SEQ ID Nr.: 4), wobei X eine beliebige Aminosäure darstellt und n eine ganze Zahl von 5 bis 20, insbesondere 8 bis 12, weiter bevorzugt 8, 10 oder 12 und am meisten bevorzugt 8 oder 12 ist (SEQ ID Nrn.: 5–9). Noch weiter bevorzugt ist die Sequenz wenn X Glycin oder Serin, insbesondere Glycin ist. Beispiele hierfür sind die Sequenzen WSHPQFEK-G₈-WSHPQFEK (SEQ ID Nr.: 10) und WSHPQFEK-G₁₂-WSHPQFEK (SEQ ID Nr.: 11). Ebenfalls stark bevorzugt ist eine Strep-Domäne, die die Sequenz WSHPQFEK-(GGGS)_n-WSHPQFEK enthält oder darstellt, wobei n 1, 2, 3, 4 oder 5, bevorzugt 2 oder 3, ist (SEQ ID Nrn.: 12–16).Highly preferred Strep domains include or consist of the following sequences: WSHPQFEK- (X) _n -WSHPQFEK (SEQ ID NO: 4) where X is any amino acid and n is an integer from 5 to 20, especially 8 to 12, more preferably 8, 10 or 12, and most preferably 8 or 12 (SEQ ID NOS: 5-9). Even more preferred is the sequence when X is glycine or serine, especially glycine. Examples of these are the sequences WSHPQFEK-G ₈ -WSHPQFEK (SEQ ID NO: 10) and WSHPQFEK-G ₁₂ -WSHPQFEK (SEQ ID NO: 11). Also strongly preferred is a Strep domain which contains or represents the sequence WSHPQFEK- (GGGS) _n -WSHPQFEK, where n is 1, 2, 3, 4 or 5, preferably 2 or 3 (SEQ ID NOS: 12- 16).

In dem erfindungsgemäßen Affinitätsmarker kann jede wie oben definierte HA-Domäne mit jeder wie oben definierten Strep-Domäne kombiniert werden. Besonders bevorzugt sind solche Affintätsmarker, in denen die Strep-Domäne zwei Strep-Tags, insbesondere 2 Strep-Tags mit der Aminosäuresequenz WSHPQFEK, die z. B. durch einen Glycin-Spacer aus 8 oder 12 Aminosäuren verknüpft sind, und in denen die HA-Domäne mit 1, 2 oder 3 HA-Tags, insbesondere HA-Tags der Sequenz YPYDVPDYA, enthält.In the affinity tag of the invention, any HA domain as defined above may be combined with any Strep domain as defined above. Particularly preferred are those Affintätsmarker in which the Strep domain two Strep tags, in particular 2 Strep tags with the amino acid sequence WSHPQFEK, the z. B. are linked by a glycine spacer of 8 or 12 amino acids, and in which the HA domain with 1, 2 or 3 HA tags, in particular HA tags of the sequence YPYDVPDYA contains.

Die HA-Domäne und die Strep-Domäne können in dem Affintätsmarker auf verschiedene Arten verbunden sein. Zum einen können die beiden Domänen z. B. über Wechselwirkungen auf Basis unterschiedlicher Elektronendichteverteilungen wie z. B. aufgrund von Wasserstoff-Brückenbindungen, van-der-Waals-Kräften und/oder Dipol-Dipol-Wechselwirkungen verbunden sein. Alternativ kann es sich auch um eine ionische oder eine kovalente Bindung handeln.The HA domain and the Strep domain may be linked in the affinity marker in several ways. First, the two domains z. B. on interactions based on different electron density distributions such. B. due to hydrogen bonds, van der Waals forces and / or dipole-dipole interactions. Alternatively, it may also be an ionic or a covalent bond.

Im Falle einer kovalenten Bindung können die beiden Domäne entweder unmittelbar oder über einen Spacer verbunden sein. Der Spacer kann jede geeignete Struktur aufweisen, vorzugsweise handelt es sich aber um eine Aminosäurekette, insbesondere eine solche mit weniger als 50, bevorzugt weniger als 30, weiter bevorzugt weniger als 25 und noch weiter bevorzugt weniger als 20 Aminosäuren. Die Anordnung in dem Affintätsmarker kann entweder Strep-Domäne-Spacer-HA-Domäne oder HA-Domäne-Spacer-Strep-Domäne sein.In the case of a covalent bond, the two domains can be connected either directly or via a spacer. The spacer may have any suitable structure, but is preferably an amino acid chain, in particular one with less than 50, preferably less than 30, more preferably less than 25 and even more preferably less than 20 amino acids. The arrangement in the affinity marker can be either Strep domain spacer HA domain or HA domain spacer Strep domain.

Wenn es erforderlich oder wünschenswert ist, mindestens eine der beiden Domänen abzuspalten, enthält der Affintätsmarker zwischen der HA-Domäne und der Strep-Domäne mindestens eine spaltbare Verknüpfung.When it is necessary or desirable to cleave at least one of the two domains, the affinity marker between the HA domain and the Strep domain contains at least one cleavable link.

Unter einer spaltbaren Verknüpfung wird jede Verbindung der beiden Domänen verstanden, die durch geeignete Mittel eine Trennung der beiden Domänen erlaubt. Im Falle z. B. einer Wechselwirkung auf Basis unterschiedlicher Elektronendichteverteilungen oder einer ionischen Bindung kann die Verbindung zwischen den beiden Domänen beispielsweise durch Änderung der Umgebung gelöst werden, beispielsweise durch Änderung des pH-Wertes, durch Veränderung der Ionenstärke oder ähnlichem. Wenn die beiden Domänen kovalent miteinander verknüpft sind, kann es sich bei der kovalente Verknüpfung z. B. um eine leicht spaltbare kovalente Bindung handeln, die z. B. durch Zugabe von Säure oder Base oder anderen Chemikalien wie bestimmten Katalysatoren einfach gespalten werden kann, ohne die beiden Domänen oder andere Verbindungen, die mit der vorliegenden Erfindung in Zusammenhang stehen, zu beschädigen.A cleavable link is understood to mean any compound of the two domains which allows separation of the two domains by suitable means. In the case of z. As an interaction based on different electron density distributions or an ionic bond, the connection between the two domains can be solved for example by changing the environment, for example by changing the pH, by changing the ionic strength or the like. If the two domains are covalently linked together, it may be in the covalent linkage z. B. may be an easily cleavable covalent bond z. B. can be easily cleaved by the addition of acid or base or other chemicals such as certain catalysts, without damaging the two domains or other compounds that are related to the present invention.

In einer Ausführungsform kann diese spaltbare Verknüpfung eine Schnittstelle sein, wie beispielsweise eine Schnittstelle für ein Enzym. Diese kann beispielsweise im Spacer gelegen sein. Bei der Schnittstelle könnte es sich beispielsweise um eine Protease-Schnittstelle handeln. Beispiele für Proteasen sind Chymotrypsin, Trypsin, Elastase, Plasmin; die entsprechenden Schnittstellen sind dem Fachmann bekannt. Falls es sich bei dem zu reinigenden Molekül um ein Protein handelt, sind spezifische Proteasen, insbesondere Proteasen aus Viren, die für gewöhnlich Pflanzen befallen, bevorzugt. Beispiele geeigneter spezifischer Proteasen sind Thrombin, Faktor Xa, Igase, die TEV-Protease aus „Tabacco Etch Virus”, die Protease PreScisson (Humane Rhinovirus 3C Protease), Enterokinase oder Kex2. Besonders bevorzugt sind die TEV-Protease und PreScission.In one embodiment, this cleavable link may be an interface, such as an enzyme site. This may for example be located in the spacer. For example, the interface could be a protease interface. Examples of proteases are chymotrypsin, trypsin, elastase, plasmin; the corresponding interfaces are known to the person skilled in the art. If the molecule to be purified is a protein, specific proteases, in particular proteases from viruses that usually attack plants, are preferred. Examples of suitable specific proteases are thrombin, factor Xa, Igase, the "Tabacco Etch Virus" TEV protease, the protease PreScisson (human rhinovirus 3C protease), enterokinase or Kex2. Particularly preferred are the TEV protease and PreScission.

Beispiele für den Aufbau geeigneter Affinitätsmarker sind die folgenden Strukturen, wobei in den genannten Beispielen die Reihenfolge der Elemente (von N- nach C-terminal soweit es sich um Peptide handelt) von links nach rechts oder von rechts nach links gelesen werden kann:Examples of the construction of suitable affinity tags are the following structures, in which case the order of the elements (from N to C-terminal in the case of peptides) can be read from left to right or from right to left:

Beispiele für Affinitätsmarker mit 2 Strep-Tags und einem HA-Tag: Examples of affinity tags with 2 strep tags and one HA tag:

WSHPQFEK Strep linker WSHPQFEK spacer YPYDVPDYA
WSHPQFEK-G 8 -WSHPQFEK Spacer-YPYDVPDYA
WSHPQFEK-G 12 -WSHPQFEK Spacer-YPYDVPDYA
WSHPQFEK- (GGGS) 2 -WSHPQFEK spacer-YPYDVPDYA
WSHPQFEK- (GGGS) 3 -WSHPQFEK spacer-YPYDVPDYA

Beispiele für Affinitätsmarker mit 2 Strep-Tags und 2 HA-Tags:Examples of Affinity Markers with 2 Strep Tags and 2 HA Tags:

WSHPQFEK Strep linker WSHPQFEK spacer YPYDVPDYA HA linker YPYDVPDYA
WSHPQFEK-G 8 -WSHPQFEK Spacer-YPYDVPDYA-HA Linker-YPYDVPDYA
WSHPQFEK-G 12 -WSHPQFEK Spacer-YPYDVPDYA-HA Linker-YPYDVPDYA
WSHPQFEK- (GGGS) 2 -WSHPQFEK-Spacer-YPYDVPDYA-HA-Linker-YPYDVPDYA
WSHPQFEK- (GGGS) 3 -WSHPQFEK-Spacer-YPYDVPDYA-HA-Linker-YPYDVPDYA
WSHPQFEK Strep linker WSHPQFEK spacer YPYDVPDYA G YPYDVPDYA
WSHPQFEK-G 8 -WSHPQFEK spacer-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA
WSHPQFEK-G 12 -WSHPQFEK spacer-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA
WSHPQFEK- (GGGS) 2 -WSHPQFEK spacer-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA
WSHPQFEK- (GGGS) 3 -WSHPQFEK spacer-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA

Beispiele für Affinitätsmarker mit 2 Strep-Tags und 3 HA-Tags, wobei die HA-Linker 1 und 2 unterschiedlich oder identisch sein können:Examples of affinity tags with 2 strep tags and 3 HA tags, where HA linkers 1 and 2 may be different or identical:

WSHPQFEK Strep Linker WSHPQFEK Spacer YPYDVPDYA HA Linker 1-YPYDVPDYA HA Linker 2-YPYDVPDYA
WSHPQFEK-G 8 -WSHPQFEK Spacer-YPYDVPDYA-HA Linker 1-YPYDVPDYA-HA Linker 2-YPYDVPDYA
WSHPQFEK-G 12 -WSHPQFEK Spacer-YPYDVPDYA-HA Linker 1-YPYDVPDYA-HA Linker 2-YPYDVPDYA
WSHPQFEK- (GGGS) 2 -WSHPQFEK-Spacer-YPYDVPDYA-HA-Linker 1-YPYDVPDYA-HA-Linker 2-YPYDVPDYA
WSHPQFEK- (GGGS) 3 -WSHPQFEK Spacer-YPYDVPDYA-HA Linker 1-YPYDVPDYA-HA Linker 2-YPYDVPDYA
WSHPQFEK Strep linker WSHPQFEK spacer YPYDVPDYA G YPYDVPDYA G YPYDVPDYA
WSHPQFEK-G 8 -WSHPQFEK spacer-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA
WSHPQFEK-G 12 -WSHPQFEK spacer-YPYDVPDYA-G-YPYD-VPDYA-G-YPYDVPDYA
WSHPQFEK- (GGGS) 2 -WSHPQFEK spacer-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA
WSHPQFEK- (GGGS) 3 -WSHPQFEK spacer-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA

Die am meisten bevorzugten Affinitätsmarker enthalten oder bestehen aus den Sequenzen der SEQ ID Nrn: 17 oder 18. Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen sind in den SEQ ID Nr. 19 und 20 angegeben.The most preferred affinity tags contain or consist of the sequences of SEQ ID NOs: 17 or 18. The corresponding nucleic acid sequences are given in SEQ ID Nos. 19 and 20.

Der erfindungsgemäße Affinitätsmarker kann beispielsweise durch chemische Synthese in an sich bekannter Weise z. B. durch Festphasensynthese linearer Peptidbausteine (SPPS) nach Merrifield unter Verwendung geeigneter Schutzgruppen wie Fmoc hergestellt werden. Einzelne Komponenten können auch über Peptidbindung miteinander verknüpft werden. Hierzu kann z. B. eine Aminosäurekopplung durch Aktivierung der Carbonsäure unter Verwendung von z. B. 1-Hydroxy-1H-Benzotriazol (HOBt) und Carbodiimid (z. B. EDC) eingesetzt werden. Für den Fall, dass es sich bei dem Affinitätsmarker um ein Protein handelt, kann dieses auch durch gentechnische Verfahren unter Verwendung der entsprechenden Nukleinsäure und/oder einem geeigneten Vektor hergestellt werden.The affinity tag according to the invention can, for example, by chemical synthesis in a conventional manner z. B. by solid phase synthesis of linear peptide building blocks (SPPS) according to Merrifield using suitable protecting groups such as Fmoc be prepared. Individual components can also be linked together via peptide bonds. For this purpose, z. B. an amino acid coupling by activation of the carboxylic acid using z. For example, 1-hydroxy-1H-benzotriazole (HOBt) and carbodiimide (eg EDC) can be used. In the case where the affinity tag is a protein, this can also be produced by genetic engineering methods using the appropriate nucleic acid and / or a suitable vector.

Beschrieben wird hierin auch ein Molekül oder Molekülkomplex enthaltend einen erfindungsgemäßen Affinitätsmarker, der wie oben definiert und beschrieben ist, sowie eine weitere Verbindung. Bei dieser Verbindung handelt es sich vorzugsweise um das aufzureinigende Molekül. Das Molekül kann jede beliebige chemische Verbindung sein, insbesondere ein organisches Molekül mit einer Masse bis z. B. 500 kDa, vorzugsweise bis 250 kDa, weiter bevorzugt bis 100 kDa und noch weiter bevorzugt bis 50 kDa. Beispielsweise kann es sich um eine Verbindung handeln, die natürlicherweise oder durch gentechnische Veränderung von einem Tier, einer Pflanze, einem Pilz, einem Bakterium oder Virus produziert wird. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Protein oder Proteinkomplex enthaltend einen erfindungsgemäßen Affinitätsmarker, der wie oben definiert und beschrieben ist, sowie eine Verbindung, die ein Protein darstellt. Die Komponenten des Moleküls oder Molekülkomplexes können sowohl durch Wechselwirkung über ionische oder kovalente Bindung miteinander verbunden sein. Die Anordnung der einzelnen Komponenten kann z. B. wie folgt sein:
HA-Domäne-Vebindung-Strep-Domäne,
Strep-Domäne-Verbindung-HA-Domäne,
HA-Domäne-Strep-Domäne-Verbindung,
Strep-Domäne-HA-Domäne-Verbindung,
Verbindung-HA-Domäne-Strep-Domäne oder
Verbindung-Strep-Domäne-HA-DomäneAlso described herein is a molecule or molecular complex containing an affinity tag according to the invention as defined and described above, as well as another compound. This compound is preferably the molecule to be purified. The molecule can be any chemical compound, in particular an organic molecule with a mass up to z. 500 kDa, preferably up to 250 kDa, more preferably up to 100 kDa and even more preferably up to 50 kDa. For example, it may be a compound produced naturally or by genetic modification of an animal, plant, fungus, bacterium or virus. Another object of the present invention is a protein or protein complex comprising an affinity tag according to the invention as defined and described above and a compound which is a protein. The components of the molecule or molecular complex may be linked by interaction through ionic or covalent bonding. The arrangement of the individual components may, for. B. be as follows:
HA domain Vebindung-Strep-domain
Strep-domain connection HA domain
HA domain Strep-domain connection,
Strep-domain-HA-domain connection,
Compound HA domain Strep domain or
Connection-Strep-domain-HA domain

Es kann erforderlich oder wünschenswert sein, die Verbindung von dem Affinitätsmarker z. B. nach der Aufreinigung zu trennen, da der Marker z. B. die Funktion oder Struktur der Verbindung beeinflussen könnte. Daher kann die Verbindung mit der oder den Domäne(n) übe]. eine spaltbare Verknüpfung verbunden sein. Die spaltbare Verknüpfung ist wie oben definiert. Falls zwei spaltbare Verknüpfungen im Molekül oder Molekülkomplex vorhanden sind, handelt es sich vorzugsweise um verschiedene spaltbare Verknüpfungen, um z. B. eine selektive Spaltung einer der beiden Verknüpfung zu ermöglichen.It may be necessary or desirable to remove the compound from the affinity tag, e.g. B. to separate after purification, since the marker z. B. could affect the function or structure of the connection. Therefore, the connection with the domain (s) can be practiced. be associated with a cleavable link. The cleavable link is as defined above. If two cleavable linkages are present in the molecule or molecular complex, they are preferably different cleavable linkages, for. B. to allow a selective cleavage of one of the two links.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei dem Molekül, um ein Protein. Das Protein enthält sowohl die HA-Domäne, optional eine Schnittstelle, wie z. B. eine TEV- oder PreScission-Schnittstelle, die Strep-Domäne, sowie das zu reinigende Protein (Proteinprobe). Die Anordnung der einzelnen Elemente (von N- nach C-terminal soweit es sich um Peptide handelt) kann beispielsweise wie folgt sein, wobei in den genannten Beispielen die Reihenfolge der Elemente von links nach rechts oder von rechts nach links gelesen werden kann:
Strep-Domäne-ggf. Schnittstelle 1-HA-Domäne-ggf. Schnittstelle 2-Proteinprobe,
HA-Domäne-ggf. Schnittstelle 1-Strep-Domäne-ggf. Schnittstelle 2-Proteinprobe oder
Strep-Domäne-ggf. Schnittstelle 1-Proteinprobe-ggf. Schnittstelle 2-HA-Domäne.According to the invention, the molecule is a protein. The protein contains both the HA domain, optionally an interface such. A TEV or PreScission interface, the Strep domain, as well as the protein to be purified (protein sample). The arrangement of the individual elements (from N to C-terminal in the case of peptides) can be, for example, as follows, wherein in the examples mentioned the order of the elements can be read from left to right or from right to left:
Strep-domain-optionally. Interface 1-HA-Domain-possibly. Interface 2-protein sample,
HA domain if necessary. Interface 1-Strep-Domain-possibly. Interface 2-protein sample or
Strep-domain-optionally. Interface 1-protein sample-if necessary Interface 2 HA domain.

Die Schnittstellen 1 und 2 können identisch oder vorzugsweise unterschiedlich sein.The interfaces 1 and 2 may be identical or preferably different.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für einen erfindungsgemäßen Affinitätsmarker oder ein erfindungsgemäßes Molekül, welches einen solchen Affinitätsmarker enthält, kodiert, da es sich bei dem Affinitätsmarker oder dem Molekül um ein Protein handelt. Bei der Nukleinsäure kann es sich beispielsweise um eine RNA oder DNA handeln. Diese kann beispielsweise verwendet werden, um den erfindungsgemäßen Affinitätsmarker und/oder das erfindungsgemäße Protein herzustellen. Hierzu kann die Nukleinsäure z. B. in eine Zelle eingebracht und in der Zelle exprimiert werden. Verfahren zum Einbringen und Exprimieren von Nukleinsäuren in Zellen sind dem Fachmann allgemein bekannt. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren enthaltend die oder bestehend aus der Sequenz der SEQ ID Nrn.: 19 oder 20.A further subject of the present invention is a nucleic acid which codes for an affinity tag according to the invention or a molecule according to the invention which contains such an affinity tag, since the affinity tag or the molecule is a protein. The nucleic acid may be, for example, an RNA or DNA. This can be used, for example, to produce the affinity tag according to the invention and / or the protein according to the invention. For this purpose, the nucleic acid z. B. are introduced into a cell and expressed in the cell. Methods for introducing and expressing nucleic acids in cells are well known to those skilled in the art. Particular preference is given to nucleic acids containing or consisting of the sequence of SEQ ID NOS: 19 or 20.

Für die Herstellung von Proteinen, insbesondere von rekombinanten Proteinen, werden üblicher Weise Vektoren verwendet. Diese Vektoren werden dann in eine Zielzelle eingebracht und die Zielzelle wird kultiviert. Bei Wahl eines geeigneten Vektors produziert die Zielzelle das gewünschte Protein. Folglich ist ein noch weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Vektor enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, welcher z. B. zur Produktion des Affinitätsmarkers oder ggf. des mit dem Affinitätsmarker markierten Proteins des Interesses verwendet werden kann. Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Vektoren bekannt. Der Vektor wird in der Regel in Abhängigkeit von der Zielzelle ausgewählt, um eine möglichst effiziente Expression zu erreichen. Neben der Nukleinsäure für den Affinitätsmarker ggf. in Kombination mit der für das Protein des Interesses enthält der Vektor z. B. einen geeigneten Promotor, Enhancer, Selektionsmarker und/oder eine geeignete Signalsequenz, die beispielsweise die Sezernierung des Proteins in das Medium bewirkt, sowie ggf. geeignete Schnittstellen für z. B. Restriktionsenzyme. Dem Fachmann sind die Bestandteile von Vektoren bekannt und er wird sie in Abhängigkeit von der jeweiligen Zielzelle auswählen können. Die Restriktionsenzymschnittstellen erlauben es, einfach und schnell Nukleinsäuren, die für unterschiedliche Proteine des Interesses kodieren, in den Vektor ein- und auszubauen. Sie können je nachdem an welcher Seite der Affinitätsmarker später an das Protein gebunden sein soll, 5' oder 3' von der Nukleinsäure, die für den Affinitätsmarker kodiert, oder zwischen den Nukleinsäureabschnitten, die HA- und die Strep-Domäne kodieren, gelegen sein.For the production of proteins, in particular of recombinant proteins, vectors are commonly used. These vectors are then introduced into a target cell and the target cell is cultured. If a suitable vector is chosen, the target cell produces the desired protein. Consequently, a still further object of the present invention is a vector comprising a nucleic acid according to the invention, which z. B. can be used for the production of the affinity tag or, if appropriate, the tagged with the affinity tag protein of interest. A variety of vectors are known in the art. The vector is usually selected depending on the target cell in order to achieve the most efficient expression possible. In addition to the nucleic acid for the affinity tag, optionally in combination with that for the protein of interest, the vector contains z. As a suitable promoter, enhancer, selection marker and / or a suitable signal sequence, for example, the secretion of the protein in the medium causes, and optionally suitable interfaces for z. B. restriction enzymes. The person skilled in the art knows the constituents of vectors and will be able to select them depending on the particular target cell. The restriction enzyme cleavage sites make it possible to rapidly and easily incorporate and expand nucleic acids encoding different proteins of interest into the vector. Depending on which side of the affinity tag is to be later bound to the protein, they may be located 5 'or 3' of the nucleic acid encoding the affinity tag or between the nucleic acid segments encoding the HA and Strep domains.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins enthaltend das Binden des erfindungsgemäßen Affinitätsmarkers an eine weitere Verbindung. Wie oben bereits erläutert sind dem Fachmann Verfahren zur Erzeugung einer Bindung zwischen einzelnen chemischen Verbindungen bekannt. Im Falle einer Peptidbindung kann diese ebenfalls wie oben erläutert erzeugt werden.Another object of the present invention is a process for the preparation of a protein of the invention comprising the binding of the affinity tag of the invention to another compound. As already explained above, methods for producing a bond between individual chemical compounds are known to the person skilled in the art. In the case of a peptide bond, this can also be generated as explained above.

Ein noch weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteins enthaltend die Schritte:

a) Herstellen einer Nukleinsäure kodierend für das Protein;
b) Exprimieren der Nukleinsäure; und
c) ggf. Isolieren des Proteins.

Yet another object of the present invention is a process for the preparation of a protein according to the invention comprising the steps:

a) preparing a nucleic acid encoding the protein;
b) expressing the nucleic acid; and
c) optionally isolating the protein.

Das Protein enthält die Komponenten HA- und Strep-Domäne sowie das aufzureinigende Protein, die jeweils wie oben definiert sind und auch so angeordnet sein können. Zusätzlich können beispielsweise ein Spacer zwischen den beiden Domänen, eine oder mehrere Schnittstellen oder eine Signalsequenz vorhanden sein. Die einzelnen Komponenten sind in dem Protein wie oben erläutert angeordnet. Dem Fachmann ist bekannt, wie man aus einer Proteinsequenz unter Berücksichtigung des genetischen Codes eine Nukleinsäuresequenz ableitet. Darüber hinaus ist ihm bekannt, wie man eine solche Nukleinsäuresequenz mittels molekularbiologischer Standardverfahren herstellt. Dies kann beispielsweise durch Verwendung und Kombination vorhandener Sequenzen unter Einsatz von Restriktionsenzymen erfolgen. Geeigneter Weise enthält die Nukleinsäure auch weitere Elemente wie z. B. einen Promotor, Enhancer, cm Transskritionsstart- und -stoppsignal und ein Translationsstartsignal.The protein contains the HA and Strep domain components as well as the protein to be purified, each of which is as defined above and may be so arranged. In addition, for example, a spacer between the two domains, one or more interfaces or a signal sequence may be present. The individual components are arranged in the protein as explained above. The person skilled in the art knows how to derive a nucleic acid sequence from a protein sequence taking into account the genetic code. In addition, he is aware of how to prepare such a nucleic acid sequence by standard molecular biological methods. This can be done, for example, by using and combining existing sequences using restriction enzymes. Suitably, the nucleic acid also contains other elements such. A promoter, enhancer, cm transient start and stop signal, and a translational start signal.

Die so hergestellte Nukleinsäure wird dann ggf. mittels eines Vektors in eine Zielzelle eingebracht und exprimiert. Die Zielzelle kann jede geeignete Zelle sein, insbesondere eine Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- oder Tierzelle sein. Eingeschlossen sind auch Zelllinien dieser Zellen. Vorzugsweise handelt es sich um eine Säugerzelle, insbesondere um eine humane Zelle oder Zelllinie. Beispiele solcher Zellen sind HEK 293-Zellen, CHO-Zellen, HeLa-Zellen, CaCo-Zellen oder NIH 3T3-Zellen. Zur Transformation oder Transfektion der Zellen können geeignete Vektoren verwendet werden. Beispiele für Vektoren sind pBR322, die pUC-Serie, pBluescript, pTZ, pSP und pGEM. Die Komponenten der Nukleinsäure oder des Vektors werden so gewählt, dass die Nukleinsäure exprimiert und das Zielprotein (Affinitätsmarker und Protein des Interesses) von der Zielzelle produziert wird. Die Zellen werden kultiviert, bis eine ausreichende Menge an Zielprotein hergestellt wurde.The nucleic acid thus prepared is then optionally introduced and expressed by means of a vector in a target cell. The target cell may be any suitable cell, in particular a bacterial, fungal, plant or animal cell. Also included are cell lines of these cells. Preferably, it is a mammalian cell, in particular a human cell or cell line. Examples of such cells are HEK 293 cells, CHO cells, HeLa cells, CaCo cells or NIH 3T3 cells. For transformation or transfection of the cells, suitable vectors may be used. Examples of vectors are pBR322, the pUC series, pBluescript, pTZ, pSP and pGEM. The components of the nucleic acid or vector are chosen so that the nucleic acid is expressed and the target protein (affinity tag and protein of interest) is produced by the target cell. The cells are cultured until a sufficient amount of target protein is produced.

Anschließend kann das Protein isoliert werden. Wenn das Zielprotein in ausreichender Menge in das Medium sezerniert wird, kann mit diesem werter gearbeitet werden. Andernfalls kann es erforderlich sein, die Zellen zu zerstören. Dies kann beispielsweise durch Lyse der Zellen z. B. mittels Ultraschall oder hypotonem Medium erfolgen. Zum Entfernen unlöslicher Komponenten kann die gewonnene Probe z. B, zentrifugiert werden, insbesondere bei 10000 × g bis 15000 × g, und der gewonnene Überstand kann für das erfindungsgemäße Verfahren zur Aufreinigung weiter verwendet werden (siehe unten).Subsequently, the protein can be isolated. If the target protein is secreted in sufficient quantity in the medium, can be worked with this werter. Otherwise, it may be necessary to destroy the cells. This can be done, for example, by lysing the cells z. B. by ultrasound or hypotonic medium. To remove insoluble components, the sample obtained z. B, are centrifuged, especially at 10,000 × g to 15,000 × g, and the recovered supernatant can be further used for the purification process according to the invention (see below).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Aufreinigung eines Proteins enthaltend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Probe enthaltend ein Protein, an das ein erfindungsgemäßer Affinitätsmarker gebunden ist;
b) Aufreinigen des Proteins mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung der HA-Domäne; und
c) Aufreinigen der aufgereinigten Proteins aus Schritt b) mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung der Strep-Domäne.

Another object of the present invention is a process for the purification of a protein comprising the steps:

a) providing a sample containing a protein to which an affinity tag according to the invention is bound;
b) purifying the protein by affinity purification using the HA domain; and
c) Purification of the purified protein from step b) by affinity purification using the Strep domain.

Alternativ kann auch das folgende Verfahren verwendet werden:

a) Bereitstellen einer Probe enthaltend ein Protein, an das ein erfindungsgemäßer Affinitätsmarker gebunden ist;
b) Aufreinigen des Proteins mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung der Strep-Domäne; und
c) Aufreinigen des aufgereinigten Proteins aus Schritt b) mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung der HA-Domäne.

Alternatively, the following method may be used:

a) providing a sample containing a protein to which an affinity tag according to the invention is bound;
b) purifying the protein by affinity purification using the Strep domain; and
c) Purification of the purified protein from step b) by affinity purification using the HA domain.

Die Probe enthaltend das mit dem Affinitätsmarker markierte Proteins kann wie oben dargestellt gewonnen werden, beispielsweise durch chemische Synthese oder auf gentechnologischem Wege mittels Expression in einer Zelle.The sample containing the protein labeled with the affinity tag can be obtained as shown above, for example by chemical synthesis or by genetic engineering by expression in a cell.

Die Probe, die wie oben beschrieben gewonnen wurde, wird mittels doppelter Affinitätsreinigung (Tandem-Affinitätsreinigung) unter Verwendung der HA-Domäne und der Strep-Domäne aufgereinigt. Die Affinitätsreinigung ist eine spezielle Form der Adsorptionsreinigung, bei der auf einem Träger Gruppen (Bindungspartner) mit hoher Affinität und daher hoher Bindungsstärke zu einer der beiden Domänen vorliegen, so dass diese bevorzugt adsorbiert und so von anderen Stoffen abgetrennt werden können. Hierzu kann entweder zuerst über die HA-Domäne und dann über die Strep-Domäne oder in umgekehrter Reihenfolge gereinigt werden. Die Reinigung findet durch spezifische Bindung an einen geeigneten Bindungspartner statt. Der Bindungspartner ist vorzugsweise an eine feste Phase gebunden. Bei der festen Phase kann es sich um übliche Trägermaterialien wie z. B. Sepharose, Superflow, Macroprep, PORÖS 20 oder PORÖS 50 handeln. Die Auftrennung erfolgt dann beispielsweise chromatographisch z. B. mittels Schwerkraft, HPLC oder FPLC. Alternativ kann der Bindungspartner auch an Beads, insbesondere magnetische Beads gebunden sein. Nach Zugabe der Beads zu der Probe kommt es zur Bindung zwischen der jeweiligen Domäne und den entsprechenden Bindungspartner. Die Suspension kann dann z. B. zentrifugiert werden, wobei das markierte Protein mit dem Bead sedimentiert und andere Komponenten im Überstand verbleiben und durch Abnehmen dieses entfernt werden können. Alternativ wird die Suspension unter Ausnutzung der magnetischen Eigenschaften der Beads aufgetrennt. In einer Ausführungsform wird die Suspension auf eine Säule aufgetragen, welche sich in einem magnetischen Feld befindet. Da die magnetischen Beads und das daran gebundene Protein im magnetischen Feld festgehalten werden, können andere Bestandteile der Probe durch mehrere Waschgänge ausgespült werden. Das Protein des Interesses kann dann z. B. durch einen geeigneten Elutionspuffer von den Beads gewaschen werden oder durch enzymatische Spaltung z. B. an der Schnittstelle zwischen der HA- und der Strep-Domäne von den Beads getrennt werden.The sample recovered as described above is purified by double affinity purification (tandem affinity purification) using the HA domain and the Strep domain. Affinity purification is a special form of adsorption purification in which groups (binding partners) with high affinity and therefore high binding strength to one of the two domains are present on a support, so that they can be preferentially adsorbed and thus separated from other substances. This can be done either first by the HA domain and then by the Strep domain or in reverse order. The purification takes place by specific binding to a suitable binding partner. Of the Binding partner is preferably bound to a solid phase. The solid phase may be conventional support materials such. Sepharose, Superflow, Macroprep, PORÖS 20 or PORÖS 50. The separation is then carried out, for example, chromatographically z. B. by gravity, HPLC or FPLC. Alternatively, the binding partner may also be bound to beads, in particular magnetic beads. After addition of the beads to the sample, binding occurs between the respective domain and the corresponding binding partner. The suspension can then z. B. centrifuged, wherein the labeled protein sedimented with the bead and other components remain in the supernatant and can be removed by removing it. Alternatively, the suspension is separated by utilizing the magnetic properties of the beads. In one embodiment, the suspension is applied to a column which is in a magnetic field. Because the magnetic beads and attached protein are held in the magnetic field, other components of the sample can be rinsed out by multiple washes. The protein of interest can then z. B. are washed by a suitable elution buffer of the beads or by enzymatic cleavage z. B. be separated at the interface between the HA and the Strep domain of the beads.

Die erste Aufreinigung des Proteins (Schritt b)) erfolgt durch a) Bindung der ersten Domäne (HA- oder Strep-Domäne) an den jeweiligen Bindungspartner unter geeigneten Bedingungen, b) ggf. Waschen und c) Lösen des Proteins vom Bindungspartner. Letzteres kann entweder durch Veränderung der Bedingungen erfolgen, wobei die geänderten Bedingungen die Bindung zwischen Affinitätsmarker und Bindungspartner nicht mehr erlauben (z. B. Veränderung des pH-Wertes oder der Ionenstärke), oder durch Abtrennen des Proteins von der an den Bindungspartner gebundenen Domäne. Das Abtrennen kann durch Spaltung der Bindung zwischen Protein und Bindungspartner z. B. durch chemische Mittel oder durch Verwendung spezifischer Enzyme, wie dies weiter oben ausführlich beschrieben ist, erfolgen. Danach erfolgt die zweite Aufreinigung des Proteins (Schritt c)) durch a) Bindung der zweiten Domäne, d. h. der Domäne, die nicht im ersten Aufreinigungsschritt verwendet wurde, an den jeweiligen Bindungspartner unter geeigneten Bedingungen, b) ggf. Waschen und c) Lösen des Proteins durch vom Bindungspartner, wobei diese Schritte wie für den ersten Aufreinigungsschritt beschrieben ausgestaltet sein können.The first purification of the protein (step b)) takes place by a) binding of the first domain (HA or Strep domain) to the respective binding partner under suitable conditions, b) optionally washing and c) dissolution of the protein from the binding partner. The latter can be done either by changing the conditions, whereby the changed conditions no longer allow the binding between affinity marker and binding partner (eg changing the pH or the ionic strength), or by separating the protein from the domain bound to the binding partner. The separation can be achieved by cleavage of the bond between protein and binding partner z. By chemical means or by the use of specific enzymes, as described in detail above. Thereafter, the second purification of the protein (step c)) by a) binding of the second domain, d. H. the domain which was not used in the first purification step, to the respective binding partner under suitable conditions, b) optionally washing and c) dissolving the protein by the binding partner, which steps may be configured as described for the first purification step.

In Falle der HA-Domäne ist der Bindungspartner vorzugsweise ein spezifischer Antikörper. Als Antikörper kann entweder ein durch dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellter polyklonaler oder vorzugsweise monoklonaler Antikörper oder ein aus dem Stand der Technik bekannter Antikörper (siehe oben) verwendet werden.In the case of the HA domain, the binding partner is preferably a specific antibody. As antibodies either a polyclonal or preferably monoclonal antibody prepared by a person skilled in the art or an antibody known from the prior art (see above) can be used.

Im Falle der Strep-Domäne ist der Bindungspartner vorzugsweise Streptavidin oder ein verwandtes Molekül wie Kern-Streptavidin (Bayer et al., 1989, Biochem. J. 259: 369–376) oder die in US 6,103,493 oder DE19641876 beschriebenen Streptavidinmuteine. Weiter bevorzugt ist das Bindungsmolekül Strep-Tactin. In diesem Fall kann die Elution des gebundenen Proteins beispielsweise mit den Kompetitoren wie Biotin oder Biotinanaloga wie z. B. Desthiobiotin, Iminobiotin, Diaminobiotin, Liponsäure, HABA und/oder DM-HABA, erfolgen. Darüber hinaus können als Bindungspartner auch spezifische Antikörper verwendet werden, die gegen die Strep-Domäne gerichtet sind. Die genannten Strep-Tag-Bindungspartner sind kommerziell erhältlich (IBA GmbH, Göttingen, Deutschland).In the case of the Strep domain, the binding partner is preferably streptavidin or a related molecule such as nuclear streptavidin (Bayer et al., 1989, Biochem. J. 259: 369-376) or those described in U.S. Pat US 6,103,493 or DE19641876 described streptavidin muteins. More preferably, the binding molecule is Strep-Tactin. In this case, the elution of the bound protein, for example, with the competitors such as biotin or biotin analogs such. B. desthiobiotin, iminobiotin, diaminobiotin, lipoic acid, HABA and / or DM-HABA done. In addition, specific antibodies which are directed against the Strep domain can also be used as binding partners. The strep tag binding partners mentioned are commercially available (IBA GmbH, Göttingen, Germany).

In einer Ausführungsform der Erfindung kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Aufreinigung auch verwendet werden, um Komponenten (Beute, prey) zu identifizieren, die mit einem mit dem Affinitätsmarker markierten Protein (Köder, bait) Wechselwirken und an dieses binden. Solche Köder-Beute-Versuche sind dem Fachmann bekannt und in den Beispielen beschrieben.In one embodiment of the invention, the purification method of the invention may also be used to identify components (prey, prey) that interact with and bind to an affinity tagged protein (bait, bait). Such bait-prey experiments are known to those skilled in the art and described in the examples.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Affinitätsmarker zwischen Schritt b) und Schritt c) gespalten. Die Spaltung erfolgt wie oben beschrieben.In a preferred embodiment of the invention, the affinity marker is cleaved between step b) and step c). The cleavage takes place as described above.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Affinitätsmarkers zur Markierung eines Proteins.Yet another object of the present invention is the use of an affinity tag according to the invention for labeling a protein.

Beschreibung der FigurenDescription of the figures

1A stellt die Aufreinigung eines Zelllysats bei Verwendung eines 6 × His-Tags im Vergleich zur Aufreinigung bei Verwendung eines 2.8-STREPII-Markers dar. Die Serin-Threonin-Kinase GRAF wurde mit einem 6 × His-Tag oder einem 2.8-STREPII-Marker (WSHPQFEK-G₈-WSHPQFEK-Spacer-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA) markiert und in HEK 293-Zellen exprimiert. Die Zellen wurden wie in den Beispielen beschrieben geerntet und aufgereinigt. Die Figur zeigt einen Vergleich der Aufreinigung von His-Tag-markiertem GRAF über eine TALON IMAC-Matrix (BD Biosciences Clontech) und 2.8-StrepII-markiertem GRAF über Strep-Tactin Superflow-Matrix (IBA). Die Proben wurden auf einem 10%igem Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch getrennt und mit Silber angefärbt. Während der 2.8-StrepII-Marker (C) ein distinktes Bandenmuster erzeugt, das in späteren Experimenten bekannten Interaktionspartnern zugeordnet werden konnte (3), zeigte die IMAC-Aufreinigung des 6 × HIS-Tags (B) einen hohen Hintergrund. Der His-Tag ist somit im Gegensatz zum STREPII-Marker nicht für eine Affinitätsaufreinigung von Proteinen aus Säugetierzellkulturen geeignet. A: Größenstandards B: GRAF mit 6 × His-Tag C: GRAF mit 2.8-STREPII-Marker 1: GRAF 2: 14-3-3 1A Figure 3 illustrates the purification of a cell lysate using a 6xHis tag as compared to purification using a 2.8 STREPII marker. Serine threonine kinase GRAF was probed with a 6xHis tag or a 2.8 STREPII tag (Fig. WSHPQFEK-G ₈ -WSHPQFEK-spacer-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA) and expressed in HEK 293 cells. The cells were harvested and purified as described in the Examples. The figure shows a comparison of the purification of His- Tag-labeled GRAF via a TALON IMAC matrix (BD Biosciences Clontech) and 2.8-StrepII-labeled GRAF via Strep-Tactin Superflow Matrix (IBA). The samples were electrophoresed on a 10% polyacrylamide gel and stained with silver. While the 2.8 StrepII marker (C) generates a distinct band pattern that could be assigned to known interaction partners in later experiments ( 3 ), the IMAC purification of the 6x HIS tag (B) showed a high background. Thus, unlike the STREPII marker, the His tag is not suitable for affinity purification of proteins from mammalian cell cultures. A: size standards B: COG with 6 × His-tag C: Graf with 2.8 STREPII marker 1: COUNT 2: 14-3-3

1B zeigt einen Vergleich der Aufreinigung eines Zelllysats bei Markierung von GRAF einem 2.12-STREPII-Marker und einer Vektorkontrolle. GRAF wurde mit einem 2.12-STREPII-Marker (WSHPQFEK-(GGGS)₃-WSHPQFEK-Spacer-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA) markiert und wie in 1A exprimiert und gereinigt. Die Zellen wurden vor der Lyse über Nacht in serumfreiem Medium gehalten. Die Figur zeigt einen Vergleich von GRAF-Aufreinigungen aus unstimulierten (a) und stimulierten (b) HEK293-Zellen. Die Aufreinigung über 2.12-STREPII aus unstimulierten Zellen ist in den Spuren B und C (Vektorkontrolle) wiedergegeben. Jeweils ein Aliquot der BRAF-2.12-STREPII transfizierten Zellen und der Vektorkontrolle wurden 10 min mit serumhaltigem Medium (10% FBS) stimuliert (D, E). A: Größenstandards B, D: GRAF mit 2.12-STREPII-Marker C, E: Vektorkontrolle a: kein FBS (B, C) b: stimuliert mit 10% FBS (D, E) 1: GRAF 2: 14-3-3 1B Figure 3 shows a comparison of the purification of a cell lysate on labeling GRAF with a 2.12 STREPII marker and a vector control. GRAF was labeled with a 2.12 STREPII marker (WSHPQFEK- (GGGS) ₃ -WSHPQFEK spacer-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA-G-YPYDVPDYA) and as described in 1A expressed and purified. The cells were kept in serum-free medium overnight before lysis. The figure shows a comparison of GRAF purifications from unstimulated (a) and stimulated (b) HEK293 cells. Purification via 2.12-STREPII from unstimulated cells is shown in lanes B and C (vector control). One aliquot of the BRAF-2.12-STREPII transfected cells and the vector control were stimulated for 10 min with serum-containing medium (10% FBS) (D, E). A: size standards B, D: GRAF with 2.12 STREPII marker C, E: vector control a: no FBS (B, C) b: stimulated with 10% FBS (D, E) 1: COUNT 2: 14-3-3

2 veranschaulicht die Aufreinigungsqualität bei Verwendung des TAPe-Markers. GRAF wurde mit dem Marker TAPe (SEQ ID NRn.: 18 und 19) markiert und in HEK 293-Zellen exprimiert. Die Figur zeigt das Ergebnis der Zweischrittaufreinigung von TAPe-markiertem-GRAF (F, G). Die Zwischenschritte wurden zur Darstellung der Aufreinigungseffizienz ebenfalls aufgetragen (B–E). Die HA-Matrix wurde nach der TEV-Eluation mit Gelladepuffer nacheluiert und das Eluat aufgetragen (B, C). In den Spuren D und E sind die Überstände der 2. Affinitätsaufreinigung aufgetragen. Die Proteine wurden auf einem 10%igen Acrylamidgel getrennt und mit Silber angefärbt. 2 illustrates the purification quality when using the TAPe marker. GRAF was labeled with the marker TAPe (SEQ ID NOs: 18 and 19) and expressed in HEK 293 cells. The figure shows the result of the two-step purification of TAPe-labeled GRAF (F, G). The intermediate steps were also plotted to illustrate the purification efficiency (B-E). The HA matrix was post-eluted after the TEV elution with gel loading buffer and the eluate was applied (B, C). Lanes D and E show the supernatants of the 2nd affinity purification. The proteins were separated on a 10% acrylamide gel and stained with silver.

Das Experiment veranschaulicht deutlich, dass im 2. Eluat keine Proteinbanden in der Vektorkontrolle mehr auftreten. Ein Vergleich der Spuren D und E mit den Spuren F und G zeigt, dass der Hindergrund vollständig abgetrennt wurde. A: Größenstandards B, D, F: Vektor (Kontrolle) C, E, G: TAPe-markiertes GRAF a: Anti-HA-Beads b: Überstand der 2. Aufreinigung (TEV-Verdau) c: Eluat der 2. Aufreinigung The experiment clearly demonstrates that no protein bands in the second eluate occur in the vector control anymore. A comparison of the tracks D and E with the tracks F and G shows that the background was completely separated. A: size standards B, D, F: vector (control) C, E, G: TAPe-labeled GRAF a: anti-HA beads b: supernatant of the 2nd purification (TEV digestion) c: eluate of the 2nd purification

3 zeigt die Identifizierung von mit GRAF wechselwirkenden Zellkomponenten mittels des Affinitätsmarkers 2.12-StrepII. Eine Affinitätsaufreinigung von transient exprimiertem markiertem GRAF und eine Vektorkontrolle wurden auf einem 10%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und mit Silber angefärbt. Die identifizierten Proteine sind nummeriert und nachfolgend wiedergegeben. A: Größenstandards B: BRAF-2.12-StrepII C: Vektor (Kontrolle) 1: BRAF 2: HSP90 3: GRAF 4: HSP70 5: FLJ10709 6: GRAF 7: Tubulin 8: MEK (1, 2) 9: 14-3-3ε 10: 14-3-3αβζ 3 shows the identification of GRAF interacting cell components by means of the affinity label 2.12-StrepII. An affinity purification of transiently expressed labeled GRAF and a vector control were run on a 10% polyacrylamide gel and stained with silver. The identified proteins are numbered and reproduced below. A: size standards B: BRAF-2.12-Strep II C: vector (control) 1: BRAF 2: HSP90 3: COUNT 4: HSP70 5: FLJ10709 6: COUNT 7: Tubulin 8: MEK (1, 2) 9: 14-3-3ε 10: 14-3-3αβζ

4 zeigt die Zweischrittaufreinigung der membranständigen Rezeptortyrosinkinase Ret und einer Ret-Mutante C634R. Die Proben wurden nach der Aufreinigung auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und die Proteine mit Silber angefärbt. Zur Darstellung der Aufreinigungseffizienz sind die Zwischenschritte dargestellt (B–G). Die Eluate des zweiten Aufreinigungsschrittes (tandem STREPII) sind in den Spuren H (Ret wt), I (Ret-C634R) und K (Vektorkontrolle) aufgetragen. Abhängig von der Stringenz der Aufreinigung kann Ret in der TAPe-Aufreinigung hochrein dargestellt werden Im Eluat ist nur noch die Doppelbande (I/II) bei 170 bzw. 180 kDa zu erkennen, die den zwei Glycosilierungsformen von Ret (120 kDa) entsprechen. A: Größenstandards D, G, K: Vektor (Kontrolle) B, E, H: TAPe-markiertes Ret C, F, I: TAPe-markiertes Ret-C634R a: Anti-HA-Beads b: Überstand der 2. Aufreinigung (TEV-Verdau) c: Eluat der 2. Aufreinigung 4 shows the two-step purification of the membrane-bound receptor tyrosine kinase Ret and a Ret mutant C634R. The samples were applied after purification on a 10% SDS-polyacrylamide gel and the proteins stained with silver. To illustrate the purification efficiency, the intermediate steps are shown (B-G). The eluates of the second purification step (tandem STREPII) are in the Lanes H (Ret wt), I (Ret-C634R), and K (vector control) were plotted. Depending on the stringency of the purification, Ret can be displayed highly pure in the TAPe purification. Only the double bands (I / II) at 170 or 180 kDa corresponding to the two glycosylation forms of Ret (120 kDa) can be recognized in the eluate. A: size standards D, G, K: vector (control) B, E, H: TAPe-labeled Ret C, F, I: TAPe-labeled Ret-C634R a: anti-HA beads b: supernatant of the 2nd purification (TEV digestion) c: eluate of the 2nd purification

Beispiel: Tandem-Affinitätsaufreinigung mittels des TAPe-TagExample: tandem affinity purification using the TAPe tag

1. Herstellung der Konstrukte1. Preparation of the constructs

Die Konstrukte wurden auf der Basis des pcDNA3.0 Vektors (Invitrogen) hergestellt. Die Tags wurden einzeln in einer Oligonukleotid-basierten Strategie in den Zielvektor kloniert. Hierzu wurden zunächst entsprechende komplementäre Oligonukleotidpaare synthetisiert. Die Enden der Oligonukleotide waren so beschaffen, dass sich nach einem Annealingschritt (temperaturgesteuerte Kondensation komplementärer Stränge) Überhänge bildeten, die komplementär zu entsprechenden Halbseiten der verwendeten Restriktionsendonukleasen waren, so dass das entstandene doppelsträngige Fragment direkt nach dem Annealing in den präparierten Vektor ligiert werden konnte. Die angewandten molekularbiologischen Techniken wurden nach Standardprotokollen durchegführt (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laborstory Press, 2. Ausg.)The constructs were prepared on the basis of the pcDNA3.0 vector (Invitrogen). The tags were individually cloned into the target vector in an oligonucleotide-based strategy. For this purpose, corresponding complementary oligonucleotide pairs were first synthesized. The ends of the oligonucleotides were such that after an annealing step (temperature-controlled condensation of complementary strands) overhangs were formed which were complementary to corresponding half-sides of the restriction endonucleases used, so that the resulting double-stranded fragment could be ligated directly after annealing in the prepared vector. The applied molecular biology techniques were carried out according to standard protocols (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory Press, 2nd Ed.)

2. Kultivierung der Zellen2. Cultivation of the cells

HEK293-Zellen wurden in DMEM-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FBS) gehalten. Die Kultivierungsbedingungen entsprechen den Standards (DSMZ, Braunschweig).HEK293 cells were maintained in DMEM medium with 10% fetal calf serum (FBS). The cultivation conditions correspond to the standards (DSMZ, Braunschweig).

Zur Transfektion mit Konstrukt-Plasmiden (TAPe-pcDNA3) wurden die Zellen auf eine Dichte von 50–80% gezogen. Die Transfektion wurde mit Effectene (Qiagen, Hilden) laut Angaben des Herstelles durchgeführt. Die Zellen wurden 6 h mit dem Transfektionsmix inkubiert. Danach wurden die Zellen in Standardmedium (DMEM, 10% FBS) für 36 h gehalten. Am Tag vor der Ernte wurden die Zellen in serumfreiem Medium über Nacht ausgehungert.For transfection with construct plasmids (TAPe-pcDNA3) the cells were grown to a density of 50-80%. The transfection was carried out with effects (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer. The cells were incubated for 6 h with the transfection mix. Thereafter, the cells were maintained in standard medium (DMEM, 10% FBS) for 36 hours. The day before harvest, the cells were starved overnight in serum-free medium.

3. Ernte der Zellen3. Harvest of the cells

Nach Abnahme des Mediums wurden die Zellkulturplatten (Durchmesser 14 cm) kurz mit PBS gewaschen und mit flüssigem Stickstoff übergossen. Das Schockfrieren ist nach Stimulation der Zellen mit Wachstumsfaktoren erforderlich, um unspezifische Phosphorylierungen zu verhindern.After removal of the medium, the cell culture plates (diameter 14 cm) were washed briefly with PBS and doused with liquid nitrogen. Shock freezing is required after stimulation of cells with growth factors to prevent nonspecific phosphorylation.

4. Lyse der Zellen4. Lysis of the cells

Zur Lyse der Zellen wurde 1 ml Lysepuffer pro Zellkulturplatte (50 mM Tris-HCl pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,5–1% NP-40; 1 × Complete protease inhibitor cocktail (Roche); ggf. (bei phosphorylierten Proteinen) 1 mM Phosphataseinhibitor Ortovanadat) auf den tiefgefrorenen Zellrasen gegeben und die Zellen durch Abschaben geerntet. Anschließend wurden die Proben 30 min bis 1 h bei 4°C im Überkopfschütter inkubiert und zum Abtrennen der Kerne 10 min bei 13000 × g (4°C) zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Filtration durch eine 65μ-Filtereinheit von ungelösten Bestandteilen befreit.For lysis of the cells, 1 ml of lysis buffer per cell culture plate (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5-1% NP-40, 1 × complete protease inhibitor cocktail (Roche), optionally (in the case of phosphorylated Proteins) 1 mM phosphatase inhibitor Ortovanadat) were added to the frozen cell lawn and the cells were harvested by scraping. Subsequently, the samples were incubated for 30 min to 1 h at 4 ° C in overhead and centrifuged for 10 min at 13000 x g (4 ° C) to separate the nuclei. The supernatant was freed of undissolved constituents by filtration through a 65μ filter unit.

5. Erste Aufreinigung5. First purification

Die klaren Lysate wurden mit gewaschener Affinitätsmatrix (etwa 15 μl anti-HA 3F10 (Roche) pro 14 cm Schale) versetzt. Der Ansatz wurde für 2 h bis 16 h auf einem Überkopfschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Überstand abgenommen.The clear lysates were spiked with washed affinity matrix (approximately 15 μl anti-HA 3F10 (Roche) per 14 cm dish). The batch was incubated for 2 h to 16 h on an overhead shaker. After incubation, the supernatant was removed.

Die Beads wurden in Spinsäulen (MicroSpin, Amersham) überführt. Nachfolgend wurden die Beads 3× mit 500 μl Waschpuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4; 150 mM NaCl (1 × TBS); ggf. bis 1% NP-40, 1 mM Orthovanadat bei phosphorylierten Proteinen) und 2× mit 500 μl TEV-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0; 0,5 mM EDTA) gewaschen. Der Waschpuffer wurde jeweils durch eine kurze Zentrifugation (5 s, 1000 × g) durch die Säule gespült.The beads were transferred to spin columns (MicroSpin, Amersham). Subsequently, the beads were washed 3 times with 500 μl wash buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl (1 × TBS), optionally up to 1% NP-40, 1 mM orthovanadate in phosphorylated proteins) and 2 × 500 μl of TEV buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA). The wash buffer was each flushed through the column by a short spin (5 sec, 1000 x g).

6. TEV-Proteolyse (1. Elution)6. TEV proteolysis (1st elution)

Die gebundenen Proteinkomplexe wurden in 100 μl TEV-Puffer (+1 mM DTT) mit 50 Units AcTEV (Invitrogen) eluiert. Hierzu wurde 2 h bei 16°C inkubiert. Die Ansätze wurden von Zeit zu Zeit durchmischt. Zur Unterstützung der Elution und zum Unterdücken des Hintergrunds durch gelöstes IgG wurden nach 1,5 h 5 μl HA-Peptid (1 mg/ml in TEV-Puffer) hinzugegeben. Nach Beendigung der Inkubation wurde das Eluat durch Zentrifugation abgetrennt. Die Beads wurden 1× mit 100 μl Waschpuffer nachgewaschen. Die Eluate wurden vereint.The bound protein complexes were eluted in 100 μl of TEV buffer (+1 mM DTT) with 50 units of AcTEV (Invitrogen). For this purpose, incubation was carried out at 16 ° C. for 2 h. The approaches were mixed from time to time. To aid elution and background suppression by dissolved IgG, 5 μl HA peptide (1 mg / ml in TEV buffer) was added after 1.5 h. After completion of the incubation, the eluate was separated by centrifugation. The beads were washed 1 × with 100 μl washing buffer. The eluates were united.

7. Zweite Aufreinigung7. Second purification

Das erste Eluat wurde mit Strep-Tactin Superflow Matrix (etwa 15 μl pro 14 cm Schale, IBA) versetzt und 2 h bei 4°C im Überkopfschüttler inkubiert. Die Beads wurden in Spin-Säulen (Amersham) 3× mit Waschpuffer gewaschen. Eluiert wurde mit 1–2 Bettvolumen (50–100 μl) Elutionspuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA; 2.5 mM Desthiobiotin; ggf. 1 mM Orthovanadat). Vor der Zentrifugation (30 s; 2000 × g) wurden die Beads 5 min auf Eis inkubiert.The first eluate was spiked with Strep-Tactin Superflow Matrix (about 15 μl per 14 cm dish, IBA) and incubated for 2 h at 4 ° C in an overhead shaker. The beads were washed in spin columns (Amersham) 3x with wash buffer. Elution was with 1-2 bed volumes (50-100 μl) of elution buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2.5 mM desthiobiotin, optionally 1 mM orthovanadate). Before centrifugation (30 s, 2000 x g), the beads were incubated on ice for 5 min.

8. Gelelektrophorese/Massenspektrometrie8. Gel electrophoresis / mass spectrometry

Für die gelelektrophoretische Auftrennung wurde die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelektrophorese, modifiziert nach Laemmli, eingesetzt (Laemmli, 1970, Nature 227, 680–685). Zur Visualisierung wurden die Proteine mit Silber nach Massenspektrometriekompatiblen Standardprotokollen angefärbt (Shevchenko et al., 1996, Analytical Chemistry, 68, 850–858). Die Identifizierung von Proteinen erfolgte nach in-Gel-Proteolyse mit Trypsin auf einem MALDI (matrix assisted loser desorption and ionization) – TOF (time of flight) Massensprektrometer mittels eines peptide mass fingerprint (PMF) laut Standardprotokollen (Mann, M., Hojrup, P. and Roepstorff, P., 1993, Biological Mass Spectrometry, 22, 338–345). SEQUENCE LISTING

For gel electrophoretic separation, discontinuous SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, modified according to Laemmli, was used (Laemmli, 1970, Nature 227, 680-685). For visualization, the proteins were stained with silver according to mass spectrometry compatible standard protocols (Shevchenko et al., 1996, Analytical Chemistry, 68, 850-858). The identification of proteins was carried out after in-gel proteolysis with trypsin on a matrix-assisted loose desorption and ionization (MALDI) TOF (time of flight) mass spectrometer by means of a peptide mass fingerprint (PMF) according to standard protocols (Mann, M., Hojrup, P. and Roepstorff, P., 1993, Biological Mass Spectrometry, 22, 338-345). SEQUENCE LISTING

Claims

Affinity tag containing a hemagglutinin epitope domain (HA domain) containing at least one HA tag, and a streptavidin binding domain (Strep domain) containing at least two strep tags.

The affinity tag of claim 1, wherein the HA domain contains or consists of at least 2, 3, 4 or 5 HA tags.

An affinity tag according to claim 1 or 2, wherein the HA tag contains the sequence YPYDVPDYA.

Affinity tag according to claim 2 or 3, wherein the individual HA tags follow one another directly or are linked via a linker (HA linker).

The affinity tag of claim 4, wherein the HA linker consists of a maximum of 10 amino acid residues.

The affinity tag of claim 4, wherein the HA linker consists of a maximum of 6, 5, 4, 3 or 2 amino acid residues.

The affinity tag of claim 4, wherein the HA linker consists of at most 1 amino acid residue.

Affinity tag according to any one of claims 4-7, wherein each amino acid residue is a glycine residue.

Affinity tag according to at least one of claims 1 to 8, wherein the Strep domain at least 3, 4, 5 or 6 Strep tags complies.

Affinity tag according to at least one of claims 1 to 9, wherein the Strep tags contain the amino acid sequence histidine-proline-glutamine, histidine-proline-asparagine and / or histidine-proline-methionine.

Affinity tag according to at least one of claims 1 to 9, wherein the Strep tags contain the amino acid sequence WSHPQFEK.

The affinity tag of claims 1 to 11, wherein each 2 Strep tags are linked by a Strep linker.

The affinity tag of claim 12, wherein the Strep linker is selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or maximum There are 20 amino acid residues.

Affinity tag according to claim 12 or 13, wherein the Strep linker consists of glycine and serine residues or of glycine and alanine residues.

The affinity tag according to at least one of claims 12 to 14, wherein the Strep linker has the sequences (G) ₈ , (G) ₁₂ , GAGA, (GAGA) ₂ , (GAGA) ₃ , (GGGS) ₂ and / or (GGGS) ₃ contains or consists of.

Affinity tag according to at least one of claims 1 to 15, wherein the Strep domain contains 2 Strep tags and the HA domain contains 1, 2 or 3 HA tags.

Affinity tag according to any one of claims 1-17, wherein there is a cleavable linkage between the HA domain and the Strep domain.

The affinity tag of claim 17, wherein the cleavable bond is a protease cleavage site.

The affinity tag of claim 18, wherein the protease cleavage site is a TEV interface or a PreScisson cleavage site.

Affinity tag according to at least one of claims 1 to 11 containing or consisting of the sequence of SEQ ID NO. 17 or 18.

A protein or protein complex containing an affinity tag according to any one of claims 1 to 20.

An affinity tag according to any one of claims 1 to 20, wherein the affinity tag is a protein.

A nucleic acid encoding an affinity tag according to claim 22 or a protein according to claim 22.

Vector containing a nucleic acid according to claim 23.

A process for producing a protein according to claim 21 or 22 comprising the step a) binding of the affinity tag according to at least one of claims 1 to 20 or 22 to a protein.

A method of making an affinity tag or protein according to claim 22 comprising the steps a) preparing a nucleic acid encoding the protein; b) expressing the nucleic acid; and c) optionally isolating the protein.

A method of purifying a protein comprising the steps of: a) providing a sample containing a protein to which an affinity tag is attached as claimed in any one of claims 1 to 20 or 22; b) purifying the protein by affinity purification using the HA domain; and c) purifying the purified protein from step b) by affinity purification using the Strep domain.

Process for the purification of a protein comprising the steps: a) providing a sample containing a protein to which an affinity tag is attached according to at least one of claims 1 to 20 or 22; b) purifying the protein by affinity purification using the Strep domain; and c) Purification of the purified protein from step b) by affinity purification using the HA domain.

The method of claim 27 or 28, wherein the affinity tag is cleaved between step b) and step c).

Use of an affinity tag according to at least one of claims 1 to 20 or 22 for labeling a protein.