DE1011119B

DE1011119B - Nutrient medium for the production of neomycin

Info

Publication number: DE1011119B
Application number: DEU3705A
Authority: DE
Inventors: Leroy Emanuel Johnson; Harold John Koepsell; Bruce Wenzel Churchill
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1955-02-21
Filing date: 1956-01-12
Publication date: 1957-06-27

Description

Nährmedium zur Herstellung von Neomycin Die Erfindung betrifft ein neues Gärungsmedium zur Herstellung von Neomycin in erhöhten Ausbeuten aus neomycinerzeugenden Mikroorganismen.Nutrient medium for the production of neomycin The invention relates to a new fermentation medium for the production of neomycin in increased yields from neomycin-producing Microorganisms.

Bisher wurde Glukose (Dextrose) als Kohlenstoffquelle bei der Herstellung von Neomycin verwendet, wobei jedoch verhältnismäßig geringe Ausbeuten an Neomycin erzielt wurden, was offenbar darauf zurückzuführen ist, daß mit zunehmendem Glukosegehalt die Anhäufung von durch Glykolyse entstehenden Stoffen, z. B. organische Säuren, dazu neigt, die Neomycinbildung nachteilig zu beeinflussen. Es ist auch bereits vorgeschlagen worden, Stärke als Kohlenstoffquelle zu verwenden; jedoch wurden hierbei nach Dulmage, Applied Microbiology, Bd.I, S. 103 bis 106 (1953), nur geringes Wachstum und geringe Ausbeuten an Neomycin erhalten.Previously, glucose (dextrose) was used as a carbon source in the manufacture used by neomycin, but with relatively low yields of neomycin were achieved, which is apparently due to the fact that with increasing glucose content the accumulation of substances produced by glycolysis, e.g. B. organic acids, tends to adversely affect neomycin formation. It is already it has been suggested to use starch as a carbon source; however have been doing this according to Dulmage, Applied Microbiology, Vol. I, pp. 103 to 106 (1953), only slight growth and low yields of neomycin obtained.

Es wurde nun gefunden, daß überraschend hohe Ausbeuten an Neomycin erhalten werden, wenn man die Glukose mit Stärke ergänzt und die Menge des proteinhaltigen Stoffes entsprechend erhöht. So werden erfindungsgemäß unverhältnismäßig hohe Ausbeuten an Neomycin erhalten, wenn man Streptomyces fradiae oder einen ähnlichen neomycinerzeugenden Organismus in einem wäßrigen Gärungsnährmedium züchtet, das mindestens etwa 30/, eines proteinhaltigen Stoffes (bezogen auf seinen Proteingehalt), etwa 1 bis 4°/o eines leicht assimilierbaren Kohlehydrats, d. h. eines solchen, das leicht durch den Mikroorganismus umgesetzt wird, wodurch ein schnelles Wachstum bzw. eine rasche Vermehrung der Mikroorganismen und die Erzeugung großer Mengen Myzel bewirkt wird, sowie mindestens etwa 30/, eines langsam assimilierbaren Polysaccharids enthält.It has now been found that surprisingly high yields of neomycin are obtained if the glucose is supplemented with starch and the amount of the protein-containing substance is increased accordingly. Thus, according to the invention, disproportionately high yields of neomycin are obtained if Streptomyces fradiae or a similar neomycin-producing organism is cultured in an aqueous fermentation medium which contains at least about 30 % of a protein-containing substance (based on its protein content), about 1 to 4% of a slight amount assimilable carbohydrate, ie one that is easily converted by the microorganism, causing rapid growth or multiplication of the microorganisms and the production of large amounts of mycelium, and contains at least about 30% of a slowly assimilable polysaccharide.

Geeignete Quellen für proteinhaltige Stoffe sind z. B. Bierhefe, Fleischextrakt, Sojapepton (einschließlich Sojapepton, das durch saure oder enzymatische Hydrolyse von Sojabohnenprotein hergestellt wird), Caseinhydrolysat (saures oder enzymatisches), lösliche Alkoholdestillationsrückstände, Sojabohnenmehl (einschließlich ausgestoßenes Mehl, Auszugsmehl, fein gemahlenes Mehl oder ganzes Sojabohnenmehl), Eipepton, feines Sojabohnenmehl u. dgl., wobei Sojabohnenmehl besonders bevorzugt wird. Es ist vorteilhaft, zwei oder mehr derartiger proteinhaltiger Stoffe zu verwenden.Suitable sources of proteinaceous substances are e.g. B. Brewer's yeast, meat extract, Soy peptone (including soy peptone produced by acid or enzymatic hydrolysis made from soybean protein), casein hydrolyzate (acidic or enzymatic), soluble alcohol distillation residues, soybean meal (including expelled Flour, extract flour, finely ground flour or whole soybean flour), egg peptone, fine Soybean meal and the like, with soybean meal being particularly preferred. It is beneficial to use two or more such proteinaceous substances.

Der proteinhaltige Stoff sollte in dem Gärungsnährmedium in einer Menge von nicht weniger als 3 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 3,5 bis 8 °/o, bezogen auf den Proteingehalt des zugegebenen Stoffs, vorhanden sein, obwohl auch größere Mengen verwendet werden können, soweit dies das jeweils verwendete Verfahren zuläßt.The proteinaceous substance should be in the fermentation medium in a Amount of not less than 3 percent by weight, preferably about 3.5 to 8%, based on the protein content of the added substance, although also Larger amounts can be used, as long as this is the particular process used allows.

Die obengenannten, proteinhaltigen Stoffe können ferner durch Stickstoffquellen, z. B. organische Verbindungen, wie Harnstoff, Harnstoffnitrat, Ammoniumcarbamat u. dgl., sowie anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat u. dgl., ergänzt werden. Dextrine, einschließlich Gummidextrin u. dgl., Stärken, wie Kartoffelstärke, Maisstärke, Manjokstärke, Reisstärke, Weizenstärke u. dgl. sowie verschiedene lösliche Stärken, gehören zu der Gruppe der langsam assimilierbaren Polysaccharide, von denen mindestens eines in dem Gärungsmedium anwesend sein muß, und zwar in einer Menge von mindestens etwa 3 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 4 bis 5 Gewichtsprozent. Es kann auch eine größere Menge, die keine übermäßige Verdickung des Mediums verursacht, verwendet werden. Im allgemeinen ist es jedoch nicht erforderlich oder erwünscht, mehr als etwa 6 °/o Stärke zu verwenden. Im Falle des Dextrins können Konzentrationen von mehr als 6 °/o verwendet werden, ohne die Viskosität des Mediums nachteilig zu beeinflussen.The above-mentioned proteinaceous substances can also be caused by nitrogen sources, z. B. organic compounds such as urea, urea nitrate, ammonium carbamate and the like, as well as inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium carbonate, Ammonium nitrate, ammonium phosphate and the like., Can be supplemented. Dextrins, including Gum dextrin and the like, starches such as potato starch, corn starch, manjoc starch, rice starch, Wheat starch and the like as well as various soluble starches belong to the group the slowly assimilable polysaccharides, at least one of which is in the fermentation medium must be present, in an amount of at least about 3 percent by weight, preferably about 4 to 5 percent by weight. There can also be a larger amount that not causing excessive thickening of the medium. In general however, it is not necessary or desirable to use more than about 6% starch. In the case of dextrin, concentrations of more than 6% can be used, without adversely affecting the viscosity of the medium.

Zur Klasse der leicht assimilierbaren Kohlehydrate gehören Dextrose, Fructose u. dgl. Dextrose sollte z. B. in einer Menge von nicht weniger als etwa 1 °/p, vorzugsweise etwa 2 bis 2,5 °/o, in dem Gärungsnährmedium vorhanden sein. Es kann auch eine größere Menge, die die Neomycinausbeute nicht nachteilig beeinflußt, verwendet werden. Im allgemeinen ist es jedoch nicht erforderlich oder ratsam, mehr als etwa 3 °/a zu verwenden. Zur Sicherstellung erhöhter Ausbeuten an Neomycin sollte das Gärungsnährmedium die genannten Stoffe, d. h. einen proteinhaltigen Stoff, ein leicht assimilierbares Kohlehydrat und ein langsam assimilierbares Polysaccharid, in den angegebenen Mengen gemeinsam enthalten. Die Kombination dieser Stoffe ist wichtig, und wenn einer der erforderlichen Bestandteile fehlt oder nicht in den angegebenen Mengen anwesend ist, so wird die Neomycinausbeute nachteilig beeinflußt.The class of easily assimilable carbohydrates includes dextrose, Fructose and the like dextrose should e.g. B. in an amount not less than about 1% / p, preferably about 2 to 2.5%, be present in the fermentation broth. A larger amount can also be used, which does not adversely affect the yield of neomycin, be used. In general, however, it is not necessary or advisable to do more to be used as about 3 ° / a. To ensure increased yields In terms of neomycin, the fermentation medium should contain the substances mentioned, d. H. a protein-containing one Substance, an easily assimilable carbohydrate and a slowly assimilable polysaccharide, included in the specified quantities together. The combination of these substances is important, and if any of the required ingredients are missing or not in the specified amounts is present, the neomycin yield is adversely affected.

Die Bildung des Neomycin wird vorzugsweise in einer submersen Kultur des Streptomyces fradiae 3535 in einem wäßrigen Medium unter aerobischen Bedingungen durchgeführt. Ein geeignetes Gärungsnährmedium enthält außer der obenerwähnten Kombination der erforderlichen Bestandteile ein Puffermittel, ein Salz, wieNatriumchlorid, und gewöhnlich eine kleine zusätzliche Menge eines anderen proteinhaltigen Stoffs. Zum Beispiel kann eine kleine Menge Bierhefe zur Ergänzung des Sojabohnenmehls vorteilhaft verwendet werden.The formation of the neomycin is preferably carried out in a submerged culture des Streptomyces fradiae 3535 in an aqueous medium under aerobic conditions carried out. A suitable fermentation nutrient medium contains in addition to the above-mentioned combination of the required ingredients a buffering agent, a salt such as sodium chloride, and usually a small extra amount of some other proteinaceous substance. To the For example, a small amount of brewer's yeast can be beneficial to supplement soybean meal be used.

Bei Verwendung eines der genannten Gärungsnährmedia kann der pH-Wert anfänglich schwach sauer sein, d. h. zwischen etwa 6 und 7 liegen. Im Verlaufe der Fermentation wird der pH-Wert des Mediums auf etwa 5,2 bis 5,6 herabgesetzt. Da die Neomycinausbeute sich verschlechtert, wenn der pH-Wert des Mediums unter 5,5 liegt, so ist es zweckmäßig, ein Hilfsmittel, wie Calcium-, Natrium- oder Kaliumcarbonat, zuzugeben, um den pH-Wert in den Anfangsstufen der Fermentation auf der geeigneten Höhe zu halten. Die Menge dieses Stoffs hängt von dem jeweils verwendeten Medium ab, sollte jedoch ausreichend sein, um den pH-Wert über etwa 5,2 zu halten. Die optimale Menge schwankt hierbei zwischen etwa 0,2 und 1,0 Gewichtsprozent.When using one of the mentioned fermentation media, the pH value initially be slightly acidic, d. H. between about 6 and 7. In the course of the Fermentation, the pH of the medium is lowered to about 5.2-5.6. There the yield of neomycin deteriorates when the pH of the medium is below 5.5 it is advisable to use an auxiliary agent such as calcium, sodium or potassium carbonate, add to the pH in the initial stages of fermentation to the appropriate Keep altitude. The amount of this substance depends on the particular medium used but should be sufficient to keep the pH above about 5.2. the the optimal amount varies between about 0.2 and 1.0 percent by weight.

Die Fermentation wird vorzugsweise unter aerobischen Bedingungen durchgeführt. Die Belüftung erfolgt in irgendeiner geeigneten Weise, und zwar mit einer Geschwindigkeit von vorzugsweise etwa 0,028 bis 0,084 m3 Luft je Stunde pro 3,781 Kulturmedium.The fermentation is preferably carried out under aerobic conditions. Ventilation is in any suitable manner, at one rate of preferably about 0.028 to 0.084 m3 of air per hour per 3.781 culture medium.

Zur Erzielung höchster Neomycinausbeuten wird die Fermentationstemperatur auf etwa 24 bis 37°, vorzugsweise 32 bis 35°, gehalten.The fermentation temperature is used to achieve the highest yields of neomycin at about 24 to 37 °, preferably 32 to 35 °.

Das zum Impfen von Kulturen des Streptomyces fradiae 3535 zur Herstellung von Neomycin verwendete Impfmaterial kann aus schräg angelegten Agarkulturen gewonnen werden. Da jedoch die besten Ausbeuten erhalten werden, wenn die Menge des Impfmaterials etwa 1 bis 5 Volumprozent des Gesamtvolumens des Mediums beträgt, so ist eine größere Menge an Impfmaterial erforderlich, als aus den Agarkulturen erhalten werden kann. Zur Herstellung der gewünschten Menge Keimkultur, werden ).,Schüttelgefäße«, die ein geeignetes Nährmedium (das jedoch nicht notwendigerweise Neomycin erzeugt) für das Wachstum des Streptomyces fradiae 3535 enthalten, mit Kulturen geimpft, die auf schräg angelegten Nährböden gehalten werden. Der in diesem flüssigen Medium entstandene Organismus wird dann zum Impfen größerer Behälter für das Wachstum der Keimkultur verwendet, die ihrerseits zum Impfen der bei der industriellen Herstellung benutzten größeren Behälter verwendet werden.That for inoculating cultures of Streptomyces fradiae 3535 for production Inoculum used by neomycin can be obtained from inclined agar cultures will. However, since the best yields are obtained when the amount of inoculum is about 1 to 5 percent by volume of the total volume of the medium, then a larger one Amount of inoculum required than can be obtained from the agar cultures. To produce the desired amount of germination culture,)., Shaking vessels «that a suitable nutrient medium (but not necessarily producing neomycin) for the growth of Streptomyces fradiae 3535, inoculated with cultures that contain be kept on inclined culture media. The one in this liquid medium The resulting organism is then used to inoculate larger containers for the growth of the Germ culture used, in turn, for inoculating in industrial production used larger containers can be used.

Die Fermentation läßt man etwa 60 bis 144, vorzugsweise 72 bis 120 Stunden, laufen.The fermentation is left for about 60 to 144, preferably 72 to 120 Hours, run.

Das Neomycin wird nach einer Abwandlung des Verfahrens von Loo et a1., J. Bact. 50, S. 701 (1945), geprüft, bei dem die Bodenschicht des Nähragars weggelassen und das den B.subtilis enthaltende Nähragar direkt in eine Petrischale gegossen wird. Man legt eine Papierscheibe auf das gekühlte Nähragar, auf die das zu untersuchende Neomycinpräparat in verdünnter Form gegossen wird, worauf man nach 18 Stunden die Wachstums- oder Verhinderungszone bestimmt. Dieses Prüfverfahren ergibt die Neomycinmenge mit Bezug auf eine Neomycinsulfatnorm (1,ug Neomycinsulfat = 0,2 Waksman-Einheiten oder 0,7 ,ug Neomycinbase). In der gesamten Beschreibung wird die Neomycinmenge in ,ug Neomycinsulfat per ccm angegeben.The neomycin is modified from the method of Loo et a1., J. Bact. 50, p. 701 (1945), checked, in which the bottom layer of the nutrient agar omitted and the nutrient agar containing the B.subtilis directly into a Petri dish is poured. A paper disk is placed on the cooled nutrient agar on which the to be examined neomycin preparation is poured in diluted form, after which one after 18 hours determines the growth or prevention zone. This test method gives the amount of neomycin with respect to a neomycin sulfate norm (1. µg neomycin sulfate = 0.2 Waksman units or 0.7 µg neomycin base). Throughout the description the amount of neomycin is given in μg neomycin sulfate per ccm.

Die nachstehend angegebenen Verfahren, Tabellen, Beispiele und allgemeinen Erklärungen dienen lediglich der Erläuterung und schränken die Erfindung in keiner Weise ein. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich die Teile und die Prozentsätze auf das Gewicht.The following procedures, tables, examples and general Explanations serve only for explanation and do not limit the invention in any way Wise one. Unless otherwise stated, parts and percentages are given on weight.

Beispiel 1 In sechs jeweils 500 ccm fassende Erlenmeyer-Kolben wurden jeweils 100 ccm des folgenden Mediums gegeben: Cerelose (Glukosemonohydrat) .............. 10 g Pepton ...............................:.. 5 g Fleischextrakt ............................ 10 g Natriumchlorid ........................... 5 g Leitungswasser ............... aufgefüllt zu 1 1 Die Kolben wurden sterilisiert, indem man sie 30 Minuten lang bei 250° in einem Autoklav behandelte. Anschließend wurden sie mit einer wäßrigen Sporensuspension des Streptomyces fradiae, Waksman Stamm 3535X, der' auf folgendem Medium Cerelose (Glukosemonohydrat) .............. 10 g Bierhefe ................................. 10 g Schlamparückstände der Aceton-Butanol- Gärung ................................ 5 g Kaliumchlorid ............................ 4 g Calciumcarbonat .......................... 1 g Agar .................................... 15 g Leitungswasser ................. aufgefüllt zu 1 1 gezüchtet war, geimpft und 3 Tage lang bei 28° auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert. Der Schüttler führte 90 Bewegungen zu je 10 cm in der Minute aus.Example 1 100 cc of the following medium were placed in each of six 500 cc Erlenmeyer flasks: Cerelose (glucose monohydrate) .............. 10 g Peptone ...............................: .. 5 g Meat extract ............................ 10 g Sodium chloride ........................... 5 g Tap water ............... topped up to 1 1 The flasks were sterilized by autoclaving them at 250 ° for 30 minutes. Then they were with an aqueous spore suspension of Streptomyces fradiae, Waksman strain 3535X, der 'on the following medium Cerelose (glucose monohydrate) .............. 10 g Brewer's yeast ................................. 10 g Acetone-butanol residue Fermentation ................................ 5 g Potassium chloride ............................ 4 g Calcium carbonate .......................... 1 g Agar .................................... 15 g Tap water ................. topped up to 1 1 was grown, inoculated and incubated for 3 days at 28 ° on a shaker. The shaker performed 90 movements of 10 cm each per minute.

600 ccm des so erhaltenen, vorgekeimten Mediums wurden verwendet, um 3001 des folgenden, sterilen Mediums zu impfen, das durch 30minütiges Erhitzen bei 121' sterilisiert worden war Dextrose................................ 25 g feines Sojabohnenmehl ................... 25 g Bierhefe ................................ 2,5 g Ammoniumsulfat ........................ 5 g Calciumcarbonat ........................ 8 g Natriumchlorid ......................... 4 g primäres Kaliumphosphat ................ 0,4 g Leitungswasser ............... aufgefüllt zu 1 1 Die Fermentation wurde in einem auf 32° gehaltenen, mit Harz überzogenen, eisernen Behälter durchgeführt. Das Rühren erfolgte durch ein Saugrohrpropeller-Rührwerk mit 200 U/min. Sterile Luft wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,27 m3/min zugeführt. Zur Regelung der Schaumbildung wurden 300 ccm eines Entschäumers zu Beginn und weitere 2100 ccm im Verlaufe der Fermentation zugegeben. Die Fermentation wurde 45 Stunden lang fortgesetzt. Mehrere j eweils 3801 fassende, aus nichtrostendem Stahl bestehende Gärtanks, die 2501 eines sterilen Mediums der in Tabelle I und den nachfolgenden Tabellen angegebenen Zusammensetzung enthielten, wurden jeweils mit 121 des in dieser Weise erhaltenen Impfmaterials geimpft. Die geimpften Tanks wurden auf einer Temperatur von 32° gehalten, mit steriler Luft bei einer Geschwindigkeit von 2,83 m3/h belüftet und der Inhalt mittels Saugrohrpropeller bei 280 U/min gerührt. Nach den angegebenen Stunden wurden Proben entnommen. Zur Regelung der Schaumbildung wurden dem Medium zu Beginn 300 ccm Schmalzöl und eine Lösung von 10/, Octadecanol in Schmalzöl in den angegebenen Mengen zugegeben. Die Fermentation wurde 114 Stunden lang fortgesetzt.600 cc of the pre-germinated medium thus obtained was used to inoculate 300 liters of the following sterile medium which had been sterilized by heating at 121 'for 30 minutes Dextrose ................................ 25 g fine soybean flour ................... 25 g Brewer's yeast ................................ 2.5 g Ammonium sulfate ........................ 5 g Calcium carbonate ........................ 8 g Sodium chloride ......................... 4 g primary potassium phosphate ................ 0.4 g Tap water ............... topped up to 1 1 The fermentation was carried out in a resin-coated iron container maintained at 32 °. The stirring was carried out by a suction pipe propeller agitator at 200 rpm. Sterile air was supplied at a rate of 0.27 m3 / min. To regulate foam formation, 300 cc of a defoamer was added at the beginning and a further 2100 cc during the fermentation. The fermentation was continued for 45 hours. Several fermentation tanks, each with a capacity of 3801 and consisting of stainless steel, which contained 2501 of a sterile medium of the composition given in Table I and the following tables, were each inoculated with 121 of the inoculum thus obtained. The inoculated tanks were kept at a temperature of 32 °, ventilated with sterile air at a rate of 2.83 m 3 / h and the contents were stirred by means of a suction pipe propeller at 280 rpm. Samples were taken after the specified hours. To regulate the foam formation, 300 cc of lard oil and a solution of 10 % octadecanol in lard oil were added to the medium in the specified amounts. The fermentation continued for 114 hours.

Tabelle I Wirkung des Stärkegehalts in Medien mit hohem Gehalt an Sojabohnenmehl Tank A I B.1 C (, D I E Medium: g/1 I Dextrose ........... 20 I 20 : 20 I 20 20 Stärke ........... 0 10 20 , 30 40 Sojabohnenmehl.... 50 50 j 50 50*)j 50 Hefe ............. 5 5 5 5 5 Natriumchlorid ..... 5 ; 5 5 5 ! 5 Calciumcarbonat .... 2 i 2 2 2 I 2 Entschäumer in ccm**) 800i 2350 ' 600 2000i 600 pH-Werte I I 0 Stunden ........ 6,30I 6,25i 6,30 6,30i 6,30 18 ........ 5,42 , 5,40 5,68I 6,05 5,70 42 ........ 7,50 ; 7,10 ! 6,90i 7,10 6,75 66 ........ 8,15i 7,70 7,50I 7,10 6,90 90 ........ 8,40 7,80 8,00 7,60 7,25 114 ........ 8,70 7,95 8,20 7,90 7,75 i Neomycinsulfat,ug/ml 42 Stunden ........ 1913 2200i 2638 1 2150 11 1988 66 ........ 2500I 2875 ; 4275 4850 I 3700 90 ........ 2700 ' 3375 1 4575 ! 5000 5725 114 ........ . 2500 4000 @ 4850 6250j 7450 *) Ausgezogenes Sojamehl. **) Zur Regelung der Schaumbildung während der Sterilisation wurden außerdem zu Beginn jedem Medium in den Tanks jeweils 300 ccm Schmalzöl zugegeben. Die Ergebnisse zeigen, daß bei einem hohen Gehalt an Sojabohnenmehl in Verbindung mit 20 g Dextrose und einer beträchtlichen Menge Stärke (20 g) hohe Ausbeuten an Neomycin erhalten werden. Wird die Stärkemenge auf 40 g erhöht, so erhält man noch bedeutend höhere Neomycinausbeuten. Enthält das Medium dagegen überhaupt keine oder unzureichende Mengen (10 g) Stärke, so werden nur geringe Ausbeuten an Neomycin erhalten.Table I Effect of starch content in media with high content of soybean meal tank AI B.1 C (, THE Medium: g / 1 I. Dextrose ........... 20 I 20: 20 I 20 20 Strength ........... 0 10 20, 30 40 Soybean meal .... 50 50 j 50 50 *) j 50 Yeast ............. 5 5 5 5 5 Sodium chloride ..... 5; 5 5 5! 5 Calcium carbonate .... 2 i 2 2 2 I 2 Defoamer in ccm **) 800i 2350 '600 2000i 600 pH values II 0 hours ........ 6.30I 6.25i 6.30 6.30i 6.30 18 ........ 5.42, 5.40 5.68I 6.05 5.70 42 ........ 7.50; 7.10! 6.90i 7.10 6.75 66 ........ 8.15i 7.70 7.50I 7.10 6.90 90 ........ 8.40 7.80 8.00 7.60 7.25 114 ........ 8.70 7.95 8.20 7.90 7.75 i Neomycin sulfate, µg / ml 42 hours ........ 1913 2200i 2638 1 2150 11 1988 66 ........ 2500I 2875; 4275 4850 I 3700 90 ........ 2700 '3375 1 4575! 5000 5725 114 ......... 2500 4000 @ 4850 6250j 7450 *) Extracted soy flour. **) To regulate foam formation during sterilization were also used at the beginning of each medium in each of the tanks 300 cc of lard oil was added. The results show that high yields of neomycin are obtained with a high content of soybean meal in conjunction with 20 g of dextrose and a considerable amount of starch (20 g). If the amount of starch is increased to 40 g, significantly higher neomycin yields are obtained. If, on the other hand, the medium contains no or insufficient amounts (10 g) of starch, only low yields of neomycin are obtained.

Der Ersatz des Sojabohnenmehls durch ausgezogenes Sojabohnenmehl, zu Feinmehl gemahlen, das durch eiii Sieb Nr. 41 geht, ist günstig im Vergleich zu den Ausbeuten, die bei Verwendung von Sojabohnenmehl in Verbindung mit Dextrose und Stärke erhalten werden.The replacement of soybean meal with extracted soybean meal, Ground into fine flour that goes through a No. 41 sieve is cheap in comparison on the yields obtained when using soybean meal in conjunction with dextrose and strength will be preserved.

Beispiel 2 Fünf aus nichtrostendem Stahl bestehende Gärtanks mit Prallplatten, die 2501 eines sterilen Mediums (durch 30minütiges Erhitzen bei 121' sterilisiert) der in Tabelle Ir angegebenen Zusammensetzung enthielten, wurden jeweils 12l Impfmaterial (hergestellt gemäß Beispiel 1) geimpft. Die geimpften Tanks wurden auf einer Temperatur von 32° gehalten und mit steriler Luft bei einer Geschwindigkeit von 2,83 m3/h belüftet. Der Tankinhalt wurde mittels Turbinen mit vier flachen Schaufeln bei einer Drehzahl von 280 U/min gerührt. Die Schaufeln waren 5 cm breit, 8,9 cm lang und radial zur Welle bei einer Neigung von 90° angeordnet. Die Schaumbildung wurde wie im Beispiel l geregelt.Example 2 Five fermentation tanks made of stainless steel with baffle plates, the 2501 of a sterile medium (sterilized by heating at 121 'for 30 minutes) of the composition given in Table Ir contained 12 liters of inoculum (prepared according to Example 1) vaccinated. The inoculated tanks were at a temperature maintained at 32 ° and ventilated with sterile air at a rate of 2.83 m3 / h. The tank contents were measured by means of turbines with four flat blades at one speed stirred by 280 rpm. The blades were 5 cm wide, 8.9 cm long, and radial to the Shaft arranged at an inclination of 90 °. The foam formation was as in the example l regulated.

Tabelle II Wirkung des Dextrosegehalts in Medien mit hohem Gehalt an Sojabohnenmehl; ohne Stärke Tank F I G I $ i I I J Medium: g/1 I Dextrose........... 20 30 40 60 I100 Sojabohnenmehl.... 50 50 I 50 50 50 Hefe ............. 5 5 5 5 5 Natriumchlorid ... . . 5 5 5 5 5 Calciumcarbonat .. 2 2 2 2 2 I Entschäumer in ccm*) 330013500 2300 2600 5100 pH-Werte 0 Stunden ........ 6,30 6,20 6,17 6,08 6,05 18 ........ 6,16 5,20 5,25 5,20 5,40 42 ........ 7,52 7,20 6,80 5,10 5,08 66 ........ 8,01 7,68 7,44 6,05 5,20 90 ........ 7,90 7,98I 7,90 7,18 5,35 114 ........ 8,03 7,73 7,86 7,61I 5,91 i Neomycinsulfat ßg/ccm 42 Stunden ........ 25631 1725 787i < 2001 < 200 66 ........ 3250 3175, 2625 1351< 100 90 ........ 3200 32253500 1040 < 50 114 ........ 3275 3825! 3800 2060< 5** *) Zu Beginn wurde im Medium (wie im Beispiel 1) zusätzlich Schmalzöl verwendet. **) Der Tank J blieb (auf Grund mikroskopischer Unter- suchung) bis zu 90 Stunden ohne Verunreinigung. Bei 116 Stunden zeigten sich Verunreinigungen. Diese Werte zeigen, daß Dextrose bei etwa 30 g/1 eine schädliche Wirkung auszuüben beginnt und daß oberhalb 40 g/1 diese Wirkung sehr deutlich ist. In Anbetracht des niedrigen pH-Wertes bei 18 Stunden und der geringen Ausbeute während der ersten 42 Stunden bei Verwendung von 30 und 40 g Dextrose pro Liter sollte die Dextrosekonzentration zweckmäßig etwa 30 g111 nicht überschreiten.Table II Effect of Dextrose Content in High Soybean Meal Media; without starch tank FIGI $ i IIJ Medium: g / 1 I. Dextrose ........... 20 30 40 60 I 100 Soybean meal .... 50 50 I 50 50 50 Yeast ............. 5 5 5 5 5 Sodium chloride .... . 5 5 5 5 5 Calcium carbonate .. 2 2 2 2 2 I. Defoamer in ccm *) 330013500 2300 2600 5100 pH values 0 hours ........ 6.30 6.20 6.17 6.08 6.05 18 ........ 6.16 5.20 5.25 5.20 5.40 42 ........ 7.52 7.20 6.80 5.10 5.08 66 ........ 8.01 7.68 7.44 6.05 5.20 90 ........ 7.90 7.98I 7.90 7.18 5.35 114 ........ 8.03 7.73 7.86 7.61 I 5.91 i Neomycin sulfate µg / ccm 42 hours ........ 2563 1 1725 787i <2001 <200 66 ........ 3250 3175, 2625 1351 <100 90 ........ 3200 32253500 1040 <50 114 ........ 3275 3825! 3800 2060 <5 ** *) At the beginning was in the medium (as in example 1) additionally Lard oil used. **) Tank J remained (due to microscopic under- search) up to 90 hours without contamination. at Impurities appeared for 116 hours. These values show that dextrose begins to exert a harmful effect at around 30 g / l and that above 40 g / l this effect is very clear. In view of the low pH value at 18 hours and the low yield during the first 42 hours when using 30 and 40 g of dextrose per liter, the dextrose concentration should expediently not exceed about 30 g111.

Nachstehende Tabelle zeigt die Wirkung auf die Neomycinausbeuten, wenn die Menge des Sojabohnenmehls in dem Medium von 25 auf 50 g/1 erhöht wird, wobei der Dextrose- und Stärkegehalt konstant bleibt. Die Fermentation wurde in Gärtanks mit Saugrohrpropeller durchgeführt, die auf einer Temperatur von 32° gehalten und mit einer Geschwindigkeit von 2,83 m3,/h belüftet wurden. Tabelle III Wirkung des Sojabohnenmehlgehalts bei konstantem Dextrose- und Stärkegehalt Durch- Tank schnitt von 18 Ver- K I L 1 M 1 N 1 0 suchen Medium: g/1 Dextrose .. 20 20 20 20 20 20 Stärke..... 40 40 I 40 40 40 40 Sojabohnen- ' mehl .... 25 30 1@ 35 50 50 50 Hefe....... 5 5 5 5 5 5 Natrium- Chlorid .. 5 5 5 5 5 5 Calcium- carbonat. 2 2 2 2 2 2 Entschäumer in ccm ..... 800 700 700 800 900 - pH-Werte 18 Stunden 6,12 6,24 6,00 5,75 5,40 - 42 7,20 7,08 6,90 6,80 6,50 - 66 7,40 7,25 7,20 6,85 6,80 - 90 7,30 7,30 7,30 7,30 7,45 - 114 7,40 7,60 7,60 7,90 7,45 - Neomycin- sulfat pg/ccm 42 Stunden 17251 1738 1663 1250 2000 - 66 2250 ' 2550 2950I 3275 3900 - 90 362514400 4475 5050 5050 - 114 3975 15075. 4875 # 5150 8775 6500 Die Ergebnisse zeigen, daß ausgezeichnete Ausbeuten erhalten werden, wenn in den 20 g Dextrose und 40 g Stärke enthaltenden Medien 50 g Sojabohnenmehl pro Liter anwesend sind.The table below shows the effect on neomycin yields when the amount of soybean meal in the medium is increased from 25 to 50 g / l, the dextrose and starch content remaining constant. The fermentation was carried out in fermentation tanks with a suction pipe propeller, which were kept at a temperature of 32 ° and ventilated at a rate of 2.83 m3 / h. Table III Effect of soybean meal content at constant dextrose and starch content By- Tank cut from 18 Ver Search for KIL 1 M 1 N 1 0 Medium: g / 1 Dextrose .. 20 20 20 20 20 20 Strength ..... 40 40 I 40 40 40 40 Soybean ' flour .... 25 30 1 @ 35 50 50 50 Yeast ....... 5 5 5 5 5 5 Sodium- Chloride .. 5 5 5 5 5 5 Calcium carbonate. 2 2 2 2 2 2 Defoamer in ccm ..... 800 700 700 800 900 - pH values 18 hours 6.12 6.24 6.00 5.75 5.40 - 42 7.20 7.08 6.90 6.80 6.50 - 66 7.40 7.25 7.20 6.85 6.80 - 90 7.30 7.30 7.30 7.30 7.45 - 114 7.40 7.60 7.60 7.90 7.45 - Neomycin sulfate pg / ccm 42 hours 17251 1738 1663 1250 2000 - 66 2250 '2550 2950I 3275 3900 - 90 362514400 4475 5050 5050 - 114 3975 1 5075. 4875 # 5150 8775 6500 The results show that excellent yields are obtained when 50 grams of soybean meal per liter are present in the media containing 20 grams of dextrose and 40 grams of starch.

Die folgende Tabelle zeigt die Wirkung auf die Neomycinausbeuten, wenn das Medium außer einer großen Menge Sojabohnenmehl und Dextrose einen langsam assimiherbaren Zucker, wie Dextrin, enthält. Die Fermentationen wurden in Gärtanks mit Turbinenschaufelrädern durchgeführt, wobei die Tanks auf einer Temperatur von 32° gehalten und mit einer Geschwindigkeit von 2,83 m3 belüftet wurden. Tabelle IV Zugabe von Dextrin zu einem Medium, das Dextrose sowie eine große Menge Sojabohnenmehl enthält Tank P 1 Q R I s Medium: g/1 Dextrose ............... 20 20 20 20 Dextrin ................. 0 10 20 40 Sojabohnenmehl ......... 50 50 50 50 Hefe ................... 5 5 5 5 Natriumchlorid .......... 5 5 5 5 Calciumcarbonat ......... 2 i 2 2 2 Entschäumer in ccm ........ 800 2350 600 600 pH-Werte 18 Stunden ............. 5,42I 5,40' 5,68 5,70 42 ............. 7,50 ' 7,10 6,90 6,75 66 ............. 8,15I7,70 7,50 6,90 90 ............. 8,40 7,80 8,00 7,25 114 ............. 8,70 7,95 8,20 20 7,75 Neomycinsulfat yg/ccm 42 Stunden ............. 1913 2200 2638 1988 66 ............. 2500 2875 4275 3700 90 ............. 2700 3375'4575 5725 114 ............. 2500 400014850 7450 Die Ergebnisse zeigen, daß die Zugabe von Dextrin in zunehmenden Mengen zu einem Medium, das 50 g Sojabohnenmehl und eine ausreichende Menge (d. h. 20 g) Dextrose enthält, zu einer entsprechenden Erhöhung der Neomycinausbeuten führt.The following table shows the effect on neomycin yields when the medium contains, in addition to a large amount of soybean meal and dextrose, a slowly assimilable sugar such as dextrin. The fermentations were carried out in fermentation tanks with turbine paddle wheels, the tanks being kept at a temperature of 32 ° and aerated at a speed of 2.83 m3. Table IV Addition of dextrin to a medium containing dextrose and a large amount of soybean meal tank P 1 QRI s Medium: g / 1 Dextrose ............... 20 20 20 20 Dextrin ................. 0 10 20 40 Soybean meal ......... 50 50 50 50 Yeast ................... 5 5 5 5 Sodium Chloride .......... 5 5 5 5 Calcium carbonate ......... 2 i 2 2 2 Defoamer in ccm ........ 800 2350 600 600 pH values 18 hours ............. 5.42I 5.40 '5.68 5.70 42 ............. 7.50 '7.10 6.90 6.75 66 ............. 8.15I7.70 7.50 6.90 90 ............. 8.40 7.80 8.00 7.25 114 ............. 8.70 7.95 8.20 20 7.75 Neomycin sulfate yg / cc 42 hours ............. 1913 2200 2638 1988 66 ............. 2500 2875 4275 3700 90 ............. 2700 3375'4575 5725 114 ............. 2500 400014850 7450 The results show that the addition of increasing amounts of dextrin to a medium containing 50 g of soybean meal and a sufficient amount (ie, 20 g) of dextrose leads to a corresponding increase in neomycin yields.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Nutrient medium containing carbohydrates and nitrogen compounds for the production of neomycin by cultivating a microorganism that produces the antibiotic, characterized in that the nutrient medium contains at least 30 /, a protein-containing substance, about 1 to 40 /, an easily assimilable carbohydrate and at least about 3 ° / o contains a slowly assimilable polysaccharide.

2. Nutrient medium according to claim 1, characterized in that the nutrient medium contains about 2 to 2.5 % glucose and about 4 to 5% starch.