DE10108808A1 - Fluorescent microparticles - Google Patents

Fluorescent microparticles

Info

Publication number
DE10108808A1
DE10108808A1 DE10108808A DE10108808A DE10108808A1 DE 10108808 A1 DE10108808 A1 DE 10108808A1 DE 10108808 A DE10108808 A DE 10108808A DE 10108808 A DE10108808 A DE 10108808A DE 10108808 A1 DE10108808 A1 DE 10108808A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
fluorescent
microparticles according
fluorescent microparticles
particles
substances
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE10108808A
Other languages
German (de)
Inventor
Joerg Enderlein
Lothar Kuhnert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to DE10108808A priority Critical patent/DE10108808A1/en
Priority to DE10290599A priority patent/DE10290599A5/en
Priority to PCT/DE2002/000556 priority patent/WO2002066574A1/en
Publication of DE10108808A1 publication Critical patent/DE10108808A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/02—Use of particular materials as binders, particle coatings or suspension media therefor
    • C09K11/025—Use of particular materials as binders, particle coatings or suspension media therefor non-luminescent particle coatings or suspension media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/08—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing inorganic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)

Abstract

The invention relates to fluorescent microparticles whose core consists of polymer particles and dyes incorporated therein or of semiconducting crystals and which are coated with a metallic conducting material. The invention further relates to a method for producing the inventive microparticles and to uses of said microparticles in analytics especially in the field of biology and medicine. The inventive microparticles are characterized by their improved photostability and higher fluorescence intensity (fluorescence brightness).

Description

Die Erfindung betrifft fluoreszierende Mikroteilchen, die im Kern aus Polymerteilchen mit inkorporierten Farbstoffen oder aus Halbleiterkristallen bestehen und mit metallisch leitenden Material beschichtet sind, ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Mikroteilchen und An­ wendungen dieser Mikroteilchen in der Analytik insbesondere in Biologie und Medizin. Die erfindungsgemäßen Mikroteilchen zeichnen sich durch verbesserte Photostabilität und höhere Fluoreszenzintensität (Fluoreszenzhelligkeit) aus.The invention relates to fluorescent microparticles, which in the core consist of polymer particles incorporated dyes or from semiconductor crystals and with metallic conductive Material are coated, also a method for producing these microparticles and An Applications of these microparticles in analytics, especially in biology and medicine. The Microparticles according to the invention are distinguished by improved photostability and higher Fluorescence intensity (fluorescence brightness).

Fluoreszierende Mikroteilchen sind aus der Literatur bekannt und haben ein breites Anwen­ dungsgebiet in der Analytik besonders beim Nachweis biologisch relevanter Materialien ge­ funden. So werden in EP 0 596 098 fluoreszierende Mikropartikel beschrieben, bei denen Fluoreszenzfarbstoffe in Polymere eingebettet und entsprechend ausgerüstet in der biologi­ schen Analytik eingesetzt werden. Analoge Materialien werden auch in USP 2 994 679 und USP 3 096 333 erwähnt.Fluorescent microparticles are known from the literature and are widely used area of application in analytics, especially for the detection of biologically relevant materials found. For example, EP 0 596 098 describes fluorescent microparticles in which Fluorescent dyes embedded in polymers and equipped accordingly in the biologi analytics. Analogous materials are also described in USP 2,994,679 and USP 3,096,333 mentioned.

Derartige fluoreszierende Mikroteilchen finden vielfältige Anwendungen in der Biologie und Medizin, da man an ihre Oberfläche biologisch aktive Materialien chemisch oder physikalisch adsorptiv anbinden kann. Auf diese Weise gelabelt, dienen die fluoreszierenden Mikropartikel als Marker oder Tracer für den Nachweis des biologischen Materials.Such fluorescent microparticles have a variety of applications in biology and Medicine, since you have biologically active materials on its surface, chemically or physically can bind adsorptively. Labeled in this way, the fluorescent microparticles serve as a marker or tracer for the detection of the biological material.

So werden in Circulation 83, 974 (1991) Blutflußmessungen mit Hilfe derartiger Mikroparti­ kel beschrieben. In J. Microbiol. Meth. 13, 135, (1991) wird das Verhalten von Bakterien un­ tersucht. Weitere Beispiele sind die Anwendung in Immunoassays (Anal. Biochem. 272, 165, (1999)) und der Nucleinsäureanalytik (Anal. Biochem. 198, 308, (1991), Nucleic Acid Res. 15, 2891, (1987)). Eine zusammenfassende Darstellung von Anwendungen befindet sich in: R. P. Haughland: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 7. Aufl. Molecu­ lar Probes, 1999.So in Circulation 83, 974 (1991) blood flow measurements with the help of such microparties described. In J. Microbiol. Meth. 13, 135, (1991) the behavior of bacteria is un tersucht. Further examples are the use in immunoassays (Anal. Biochem. 272, 165, (1999)) and nucleic acid analysis (Anal. Biochem. 198, 308, (1991), Nucleic Acid Res. 15, 2891, (1987)). A summary of applications can be found in: R. P. Haughland: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 7th Ed. Molecu lar Probes, 1999.

Bekannt ist auch die Verwendung von Halbleitermikrokristallen mit Teilchengrößen im Nanometerbereich sogenannter Quantum Dots für den gleichen Anwendungszweck (WO 99/26 269, WO 00/17 642).It is also known to use semiconductor microcrystals with particle sizes in the Nanometer range of so-called quantum dots for the same application (WO 99/26 269, WO 00/17 642).

Diese in der Literatur bisher beschriebenen fluoreszierenden Mikroteilchen haben jedoch mindestens zwei grundsätzliche Nachteile. Zum einen besitzen die inkorporierten Farbstoffe eine ungenügende Photostabilität und zum anderen ist die Intensität des emmittierten Fluores­ zenzlichts (Helligkeit) oft ungenügend. Dadurch ist ihre Anwendung insbesondere bei hoch­ sensitiven Messungen eingeschränkt. Beispielsweise muß ein sehr hoher apparativer Aufwand hinsichtlich der Lasertechnik und Elektronik bei der Anwendung der Mehrphotonenanregung, z. B. Zweiphotonenanregung, betrieben werden. Die Methode der Zweiphotonenanregung im langwelligen Bereich oberhalb von 600 nm und die Detektion des Fluoreszenzlichts kurzwel­ lig ist besonders attraktiv, da bei dieser Meßmethode nur eine sehr geringe Untergrundstrah­ lung auftritt.However, these fluorescent microparticles previously described in the literature have at least two fundamental disadvantages. Firstly, the incorporated dyes insufficient photostability and, secondly, the intensity of the emitted fluorescence zenzlichts (brightness) often insufficient. As a result, their application is particularly high sensitive measurements. For example, a very high expenditure on equipment with regard to laser technology and electronics when using multi-photon excitation, z. B. two-photon excitation operated. The method of two-photon excitation in long-wave range above 600 nm and the detection of the fluorescent light short lig is particularly attractive because with this measurement method only a very small background beam is used lung occurs.

Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, fluoreszierende Mikroteilchen mit wesentlich verbes­ serter Fluoreszenzhelligkeit und Photostabilität, die den Einsatz hochempfindlicher Nach­ weisverfahren mit einfachen Mitteln gestatten, aufzufinden und Verfahren zu ihrer Herstel­ lung und Verwendung anzugeben.The object of the invention is therefore to provide fluorescent microparticles with substantially verbes serter fluorescence brightness and photostability, which require the use of highly sensitive Allow simple and easy ways to find and procedures for their manufacture indication and use.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch fluoreszierende Mikroteilchen mit den Merkma­ len des Anspruchs 1 bzw. Herstellungsverfahren nach Anspruch 21 und Verwendung nach Anspruch 28 gelöst. This object is achieved by fluorescent microparticles with the characteristics len of claim 1 or manufacturing method according to claim 21 and use according to Claim 28 solved.  

Nachfolgend wird die Erfindung näher erläutert. Die erfindungsgemäßen fluoreszierenden Mikroteilchen enthalten einen Kern eines fluoreszierenden Materials, der aus Polymerparti­ keln, die mit organischen Farbstoffen beladen sind oder aus Halbleitermikrokristallen, besteht. Diese fluoreszierenden Kernteilchen werden mit einem bei den optischen Frequenzen der An­ regung und Fluoreszenz metallisch leitenden Material beschichtet. In Abhängigkeit vom Durchmesser des fluoreszierenden Kerns, der Art des metallisch leitenden Materials und des­ sen Schichtdicke werden die Intensität des abgestrahlten Fluoreszenzlichts und/oder die Pho­ tostabilität, der im Kern befindlichen Farbstoffe wesentlich erhöht. Diese bemerkenswerte Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften tritt sowohl bei Einphotonen- als auch bei Mehr­ photonennaregung auf. Im Detail hängt diese Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften von der Art des metallisch leitenden Materials, dem Durchmesser des Kerns und der Schichtdicke des aufgebrachten Metalls ab. So wurde gefunden, daß Gold, Silber, Kupfer oder Aluminium sich besonders gut eignen. Der Durchmesser des fluoreszierenden Kerns liegt bevorzugt im Bereich von 10 bis 90 nm und die Schichtdicke des metallisch leitenden Materials beträgt bevorzugt 1 bis 10 nm. Verwendet man Silber als metallisch leitendes Material, so ist der be­ sonders bevorzugte Durchmesser des Kerns 10 bis 50 nm. Die gleichen Effekte der Verbesse­ rung der Fluoreszenzeigenschaften treten auch auf, wenn der Kern der fluoreszierenden Mi­ kroteilchen aus Halbleitermaterial, wie CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, InP, InAs be­ steht.The invention is explained in more detail below. The fluorescent according to the invention Microparticles contain a core of a fluorescent material that consists of polymer particles cels, which are loaded with organic dyes or semiconductor microcrystals. These fluorescent core particles are associated with one at the optical frequencies of the An excitation and fluorescence coated metallic conductive material. Depending on Diameter of the fluorescent core, the type of metallic conductive material and the Its layer thickness is the intensity of the emitted fluorescent light and / or the Pho tostability, the dyes in the core increased significantly. This remarkable Improvement of the fluorescence properties occurs with both single-photon and more photon exposure on. This improvement in fluorescence properties depends in detail the type of metallic conductive material, the diameter of the core and the layer thickness of the applied metal. So it was found that gold, silver, copper or aluminum are particularly suitable. The diameter of the fluorescent core is preferably Range from 10 to 90 nm and the layer thickness of the metallically conductive material is preferably 1 to 10 nm. If silver is used as the metallically conductive material, the be particularly preferred core diameter 10 to 50 nm. The same effects of improvement The fluorescence properties also occur when the core of the fluorescent Mi Crown particles made of semiconductor material, such as CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, InP, InAs be stands.

Als fluoreszenzfähige organische Farbstoffe eignen sich Farbstoffe aus den Stoffklassen der Cumarine, Oxazine, Thiazine, Rhodamine, Dibenzpyrane, Polymethine wie Cyanine, Phtha­ locyanine oder Kombinationen davon.Dyes from the classes of substances are suitable as fluorescent organic dyes Coumarins, oxazines, thiazines, rhodamines, dibenzpyrans, polymethines such as cyanines, phtha locyanine or combinations thereof.

Diese Farbstoffe werden in Polymermaterial eingebracht, wofür sich Polymere oder Copoly­ mere von Styrol, Divinylbenzol, Acrylnitril oder Methacrylnitril, Acrylamid oder Methacry­ lamid, Acrylsäure- oder Methacrylsäureester, Maleinsäurederivaten, Vinylacetat, Vinylchlo­ rid, ferner Cellulosederivate, Agarose, Polyurethan, Polyhydroxybuttersäure, Polylactide eig­ nen.These dyes are introduced into polymer material, for which polymers or copoly mers of styrene, divinylbenzene, acrylonitrile or methacrylonitrile, acrylamide or methacrylic lamide, acrylic or methacrylic acid esters, maleic acid derivatives, vinyl acetate, vinyl chloride rid, also cellulose derivatives, agarose, polyurethane, polyhydroxybutyric acid, polylactides NEN.

Geeignet sind ebenfalls vernetzte Polymere mit anionen- oder kationenaustauschenden Grup­ pen.Crosslinked polymers with an anion or cation exchange group are also suitable pen.

Vorteilhaft werden die metallisch beschichteten fluoreszierenden Mikroteilchen mit einer Schutzschicht aus Oxiden oder Sulfiden überzogen. Geeignet sind aber auch Polysulfide oder andere thiolgruppenenthaltende Substanzen. Gleichfalls können die metallisierten Mikroteil­ chen mit Eiweißkörpern wie Albumin adsorptiv beschichtet werden. Auf diese Weise und durch Beschichtung mit anderen Substanzen oder chemische Reaktion erhalten die Mikroteil­ chen funktionelle Kopplungsgruppen wie Hydroxyl, Amin, Amid, Imid, Carbonsäureanhy­ drid, Sulfhydryl, Sulfonat, Aldehyd, Azid, Chinonazid.The metallic coated fluorescent microparticles with a Protective layer made of oxides or sulfides. However, polysulfides or are also suitable other substances containing thiol groups. Likewise, the metallized micro part be coated with protein bodies such as albumin adsorptively. This way and the micro part is obtained by coating with other substances or chemical reaction Chen functional coupling groups such as hydroxyl, amine, amide, imide, carboxylic acid drid, sulfhydryl, sulfonate, aldehyde, azide, quinone azide.

An diese funktionelle Gruppen oder durch vorherige Beschichtung können auch biologisch aktive Substanzen wie Biotun, Avidin, Streptavidin, oder Nucleinsäureverbindungen ange­ bracht werden.These functional groups or by prior coating can also be organic active substances such as Biotun, avidin, streptavidin, or nucleic acid compounds be brought.

Auf diese Weise mit einer chemisch aktiven Oberfläche ausgerüstet, eignen sich die erfin­ dungsgemäßen fluoreszierenden Mikroteilchen für eine Vielzahl von analytischen Anwen­ dungen.Equipped with a chemically active surface in this way, the inventions are suitable fluorescent microparticles according to the invention for a large number of analytical applications fertilize.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Mikroteilchen erfolgt in mehreren Schritten.The fluorescent microparticles according to the invention are produced in several Steps.

Im ersten Schritt werden die Kernteilchen mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 5 bis 100 nm, die aus mit Farbstoffen beladenen Polymerteilchen oder Halbleitermikrokristallen bestehen, präpariert.In the first step, the core particles with an average particle diameter of 5 to 100 nm, made of polymer particles or semiconductor microcrystals loaded with dyes exist, prepared.

In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden hydrophobe in Wasser praktisch unlösliche Farbstoffe gemeinsam mit dem ebenfalls in Wasser unlöslichen Polymermaterial in einem organischen mit Wasser ebenfalls nur beschränkt mischbaren Lösungs­ mittel gelöst. Dabei werden Lösungsmittel verwendet, deren Siedepunkt niedriger als der von Wasser ist. Geeignet sind beispielsweise Methylenchlorid, Chloroform, Dichlorethan, Te­ trachlorkohlenstoff, Trichlorethylen, Benzol, Cyclohexan.In one embodiment of the method according to the invention, hydrophobes in water practically insoluble dyes together with the water-insoluble polymer material  in an organic solution which is also miscible with water medium solved. Solvents are used whose boiling point is lower than that of Is water. For example, methylene chloride, chloroform, dichloroethane, Te are suitable trachlorocarbon, trichlorethylene, benzene, cyclohexane.

Als Polymermaterial werden verwendet Polymere oder Copolymere von Styrol, Divinylben­ zol, Acrylnitril oder Methacrylnitril, Acrylsäure- oder Methacrylsäureester, Maleinsäurederi­ vaten, Vinylacetat, Vinylchlorid, ferner wasserunlösliche Cellulosederivate, Polyurethan, Po­ lyhydroxybuttersäure, Polylactide, Polyvinylalkohol, Gelatine, Agarose.Polymers or copolymers of styrene or divinylbene are used as the polymer material zole, acrylonitrile or methacrylonitrile, acrylic acid or methacrylic acid esters, maleic acid derivatives vaten, vinyl acetate, vinyl chloride, also water-insoluble cellulose derivatives, polyurethane, Po lyhydroxybutyric acid, polylactide, polyvinyl alcohol, gelatin, agarose.

Nach Zugabe von grenzflächenaktiven Stoffen als Emulgierhilfsmittel, die sowohl zu der or­ ganischen als auch zu der wässrigen Phase oder zu beiden Phasen erfolgen kann, werden bei­ de Phasen unter Anwendung eines hochtourigen Rührwerks intensiv vermischt, so daß sich eine feinteilige Emulsion bildet. In der kontinuierlichen Wasserphase feinverteilt befinden sich die Tröpfchen des Lösungsmittels, die das Polymermaterial und den Farbstoff enthalten. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels verfestigen sich diese Tröpfchen zu sphäroiden Mi­ kroteilchen. Diese können z. B. durch Zentrifugieren isoliert, gewaschen und entsprechend weiterverarbeitet werden.After the addition of surfactants as emulsifying agents, which are both to the or ganic as well as to the aqueous phase or to both phases can be done at de phases are mixed intensively using a high-speed agitator so that forms a fine emulsion. Be finely divided in the continuous water phase the droplets of the solvent containing the polymer material and the dye. After the solvent has been distilled off, these droplets solidify to spheroidal Mi kroteilchen. These can e.g. B. isolated by centrifugation, washed and accordingly to be processed further.

Bei der Herstellung von Kernteilchen, die hydrophile Polymere wie Agarose, Polyacrylamid, wasserlösliche Cellulosederivate, Polyvinylalkohol, Gelatine und hydrophile Farbstoffe ent­ halten, geht man umgekehrt vor. Man löst die Polymeren und die Farbstoffe in Wasser und emulgiert diese Lösung wieder unter Anwendung von grenzflächenaktiven Stoffen in einem organischen Lösungsmittel, dessen Siedepunkt oberhalb des Siedepunktes von Wasser liegt. Geeignet sind hierfür beispielsweise Toluol, Ethylbenzol, Xylole, Cumol. Nach dem Vermi­ schen beider Phasen unter Einsatz eines hochtourigen Rührwerks wird eine feinteilige Emul­ sion mit dem organischen Lösungsmittel als kontinuierliche Phase erhalten. In den feinver­ teilten Wassertropfen befinden sich das Polymermaterial und die Farbstoffe. Nach Abdestil­ lieren des Wassers verfestigen sich diese Tröpfchen zu sphäroiden Mikroteilchen. Diese wer­ den wieder durch Zentrifugieren isoliert.In the manufacture of core particles that contain hydrophilic polymers such as agarose, polyacrylamide, water-soluble cellulose derivatives, polyvinyl alcohol, gelatin and hydrophilic dyes hold, you do the opposite. The polymers and the dyes are dissolved in water and emulsifies this solution again using surfactants in one organic solvent whose boiling point is above the boiling point of water. For example, toluene, ethylbenzene, xylenes, cumene are suitable. After the Vermi In both phases, using a high-speed agitator, a finely divided emul sion obtained with the organic solvent as a continuous phase. In the Feinver The polymer material and the dyes are found in shared water drops. According to Abdestil The droplets of the water solidify into spheroidal microparticles. This who isolated again by centrifugation.

Erfindungsgemäß lassen sich auch polymere Mikroteilchen, die an ihrer Oberfläche anionen- oder kationenaustauschende Gruppen enthalten, wie entsprechend modifizierte Styrol- Divinyl-Copolymere, mit ionischen Farbstoffen beladen.According to the invention, it is also possible to use polymeric microparticles which have anion- or contain cation-exchanging groups, such as appropriately modified styrene Divinyl copolymers loaded with ionic dyes.

Im zweiten Schritt werden diese fluoreszierenden Kernteilchen mit einem bei den optischen Frequenzen der Anregung und Fluoreszenz metallisch leitenden Material beschichtet. Hierfür sind insbesondere Gold, Silber, Kupfer oder Aluminium geeignet. In Abhängigkeit von der Größe der Kernteilchen sind hierbei bestimmte Schichtdicken im Bereich von 1 bis 10 nm besonders bevorzugt, um maximale Photostabilität und/oder Fluoreszenzintensität zu errei­ chen.In the second step, these fluorescent core particles are combined with an optical one Frequencies of excitation and fluorescence coated metallic conductive material. Therefor gold, silver, copper or aluminum are particularly suitable. Depending on the The size of the core particles are certain layer thicknesses in the range from 1 to 10 nm particularly preferred to achieve maximum photostability and / or fluorescence intensity chen.

Diese erfindungsgemäße Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften hängt in komplexer Weise von den Materialeigenschaften der beteiligten Stoffe (Polymermaterial und Farbstoffe), Art des metallisch leitenden Materials, den geometrischen Verhältnissen (Durchmesser der Kernteilchen und Schichtdicke des metallisch leitenden Materials) und der Art der Anregung und Emission (Ein- oder Mehrphotonenanregung) ab.This improvement in fluorescence properties according to the invention depends on complex Manner of the material properties of the substances involved (polymer material and dyes), Type of the metallic conductive material, the geometric conditions (diameter of the Core particles and layer thickness of the metallic conductive material) and the type of excitation and emission (single or multi-photon excitation).

Die Beschichtung der fluoreszierenden Kernteilchen erfolgt durch Dispergieren dieser Teil­ chen in einem Lösungsmittel bevorzugt in wässrigem Medium, Zugabe eines Salzes oder ei­ ner anderen Verbindung des metallisch leitenden Materials und eines Reduktionsmittels. Als Metallsalze eignen sich beispielsweise Silbersulfat, Silbernitrat, Gold(III)chlorid, Gold(I)cyanid, Kupfersulfat, Kupfernitrat. Für Silber bzw. Gold eignen sich eine Vielzahl von Reduktionsmitteln. Die folgende Aufzählung stellt eine Auswahl ohne Anspruch auf Vollzäh­ ligkeit dar: Formaldehyd, Eisen(II)sulfat, Weinsäure, Hydrochinon, p-Aminophenol, Dialky­ laniline, Phenidon, Sulfit, Oxalsäure, Zucker, Weinsäure, Citronensäure.The fluorescent core particles are coated by dispersing these parts Chen in a solvent, preferably in an aqueous medium, addition of a salt or egg ner another connection of the metallic conductive material and a reducing agent. Suitable metal salts are, for example, silver sulfate, silver nitrate, gold (III) chloride, Gold (I) cyanide, copper sulfate, copper nitrate. A variety of are suitable for silver or gold Reducing agents. The following list represents a selection without claim to full toughness ity: formaldehyde, iron (II) sulfate, tartaric acid, hydroquinone, p-aminophenol, dialky laniline, phenidone, sulfite, oxalic acid, sugar, tartaric acid, citric acid.

Zweckmäßigerweise werden Lösungen der Metallsalze und des Reduktionsmittels abwech­ selnd in kleinen Portionen zu den dispergierten Kernteilchen gegeben und Proben entnommen, um den Vorgang der Beschichtung zu verfolgen und zu kontrollieren. Die entnommenen Proben werden auf ihre Fluoreszenzeigenschaften im Vergleich zu den unbeschichteten Kernteilchen untersucht. Die Dicke der Beschichtung wird durch Ablösen der Metallschicht von einer definierten Anzahl von Mikroteilchen und analytische Bestimmung der Metallio­ nenkonzentration ermittelt. Hierfür werden beispielsweise Polarographie oder Atomabsorpti­ onsspektroskopie verwendet.Solutions of the metal salts and the reducing agent are expediently alternated added to the dispersed core particles in small portions and samples were taken,  to track and control the coating process. The removed Samples are compared to the uncoated on their fluorescence properties Core particles examined. The thickness of the coating is determined by peeling off the metal layer of a defined number of microparticles and analytical determination of the metallio concentration determined. For this purpose, for example, polarography or atomic absorption used on spectroscopy.

Dabei haben sich Schichtdicken des metallisch leitenden Materials im Bereich von 1 bis 10 nm und fluoreszierende Kernteilchen mit einem Durchmesser von 10 bis 90 nm als geeignet erwiesen. Besonders geeignet sind Kernteilchen deren Durchmesser 10 bis 50 nm beträgt, wenn als metallisch leitendes Material Silber verwendet wird.The layer thicknesses of the metallically conductive material are in the range from 1 to 10 nm and fluorescent core particles with a diameter of 10 to 90 nm are suitable proved. Core particles with a diameter of 10 to 50 nm are particularly suitable, if silver is used as the metallic conductive material.

In einem weiteren Arbeitsschritt kann die Oberfläche der metallisierten Teilchen modifiziert werden, um das Ankoppeln insbesondere von biologisch oder medizinisch relevanten Sub­ stanzen zu bewirken. Hierfür gibt es eine Reihe von Varianten, die separat und/oder in Kom­ bination angewendet werden können. Durch Behandlung mit Oxidationsmitteln oder Ammo­ niumsulfidlösungen wird auf den metallisierten Oberflächen eine dünne Schutzschicht er­ zeugt. Hierfür eignen sich auch aliphatische Polysulfide oder monomere thiolgruppenenthal­ tende Substanzen.In a further step, the surface of the metallized particles can be modified in order to connect in particular biologically or medically relevant sub to effect punching. There are a number of variants for this, which are available separately and / or in comm combination can be applied. By treatment with oxidizing agents or ammo nium sulfide solutions will form a thin protective layer on the metallized surfaces testifies. Aliphatic polysulfides or monomeric thiol groups are also suitable for this substances.

Um das weitere Ankoppeln von Biomaterialien zu ermöglichen kann eine Beschichtung mit Eiweißkörpern wie Albumin oder anderen Substanzen, die funktionelle Gruppen enthalten, erfolgen. Als Beschichtungsmaterial eignen sich eine Vielzahl von monomeren oder polyme­ ren Substanzen wie Styrol-Maleinsäure-Copolymere, Polyvinylalkohol und Polyvinylalko­ holderivate, lösliche Cellulosederivate, Azide, Diazide, Chinondiazide.To enable the further coupling of biomaterials, a coating with Protein bodies such as albumin or other substances that contain functional groups respectively. A large number of monomers or polymers are suitable as coating material ren substances such as styrene-maleic acid copolymers, polyvinyl alcohol and polyvinyl alcohol holder derivatives, soluble cellulose derivatives, azides, diazides, quinonediazides.

Auf diese Weise können die fluoreszierenden Mikroteilchen mit funktionellen Gruppen, wie Hydroxyl, Amin, Amid, Imid, Carbonsäureanhydrid, Sulfhydryl, Sulfonat, Aldehyd, Azid, Chinonazid oder biologisch aktive Substanzen ausgerüstet werden. Für die Anwendung in der Bioanalytik ist die Beschichtung mit bzw. Ankopplung von Biotin, Avidin, Streptavidin, oder Nucleinsäureverbindungen besonders attraktiv.In this way, the fluorescent microparticles with functional groups such as Hydroxyl, amine, amide, imide, carboxylic anhydride, sulfhydryl, sulfonate, aldehyde, azide, Quinone azide or biologically active substances. For use in the Bioanalytics is the coating with or coupling of biotin, avidin, streptavidin, or Particularly attractive nucleic acid compounds.

Die erfindungsgemäßen fluoreszierenden Mikroteilchen werden als Fluoreszenzmarker oder Tracer verwendet. Die Verwendung als Fluoreszenzmarker benutzt dabei die Möglichkeit, daß die an den Mikroteilchen gebundenen funktionellen Gruppen oder biologisch aktiven Substanzen mit Analytsubstanzen reagieren und anschließend über eine Fluoreszenzmessung detektiert werden können.The fluorescent microparticles according to the invention are used as fluorescent markers or Tracer used. The use as a fluorescence marker uses the possibility that the functional groups or biologically active bound to the microparticles React substances with analyte substances and then via a fluorescence measurement can be detected.

Die übliche Vorgehensweise ist dabei folgende:
The usual procedure is as follows:

  • a) Es wird eine Probe in der sich die nachzuweisenden Analytsubstanzen befinden vorberei­ tet.a) A sample containing the analyte substances to be detected is prepared tet.
  • b) Fluoreszierende Mikroteilchen mit funktionellen Gruppen oder biologisch aktiven Sub­ stanzen ausgerüstet, die zur Erkennung der Analytsubstanzen fähig sind, werden disper­ giert oder in geeigneter Weise auf eine Oberfläche aufgebracht.b) Fluorescent microparticles with functional groups or biologically active sub punches equipped that are capable of recognizing the analyte substances become disper giert or applied in a suitable manner on a surface.
  • c) Die Analytsubstanzen und die fluoreszierenden Mikroteilchen werden zusammengebracht und für die benötigte Reaktionszeit inkubiert.c) The analyte substances and the fluorescent microparticles are brought together and incubated for the required reaction time.
  • d) Mikroteilchen, die nicht reagiert haben, werden entfernt.d) Microparticles that have not reacted are removed.
  • e) Die gebundenen Mikroteilchen und damit die Analytsubstanzen werden bestrahlt und über das abgestrahlte Fluoreszenzlicht detektiert.e) The bound microparticles and thus the analyte substances are irradiated and over the emitted fluorescent light is detected.

Nach diesem Schema lassen sich Proteine, Peptide, DNA, RNA, Oligonucleotide, Polysaccha­ ride, Avidin, Biotin, polymere und nichtpolymere Biomoleküle, Antikörper, Antigene, Viren oder andere Mikroorganismen nachweisen.Proteins, peptides, DNA, RNA, oligonucleotides, polysaccha can be made according to this scheme ride, avidin, biotin, polymer and non-polymer biomolecules, antibodies, antigens, viruses or other microorganisms.

Das beschriebene Verfahren kann auch speziell als Immunoassay ausgestaltet werden.The method described can also be specifically designed as an immunoassay.

Die Detektion von DNA, RNA oder Oligonucleotiden kann in der DNA-Sequenzanalyse ver­ wendet werden. The detection of DNA, RNA or oligonucleotides can ver in DNA sequence analysis be applied.  

Mit fluoreszierenden Mikroteilchen markierte Zellen können aussortiert oder cytometrisch detektiert werden.Cells labeled with fluorescent microparticles can be sorted out or cytometrically can be detected.

Die erfindungsgemäßen fluoreszierenden Mikroteilchen lassen sich auch als Tracer zur Unter­ suchung von Transportvorgängen in fluiden Medien innerhalb und außerhalb von lebenden Organismen oder Zellen anwenden.The fluorescent microparticles according to the invention can also be used as tracers search for transport processes in fluid media inside and outside of living Apply organisms or cells.

Die hohe Fluoreszenzintensität der erfindungsgemäßen Mikroteilchen bei Zweiphotonenanre­ gung erlaubt eine Anregung mit preiswerten kommerziellen Diodenlasern im Bereich 600-­ 1100 nm und die Detektion der kurzwellig dazu emittierten Fluoreszenzstrahlung im Bereich von 300-700 nm. Wegen der hohen Fluoreszenzintensität und der verbesserten Photostabilität lassen sich mit den erfindungsgemäßen Mikroteilchen vielfach Detektionsverfahren einfacher und wirtschaftlich günstiger gestalten. Beispielsweise ist die Detektion der fluoreszierenden Mikroteilchen auch mit einer CCD-Kamera möglich.The high fluorescence intensity of the microparticles according to the invention with two-photon excitation gung allows excitation with inexpensive commercial diode lasers in the range 600- 1100 nm and the detection of the short-wave emitted fluorescence radiation in the range from 300-700 nm. Because of the high fluorescence intensity and the improved photostability detection methods can in many cases be simplified with the microparticles according to the invention and make it more economical. For example, the detection is fluorescent Microparticles also possible with a CCD camera.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.The invention is explained in more detail below with the aid of exemplary embodiments, without referring to these examples to be limited.

Beispiel 1example 1

In 250 ml doppelt destilliertem Wasser werden 1 g Polystyrollatexpartikel deren mittlerer Teil­ chendurchmesser 50 nm beträgt und die mit einem bei einer Wellenlänge von 635 nm anreg­ baren Cyaninfarbstoff F1 (die Formel ist unter Figure 1 angegeben) beladen sind unter inten­ sivem Rühren dispergiert. Um diese fluoreszierenden Kernteilchen mit Silber zu beschichten, werden zwei Lösungen bereitet.
Lösung A: 2%-ige Lösung von Silbernitrat in doppelt destilliertem Wasser
Lösung B: In 250 ml doppelt destilliertem Wasser werden gelöst 2 g p-Aminophenol und 10 g KaliumcarbonatIn 250 ml of double-distilled water, 1 g of polystyrene latex particles with an average particle diameter of 50 nm and loaded with a cyanine dye F1 that can be excited at a wavelength of 635 nm (the formula is given in Figure 1) are dispersed with intensive stirring. In order to coat these fluorescent core particles with silver, two solutions are prepared.
Solution A: 2% solution of silver nitrate in double distilled water
Solution B: 2 g of p-aminophenol and 10 g of potassium carbonate are dissolved in 250 ml of double-distilled water

Beide Lösungen werden auf 25 Grad C temperiert.Both solutions are tempered to 25 degrees C.

Zu der Suspension mit den farbstoffbeladenen Latexpartikeln werden anschließend 10 ml Lö­ sung A und 20 ml Lösung B gegeben. Nach einer Reaktionszeit von 25 min werden anschlie­ ßend 30 ml Reaktionsgemisch mit einer Pipette entnommen, die Latexpartikel durch zentrifu­ gieren isoliert und drei Mal mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wird diese Prozedur mit der verbleibenden Reaktionsmischung noch vier Mal wiederholt, so daß man eine Reihe unterschiedlich mit Silber beschichteter Latexpartikel erhält. Die isolierten und gewaschenen Latexpartikel werden in 100 ml doppelt destilliertem Wasser dispergiert, um die Fluoreszenzeigenschaften bei Anregung mit der Wellenlänge 635 nm bei der Emissi­ onswellenlänge 670 nm zu messen. Das erfogt mittels einer herkömmlichen Fluorime­ teranordnung unter Anregung mit einem Diodenlaser. Dabei dienen die nicht mit Silber be­ schichteten Polystyrolpartikel als Referenzobjekt. Als Photostabilität wird die Zahl der detek­ tierbaren Fluoreszenzphotonen bis zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität auf den halben Ausgangswert (Halbwertzeit) definiert.10 ml of solution are then added to the suspension with the latex particles loaded with dye solution A and 20 ml of solution B. After a reaction time of 25 min ßend 30 ml reaction mixture with a pipette, the latex particles by centrifuge yaw isolated and washed three times with double distilled water. Then will repeat this procedure four more times with the remaining reaction mixture so that a number of latex particles coated differently with silver are obtained. The isolated and washed latex particles are dispersed in 100 ml of double distilled water, around the fluorescence properties when excited with the wavelength 635 nm at Emissi to measure wavelength 670 nm. This is done using a conventional fluorime arrangement under excitation with a diode laser. They do not serve with silver layered polystyrene particles as a reference object. The number of detec animal fluorescence photons up to a decrease in the fluorescence intensity by half Output value (half-life) defined.

Nach der Messung wird die Menge des auf den Teichen abgeschiedenen Silbers bestimmt. Dazu wird das Silber mit einer Kaliumferricyanidlösung oxidativ in Lösung gebracht und polarographisch bestimmt.After the measurement, the amount of silver deposited on the ponds is determined. For this purpose, the silver is oxidatively dissolved with a potassium ferricyanide solution and determined polarographically.

Es wurde gefunden, daß die Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften in komplexer Weise von der Größe der Kernteilchen und der Schichtdicke des aufgebrachten Silbers abhängt. Im Vergleich zu den unbeschichteten Mikroteilchen wurde eine maximale Erhöhung der Fluo­ reszenz um den Faktor 22 und der Photostabilität um den Faktor 100 bei einem Teilchen­ durchmesser von 50 nm und einer Silberschichtdicke von 6 nm gefunden. It has been found that the improvement in fluorescence properties is complex depends on the size of the core particles and the layer thickness of the applied silver. Compared to the uncoated microparticles there was a maximum increase in fluo Resistance by a factor of 22 and photostability by a factor of 100 for a particle diameter of 50 nm and a silver layer thickness of 6 nm found.  

Beispiel 2Example 2

In diesem Beispiel wird analog Beispiel 1 die Beschichtung von Mikroteilchen mit Gold und die Bestimmung der Fluoreszenzeigenschaften der erhaltenen Teilchen bei Einphotonenanre­ gung bei der Wellenlänge 635 nm und Emission bei 670 nm beschrieben.In this example, the coating of microparticles with gold and the determination of the fluorescence properties of the particles obtained under single-photon conditions tion at the wavelength of 635 nm and emission at 670 nm.

Es werden wieder 1 g der farbstoffbeladenen Polystyrolmikroteilchen analog Beispiel 1 in 250 ml doppelt destilliertem Wasser dispergiert und die folgenden Lösungen bereitet:
Lösung A: 3%ige Lösung von Tetrachlorogoldsäuretrihydrat in 1 l doppelt destilliertem Was­ ser
Lösung B: 2,5%ige Lösung von Kaliumcarbonat in 1 l doppelt destillieretem Wasser
Lösung C: 3 ml 37%ige Formaldehydlösung gelöst in 1 l doppelt destilliertem WasserAgain 1 g of the dye-loaded polystyrene microparticles are dispersed analogously to Example 1 in 250 ml of double-distilled water and the following solutions are prepared:
Solution A: 3% solution of tetrachloroauric acid trihydrate in 1 liter of double distilled water
Solution B: 2.5% solution of potassium carbonate in 1 liter of double distilled water
Solution C: 3 ml of 37% formaldehyde solution dissolved in 1 l of double distilled water

Zu 250 ml der Dispersion, die 1 g farbstoffbeladene Polystyrolmikroteilchen analog Beispiel 1 enthält, werden 10 ml Lösung A, 8 ml Lösung B und 20 ml Lösung C gegeben. Das Reakti­ onsgemisch wird auf 80 Grad C erwärmt und nach 10 Minuten eine Probe entnommen. Nach Zentrifugieren und Waschen werden jeweils analog Beispiel 1 die Fluoreszenzeigenschaften der goldbeschichtete Mikroteilchen bestimmt. Der Goldgehalt der Mikroteilchen wird nach Ablösen des Goldes in Königswasser wieder polarografisch bestimmt.To 250 ml of the dispersion, the 1 g of dye-loaded polystyrene microparticles analogously to Example 1 contains 10 ml of solution A, 8 ml of solution B and 20 ml of solution C. The Reacti The mixture is heated to 80 degrees C and a sample is taken after 10 minutes. To Centrifuging and washing are each analogous to Example 1, the fluorescence properties of the gold-coated microparticles. The gold content of the microparticles becomes Removal of the gold in aqua regia determined again polarographically.

Durch mehrfache Wiederholung dieser Prozedur erhält man Mikroteilchen mit unterschiedli­ cher Goldbeschichtung.By repeating this procedure several times, microparticles with different results are obtained gold plating.

Für Teilchen mit einem Durchmesser von 50 nm wird bei einer aufgebrachten Goldschicht von 9 nm eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität um den Faktor 13 und eine Verbesserung der Photostabilität um den Faktor 60 im Vergleich zu den unbeschichteten fluoreszierenden Polystyrolpartikeln festgestellt.For particles with a diameter of 50 nm with an applied gold layer of 9 nm an increase in the fluorescence intensity by a factor of 13 and an improvement the photostability by a factor of 60 compared to the uncoated fluorescent Polystyrene particles found.

Beispiel 3Example 3

Beispiel 3 beschreibt die Bestimmung der Fluoreszenzeigenschaften für Zweiphotonenanre­ gung. Als Ausgangsmaterial dienten dabei Polystyrolmikroteilchen von einem Durchmesser von 50 nm die mit dem Farbstoff Rhodamin 6G beladen waren. Die Beschichtung dieser Mi­ kroteilchen mit Silber bzw. Gold erfolgte analog Beispiel 1 und Beispiel 2.Example 3 describes the determination of the fluorescence properties for two-photon arrays supply. Polystyrene microparticles with a diameter were used as the starting material of 50 nm which were loaded with the dye rhodamine 6G. The coating of this Mi Crown particles with silver or gold were made analogously to Example 1 and Example 2.

Zur Bestimmung der Fluoreszenzeigenschaften wurde mit einem gepulsten Diodenlaser (Pulswiederholrate 80 MHz, Pulsbreite 50 ps) auf der Wellenlänge 790 nm angeregt und die Fluoreszenzemission bei Wellenlängen im Bereich von 450-600 nm gemessen. Für Mikro­ teilchen mit einem Kerndurchmesser von 50 nm und einer Silberbeschichtung von 6 nm ergab sich beispielsweise eine Erhöhung der Fluoreszenzintesität um den Faktor 1000 gegenüber den nicht metallisierten Teilchen bei der Messung des Fluoreszenzlichts bei der Wellenlänge 460 nm. Die Photostabilität erhöhte sich für diese Mikroteilchen unter den gleichen Meßbe­ dingungen etwa um den Faktor 2.A fluorescent diode laser was used to determine the fluorescence properties (Pulse repetition rate 80 MHz, pulse width 50 ps) excited on the wavelength 790 nm and the Fluorescence emission measured at wavelengths in the range of 450-600 nm. For micro particles with a core diameter of 50 nm and a silver coating of 6 nm an increase in the fluorescence intensity by a factor of 1000, for example the non-metallized particles when measuring the fluorescent light at the wavelength 460 nm. The photostability increased for these microparticles under the same measuring range conditions by a factor of 2.

Für mit Gold beschichtete Teilchen wurde maximal eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität um etwa den Faktor 200 gefunden für Kernteilchen mit einem Durchmesser von 50 nm und einer Goldbeschichtung von 7 nm.For gold-coated particles, there was a maximum increase in fluorescence intensity found by a factor of 200 for core particles with a diameter of 50 nm and a gold coating of 7 nm.

Claims (35)

1. Fluoreszierende Mikroteilchen mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 5 bis 100 nm, wobei
  • a) die Teilchen aus einem Kern eines fluoreszierenden Materials bestehen, der mit einem bei den optischen Frequenzen der Anregung und Fluoreszenz metallisch leitenden Material derartig beschichtet ist, daß Durchmesser des Kerns des fluoreszierenden Materials, sowie Art und Schichtdicke des metallisch leitenden Materials so aufeinander abgestimmt sind, daß maximale Photostabilität und/oder Helligkeit bei Ein- und/oder Mehrphotonenanre­ gung erreicht wird,
  • b) die Teilchen mit einer weiteren transparenten Schutzschicht versehen und
  • c) die Teilchen gegebenenfalls mit funktionellen Gruppen oder Konjugatmolekülen ausgerü­ stet sind, die die Ankopplung an Biomoleküle oder andere Analytsubstanzen gestatten.
1. Fluorescent microparticles with an average particle diameter of 5 to 100 nm, wherein
  • a) the particles consist of a core of a fluorescent material which is coated with a material which is metallically conductive at the optical frequencies of the excitation and fluorescence such that the diameter of the core of the fluorescent material and the type and layer thickness of the metallically conductive material are matched to one another that maximum photostability and / or brightness is achieved with single and / or multi-photon excitation,
  • b) provide the particles with a further transparent protective layer and
  • c) the particles are optionally equipped with functional groups or conjugate molecules which allow coupling to biomolecules or other analyte substances.
2. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kern aus einem Polymermaterial besteht, der mit fluoreszierenden Stoffen beladen ist.2. Fluorescent microparticles according to claim 1, characterized in that the core consists of a polymer material that is loaded with fluorescent substances. 3. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Polymermaterial um Polymere oder Copolymere von Styrol, Divinylbenzol, Acrylnitril oder Methacrylnitril, Acrylamid oder Methacrylamid, Acrylsäure- oder Methacrylsäureester, Butadien, Maleinsäurederivaten, Vinylacetat, Vinylchlorid, ferner Cellulosederivate, Agarose, Polyvinylalkohol, Gelatine, Polyurethan, Polyhydroxybutter­ säure, Polylactide handelt.3. Fluorescent microparticles according to claim 1 and 2, characterized in that it the polymer material is polymers or copolymers of styrene, divinylbenzene, Acrylonitrile or methacrylonitrile, acrylamide or methacrylamide, acrylic acid or Methacrylic acid ester, butadiene, maleic acid derivatives, vinyl acetate, vinyl chloride, further Cellulose derivatives, agarose, polyvinyl alcohol, gelatin, polyurethane, polyhydroxy butter acid, polylactide. 4. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymermaterial vernetzt ist und anionen- oder kationenaustauschende Gruppen enthält.4. Fluorescent microparticles according to claim 1 to 3, characterized in that the Polymer material is cross-linked and contains anion or cation-exchanging groups. 5. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den fluoreszierenden Stoffen um organische Farbstoffe handelt.5. Fluorescent microparticles according to claim 1 to 4, characterized in that it the fluorescent substances are organic dyes. 6. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den organischen Farbstoffen um Cumarine, Oxazine, Thiazine, Rhodamine, Dibenzpy­ rane, Polymethine wie Cyanine, Phthalocyanine oder eine Kombination davon handelt.6. Fluorescent microparticles according to claim 5, characterized in that it is for organic dyes around coumarins, oxazines, thiazines, rhodamines, dibenzpy rane, polymethines such as cyanines, phthalocyanines or a combination thereof. 7. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kern aus Halbleiterkristallen besteht.7. Fluorescent microparticles according to claim 1, characterized in that the core consists of semiconductor crystals. 8. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Halbleiterkristalle aus CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, InP, InAs bestehen.8. Fluorescent microparticles according to claim 1 and 7, characterized in that the Semiconductor crystals consist of CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, InP, InAs. 9. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem metallisch leitenden Material um Gold, Silber, Kupfer oder Aluminium han­ delt.9. Fluorescent microparticles according to claim 1 to 7, characterized in that it the metallic conductive material is gold, silver, copper or aluminum delt. 10. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser des Kerns des fluoreszierenden Materials bevorzugt im Bereich von 10 nm bis 90 nm liegt und die Schichtdicke des metallisch leitenden Materials bevorzugt 1 bis 10 nm beträgt. 10. Fluorescent microparticles according to claim 1 to 8, characterized in that the Diameter of the core of the fluorescent material preferably in the range of 10 nm is up to 90 nm and the layer thickness of the metallically conductive material is preferably 1 to 10 nm is.   11. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser des Kerns des fluoreszierenden Materials besonders bevorzugt im Bereich von 10 bis 50 nm liegt und das metallisch leitende Material aus Silber besteht.11. Fluorescent microparticles according to claim 1 to 9, characterized in that the Diameter of the core of the fluorescent material is particularly preferred in the range is from 10 to 50 nm and the metallic conductive material consists of silver. 12. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um sphärische Teilchen handelt.12. Fluorescent microparticles according to claim 1 to 11, characterized in that it are spherical particles. 13. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um nichtsphärische Teilchen handelt.13. Fluorescent microparticles according to claim 1 to 11, characterized in that it are non-spherical particles. 14. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Teilchen mit unregelmässiger bis fraktaler Oberflächenstruktur handelt.14. Fluorescent microparticles according to claim 1 to 13, characterized in that it are particles with an irregular to fractal surface structure. 15. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 14 dadurch gekennzeichnet, daß die transparente Schutzschicht aus Oxiden oder Sulfiden des metallisch leitenden Materials und/oder Polymeren besteht.15. Fluorescent microparticles according to claim 1 to 14, characterized in that the transparent protective layer made of oxides or sulfides of the metallic conductive material and / or polymers. 16. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen mit Eiweißkörpern bevorzugt Albumin beschichtet sind.16. Fluorescent microparticles according to claim 1 to 15, characterized in that the Particles with protein bodies are preferably coated with albumin. 17. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 15 dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen mit aliphatischen Polysulfiden oder monomeren thiolgruppenenthaltenden Stof­ fen beschichtet sind.17. Fluorescent microparticles according to claim 1 to 15, characterized in that the Particles with aliphatic polysulfides or monomeric substance containing thiol groups fen are coated. 18. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 17 oder eine Modifikation davon, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche funktionelle Kopplungsgruppen aus der Rei­ he Hydroxyl, Amin, Amid, Imid, Carbonsäureanhydrid, Sulfhydril, Sulfonat, Aldehyd, Azid, Chinondiazid, enthält.18. Fluorescent microparticles according to claim 1 to 17 or a modification thereof, characterized in that the surface functional coupling groups from the Rei he hydroxyl, amine, amide, imide, carboxylic anhydride, sulfhydril, sulfonate, aldehyde, Azide, quinonediazide, contains. 19. Fluoreszierende Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 18 oder eine Modifikation davon, gekennzeichnet dadurch, daß die Oberfläche eine biologisch aktive Substanz wie Biotin, Avidin, Streptavidin, oder eine Nucleinsäureverbindung enthält.19. Fluorescent microparticles according to claim 1 to 18 or a modification thereof, characterized in that the surface is a biologically active substance such as biotin, Contains avidin, streptavidin, or a nucleic acid compound. 20. Herstellung eines fluoreszierenden Mikroteilchens nach einem der Ansprüche 1 bis 19.20. Production of a fluorescent microparticle according to one of claims 1 to 19. 21. Verfahren zur Herstellung fluoreszierender Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 20, ge­ kennzeichnet durch folgende Arbeitsschritte
  • a) Präparation von Polymerteilchen, die fluoreszierende organische Farbstoffe enthalten oder fluoreszierenden Halbleiterkristallen mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 5 bis 100 nm,
  • b) Beschichtung von fluoreszierenden Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von 5 bis 100 nm mit einem bei den optischen Frequenzen der Anregung und Fluoreszenz metal­ lisch leitenden Material in der Weise, daß Durchmesser der fluoreszierenden Teilchen, sowie Art und Schichtdicke des metallisch leitenden Materials so aufeinander abgestimmt sind, daß maximale Photostabilität und/oder Helligkeit bei Ein- und/oder Mehrphotonen­ anregung erreicht wird,
  • c) Beschichtung der metallisierten Teilchen mit einer weiteren transparenten Schutzschicht und gegebenenfalls weitere Beschichtung mit funktionellen Gruppen oder Konjugatmole­ külen, die die Ankopplung an Biomoleküle oder andere Analytsubstanzen gestatten.
21. A method for producing fluorescent microparticles according to claim 1 to 20, characterized by the following steps
  • a) preparation of polymer particles which contain fluorescent organic dyes or fluorescent semiconductor crystals with an average particle diameter of 5 to 100 nm,
  • b) Coating of fluorescent particles with an average diameter of 5 to 100 nm with a metallic conductive material at the optical frequencies of the excitation and fluorescence in such a way that the diameter of the fluorescent particles and the type and layer thickness of the metallic conductive material are coordinated are that maximum photostability and / or brightness is achieved with single and / or multi-photon excitation,
  • c) Cool the coating of the metallized particles with a further transparent protective layer and optionally further coating with functional groups or conjugate moles which allow coupling to biomolecules or other analyte substances.
22. Verfahren zur Herstellung fluoreszierender Mikroteilchen nach Anspruch 20 und 21, da­ durch gekennzeichnet, daß farbstoffbeladene hydrophobe Polymerteilchen durch Lösen der Polymere und Farbstoffe in einem organischen mit Wasser nicht vollständig mischba­ ren Lösungsmittel und anschließende Emulgierung in Wasser unter Zugabe grenzflächen­ aktiver Stoffe und Abdestillieren des organischen Lösungsmittels oder daß farbstoffbela­ dene hydrophile Polymerteilchen durch Lösen der hydrophilen Polymere und der Farb­ stoffe in Wasser, anschließende Emulgierung in einem organischen Lösungsmittel unter Zugabe grenzflächenaktiver Stoffe und Abdestillieren des Wassers präpariert werden.22. A method for producing fluorescent microparticles according to claim 20 and 21, because characterized in that dye-loaded hydrophobic polymer particles by dissolving of the polymers and dyes in an organic not completely miscible with water Ren solvent and subsequent emulsification in water with the addition of interfaces active substances and distilling off the organic solvent or that dye the hydrophilic polymer particles by dissolving the hydrophilic polymers and the color substances in water, subsequent emulsification in an organic solvent Add surfactants and distill off the water. 23. Verfahren zur Herstellung fluoreszierender Mikroteilchen nach Anspruch 20 und 21, da­ durch gekennzeichnet, daß vernetzte Polymerteilchen mit Anionen- oder Kationencha­ rakter in Lösung mit entsprechenden ionischen organischen fluoreszierenden Farbstoffen zusammengebracht werden, so daß sich die Polymerteilchen mit Farbstoffen beladen.23. A method for producing fluorescent microparticles according to claim 20 and 21, because characterized in that cross-linked polymer particles with anion or cation cha in solution with appropriate ionic organic fluorescent dyes are brought together so that the polymer particles are loaded with dyes. 24. Verfahren zur Herstellung fluoreszierender Mikroteilchen nach Anspruch 20 und 21, da­ durch gekennzeichnet, daß die mit Farbstoff beladenen polymeren Teilchen oder Mikro­ kristalle in wässriger Suspension mit Lösungen von Salzen oder Komplexsalzen von Gold, Silber oder Kupfer in Gegenwart eines Reduktionsmittels zusammengebracht wer­ den bis sich das Metall in der erforderlichen Schichtdicke auf den polymeren Teilchen oder Halbleiterkristallen niedergeschlagen hat.24. A method for producing fluorescent microparticles according to claim 20 and 21, because characterized in that the polymer particles or micro-charged with dye crystals in aqueous suspension with solutions of salts or complex salts of Gold, silver or copper brought together in the presence of a reducing agent until the metal is in the required layer thickness on the polymer particles or has deposited semiconductor crystals. 25. Verfahren zur Herstellung fluoreszierender Mikroteilchen nach Anspruch 20 und 21, da­ durch gekennzeichnet, daß eine transparente Schutzschicht aus Oxiden oder Sulfiden durch Suspension der metallisierten fluoreszierenden Polymerteilchen oder der metalli­ sierten Halbleitermikrokristalle in wässrigen Lösungen in Gegenwart von Oxidationsmit­ teln oder Ammoniumsulfid aufgebracht wird.25. A method for producing fluorescent microparticles according to claim 20 and 21, because characterized in that a transparent protective layer of oxides or sulfides by suspension of the metallized fluorescent polymer particles or the metalli based semiconductor microcrystals in aqueous solutions in the presence of oxidizing agents or ammonium sulfide is applied. 26. Verfahren zur Herstellung fluoreszierender Mikroteilchen nach Anspruch 20 und 21, da­ durch gekennzeichnet, daß die metallisierten fluoreszierenden Mikroteilchen in wässriger oder gegebenenfalls organischer Suspension mit Eiweißkörpern wie Albumin oder ande­ ren Substanzen mit den funktionellen Gruppen Hydroxyl, Amin, Amid, Imid, Carbonsäu­ reanhydrid, Sulfhydril, Sulfonat, Aldehyd, Azid, Chinondiazid oder biologisch aktiven Substanzen beschichtet werden.26. A method for producing fluorescent microparticles according to claim 20 and 21, because characterized in that the metallized fluorescent microparticles in aqueous or optionally organic suspension with protein bodies such as albumin or others Ren substances with the functional groups hydroxyl, amine, amide, imide, carboxylic acid reanhydride, sulfhydril, sulfonate, aldehyde, azide, quinonediazide or biologically active Substances are coated. 27. Verfahren zur Herstellung fluoreszierender Mikroteilchen nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktiven Substanzen Biotin, Avidin, Streptavidin oder eine Nucleinsäureverbindung sind.27. A method for producing fluorescent microparticles according to claim 25, characterized characterized in that the biologically active substances biotin, avidin, streptavidin or are a nucleic acid compound. 28. Verwendung von fluoreszierenden Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 19, als Fluores­ zenzmarker oder Tracer.28. Use of fluorescent microparticles according to claim 1 to 19, as fluorescence zenzmarker or tracer. 29. Verwendung von fluoreszierenden Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 19 zum Nachweis von Substanzen, die mit den funktionellen Gruppen der Mikroteilchen reagieren oder dar­ an binden, wobei es sich um ein Protein, ein Peptid, DNA, RNA, ein Polysaccharid, ein Oligonucleotid, Avidin, Biotin, ein polymeres Biomolekül, ein nichtpolymeres Biomole­ kül, einen Antikörper, ein Antigen, einen Virus oder einen anderen Mikroorganismus handelt.29. Use of fluorescent microparticles according to claim 1 to 19 for detection of substances that react with or represent the functional groups of the microparticles bind to, which is a protein, a peptide, DNA, RNA, a polysaccharide Oligonucleotide, avidin, biotin, a polymeric biomolecule, a non-polymeric biomole cool, an antibody, an antigen, a virus or other microorganism is. 30. Verwendung von fluoreszierenden Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 19 in Immunoas­ says, in der DNS-Sequenz-Analyse, in der Zellsortierung, in Imaging-Verfahren. 30. Use of fluorescent microparticles according to claim 1 to 19 in immunoas says, in DNA sequence analysis, in cell sorting, in imaging processes.   31. Verwendung von fluoreszierenden Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 19, als Tracer zum Nachweis von Transportvorgängen.31. Use of fluorescent microparticles according to claim 1 to 19, as a tracer for Evidence of transport operations. 32. Verwendung von fluoreszierenden Mikroteilchen nach Anspruch 29, in der Zytometrie.32. Use of fluorescent microparticles according to claim 29, in cytometry. 33. Verwendung von fluoreszierenden Mikroteilchen nach Anspruch 29, als Tracer zum Nachweis von Transportvorgängen in lebenden Organismen oder Zellen.33. Use of fluorescent microparticles according to claim 29, as a tracer for Detection of transport processes in living organisms or cells. 34. Verwendung von fluoreszierenden Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 19 und 28 bis 33 in Meßsystemen mit Zweiphotonenanregung im Bereich von 600-1100 nm und Nachweis der Fluoreszenzemission im Bereich 300-700 nm.34. Use of fluorescent microparticles according to claim 1 to 19 and 28 to 33 in Measuring systems with two-photon excitation in the range of 600-1100 nm and detection the fluorescence emission in the range 300-700 nm. 35. Verwendung von fluoreszierenden Mikroteilchen nach Anspruch 1 bis 19 und 28 bis 33 und/oder 34 in Meßsystemen mit einer CCD-Kamera zur Detektion der Fluoreszenz.35. Use of fluorescent microparticles according to claims 1 to 19 and 28 to 33 and / or 34 in measuring systems with a CCD camera for detecting the fluorescence.
DE10108808A 2001-02-16 2001-02-16 Fluorescent microparticles Withdrawn DE10108808A1 (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10108808A DE10108808A1 (en) 2001-02-16 2001-02-16 Fluorescent microparticles
DE10290599A DE10290599A5 (en) 2001-02-16 2002-02-12 Fluorescent microparticles, useful as markers or tracers, comprise core of fluorescent material coated with metallic conductive material with further transparent protective layer
PCT/DE2002/000556 WO2002066574A1 (en) 2001-02-16 2002-02-12 Fluorescent microparticles

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10108808A DE10108808A1 (en) 2001-02-16 2001-02-16 Fluorescent microparticles

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE10108808A1 true DE10108808A1 (en) 2002-09-05

Family

ID=7675278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE10108808A Withdrawn DE10108808A1 (en) 2001-02-16 2001-02-16 Fluorescent microparticles

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE10108808A1 (en)
WO (1) WO2002066574A1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008033940B3 (en) * 2008-07-18 2010-01-21 Innovent E.V. Functional layer quality determining method, involves separately supplying colorant to working gas or plasma beam or flame or together with precursor, where method is implemented as normal pressure plasma method
CN110672574A (en) * 2019-11-06 2020-01-10 湖北师范大学 For detecting Cu2+Ratiometric fluorescent sensor, and preparation method and application thereof

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0125617D0 (en) * 2001-10-25 2001-12-19 Univ Manchester Photostabilised organic material
WO2004072613A2 (en) * 2003-02-07 2004-08-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Multi-shell microspheres with integrated chomatographic and detection layers for use in array sensors
WO2006084339A1 (en) * 2005-02-14 2006-08-17 Australian Nuclear Science & Technology Organisation Layered nanoparticles
WO2008127139A1 (en) * 2007-04-11 2008-10-23 Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engeldardta Rossiiskoi Akademii Nauk Indicyanine dyes and the derivatives thereof for analysing biological micromolecules
KR101767262B1 (en) * 2009-11-09 2017-08-11 삼성전자주식회사 Method and apparatus for changing input format in input system using universal plug and play
CN102516696B (en) * 2011-12-19 2014-03-12 东南大学 Method for preparing bioluminescent nano thermometer
CN105985598B (en) * 2016-06-17 2021-05-28 燕山大学 Dye-graphene-polyvinyl alcohol ternary fluorescent compound and preparation method thereof
DE102017114537A1 (en) 2017-06-29 2019-01-03 Endress+Hauser Conducta Gmbh+Co. Kg Sensor membrane, sensor cap and optical sensor
CN108586758B (en) * 2018-05-10 2020-10-16 宁波新斯维箱包有限公司 Microcapsule and preparation method thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5326692B1 (en) * 1992-05-13 1996-04-30 Molecular Probes Inc Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift
DE19933104A1 (en) * 1999-07-15 2001-01-18 Ingo Klimant Phosphorescent micro- and nanoparticles as reference standards and phosphorescence markers

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008033940B3 (en) * 2008-07-18 2010-01-21 Innovent E.V. Functional layer quality determining method, involves separately supplying colorant to working gas or plasma beam or flame or together with precursor, where method is implemented as normal pressure plasma method
CN110672574A (en) * 2019-11-06 2020-01-10 湖北师范大学 For detecting Cu2+Ratiometric fluorescent sensor, and preparation method and application thereof
CN110672574B (en) * 2019-11-06 2021-10-15 湖北师范大学 For detecting Cu2+Ratiometric fluorescent sensor, and preparation method and application thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002066574A1 (en) 2002-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69907630T2 (en) MICROPARTICLES WITH MULTIPLE FLUORESCENCE SIGNALS
DE60029528T2 (en) Separation of substances by dielectrophoresis
DE60037267T2 (en) SURFACE IMPROVED SPECTROSCOPIC ACTIVE COMPOSITE NANOPARTICLES
DE60119170T2 (en) DETECTION METHOD OF REINFORCED SILVER DYEING
DE69233703T2 (en) Method and apparatus for improved luminescence tests
Chen et al. Gold nanoparticle based colorimetric probe for dopamine detection based on the interaction between dopamine and melamine
DE60117556T2 (en) MULTI-ANALYTIC MOLECULAR ANALYSIS THROUGH THE USE OF APPLICATION SPECIFIC RAPID PARTICLE ARRAYS
DE10108808A1 (en) Fluorescent microparticles
DE69911007T2 (en) NUCLEIC SEQUENCE IDENTIFICATION
Wei et al. Fabrication and evaluation of sulfanilamide-imprinted composite sensors by developing a custom-tailored strategy
US9745438B2 (en) Method and system for manufacture and use of macroporous beads in a multiplex assay
DE3235658C2 (en)
EP3771487A1 (en) Method for the simultaneous determination of various analytes in an environmental sample and / or an agricultural raw material based on core-shell microparticles
DE60317315T2 (en) DETECTION OF DNA BINDING PROTEINS
DE3215983A1 (en) ANALYSIS UNIT
DE69919143T2 (en) NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION TEST PROCEDURE IN SOLUTION
DE3412340C2 (en) Substrate for fluorescence immunoanalysis of biological fluids
DE60219428T2 (en) BIOCHEMICAL METHOD AND APPARATUS FOR DETECTING GENETIC CHARACTERISTICS
DE19903576C2 (en) Quantitative determination of analytes in a heterogeneous system
DE60126711T2 (en) METHOD OF MEASURING POLYMORPHISMS
DE2910414A1 (en) METHOD FOR MANUFACTURING POLYGLUTARALDEHYDE AND ITS USE
DE60300298T2 (en) Arbitrary arrangement of microspheres for analysis of nucleic acids using enzyme digestion
DE102007005472B4 (en) Method and apparatus for producing a molecular film having a set density
DE102014203266B4 (en) Composition with FRET pair in defined geometry
WO2002040698A2 (en) Analysis of soluble factor biological markers

Legal Events

Date Code Title Description
8143 Withdrawn due to claiming internal priority