DE10060959A1 - A process for the isolation and identification of effectors - Google Patents

A process for the isolation and identification of effectors

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DE10060959A1
DE10060959A1 DE2000160959 DE10060959A DE10060959A1 DE 10060959 A1 DE10060959 A1 DE 10060959A1 DE 2000160959 DE2000160959 DE 2000160959 DE 10060959 A DE10060959 A DE 10060959A DE 10060959 A1 DE10060959 A1 DE 10060959A1
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DE
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effector
effect
biological
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DE2000160959
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German (de)
Inventor
Thomas Polakowski
Eberhard Schneider
Jens Solsbacher
Peter Wagner
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PHYLOS, INC., LEXINGTON, MASS., US
Original Assignee
Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034Isolating an individual clone by screening libraries

Abstract

The invention relates to a method that allows isolation and identification of components that bind to constituents of particulate systems, thereby inducing a biological effect. Said biological effect is used to isolate the effector-charged particulate systems using cell sorting systems or by cell growth selection. The effector-inducing constituents are identified by means of a nucleic acid that can be unambiguously associated with the effector-inducing constituent.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Methode, die die Isolierung und Identifizierung von Komponenten erlaubt, die an Bestandteile von partikulären Systemen binden und hierbei einen biologischen Effekt auslösen, sowie die durch diese Methode erhältlichen Effektoren. The present invention is a method that allows the isolation and identification of components that bind to components of particulate systems and thereby cause a biological effect, and the effectors obtainable by this method.

Die Identifizierung bzw. Isolierung biologisch aktiver Substanzen (Effektoren), die einen bestimmten physiologischen Effekt auf ein partikuläres System, z. The identification or isolation of biologically active substances (effectors), which a particular physiological effect on a particulate system such. B. eine Zelle, ausüben, ist essentieller Bestandteil unzähliger Programme zur Auffindung neuer pharmakologisch wirksamer Substanzen. B. a cell exercise, is an essential part of countless programs for the discovery of novel pharmacologically active substances. Solche Programme, bei denen 100.000 und mehr Substanzen aus einer Stoffbibliothek getestet werden, nennt man "high throughput screen" (HTS). Such programs, in which 100,000 and more substances are tested from a fabric library, one "high throughput screen" calls (HTS).

Ideal für einen HTS ist eine "robuste" (bio-)chemische oder biologische Reaktion (z. B. in einem zellulären System), die sich einfach über ein optisches System oder durch radioaktiv markierte Substanzen verfolgen läßt und die eine direkte Verbindung zu dem gewünschten physiologischen Effekt hat (Kenny et al. (1998) Progress in Drug Research. 51: 245-269). Ideal for a HTS is a "robust" (bio) chemical or biological reaction (eg., In a cellular system), which can be traced simply via an optical system or by radioactively labeled substances and the desired direct connection to the physiological effect has (Kenny et al (1998) Progress in Drug Research 51:.. 245-269). Die andere wichtige Komponente eines HTS ist die Stoffbibliothek, die verwendet wird, um den gewünschten physiologischen Effekt zu erreichen. The other important component of an HTS material is the library that is used to achieve the desired physiological effect. Hier unterscheidet man Naturstoffbibliotheken von sogenannten Arrays, die mit Mitteln der kombinatorischen Chemie hergestellt werden können (Drolet et al. (1999) Comb Chem High Troughput Screen 2: 271-8). Here, a distinction is natural product libraries of so-called arrays, which can be prepared by means of combinatorial chemistry (Drolet et al (1999) Comb Chem High Throughput Screen. 2: 271-8). Je größer die Bibliotheken oder Arrays, desto wahrscheinlicher ist es, daß sich darin ein Effektor befindet. The larger the library or array, the more likely it is that an effector therein is located.

HTS werden in der Regel in möglichst kleinen Flüssigkeitsvolumina und in automatisierter Form durchgeführt. HTS be carried out usually in the smallest possible liquid volumes and automated means. Jedes Flüssigkeitsvolumen stellt dabei ein abgegrenztes Kompartiment dar, in dem es zur Reaktion mit einem einzigen Mitglied der Stoffbibliothek kommt. Each volume of liquid in this case represents a distinct compartment in which a reaction takes place with a single member of the fabric library. Dies ist nötig, um jede Reaktion dem entsprechenden Effektor aus der Bibliothek zuordnen zu können. This is necessary to allocate the appropriate effector from the library to each reaction. Die Kodierung erfolgt über die Lage der Reaktionsvolumina z. The encoding is done about the situation of reaction volumes for. B. auf Mikrotiterplatten. B. on microtiter plates. Hierfür ist ein großer apparativer und zeitlicher Aufwand nötig. For this, a large of apparatus and time expenditure is necessary.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein HTS-Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit Hilfe dessen Effektoren aus komplexen Stoffgemischen isoliert und identifiziert werden können, ohne daß die aufwendige Kompartimentierung, die bei herkömmlichen HTS-Verfahren notwendig ist, durchgeführt werden muß. The object of the present invention is to provide a HTS methods are available, the effectors may be isolated from complex mixtures and identified with the aid, without the extensive compartmentalization, which is necessary in conventional HTS process must be performed. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ferner ein HTS-Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die parallele Analyse sehr komplexer Stoffgemische auf eine oder mehrere Effektorwirkungen erlaubt. Object of the present invention is also to provide a HTS methods are available that will allow the parallel analysis of highly complex mixtures of substances on one or more Effektorwirkungen.

Gelöst wird die Aufgabe mit der vorliegenden Erfindung, die eine Methode darstellt, mit der das HTS im Batch-Verfahren mit partikulären Systemen durchgeführt werden kann, wodurch die aufwendige Kompartimentierung entfällt, und mit der in einem Zeitabschnitt eine deutlich größere Bibliothek durchmustert werden kann als dies mit den herkömmlichen HTS-Methoden möglich wäre. The object is achieved with the present invention, illustrating a method by which the HTS in a batch process can be carried out with particulate systems, whereby the complex compartmentalization is omitted, and a significantly larger library can be screened with in a time period as this would be possible with conventional HTS methods. Bevorzugt können so bis zu 10 9 , besonders bevorzugt bis zu 10 12 , insbesondere bis zu 10 15 verschiedene Komponenten aus einer randomisierten Bibliothek potentieller Effektoren innerhalb weniger Wochen auf Auslösung eines biologischen Effektes durchmustert werden. Preferably, may particularly preferably be screened up to 10 12, in particular up to 10 15 different components from a randomized library of potential effectors within a few weeks to trigger a biological effect, so up to 10 9. Dadurch wird der Zeit-, Material- und Kostenaufwand derartiger HTS drastisch verringert. Thus, the time, material and cost of such HTS is drastically reduced.

Erfindungsgemäß versteht man unter einem partikulären System einen abgegrenzten Raum, in und/oder an dem eine Effektor-induzierte Reaktion stattfinden kann. According to the invention is understood to mean a particulate system includes a confined space, in and / or on which a effector-induced reaction to take place. Es handelt sich hierbei beispielsweise um biologische Zellen, Viren, Liposomen, Vesikel oder um als Trägermaterial eingesetzte Feststoffe. These are, for example, biological cells, viruses, liposomes, vesicles or solids used as a support material. Bei den biologischen Zellen handelt es sich hierbei bevorzugt um einzellige prokaryotische oder eukaryotische Organismen oder um isolierte Zellen oder Zellverbände aus höheren eukaryotischen Organismen. The biological cells, these are preferably unicellular prokaryotic or eukaryotic organisms or isolated cells or cell clusters from higher eukaryotic organisms. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den biologischen Zellen um Hefezellen, insbesondere um solche der Art Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris oder Hansenula polymorpha. Particularly preferably it is in the biological cells are yeast cells, in particular those of the species Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris or Hansenula polymorpha. Die partikulären Systeme können auch gentechnisch verändert sein. The particulate systems can also be genetically modified.

Wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Bibliothek, bei der die Identität der einzelnen Komponenten über eine Nukleinsäure (RNA, DNA) oder über ein Nukleinsäureanalogon bestimmt werden kann. An essential feature of the present invention is the use of a library, in which the identity of the individual components of a nucleic acid (RNA, DNA) or a nucleic acid analogue may be determined. Dies wird dadurch ermöglicht, daß erfindungsgemäß jeder einzelnen Bibliothekskomponente eine individuelle Nukleinsäure zuordbar ist. This is made possible by the fact that according to the invention each library component an individual nucleic acid is assignable.

Grundlegende erfinderische Idee der vorliegenden Erfindung ist demnach, aus einer Bibliothek von Komponenten solche zu isolieren, die durch Bindung an einen Bestandteil eines partikulären Systems in der Lage sind, einen biologischen Effekt in und/oder an dem partikulären System auszulösen (sogenannte Effektoren) und die isolierten Effektoren über eindeutig zuordbare Nukleinsäuren zu identifizieren, indem man Basic inventive idea of ​​the present invention is to isolate those from a library of components by binding to a component of a particulate system capable of eliciting a biological effect in and / or on the particulate system (so-called effectors) and is therefore to identify isolated effectors over clearly assignable nucleic acids by

  • a) partikuläre Systeme einer Bibliothek von Komponenten aussetzt, denen individuell Nukleinsäuren zuordbar sind, exposes a) particulate systems a library of components which individually nucleic acids can be assigned,
  • b) den biologischen Effekt in und/oder an den Effektor-beladenen partikulären Systemen nutzt, um Effektor-beladene partikuläre Systeme mittels eines Zellsortierungssystems und/oder mittels Wachstumsselektion zu isolieren, b) uses the biological effect and / or to the effector-laden particulate systems in order to isolate effector laden particulate systems by means of a cell sorting system and / or by selection for growth,
  • c) die Identität des Effektors durch Identifizierung der individuell zuordbaren Nukleinsäure oder eines Teiles davon ermittelt. c) the identity of the effector determined by identification of the individual can be associated nucleic acid or a part thereof.

Der Bestandteil des partikulären Systems, an den der Effektor bindet, kann erfindungsgemäß etwa ein Polypeptid, ein Kohlenhydrat, eine Nukleinsäure oder eine andere chemische Verbindung sein oder eine der genannten Verbindungen umfassen. The component of the particulate system to which the effector binds, can be or include any of the above compounds according to the invention as a polypeptide, a carbohydrate, a nucleic acid or other chemical compound.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Bestandteil des partikulären Systems um einen homolog oder heterolog exprimierten Rezeptor, der durch Expression von natürlicherweise vorkommenden oder synthetisch hergestellten Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivaten erhältlich ist. It is preferable that the constituent of the particulate system to a homologous or heterologous expressed receptor which is obtainable by expression of naturally occurring or synthetically produced nucleic acids or nucleic acid derivatives.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Rezeptor um einen Rezeptor aus der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, insbesondere um einen der im folgenden aufgezählten Rezeptoren: α-Faktor-Rezeptor Ste2p aus Saccharomyces cerevisiae, TSH-Rezeptor (Schuppert et al. (1996) Thyroid 6: 575), FSH-Rezeptor (Tilly et al. (1992) Endocrinology 131: 799), EGF-Rezeptor (Christensen et al. (1998) Dan. Med. Bull. 45: 121), TNF-Rezeptor (Murphy et al. (1994) Thymus 23: 177), Transferrin- Rezeptor (Ponka and Lok (1999) Int. J. Biochem. Cell Biol. 31: 1111), Insulin- Rezeptor (Milazzo et al. (1992) Cancer Res. 52: 3924), FGF-Rezeptor (Kiefer et al. (1991) Growth Factors 5: 115), TGFβ-Rezeptor (Derynck et al. (1994) Princess Takamatsu Symp. 24: 264), IGF-Rezeptor (Peyrat and Bonneterre (1992) Breast Cancer Res. Treat. 22: 59), Angiotensin II-Rezeptor (Smith and Timmermans (1994) Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 3: 112) und Somatostatin-Rezeptor (Schonbrunn (1999) Ann. Oncol. 10 Suppl. 2: 17). It is preferable that the receptor is a receptor of the family of G-protein-coupled receptors, in particular one of the listed in the following receptors:. Α-factor receptor Ste2p from Saccharomyces cerevisiae, TSH receptor (Schuppert et al (1996 (575), FSH receptor Tilly et al (1992) Endocrinology 131::) Thyroid sixth 799), EGF receptor (Christensen et al (1998) Dan Med Bull 45:.... 121), TNF receptor ( . Murphy et al (1994) thymus 23: 177), transferrin receptor (Lok and Ponka (1999) Int J Biochem Cell Biol. 31:.. 1111), insulin receptor Cancer Res (Milazzo et al (1992). 3924), FGF receptor (Kiefer et al (1991). Growth Factors 5::. 52115), TGF receptor (Derynck et al (1994). Princess Takamatsu Symp. 24: 264), IGF receptor (Peyrat and Bonneterre (1992) Breast Cancer Res Treat. 22:. ((Smith and Timmermans 1994) 59), angiotensin II receptor 3 Curr Opin Nephrol Hypertens:.... 112) and somatostatin receptor (Schonbrunn (1999) Ann Oncol. . 10 Suppl. 2: 17).

Der oben bezeichnete Schritt (a) kann hierbei so durchgeführt werden, dass eine Bibliothek von unterschiedlichen Komponenten, die jeweils selbst Nukleinsäuren sind und/oder jeweils mindestens eine Nukleinsäure umfassen, zu einer Vorlage von partikulären Systemen hinzugegeben werden und die so erhaltene Mischung inkubiert wird. The above-described step (a) can be carried out here so that a library of different components, each of which itself nucleic acids and / or in each case comprise at least one nucleic acid are added to a template of particulate systems, and the mixture thus obtained is incubated.

Anschließend kann nun in Schritt (b) ein Zellsortierungssystem, wie etwa FACS, oder die Wachstumsselektion verwendet werden, um Effektor-beladene partikuläre Systeme zu detektieren und von den unbeladenen partikulären Systemen zu trennen. Subsequently, now in step (b) a cell sorting system, such as FACS, or the growth selection are used to detect effector laden particulate systems and be separated from the uncharged particulate systems.

Die Komponenten der Bibliothek, die zur Untersuchung auf Bindung von außen zu den partikulären Systemen gegeben werden, um Effektoren ausfindig zu machen, können erfindungsgemäß RNA, DNA oder eine Kombination aus RNA und DNA oder eine Kombination aus einer Nukleinsäure und einem Funktionsträger, bevorzugt einem Peptid, aber auch eine Kombination aus einer Nukleinsäure und einer anderen chemischen Verbindung umfassen. The components of the library, which are given for testing for binding of the outside of the particulate systems in order to locate effectors can according to the invention RNA, DNA or a combination of RNA and DNA or a combination of a nucleic acid and a function carrier, preferably a peptide but also include a combination of a nucleic acid and another chemical compound.

Aufgrund des Nukleinsäureanteils bzw. der Nukleinsäurenatur der Bibliotheksmitglieder ist es anschließend möglich über PCR-Techniken partikulär gebundene Bibliotheksmitglieder bzw. deren Nukleinsäure oder einen Teil davon zu amplifizieren und die bindenden Komponenten anschließend bevorzugt durch Sequenzierung oder Hybridisierung des Amplifikats zu identifizieren. Because the nucleic acid portion or nucleic acid nature of the library members, it is then possible using PCR techniques particle-bound library members or their nucleic acid or to amplify a portion thereof and the binding components and then preferably by sequencing or hybridization of the amplicon to identify.

Für den Fall, daß die Komponenten der Bibliothek einen Nukleinsäureanteil und einen Polypeptidanteil enthalten, umfaßt vorzugsweise der Nukleinsäureanteil die genetische Information für den Polypeptidanteil. In the event that the components of the library contain a nucleic acid moiety and a polypeptide moiety, preferably the nucleic acid portion comprising the genetic information for the polypeptide portion. Bei derartigen Bibliotheksmitgliedern handelt es sich vorzugweise um solche bei denen der Nukleinsäureanteil entweder direkt oder über ein Zwischenglied kovalent mit dem Polypeptidanteil verknüpft ist oder um solche bei denen der Polypeptidanteil an der Außenseite eines Bakteriums, einer Hefezelle oder eines Virus, bevorzugt eines Bakteriophagen, präsentiert wird (sogenanntes bacterial display (Christmann et al. (1999) Protein Engineering 12: 797-806), yeast display (De Francesco (1999) Scientist 13: 17), viral display bzw. phage display (Smith et al. (1997) Chem. Rev. 97: 391-410)). In such library members, it is preferably to those in which the nucleic acid portion is either directly or linked covalently via an intermediate member with the polypeptide portion or those in which the polypeptide portion on the outside of a bacterium, a yeast cell or a virus, preferably a bacteriophage, is presented (so-called bacterial display (Christmann et al (1999) protein Engineering. 12: 797-806), yeast display (De Francesco (1999) Scientist 13: 17), viral display, or phage display (Smith et al (1997) Chem. . Rev. 97: 391-410)).

Ist der Nukleinsäureanteil über ein Zwischenglied kovalent mit dem Polypeptidanteil verknüpft, so handelt es sich bei dem Zwischenglied bevorzugt um eine tRNA- analoge Verbindung. If the nucleic acid portion via an intermediate member covalently linked to the polypeptide moiety, so it is preferable in the intermediate member to a tRNA analog connection. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der tRNA-analogen Verbindung um ein Amin, insbesondere um Puromycin oder um eine mit Phenylalanin beladene modifizierte tRNA. Particularly preferably it is in the tRNA analogue compound is an amine, in particular to puromycin or a loaded with phenylalanine modified tRNA. Solche Komponenten sind beispielsweise durch ein Verfahren erhältlich, wie es in WO 98/31700 oder WO 98/16636 beschrieben ist. Such components are available, for example by a process as described in WO 98/31700 or WO 98/16636.

Für den Fall, daß es sich bei dem Effektor um eine Nukleinsäure handelt, kann der Effektor selbst oder Teile davon mit Hilfe der PCR amplifiziert werden. In the event that it is at the effector is a nucleic acid, the effector itself or parts thereof by means of the PCR can be amplified. Für den Fall, daß die selektierten Bibliotheksmitglieder einen Polypeptidanteil und einen die genetische Information für den Polypeptidanteil umfassenden Nukleinsäureanteil enthalten, kann durch Amplifikation der Nukleinsäure oder eines Teils davon mittels PCR und anschließenden Einbau der Nukleinsäure in einen geeigneten Vektor das Polypeptid mit Effektorwirkung in einem geeigneten Wirt produziert werden. In the event that the selected library members contain a polypeptide portion and a genetic information for the polypeptide portion comprising nucleic acid portion, the polypeptide having effector can be obtained by amplification of the nucleic acid or a part thereof by PCR and subsequent incorporation of the nucleic acid into a suitable vector in a suitable host to be produced.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, daß Polypeptide unter Verwendung einer kodierenden Nukleinsäure markiert werden, wobei die Nukleinsäure nicht die genetische Information für das Polypeptid umfaßt. According to the invention it is also possible that polypeptides are labeled using a coding nucleic acid, wherein the nucleic acid does not comprise the genetic information for the polypeptide. Genauso kann man erfindungsgemäß alle möglichen anderen potentiellen Effektoren unter Verwendung von Nukleinsäuren auf spezifische Weise markieren. Similarly, one can select according to the invention all kinds of other potential effectors using nucleic acids in a specific way. Bei diesen anderen möglichen Effektoren kann es sich z. These other potential effectors can be,. B. um Nukleinsäuren, Kohlenhydraten oder Lipiden handeln bzw. können diese möglichen Effektoren mindestens eine der genannten Gruppen umfassen. B. nucleic acids, carbohydrates or lipids act or can comprise at least one of said groups of these potential effectors. Durch Amplifikation der markierenden Nukleinsäure oder eines Teils davon und anschließende Sequenzierung oder Hybridisierung des Amplifikats kann man auch in diesem Fall die Effektoren identifizieren. By amplification of the labeling nucleic acid or a portion thereof, and subsequent sequencing or hybridization of amplicon can identify the effectors, also in this case.

Bei dem biologischen Effekt, der durch die Effektoren ausgelöst und durch die Zellsortierungssysteme detektiert und zur Sortierung verwendet wird und/oder der Wachstumsselektion zugrunde liegt, handelt es sich beispielsweise um In the biological effect that is caused by the effectors and detected by the cell sorting systems and used for sorting and / or growth selection is based, is, for example,

  • a) die direkte oder indirekte (z. B. vermittelt über eine Signalkaskade) An- oder Abschaltung eines Reporters bzw. Reportergens, a) the direct or indirect (eg. B. mediated by a signaling cascade) presence or disconnection of a reporter or reporter gene,
  • b) die Veränderung des Nukleinsäuregehalts des partikulären Systems, b) the change in the nucleic acid content of the particulate system,
  • c) die Freisetzung eines sekundären Messengers. c) the release of a secondary messenger.

Ein derartiger physiologischer Effekt kann hierbei natürlicherweise bei Bindung des Effektors an einen Bestandteil des partikulären Systems induziert werden oder dieses kann durch entsprechende künstliche, insbesondere gentechnische Manipulation auf eine Weise verändert sein, daß bei Bindung des Effektors, etwa infolge einer Signalkaskade, ein entsprechender Effekt auftritt. Such a physiological effect may in this case be induced upon binding of the effector to a component of the particulate system or it can be changed by appropriate artificial, particularly genetic manipulation in a way, that occurs upon binding of the effector, such as a result of a signal cascade, a similar effect naturally ,

Insbesondere kann etwa ein Reportergen gentechnisch in das partikuläre System eingebaut werden, das bei Bindung einer Komponente an einen bestimmten, nach außen hin exponierten Bestandteil des partikulären Systems oder durch Bindung an einen Bestandteil im Inneren des partikulären Systems entweder direkt oder durch Vermittlung von Mediatoren infolge einer Signalkaskade ein- oder abgeschaltet wird. In particular, as a reporter gene may be engineered into the particulate system, which upon binding of a component to a specified, outwardly exposed part of the particulate system or by binding to a component in the interior of the particulate system, either directly or through the intermediary of mediators due to mono- or signaling cascade is turned off. Beispiele für derartige Reportergene sind die Gene für die Luciferase, die ▱- Galactosidase, die alkalische Phosphatase, die ▱-Lactamase, die Chloramphenicolacetyltransferase und das GFP (green fluorescent protein). Examples of such reporter genes are the genes for luciferase, the ▱- galactosidase, alkaline phosphatase, the ▱-lactamase, chloramphenicol acetyl transferase, and GFP (green fluorescent protein).

Besonders bevorzugt zur Auffindung von Effektoren ist als partikuläres System Saccharomyces cerevisiae. Especially preferred for finding effectors is a particulate system Saccharomyces cerevisiae. Diese Hefe bietet die Möglichkeit z. This yeast provides the opportunity for. B. eine Vielzahl menschlicher GPCR's heterolog zu exprimieren und mit dem Hefe eigenen Pheromon-Stoffwechselweg zu koppeln. to express as a variety of human GPCRs heterologous and to couple to the yeast pheromone pathway own. Wird ein geeignetes Reportergen der Kontrolle eines Pheromon-gesteuerten Promotors unterstellt, so kommt es bei Bindung eines Effektors mittels einer Signalkaskade zur Expression des Reportergens. Is a suitable reporter gene the control of a pheromone-controlled promoter assumed, it comes upon binding of an effector by means of a signaling cascade for the expression of the reporter gene.

Effektor-beladene partikuläre Systeme können unmittelbar unter Nutzung des erzeugten physiologischen Effektes durch Zellsortierungssysteme von nicht beladenen partikulären Systemen getrennt werden, nämlich aufgrund ihrer veränderten Eigenschaften, insbesondere aufgrund ihrer veränderten Fluoreszenzeigenschaften, ihrer veränderten morphologischen, biochemischen und/oder physikalischen Eigenschaften (z. B. Oberflächenladungsdichte, Ladung). Effector laden particulate systems may be separated by cell sorting systems not laden particulate systems directly by using the physiological effect produced, namely, due to their altered properties, in particular due to their altered fluorescent properties, their altered morphological, biochemical and / or physical properties (eg. B. surface charge density, charge). Alternativ können unter Einsatz weiterer Mittel die veränderten Eigenschaften detektierbar gemacht werden und dadurch die Trennung durch Zellsortierungssysteme ermöglicht werden. Alternatively, the modified properties can be made detectable, thereby enabling the separation by cell sorting systems using other means.

Als Beispiele für den ersten Fall seien etwa die Wachstumsselektion und die Zellsortierung mittels FACS genannt. As examples of the first case about the growth selection and cell sorting may be mentioned by FACS. Falls der physiologische Effekt eine größere oder geringere Dichte des partikulären Systems zur Folge hat, kann dieser Effekt zur Abtrennung Effektor-beladener partikulärer Systeme genutzt werden (z. B. durch Zentrifugation oder Elutriation). If the physiological effect has a greater or lesser density of the particulate system, the result of this effect can be used for the separation effector laden particulate systems (eg., By centrifugation or elutriation).

Besteht der physiologische Effekt darin, daß Gene exprimiert werden, deren Expression Wachstum unter Wachstumsbedingungen erlaubt, bei denen die anderen partikulären Systeme nicht überlebensfähig sind, so kann man durch Vorgabe entsprechender Wachstumsbedingungen eine Selektion der Effektor- beladenen von den unbeladenen partikulären Systemen erreichen. Consists of the physiological effect that genes are expressed, the expression of which allows growth under growth conditions, in which the other particulate systems are not capable of surviving, as can be achieved by specifying appropriate growth conditions for selection of effector loaded from the unloaded particulate systems. Kommt es bei Bindung des Effektors, gegebenenfalls über entsprechende Mediatoren, zur Aktivierung eines Reportergens, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, so können die Effektor-beladenen partikulären Systeme in diesem Fall mittels FACS von den unbeladenen Systemen getrennt werden. If, upon binding of the effector, optionally via appropriate mediators for the activation of a reporter gene encoding for a fluorescent protein, the effector-laden particulate systems may be isolated by FACS from the unloaded systems in this case.

Als Beispiele für die mittelbare Detektion seien partikuläre Systeme genannt, die mit Verbindungen beladen sind, die die Detektion eines freigesetzten sekundären Messengers erlauben. As examples of the indirect detection may be mentioned particulate systems, which are loaded with compounds that allow detection of a released secondary messengers. Handelt es sich bei diesen Verbindungen um Proteine, so werden diese bevorzugt durch Expression von Nukleinsäuren bzw. eines entsprechenden Expressionsvektors, der zuvor in die partikulären Systeme eingebracht wurde, synthetisiert. If it is these compounds are proteins, they are preferably synthesized by expression of nucleic acids or of an appropriate expression vector which has previously been incorporated into the particulate systems. Verwendet man hierbei als partikuläre Systeme etwa solche, die mit FLUO-3, Aequorin oder dem Genprodukt einer Calmodulin- GFP-Fusion (Miyawaki et al. (1997) Nature 388: 882-887) beladen sind, so können diejenigen partikulären Systeme, bei denen die Effektorbindung eine Freisetzung des sekundären Messengers Ca 2+ bewirkt, aufgrund der Bildung eines fluoreszierenden Komplexes unter Verwendung von FACS von den unbeladenen Systemen getrennt werden. is used here as particulate systems as those with FLUO-3, aequorin or the gene product of a calmodulin-GFP fusion (Miyawaki et al (1997) Nature 388:. 882-887) are loaded, so, those particulate systems in where the effector binding causes release of secondary messengers Ca 2+, are separated due to the formation of a fluorescent complex using FACS by the unladen systems. Führt die Bindung eines Effektors zu einem veränderten DNA- und/oder RNA-Gehalt im partikulären System, so kann man diesen mittels Nukleinsäure-spezifischer Floureszenzfarbstoffe sichtbar machen und die partikulären Systeme mit verändertem Nukleinsäuregehalt von allen übrigen mittels FACS abtrennen. Performs the binding of the effector to an altered DNA and / or RNA content in the particulate system, it is possible to make this visible by nucleic acid-specific fluorescent dyes and separating the particulate systems with modified nucleic acid content of all other means of FACS. Erfindungsgemäß können so etwa Effektoren mit Apoptose auslösender Wirkung oder Effektoren mit wachstumsstimulierender Aktivität isoliert werden. According to the invention as effectors with apoptosis-inducing effect, or effectors with growth stimulating activity may be isolated way. Insbesondere kann man hierüber Effektoren mit Zellzyklus-arretierender Aktivität identifizieren. In particular, one can identify here effectors with cell cycle LOCKING activity.

So läßt sich z. Thus, for leaves. B. die Anlagerung eines Effektors mit G1-Phase-arretierender Wirkung indirekt über den einfachen DNA-Gehalt der arretierten Zellen nachweisen, wenn gleichzeitig alle anderen Zellen aufgrund der Wirkung eines G2- oder M-Phase- spezifischen Inhibitors (wie z. B. Nocodazol) mit doppelten DNA-Gehalt arretiert werden. B. detecting the attachment of an effector with G1 phase-LOCKING effect indirectly through the simple DNA content of the arrested cells when simultaneously all other cells due to the action of a G2 or M-phase specific inhibitor (such. As nocodazole ) are locked with double DNA content. Umgekehrt läßt sich z. Conversely, z can be. B. die Anlagerung eines Effektors mit Zellzyklus- blockierender Wirkung in der G2- oder M-Phase des Zellzyklus dadurch nachweisen, daß gleichzeitig alle nicht in der G2- oder M-Phase mit doppeltem DNA-Gehalt arretierten Zellen aufgrund der Wirkung eines G1-Phase-spezifischen Inhibitors mit einfachem DNA-Gehalt im Zellzyklus arretieren. B. detecting the attachment of an effector with cell-cycle blocking effects in the G2 or M phase of the cell cycle by simultaneously all unlocked in the G2 or M-phase dual-DNA content of cells due to the action of a G1 phase -specific inhibitor with a simple DNA content in cell cycle arrest. Beiden Ausführungsbeispielen ist das Prinzip der Gegenselektion gemeinsam: Durch definierte Zellkulturbedingungen wird ein Phänotyp der Zellen stimuliert, dessen Eintreten bei einzelnen Zellen in Folge der Anlagerung von Effektoren verhindert wird, was sich für die spezifische Detektion einer funktionellen Wirkung der Effektoren auf Zellen ausnutzen läßt. Both embodiments, the principle of counter-selection is common: a phenotype of the cells is stimulated by defined cell culture conditions, whose occurrence is prevented in the individual cells due to the addition of effectors, which can be exploited for the specific detection of a functional action of effectors on cells.

In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens befinden sich die Bestandteile der partikulären Systeme, für die ein Effektor gesucht wird, im Inneren der partikulären Systeme. In a particular embodiment of the method according to the invention are the components of the particulate systems for which an effector is sought in the interior of the particulate systems. Bevorzugt werden bei dieser Ausführungsform die Komponenten der Bibliothek im Innern der partikulären Systeme dadurch bereitgestellt, daß eine Bibliothek entsprechender, für diese Komponenten kodierender Nukleinsäuren ins Innere der partikulären Systeme eingebracht wird und diese Nukleinsäuren anschließend transkribiert und/oder tranlatiert werden. the components of the library in the interior of the particulate systems are preferred in this embodiment provided by the fact that a library of corresponding encoding nucleic acids for these components is introduced into the interior of the particulate systems and these nucleic acids then transcribed and / or tranlatiert. Besonders bevorzugt werden hierbei auch die Bestandteile der partikulären Systeme, für die ein Bindungspartner zur Auslösung eines biologischen Effekts gesucht wird, im Innern der partikulären Systeme bereitgestellt, indem eine Nukleinsäure, die für den Bestandteil kodiert, ins Innere der partikulären Systeme eingebracht wird, und diese anschließend transkribiert und/oder translatiert wird. also the components of the particulate systems for which a binding partner to initiate a biological effect is wanted to be particularly preferred in this case, provided in the interior of the particulate systems by a nucleic acid encoding the component, is introduced into the interior of the particulate systems, and these is then transcribed and / or translated. Das Polypeptid kann auf diese Weise auch posttranslational modifiziert sein. The polypeptide may also be modified post-translationally in this way.

Beim Einbringen der Nukleinsäuren der Bibliothek in die partikulären Systeme werden die Bedingungen hierbei bevorzugt so gewählt, daß nicht mehr als jeweils eine Nukleinsäure ins Innere eines partikulären Systems gelangt. When introducing the nucleic acids of the library in the particulate systems, the conditions are in this case preferably selected such that no more than a respective nucleic acid enter the inside of a particulate system. Die Nukleinsäuren, die ins Innere der partikulären Systeme eingebracht werden, befinden sich bevorzugt auf Expressionskonstrukten, besonders bevorzugt auf Plasmiden, die die Expression der Polypeptide in dem entsprechenden partikulären Systemen ermöglichen. The nucleic acids are introduced into the interior of the particulate systems are preferably on expression constructs, particularly preferably on plasmids which allow expression of the polypeptides in the corresponding particulate systems.

Besonders bevorzugt wird auch bei dieser Ausführungsform bei Bindung der Komponente an den Bestandteil des partikulären Systems ein physiologischer Effekt ausgelöst, der wie oben beschrieben zur Zellsortierung und/oder zur Wachstumsselektion verwendet werden kann. triggered upon binding of the component to the component of the particulate system, a physiological effect, which can be used as described above for cell sorting and / or selection for growth is also particularly preferred in this embodiment. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform werden hierbei der Bestandteil des partikulären Systems und die Komponenten der Bibliothek als Fusionsproteine mit funktionell zueinander komplementären Untereinheiten eines Proteins, bevorzugt eines Transkriptionsfaktors, exprimiert, so daß bei Bindung der Komponente an den Bestandteil des partikulären Systems die Funktion des Proteins rekonstituiert wird. In an especially preferred embodiment in this case be a component of the particulate system, and the components of the library as fusion proteins with functionally complementary to each other subunits of a protein, preferably a transcription factor expressed, so that upon binding of the component to the component of the particulate system, the function of the protein is reconstituted. Das dabei verwendete Verfahren entspricht hierbei bevorzugt dem Hefe 2- Hybridsystem (Fields et al. (1989) Nature 340: 245-246; Chien et al. (1991) PNAS 88: 9578-9582) bzw. der "Interaktionsfalle" (Shirley et al. (1995) Methods Cell Biol. 49: 401-416). The method used in this case may preferably correspond to the yeast 2-hybrid system (Fields et al (1989) Nature 340: 245-246; Chien et al (1991) PNAS. 88:. 9578-9582) or the "interaction trap" (Shirley et al. (1995) Methods Cell Biol. 49: 401-416). Das Hefe 2-Hybridsystem basiert auf dem modularen Aufbau von Transkriptionsfaktoren (z. B. Gal4p) aus zwei funktional unabhängigen Domänen: einer DNA-Bindungsdomäne und einer Aktivierungsdomäne. The yeast 2-hybrid system is based on the modular design of transcription factors made up of two functionally independent domains (eg Gal4p.): A DNA binding domain and an activation domain. Diese lassen sich voneinander trennen und können in Fusion mit anderen Proteinanteilen unter Aufrechterhaltung ihrer ursprünglichen Aktivität exprimiert werden. These can be separated from one another and can be expressed in fusion with other protein portions while maintaining its original activity. Kommt es zu einer Interaktion dieser Hybridproteine miteinander, wird die Funktion des Transkriptionsfaktors rekonstituiert. If there is an interaction of these hybrid proteins to each other, the function of the transcription factor is reconstituted. Nachgeschaltete Reporter, deren Expression von diesem Transkriptionsfaktor abhängig ist, können dann aktiviert werden. Downstream reporter whose expression is dependent on this transcription factor can then be activated. Diese Transaktivierung der Reporter zeigt eine positive Interaktion der Hybridproteine an und erlaubt darüberhinaus eine Selektion über auxotrophe Marker, Enzymaktiviäten (z. B. β-Galaktosidase) oder optisch (z. B. durch Aktivierung von GFP). These transactivation of the reporter indicates a positive interaction of the hybrid proteins and moreover permits selection via auxotrophic markers Enzymaktiviäten (z. B. β-galactosidase) or optically (eg., By activation of GFP). In einer bevorzugten Ausführungsform werden hierbei die Reporterproteine unter Verwendung einer Kernlokalisierungssequenz, z. In a preferred embodiment, the reporter proteins in this case are obtained using a nuclear localization sequence, for example. B. die des SV40 T-Antigens PKKKRKV, in den Zellkern transportiert. As that of the SV40 T antigen PKKKRKV transported into the nucleus. Die Selektion kann alternativ auch durch die bereits oben beschriebenen Zellsortierungssysteme, bevorzugt durch FACS oder Wachstumsselektion, erfolgen. The selection can alternatively also by the methods described above cell sorting systems, preferably by FACS or growth selection.

Erfindungsgemäß können sich auch unterschiedliche Reportersysteme in den partikulären System befinden und die Sortierung auch unter Verwendung mehrerer Zellsortierungssysteme erfolgen. According to the invention, different reporter systems can be located in the particulate system and carried out the sorting and using multiple cell sorting systems.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren ein Verfahren, das nach Isolierung des Effektors als weiteren Schritt die Ermittlung der Effekt-auslösenden Einheit des isolierten Effektors umfasst, und darin besteht, dass der isolierte Effektor in kleinere Einheiten zerlegt wird und diese Einheiten jeweils auf Effektorwirkung hin untersucht werden. The present invention is further directed to a method comprising the further step of determining the effect triggering unit of the isolated effector after isolation of the effector, and consists in that the isolated effector is divided into smaller units and each of these units to go effector to be examined. Die kleineren Einheiten werden hierbei bevorzugt proteolytisch oder durch Festphasensynthese erzeugt. The smaller units are in this case preferably generates proteolytically or by solid phase synthesis.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren, das nach Isolierung des Effektors als weiteren Schritt zur Verbesserung oder Veränderung der Effektorwirkung die Modifikation des isolierten Effektors umfasst, wobei die Modifikation des Effektors beispielsweise durch Mutagenese erfolgen kann. The present invention further provides a process comprising the further step to improve or alter the effector comprises modification of the isolated effector after isolation of the effector, wherein the modification of the effector can be made for example by mutagenesis.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind die Verwendung eines Moleküls mit Effektorwirkung oder eines Teiles davon, erhältlich nach einem der oben beschriebenen Verfahren, zur Herstellung eines Medikaments oder Diagnostikums, sowie ein Medikament und ein Diagnostikum, das ein solches Molekül oder einen Teil davon umfaßt. Further objects of the invention are the use of a molecule with effector or a part thereof, obtainable by a process as described above for the preparation of a medicament or diagnostic, and a medicament and a diagnostic agent which comprises such a molecule or a portion thereof.

Claims (35)

  1. 1. Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von Komponenten, die an Bestandteile von partikulären Systemen binden und einen biologischen Effekt auslösen (Effektoren), folgende Schritte umfassend: 1. A process for the isolation and identification of components that bind to components of particulate systems and trigger a biological effect (effectors), comprising the steps of:
    • a) die partikulären Systeme werden einer Bibliothek von Komponenten ausgesetzt, denen individuell Nukleinsäuren zuordbar sind, a) the particulate systems are exposed to a library of components, which individually can be associated with nucleic acids,
    • b) der biologische Effekt in und/oder an den Effektor-beladenen partikulären Systemen wird genutzt, um mittels Zellsortierung und/oder durch Wachstumsselektion die Effektor-beladenen partikulären Systeme zu isolieren, b) the biological effect and / or to the effector-laden particulate systems is used to isolate the effector laden particulate systems using cell sorting and / or by selection for growth,
    • c) die Identität des Effektors wird durch Identifizierung der individuell zuordbaren Nukleinsäure oder eines Teiles davon ermittelt. c) the identity of the effector is determined by identifying the individually assignable nucleic acid or a part thereof.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) eine Bibliothek von unterschiedlichen Komponenten, die jeweils selbst Nukleinsäuren sind und/oder jeweils mindestens eine Nukleinsäure umfassen, zu einer Vorlage von partikulären Systemen hinzugegeben werden und die so erhaltene Mischung inkubiert wird. 2. The method according to claim 1, characterized in that in step (a), a library of different components, each of which itself nucleic acids and / or comprise at least one nucleic acid are added to a template of particulate systems and incubating the mixture thus obtained becomes.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Effektor-bindenden Bestandteil des partikulären Systems um ein Polypeptid, ein Kohlenhydrat, eine Nukleinsäure oder eine chemische Verbindung handelt oder dieser wenigstens eine der genannten Verbindungen umfaßt. 3. The method of claim 1 or 2, characterized in that it is in the effector binding component of the particulate system is a polypeptide, a carbohydrate, a nucleic acid or a chemical compound or this comprises at least one of said compounds.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Effektor-bindende Bestandteil des partikulären Systems ein homolog oder heterolog exprimierter Rezeptor ist, der durch Expression von natürlicherweise vorkommenden oder synthetisch hergestellten Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivaten erhältlich ist. 4. The method according to claim 3, characterized in that the effector binding component of the particulate system is a homologous or heterologous expressed receptor which is obtainable by expression of naturally occurring or synthetically produced nucleic acids or nucleic acid derivatives.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Rezeptor um einen Rezeptor aus der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren handelt. 5. The method according to claim 4, characterized in that it is the receptor is a receptor of the family of G-protein-coupled receptors.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Komponenten der Bibliothek um Nukleinsäuren, bevorzugt Ribonukleinsäuren oder Desoxyribonukleinsäuren, handelt oder die einzelnen Komponenten mindestens eine Nukleinsäure und eine andere Verbindung umfassen, wobei es sich bei der anderen Verbindung bevorzugt um ein Polypeptid, eine Nukleinsäure, ein Kohlenhydrat oder ein Lipid handelt. 6. The method of claim 1 to 5, characterized in that it is for the components of the library to nucleic acids, preferably ribonucleic acids or deoxyribonucleic acids, is or the individual components comprising at least one nucleic acid and another compound, which is preferably the other compound a polypeptide, nucleic acid, a carbohydrate or a lipid is.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponenten eine Nukleinsäure und ein Polypeptid enthalten, wobei die Nukleinsäure die genetische Information für das Polypeptid umfaßt. 7. The method according to claim 6, characterized in that the components comprise a nucleic acid and a polypeptide, wherein the nucleic acid comprises the genetic information for the polypeptide.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure direkt oder über ein Zwischenglied kovalent mit dem Polypeptid verknüpft ist. 8. The method according to claim 7, characterized in that the nucleic acid is linked directly or via an intermediate member covalently to the polypeptide.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Zwischenglied um Puromycin oder eine andere tRNA-homologe Verbindung handelt. 9. The method according to claim 8, characterized in that it is in the intermediate member to puromycin or other tRNA-homologous compound.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Polypeptid auf der Oberfläche eines Virus, bevorzugt eines Bakteriophagen, eines Bakteriums oder einer Hefezelle befindet. 10. A method according to claim 7, characterized in that the polypeptide on the surface of a virus, preferably a bacteriophage, a bacterium or a yeast cell is located.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a) die Komponenten der Bibliothek in die partikulären Systeme eingebracht werden, indem Nukleinsäuren, die für unterschiedliche Komponenten kodieren, ins Innere der partikulären Systeme eingebracht werden, und die Komponenten durch Transkription und/oder Translation der kodierenden Nukleinsäuren hergestellt werden. 11. The method according to claim 1, characterized in that in step (a) the components of the library can be introduced into the particulate systems by be introduced into the interior of the particulate systems nucleic acids which code for different components, and the components through transcription and / or translation of the coding nucleic acids can be produced.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Effektor-bindenden Bestandteil des partikulären Systems um ein Polypeptid, ein Kohlenhydrat, eine Nukleinsäure oder eine andere chemische Verbindung handelt oder dieser wenigstens eine der genannten Verbindungen umfaßt. 12. The method according to claim 11, characterized in that it is in the effector binding component of the particulate system is a polypeptide, a carbohydrate, a nucleic acid or other chemical compound or this comprises at least one of said compounds.
  13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Effektor-bindenden Bestandteil des partikulären Systems um ein Polypeptid handelt, das auch posttranslational modifiziert sein kann, wobei das Polypeptid bevorzugt durch Expression einer zuvor in die partikulären Systeme eingebrachten Nukleinsäure hergestellt wird. 13. The method according to claim 12, characterized in that it is a polypeptide is at the effector binding component of the particulate system, which can also be modified post-translationally, wherein the polypeptide is preferably produced by expression of a previously introduced into the particulate systems nucleic acid ,
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Komponenten um Nukleinsäuren oder Polypeptide handelt oder diese mindestens eine der genannten Verbindungen umfassen. 14. The method of claim 11 to 13, characterized in that it concerns the components are nucleic acids or polypeptides or comprise at least one of said compounds.
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestandteile der partikulären Systeme und die Komponenten Fusionsproteine sind, wobei die biologische Aktivität der Fusionsproteinanteile durch Bindung der Komponente an den Bestandteil des partikulären Systems wiederhergestellt wird. 15. The method according to claim 14, characterized in that the constituents of the particulate systems and the components are fusion proteins wherein the biological activity of the fusion protein moieties is restored by binding the component to the component of the particulate system.
  16. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Fusionsproteinanteilen um DNA-Bindungsdomäne und Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors handelt, so daß bei Bindung der Komponente an den Bestandteil der Transkriptionsfaktor rekonstituiert wird. 16. The method according to claim 15, characterized in that it is in the fusion protein moieties to DNA-binding domain and activation domain of a transcription factor, so that is reconstituted to the component of the transcription factor upon binding of the component.
  17. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sich ein Reportergen im partikulären System befindet, das durch den Transkriptionsfaktor aktiviert wird. 17. The method according to claim 16, characterized in that a reporter gene in the particulate system is located, which is activated by the transcription factor.
  18. 18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellsortierung durch Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren erfolgt oder die Zellsortierung mindestens diese Methode umfaßt. 18. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the cell sorting is by fluorescence activated cell sorting or cell sorting at least comprises this method.
  19. 19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Effektor-induzierten Reaktion um die Freisetzung eines sekundären Messengers oder um die Expression eines Reportergens handelt. 19. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that it is at the effector-induced reaction to the release of a secondary messenger or the expression of a reporter gene.
  20. 20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Effektor-induzierten Reaktion um eine Veränderung, Erhöhung oder Verminderung, der Gesamtmenge an Nukleinsäuren im partikulären System handelt. 20. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that it is at the effector-induced reaction to a change, increase or decrease, the total amount of nucleic acids in the particulate system.
  21. 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Nukleinsäuregehalt der partikulären Systeme durch Zugabe von Nukleinsäure- spezifischen Fluoreszenfarbzstoffen sichtbar gemacht wird. 21. The method according to claim 20, characterized in that the nucleic acid content of the particulate systems is visualized by addition of nucleic acid specific Fluoreszenfarbzstoffen.
  22. 22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Effektoren um Apoptose-auslösende Substanzen handelt. 22. The method according to claim 21, characterized in that it concerns with the effectors to apoptosis-inducing substances.
  23. 23. Verfahren nach Anspruch 20 zur Ermittlung von Effektoren mit G1-Phase- arretierender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht Effektor- beladenen partikulären Systeme nach Zugabe der Komponenten durch die Wirkung eines G2- oder M-Phase-spezifischen Inhibitors, bevorzugt Nocodazol, in einer Zellzyklus-Phase mit doppeltem DNA-Gehalt arretiert werden. 23. The method according to claim 20 for the determination of effectors with G1-phase LOCKING effect, characterized in that the non-effector laden particulate systems by addition of the components by the action of a G2 or M phase-specific inhibitor, preferably nocodazole, be locked in a cell cycle phase with double DNA content.
  24. 24. Verfahren nach Anspruch 20 zur Ermittlung von Effektoren mit G2- oder M- Phase-arretierender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht Effektor- beladenen partikulären Systeme nach Zugabe der Komponenten durch die Wirkung eines G1-Phase-spezifischen Inhibitors in einer Zellzyklus-Phase mit einfachem DNA-Gehalt arretiert werden. 24. The method according to claim 20 for the determination of effectors with G2 or M phase-LOCKING effect, characterized in that the non-effector laden particulate systems by addition of the components by the action of G1-phase-specific inhibitor in a cell cycle phase can be locked with a simple DNA content.
  25. 25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den partikulären Systemen um biologische Zellen, bevorzugt um einzellige prokaryotische oder eukaryotische Organismen oder um isolierte Zellen bzw. Zellverbände aus höheren eukaryotischen Organismen, um Viren, Liposomen, Vesikel oder um als Trägermaterial eingesetzte Feststoffe handelt oder die partikulären Systeme wenigstens eine der genannten Gruppen umfassen, wobei die partikulären Systeme auch gentechnisch, chemisch oder physikalisch verändert sein können. 25. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that it is in the particulate systems for biological cells, preferably unicellular prokaryotic or eukaryotic organisms or isolated cells or cell clusters from higher eukaryotic organisms to viruses, liposomes, vesicles or acts as a carrier material solids used or the particulate systems least one of said groups include wherein the particulate systems may also be genetically, chemically or physically modified.
  26. 26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den biologischen Zellen um Hefezellen, bevorzugt um solche der Art Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris oder Hansenula polymorpha, handelt. 26. The method according to claim 25, characterized in that it pombe in biological cells are yeast cells, preferably those of the species Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces, Pichia pastoris or Hansenula polymorpha, are.
  27. 27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifizierung der Nukleinsäure beziehungsweise eines Teiles davon gemäß Anspruch 1 (c) mit Hilfe einer Amplifikation, bevorzugt durch Polymerase- Kettenreaktion, erfolgt. 27. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the identification of the nucleic acid or part thereof according to claim 1 (c) using an amplification, preferably by polymerase chain reaction occurs.
  28. 28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Identität der Nukleinsäure durch Sequenzierung oder Hybridisierung des Amplifikats ermittelt wird. 28. The method according to claim 27, characterized in that the identity of the nucleic acid is determined by sequencing or hybridization of the amplified product.
  29. 29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es als zusätzliche Schritte zur Ermittlung der Effekt-auslösenden Einheit des isolierten Effektors die Zerlegung des Effektors in kleinere Einheiten sowie die Untersuchung der so erhaltenen Einheiten auf Effektorwirkung umfaßt. 29. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the decomposition of the effector comprising as additional steps for determining the effect of the isolated effector triggering unit in smaller units, as well as the investigation of the units so obtained effector.
  30. 30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es als zusätzlichen Schritt zur Verbesserung oder Veränderung der Effektorwirkung des isolierten Effektors die Modifikation des isolierten Effektors umfaßt. 30. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that it comprises as an additional step to improve or alter the effector of the isolated effector, the modification of the isolated effector.
  31. 31. Molekül mit Effektorwirkung, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche. 31 molecule with effector, obtainable by a process according to any one of the preceding claims.
  32. 32. Verwendung eines Moleküls nach Anspruch 31 oder eines Teiles davon zur Herstellung eines Diagnostikums. 32. Use of a molecule according to claim 31 or a part thereof for the manufacture of a diagnostic agent.
  33. 33. Verwendung eines Moleküls nach Anspruch 31 oder eines Teiles davon zur Herstellung eines Medikamentes. 33. Use of a molecule according to claim 31 or a part thereof, for the manufacture of a medicament.
  34. 34. Diagnostikum, enthaltend ein Molekül nach Anspruch 31 oder einen Teil davon. 34. A diagnostic agent comprising a molecule according to claim 31 or a part thereof.
  35. 35. Medikament, enthaltend ein Molekül nach Anspruch 31 oder einen Teil davon. 35. A medicament comprising a molecule according to claim 31 or a part thereof.
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