DE102015006187B4 - Cloning system and method for the identification of interaction partners in protein complexes - Google Patents

Cloning system and method for the identification of interaction partners in protein complexes Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Klonierungssystem und ein Verfahren zur Untersuchung von Interaktionen zwischen drei Proteinpartnern, mit denen zugleich ein schnelles Hochdurchsatz-Screening von cDNA-Banken möglich ist. Das Klonierungssystem besteht aus einem ersten Vektor und einem zweiten Vektor. Der erste Vektor enthält zwei Expressionskassetten: In die erste Expressionskassette wird die DNA eines ersten bekannten Proteins, gekoppelt an die Cub-Sequenz des Ubiquitins und an die DNA eines Transkriptionsfaktors für mindestens zwei Reportergene kloniert; In die zweite Expressionskassette wird die DNA eines zweiten bekannten Proteins, gekoppelt an die Nub-Sequenz des Ubiquitins kloniert. Der zweite Vektor enthält eine Expressionskassette, in welche die cDNA Bank oder die DNA eines dritten, auf die Interaktion mit den beiden bekannten Proteinen zu testenden dritten Proteins eingefügt werden kann. Die beiden Vektoren enthalten weitere Elemente, wie speziell ausgewählte Replikationsursprünge, Promotoren, Antibiotikaresistenz-Gene und Auxotrophie-Marker-Gene, die das Durchführen des Verfahrens, auch als Hochdurchsatz-Screening einer cDNA-Bank auf das Vorhandensein eines potentiellen Proteinpartners erlauben. Bei diesem Verfahren werden der erste Vektor in Hefezellen des ersten Paarungstyps und der zweite Vektor in Hefezellen des zweiten Paarungstyps übertragen, die Hefezellen beider Paarungstypen miteinander gepaart und auf einem speziellen Mangel-Medium selektioniert. Dabei wachsen auf dem Medium nur solche Hefe-Zellen, welche die DNA des ersten und des zweiten Proteins von dem ersten Vektor, sowie die DNA des dritten Proteins von dem zweiten Vektor exprimieren und das erste, das zweite und das dritte Protein synthetisieren können, wobei diese drei Proteine untereinander interagieren müssen.

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The invention relates to a cloning system and a method for investigating interactions between three protein partners, with which at the same time a fast high-throughput screening of cDNA libraries is possible. The cloning system consists of a first vector and a second vector. The first vector contains two expression cassettes: In the first expression cassette, the DNA of a first known protein coupled to the cubic sequence of the ubiquitin and to the DNA of a transcription factor for at least two reporter genes is cloned; Into the second expression cassette is cloned the DNA of a second known protein coupled to the nub sequence of the ubiquitin. The second vector contains an expression cassette into which the cDNA library or DNA of a third, to be tested for interaction with the two known proteins third protein can be inserted. The two vectors contain additional elements, such as specially selected origins of replication, promoters, antibiotic resistance genes and auxotrophic marker genes, which allow the method to be carried out, also as a high-throughput screening of a cDNA library for the presence of a potential protein partner. In this method, the first vector is transferred into yeast cells of the first mating type and the second vector is transferred into yeast cells of the second mating type, the yeast cells of both mating types mated to each other and selected on a special deficient medium. Only yeast cells which can express the DNA of the first and the second protein from the first vector as well as the DNA of the third protein from the second vector and can synthesize the first, the second and the third protein grow on the medium these three proteins have to interact with each other.
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Klonierungssystem und ein Verfahren zur Untersuchung von Interaktionen zwischen drei Proteinpartnern, das dazu geeignet ist, für bereits bekannte, miteinander interagierende Proteinpaare einen weiteren Interaktionspartner in einem Hochdurchsatz-Maßstab zu identifizieren.The present invention relates to a cloning system and a method for investigating interactions between three protein partners, which is suitable for identifying a further interaction partner in a high-throughput scale for already known interacting protein pairs.

Aus dem Stand der Technik ist das sog. Yeast Two Hybrid (Y2H)-Verfahren bekannt (1), das zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen verwendet werden kann. Dabei handelt es sich um ein Zwei-Komponenten-System, bei dem zwei potentielle Interaktionspartner (Bait und Prey) jeweils eine Komponente eines Reportersystems tragen. Das Reportersystem wird erst aktiviert, wenn sich das Bait-Protein und das Prey-Protein zu einem Komplex zusammenlagern. Beim Y2H-Verfahren werden an das Bait-Protein eine DNA-Bindedomäne und an das Prey-Protein eine Aktivator-Domäne gekoppelt. Bei der Bildung eines Komplexes zwischen den beiden zu untersuchenden Interaktionspartnern formen das Bait- und das Prey-Protein ein DNA-Aktivierungsprotein, das z.B. einem Transkriptionsfaktor entspricht. Dieser aktiviert die Transkription der Reporter-Gene. Das Verfahren hat den Nachteil, dass die Interaktion der zu untersuchenden Proteine im Zellkern der Hefe stattfinden muss, da der Transkriptionsfaktor an die DNA binden muss. Viele biochemische und strukturelle Prozesse im Zytoplasma einer Zelle werden somit erst gar nicht erfasst. Denn es ist gut möglich, dass sich Proteine im Milieu des Zellkerns ganz anders falten als am Ort ihres üblichen Vorkommens im Zytoplasma einer Zelle, oder dass durch die Verkürzung größerer Proteine beim Transport in den Zellkern wichtige Interaktionsdomänen verloren gehen oder maskiert werden. Dadurch kann es zu falschen Versuchsergebnissen kommen. Außerdem lassen sich bestimmte Proteine nicht in den Zellkern transportieren, wie beispielsweise Membranproteine.The so-called Yeast Two Hybrid (Y2H) method is known from the prior art (1), which can be used to detect protein-protein interactions. This is a two-component system in which two potential interaction partners (Bait and Prey) each carry a component of a reporter system. The reporter system is activated only when the bait protein and the prey protein aggregate into a complex. In the Y2H method, a DNA binding domain is coupled to the bait protein and an activator domain is linked to the prey protein. In forming a complex between the two interaction partners to be studied, the bait and the prey protein form a DNA activating protein, e.g. corresponds to a transcription factor. This activates the transcription of reporter genes. The method has the disadvantage that the interaction of the proteins to be examined must take place in the nucleus of the yeast, since the transcription factor must bind to the DNA. Many biochemical and structural processes in the cytoplasm of a cell are thus not detected at all. Because it is quite possible that proteins in the environment of the cell nucleus fold quite differently than at the place of their usual occurrence in the cytoplasm of a cell, or that by shortening larger proteins during transport into the nucleus important interaction domains are lost or masked. This can lead to incorrect test results. In addition, certain proteins can not be transported into the cell nucleus, such as membrane proteins.

Ein weiteres aus dem Stand der Technik bekanntes Verfahren zur Untersuchung von Proteinwechselwirkungen ist das sog. Split-Ubiquitin-System (SUS), mit dem es zum ersten Mal möglich war, nichtkernlokalisierte, wie z.B. membrangebundene Proteine, aber auch Transkriptionsfaktoren zu untersuchen (2). Bei diesem Verfahren wirkt der Komplex aus den aneinander gelagerten Bait- und Prey-Proteinen nicht selbst als Reporter, sondern er setzt einen Reporter frei, der räumlich unabhängig von den interagierenden Proteinen aktiv werden kann. Beim SUS-Verfahren werden zwei Hälften eines Ubiquitin-Moleküls (Nub und Cub) jeweils an das Bait- und das Prey-Proteine gekoppelt. Erst bei einer Interaktion zwischen den beiden zu untersuchenden Proteinen entsteht ein funktionelles Ubiquitin-Molekül, wodurch der entstandene Komplex von spezifischen Ubiquitin-Proteasen erkannt und gespalten wird. Dabei wird ein chimärer Transkriptionsfaktor (ProteinA-LexA-VP16) freigesetzt, der im Kern die Transkription der Reporter-Gene initiiert. Dieses System erlaubt das Studium von Proteininteraktionen, die im Zytoplasma bzw. an Endomembranen stattfinden. Ein Nachteil des SUS-Verfahrens besteht aber wiederum darin, dass die potentiellen Proteinpartner jeweils einzeln in die entsprechenden Vektoren kloniert und dann nacheinander in die Zielzelle eingeschleust werden müssen. Die Verwendung des Y2H-Verfahrens ist somit auf die Untersuchung weniger, bereits bekannter Proteinpaare auf ihre Interaktionsfähigkeit beschränkt.Another method known in the art for studying protein interactions is the so-called split ubiquitin (SUS) system, with which it was possible for the first time to obtain non-core localized, e.g. to study membrane-bound proteins as well as transcription factors (2). In this method, the complex of the juxtaposed bait and prey proteins does not act as reporters themselves, but releases a reporter that can become spatially independent of the interacting proteins. In the SUS method, two halves of a ubiquitin molecule (Nub and Cub) are coupled to the bait and the prey proteins, respectively. Only when an interaction between the two proteins to be investigated, a functional ubiquitin molecule is formed, whereby the resulting complex of specific ubiquitin proteases is recognized and cleaved. It releases a chimeric transcription factor (ProteinA-LexA-VP16), which in its core initiates transcription of reporter genes. This system allows the study of protein interactions that take place in the cytoplasm or endomembranes. However, a disadvantage of the SUS method is again that the potential protein partners must each be individually cloned into the corresponding vectors and then introduced one after the other into the target cell. The use of the Y2H method is thus limited to the investigation of less, already known protein pairs on their ability to interact.

Zwei aus dem Stand der Technik bekannte Weiterentwicklungen haben die SUS-Technik deutlich erweitert. 2004 erlaubte zum ersten Mal der sog. Mating Based Approach ein Hochdurchsatz-Screening von Proteinpaaren (3). Dieses Verfahren nützt ein bei Hefen natürlicherweise vorkommendes Paarungsverhalten: zwei haploide Hefezellen, die zu unterschiedlichen Paarungstypen gehören (MATa und MATalpha), können zu einer diploiden Zelle verschmelzen. Bei dem Mating Based Approach werden die an Nub-Sequenzen gekoppelten Bait-Proteine in die MATa-Zellen, die zu testenden Prey-Proteine, z.B. in Form einer cDNA Bank in die MATalpha-Zellen kloniert (1). Auf diese Weise ist es zum ersten Mal gelungen, viele potentielle Protein-Protein-Interaktionsparther vergleichsweise schnell zu screenen. Der Nachteil auch dieses Verfahrens besteht darin, dass es auf die Untersuchung von ausschließlich nur zwei Proteinpartnern beschränkt ist. Die Wechselwirkung von gerade mal zwei Proteinen ist allerdings nur ein Ausschnitt aus einem viel größeren Spektrum an Interaktionen in einer Zelle.Two further developments known from the prior art have significantly expanded the SUS technology. In 2004, the so-called Mating Based Approach allowed high-throughput screening of protein pairs for the first time (3). This method utilizes a naturally occurring mating behavior in yeast: two haploid yeast cells belonging to different mating types ( MATa and MATalpha ) can merge into a diploid cell. In the mating based approach, the bait proteins coupled to nub sequences are cloned into the MATa cells, and the prey proteins to be tested, for example in the form of a cDNA bank, are cloned into the MATalpha cells ( 1 ). In this way, it has been possible for the first time to screen many potential protein-protein interaction partners comparatively quickly. The disadvantage of this method is that it is limited to the study of only two protein partners. However, the interaction of just two proteins is only a part of a much wider range of interactions in a cell.

Eine andere Weiterentwicklung des SUS-Verfahrens erlaubt das Studium der Interaktion von drei Proteinen. Es ist die sog. Split-Ubiquitin-Bridge-Methode aus dem Jahr 2009 (4), nachfolgend auch SUS-Bridge Assay genannt.Another advancement of the SUS method allows the study of the interaction of three proteins. It is the so-called split-ubiquitin bridge method from the year 2009 (4), also called SUS-Bridge Assay below.

Kennzeichen des ursprünglichen SUS-Verfahrens ist, dass die DNA des Prey-Proteins an die DNA der Nub-Sequenz und die DNA des Bait-Proteins an die DNA der Cub-Sequenz des Ubiquitins gekoppelt ist, so dass nach Transkription zwei Fusionsproteine entstehen. Unterhalb der Cub-Sequenz ist zusätzlich die DNA-Sequenz eines chimären Transkriptionsfaktors gekoppelt. Nach einer Wiederherstellung des Ubiquitin-Moleküls durch die räumliche Annäherung von Nub- und Cub-Teilproteinen wird der entstandene Protein-Komplex von spezifischen Ubiquitin-Proteasen erkannt und der Transkriptionsfaktor unterhalb des rekonstituierten Ubiquitin freigesetzt, der im Kern die Transkription der Reporter-Gene initiiert.Characteristic of the original SUS procedure is that the DNA of the Prey protein is coupled to the DNA of the Nub sequence and the DNA of the Bait protein to the DNA of the Cub sequence of the ubiquitin, so that after transcription two fusion proteins arise. Below the cub sequence, the DNA sequence of a chimeric transcription factor is additionally coupled. After restoration of the ubiquitin molecule by the spatial approximation of Nub and Cub partial proteins, the resulting protein complex is recognized by specific ubiquitin proteases and the transcription factor is released below the reconstituted ubiquitin, which in its core initiates transcription of the reporter genes.

Beim SUS-Bridge Assay werden Bait und Prey allerdings so ausgewählt, dass diese für sich genommen nicht miteinander interagieren, sondern nur in Gegenwart eines mit Bait und Prey zusätzlich interagierenden dritten Proteins. Nur in diesem Fall können die Nub- und Cub-Teilproteine wieder in räumliche Nähe gebracht werden und das Wachstum auf Mangelmedium ermöglichen. Bei diesem Verfahren erfolgt die Aktivierung des Reportergens nur, wenn sich zwischen den zwei Interaktionspartnern Bait und Prey zusätzlich ein weiteres, drittes Protein (Bridge) anlagert und sie so zusammenbringt. Auf diese Weise war es zum ersten Mal möglich, die Interaktion zwischen drei potentiellen Protein-Partnern zu untersuchen. Bei dem Split-Ubiquitin-Bridge-Verfahren handelt es sich jedoch um einen Assay, mit dem nur wenige ausgewählte Proteine untersucht werden können, denn das Verfahren ist methodisch sehr aufwändig: die drei potentiellen Interaktionspartner müssten sequentiell, also hintereinander (als sequentielle Kotransformation) in die Hefezelle kloniert werden, was mit viel Arbeits- und Zeitaufwand verbunden ist. Ein Hochdurchsatz-Screening von vielen potentiellen Proteinpartnern, etwa das Studium einer kompletten cDNA-Bank ist damit nicht möglich. However, in the SUS-Bridge assay, Bait and Prey are chosen so that they do not interact with each other on their own, but only in the presence of a third protein interacting with Bait and Prey. Only in this case, the Nub and Cub partial proteins can be brought back into spatial proximity and allow growth on deficiency medium. In this method, the activation of the reporter gene takes place only if between the two interaction partners Bait and Prey additionally adds another, third protein (bridge) and brings them together. In this way, it was possible for the first time to study the interaction between three potential protein partners. However, the split-ubiquitin-bridge method is an assay with which only a few selected proteins can be investigated, since the method is very complicated in terms of method: the three potential interaction partners must be sequential, ie consecutively (as a sequential cotransformation) in the yeast cell are cloned, which is associated with much labor and time. A high-throughput screening of many potential protein partners, such as the study of a complete cDNA library is thus not possible.

Ein anderes Verfahren zur Detektion von Proteininteraktionen basiert ebenfalls auf der Komplementation eines Reporterproteins („Split-TEV“, (13)). Allerdings erlaubt dieses Verfahren nicht ein auf Mating zweier Hefestämme basierendes Einklonieren der cDNA Bank, und die Herstellung der Konstrukte erfolgt über klassisches und somit zeitintensiveres Klonieren und sequentielle Transformation.Another method of detecting protein interactions is also based on the complementation of a reporter protein ("Split-TEV", (13)). However, this method does not allow cloning of the cDNA library based on mating of two yeast strains, and the construction of the constructs is accomplished by classical and hence more time-consuming cloning and sequential transformation.

Mit allen bislang aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren ist es somit nicht möglich, eine Interaktion von mehr als zwei Proteinpartnern in einem Hochdurchsatz-Maßstab zu untersuchen. Das ist ein entscheidender Nachteil des Stands der Technik: da eukaryotische Zellen komplexe Stoffwechselwege aufweisen, bei denen häufig mehr als zwei Proteine miteinander wechselwirken, sind die bekannten Verfahren für eine systematische Untersuchung von Proteininteraktionen für viele biologische Fragestellungen ungeeignet.Thus, with all of the methods known to date in the art, it is not possible to study an interaction of more than two protein partners in a high-throughput scale. This is a major drawback of the prior art: since eukaryotic cells have complex metabolic pathways often involving more than two proteins interacting with each other, the known methods for systematic study of protein interactions are unsuitable for many biological issues.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Klonierungssystem und ein Verfahren zur Untersuchung von Interaktionen zwischen drei Proteinpartnern bereitzustellen, mit denen zugleich ein schnelles Hochdurchsatz-Screening von cDNA-Banken möglich ist. Das erfindungsgemäße Klonierungssystem und Verfahren sollen erstmals ein Hochdurchsatz-Screening etwa einer kompletten cDNA-Bank auf das Vorhandensein mindestens eines Proteins erlauben, das mit zwei bereits bekannten und vom Experimentator jeweils vorgegebenen Proteinen interagiert, somit eine Dreifachinteraktion eingeht.The object of the present invention is therefore to provide a cloning system and a method for the investigation of interactions between three protein partners, with which at the same time a fast high-throughput screening of cDNA libraries is possible. For the first time, the cloning system and method according to the invention are intended to permit a high-throughput screening of, for example, a complete cDNA library for the presence of at least one protein which interacts with two proteins already known and predetermined by the experimenter, thus entering into a triple interaction.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines neuartigen Klonierungssystems gelöst, das es erstmals erlaubt, sowohl Bait als auch Prey in einem einzigen Arbeitsgang in Hefe einzutransformieren: zum einen wird ein erster Vektor, ein sogenannter ,2in1' Vektor hergestellt, der sowohl ,bait-Cub-Fusion' als auch ,prey-Nub-Fusion' auf demselben Plasmid tragen kann (2); zum anderen wird ein zweiter Vektor, enthaltend die DNA des dritten, unbekannten Proteins, z.B. in Form einer cDNA-Bank, hergestellt.This object is achieved by the provision of a novel cloning system which for the first time allows both bait and prey to be transformed into yeast in a single operation: firstly, a first vector, a so-called '2in1' vector is prepared, both bait-Cub Fusion as well as prey-nub fusion on the same plasmid ( 2 ); on the other hand, a second vector containing the DNA of the third, unknown protein, for example in the form of a cDNA library, is produced.

Erfindungsgemäß wird der erste Vektor, enthaltend die DNA des ersten bekannten Proteins (Bait) und die DNA des zweiten bekannten Proteins (Prey), die nicht direkt miteinander interagieren können, in Hefezellen des ersten Paarungstyps, und der zweite Vektor, enthaltend die DNA des dritten, unbekannten Proteins, in Hefezellen des zweiten Paarungstyps übertragen, und die Hefezellen der beiden Paarungstypen werden anschließend zur Verschmelzung gebracht. Dabei ist die DNA des Prey-Proteins an die DNA der Nub-Sequenz und die DNA des Bait-Proteins an die DNA der Cub-Sequenz des Ubiquitins gekoppelt, so dass nach Transkription zwei Fusionsproteine entstehen. Unterhalb der Cub-Sequenz ist zusätzlich die DNA-Sequenz eines chimären Transkriptionsfaktors gekoppelt. Nach einer Wiederherstellung des Ubiquitin-Moleküls durch die räumliche Annährung von Nub- und Cub-Teilproteinen wird der entstandene Protein-Komplex von spezifischen Ubiquitin-Proteasen erkannt und der Transkriptionsfaktor unterhalb des rekonstituierten Ubiquitin freigesetzt, der im Kern die Transkription der Reporter-Gene initiiert.According to the invention, the first vector containing the DNA of the first known protein (Bait) and the DNA of the second known protein (Prey) which can not interact directly with each other, in yeast cells of the first mating type, and the second vector containing the DNA of the third , unknown protein, into yeast cells of the second mating type, and the yeast cells of the two mating types are subsequently fused. In this case, the DNA of the Prey protein is coupled to the DNA of the Nub sequence and the DNA of the Bait protein to the DNA of the Cub sequence of the ubiquitin, so that arise after transcription of two fusion proteins. Below the cub sequence, the DNA sequence of a chimeric transcription factor is additionally coupled. Upon restoration of the ubiquitin molecule by the spatial proximity of partial Nub and Cub proteins, the resulting protein complex is recognized by specific ubiquitin proteases and the transcription factor released below the reconstituted ubiquitin, which in its core initiates transcription of the reporter genes.

Der erste Vektor enthält im Einzelnen mindestens folgende Elemente (2): einen ersten Promotor; die DNA eines ersten bekannten Proteins, gekoppelt an eine Chimäre aus C-terminaler Sequenz (Cub) des Ubiquitins und an die DNA eines Transkriptionsfaktors; einen zweiten Promotor; die DNA eines zweiten bekannten Proteins, gekoppelt an die N-terminale Sequenz (Nub) des Ubiquitins; ein erstes Auxotrophie-Marker-Gen; einen ersten Replikationsursprung aus E. coli; einen ersten Replikationsursprung aus S. cerevisiae; ein erstes Antibiotikaresistanz-Gen.The first vector contains in detail at least the following elements ( 2 ): a first promoter; the DNA of a first known protein coupled to a chimera of the ubiquitin C-terminal sequence (Cub) and to the DNA of a transcription factor; a second promoter; the DNA of a second known protein coupled to the N-terminal sequence (Nub) of ubiquitin; a first auxotrophic marker gene; a first origin of replication from E. coli; a first origin of replication from S. cerevisiae; a first antibiotic resistance gene.

Der zweite Vektor enthält im Einzelnen mindestens folgende Elemente (2): einen dritten Promotor; die DNA des dritten, unbekannten Proteins; ein zweites Auxotrophie-Marker-Gen; einen zweiten Replikationsursprung aus E. coli; einen zweiten Replikationsursprung aus S. cerevisiae; ein zweites Antibiotikaresistanz-Gen.The second vector contains in detail at least the following elements ( 2 ): a third promoter; the DNA of the third, unknown protein; a second auxotrophic marker gene; a second origin of replication from E. coli; a second origin of replication from S. cerevisiae; a second antibiotic resistance gene.

Das erfindurigsgemäße Verfahren zur Untersuchung von Interaktionen zwischen drei Proteinpartnern besteht aus folgenden Schritten:

  • Übertragung des ersten Vektors in Hefezellen des ersten Paarungstyps;
  • Übertragung des zweiten Vektors in Hefezellen des zweiten Paarungstyps;
  • Paarung der Hefezellen des ersten und des zweiten Paarungstyps;
The inventive method for the investigation of interactions between three protein partners consists of the following steps:
  • Transfer of the first vector into yeast cells of the first mating type;
  • Transfer of the second vector into yeast cells of the second mating type;
  • Mating the yeast cells of the first and second mating type;

Übertragung der Hefezellen auf ein Mangelmedium, welches auf Vorhandensein beider Vektoren sowie Reportergen-Aktivität (welche eine Interaktion der drei zu untersuchenden Proteine bedeutet) selektiert.Transferring the yeast cells to a deficient medium which selects for the presence of both vectors as well as reporter gene activity (which means an interaction of the three proteins to be examined).

Nach einer Übertragung des ersten Vektors in Hefezellen des ersten Paarungstyps, einer Übertragung des zweiten Vektors in Hefezellen des zweiten Paarungstyps, und einer anschließenden Verschmelzung der Hefezellen beider Paarungstypen überleben nur solche Zellen auf einem Mangel-Medium für den ersten und den zweiten Auxotrophie-Marker und können somit selektioniert werden, die das erste und das zweite Protein auf dem ersten Vektor, sowie das dritte Protein auf dem zweiten Vektor exprimieren, und diese drei Proteine untereinander interagieren.After transfer of the first vector into yeast cells of the first mating type, transfer of the second vector into yeast cells of the second mating type, and subsequent fusion of the yeast cells of both mating types, only cells survive on a deficient medium for the first and second auxotrophic markers and Thus, it is possible to select those which express the first and the second protein on the first vector as well as the third protein on the second vector, and these three proteins interact with one another.

Dadurch, dass die beiden bekannten Proteine erfindungsgemäß auf nur einem Vektor kodiert sind, wird nur ein Auxotrophie-Marker bzw. nur einer der beiden Hefestämme (z.B. THY.AP4, 1) für die Expression beider Fusionsproteine (,bait-Cub-Fusion' und ,prey-Nub-Füsion') benötigt. Der zweite Marker kann somit für das Einklonieren der cDNA-Bank für den zu untersuchenden unbekannten dritten Proteinpartner verwendet werden.Because the two known proteins are encoded according to the invention on only one vector, only one auxotrophy marker or only one of the two yeast strains (eg THY.AP4 . 1 ) for expression of both fusion proteins ('bait-cub fusion' and 'prey-nub-infection'). The second marker can thus be used for the cloning of the cDNA library for the unknown third protein partner to be investigated.

Für den ersten Vektor, der die DNA des ersten und des zweiten bekannten Proteins enthält, wird bevorzugt ein low-copy Hefe-Replikationsursprung verwendet, wie beispielsweise CEN4/ARS1.For the first vector containing the DNA of the first and second known proteins, a low copy yeast origin of replication is preferably used, such as CEN4 / ARS1.

Als erster Promotor wird ein regulierbarer, insbesondere ein reprimierbarer Promotor verwendet. Besonders bevorzugt wird der Methionin-reprimierbare met25 Promotor verwendet.The first promoter used is a regulatable, in particular a repressible, promoter. Most preferably, the methionine-repressible met25 promoter is used.

Als zweiter Promotor wird insbesondere ein konstitutiv exprimierender und / oder ein regulierbarer Promotor verwendet. Insbesondere kommen dafür starke Promotoren in Frage, wie beispielsweise der TDH3- (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3) oder PMA1-Promotor (Plasma Membrane ATPase).As a second promoter in particular a constitutively expressing and / or a regulatable promoter is used. In particular, strong promoters come into question, such as the TDH3 - (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3) or PMA1 Promoter (plasma membrane ATPase).

Für den zweiten Vektor, der die DNA des dritten, unbekannten Proteins enthält, wird bevorzugt ein high-copy Hefe-Replikationsursprung verwendet, wie beispielsweise 2µ-Ori, der eine hohe Kopienzahl des Plasmids zur Folge hat und damit indirekt auch die Expression verstärkt.For the second vector containing the DNA of the third, unknown protein, a high-copy yeast origin of replication is preferably used, such as 2μ Ori, which results in a high copy number of the plasmid and thus indirectly also enhances expression.

Der zweite Vektor enthält einen dritten, starken konstitutiv exprimierenden Promotor, wie PMA1-, TDH3- oder ADH-Promotor.The second vector contains a third, strong constitutively expressing promoter, such as PMA1 - TDH3 - or ADH Promoter.

Die beiden im Verfahren verwendeten Vektoren enthalten Gene, die jeweils unterschiedliche Antibiotika-Resistenzen (z.B. Ampicillin und Spectinomycin) vermitteln, was eine einfache Trennung der Transformanten ermöglicht.The two vectors used in the method contain genes that each confer different antibiotic resistances (e.g., ampicillin and spectinomycin), allowing for easy separation of the transformants.

Außerdem enthalten die beiden erfindungsgemäßen Vektoren Gene, die jeweils für unterschiedliche Auxotrophie-Marker kodieren, z.B. für Leucin- oder für Tryptophan-Auxotrophie (2).In addition, the two vectors according to the invention contain genes which in each case code for different auxotrophic markers, eg for leucine or for tryptophan auxotrophy ( 2 ).

Die DNA des dritten, unbekannten Proteins, kann z.B. als ein gezielt ausgewähltes Gen oder in Form einer cDNA Bank in den Expressionsvektor kloniert werden. Die Expression der Reporter-Gene bei einer Wiederherstellung des Ubiquitin-Moleküls führt dann dazu, dass nur Klone auf einem Selektionsmedium, z.B. Mangelmedium, wachsen, welche alle drei miteinander interagierenden Proteine exprimieren. Diese Klone können dann isoliert und die in ihnen exprimierten Gene identifiziert werden. The DNA of the third, unknown protein may e.g. be cloned as a specifically selected gene or in the form of a cDNA library in the expression vector. Expression of the reporter genes upon restoration of the ubiquitin molecule then results in only clones on a selection medium, e.g. Deficiency medium, grow, which express all three interacting proteins. These clones can then be isolated and the genes expressed in them identified.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht gegenüber dem Stand der Technik die entscheidende Prozessbeschleunigung für ein Hochdurchsatz-Screening, bei dem erstmals eine komplette cDNA Bank auf die Anwesenheit eines potentiellen dritten Interaktionspartners untersucht werden kann, der mit zwei bereits bekannten, für sich genommen wechselwirkenden Proteinen, interagiert. Da das Screening über den Einsatz der.Mating based-Prozedur im Hochdurchsatz durchgeführt werden kann, weist das erfindungsgemäße Verfahren eine zehn bis hundertfach höhere Effizienz auf, im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren. Auf einen etwaigen industriellen Maßstab bezogen ist ebenfalls ein großer Vorteil, dass jede cDNA-Bank, einmal im entsprechenden Expressionsvektor und in Hefe kloniert, bei - 80°C einige Jahre lang aufbewahrt und für jedes beliebige Screening wiederverwendet werden kann. Lediglich Bait und Prey müssten im ersten Vektor ausgetauscht werden.Compared with the prior art, the method according to the invention enables the decisive process acceleration for a high-throughput screening, in which for the first time a complete cDNA library can be examined for the presence of a potential third interaction partner which interacts with two already known, interacting proteins in their own right. Since the screening can be carried out by high-throughput use of the mating-based procedure, the method according to the invention has a ten to one hundred times higher efficiency compared to the methods known from the prior art. Relative to any industrial scale, there is also a great advantage that each cDNA library, once cloned in the appropriate expression vector and in yeast, can be stored at -80 ° C for several years and reused for any screening. Only bait and Prey would have to be exchanged in the first vector.

Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand der unten beschriebenen Ausführungsbeispiele mit Bezug auf die Figuren beschrieben.Further advantages, features and applications of the invention will be described below with reference to the embodiments described below with reference to the figures.

1: Schematische Darstellung der Hefestämme, die als Beispiel für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. (A) THY.AP4, vom mating Typ ,alpha‘ wird auch als ,bait-strain‘ bezeichnet und trägt die Reportergene (ADE2, HIS3 und lacZ) unter der Kontrolle des lexA Promotors. Der Stamm ist auxotroph gegenüber Tryptophan, Leucin, Uracil, Histidin und Adenin. (B) Der Hefestamm THY.AP5, auch als ,prey-strain‘ bekannt, wird im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, um die cDNA Bank zu tragen. Dieser Stamm trägt die gleichen Auxotrophien wie THY.AP4 mit einer Ausnahme: er ist prototroph gegenüber Uracil, was eine Gegenselektion gegenüber THY.AP4 ermöglicht. 1 : Schematic representation of the yeast strains used as an example of the method according to the invention. (A) THY.AP4 , mating type, alpha 'is also called' bait-strain 'and carries the reporter genes ( ADE2 . HIS3 and lacZ) under the control of the lexA promoter. The strain is auxotrophic towards tryptophan, leucine, uracil, histidine and adenine. (B) The yeast strain THY.AP5 . also known as prey-strain, is used in the method of the invention to carry the cDNA library. This strain carries the same auxotrophies as THY.AP4 with one exception: he is prototrophic towards uracil, which is a counter-selection THY.AP4 allows.

2: Vektorkarten der Plasmide, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Einmal vorgestellt sind zwei ,2in1' Vektoren. Die beiden ,2in1' Vektoren tragen das Ampicillin-Resistenzgen und den pMB1 Replikationsursprung für Selektion und Wachstum in E. coli sowie die Leucin-Expressionskassette und eine sogenannte Centromer/Autosomale Replikations-Sequenz (Cen4/ARS1) für die Anzucht in Saccharomyces cerevisiae. Die beiden Expressionskassetten stehen entweder unter der Kontrolle des Methionin-reprimierbaren met25 Promotors (im Falle der C-terminalen Cub-PLV Fusionen) oder unter der des starken und konstitutiven tdh3 Promotors (im Falle der N-terminalen NubG-HA Fusionen [(A), pSUSr-2in1] bzw. der C-terminalen NubA-HA Fusionen [(B), pSUSr2-2in1]). Weiterhin vorgestellt ist ein Expressionsvektor, welcher die cDNA Bank für potentielle Interaktionspartner trägt. Dieser wird mittels Spectinomycin in Bakterien bzw. Tryptophanmangel [(C), pYOX2-Dest] in Hefe selektiert und über ,high-copy‘ Replikationsursprünge pMB1 (E.coli) bzw. 2µ (S. cerevisiae) vervielfältigt. Die Gateway Kassette des Expressionsvektors steht unter Kontrolle des starken, konstitutiven Hefe pma1 Promotors. 2 : Vector maps of the plasmids used for the method according to the invention. Once presented are two, 2in1 'vectors. The two, 2in1 'vectors carry the ampicillin resistance gene and the pMB1 Origin of replication for selection and growth in E. coli and the leucine expression cassette and a so-called centromer / autosomal replication sequence (Cen4 / ARS1) for growth in Saccharomyces cerevisiae. The two expression cassettes are either under the control of the methionine-repressible met25 promoter (in the case of the C-terminal Cub-PLV fusions) or below that of the strong and constitutive TDH3 Promotors (in the case of the N-terminal NubG-HA fusions [(A), pSUSr-2in1] or the C-terminal NubA-HA fusions [(B), pSUSr2-2in1]). Also presented is an expression vector carrying the cDNA library for potential interaction partners. This is by spectinomycin in bacteria or tryptophan deficiency [(C), pYOX2 Dest ] in yeast and via 'high-copy' replication origins pMB1 (E.coli) or 2μ (S. cerevisiae) reproduced. The Gateway cassette of the expression vector is under the control of the strong, constitutive yeast pma1 Promoter.

3: Schematische Darstellung für eine beispielhafte Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Es wird nach einem Interaktionspartner der membranlokalisierten Rezeptorkinasen BRI1 und BAK1 gesucht. Dazu werden BRI1 und BAK1 jeweils C-terminal mit NubA bzw. Cub-PLV getaggt und in Vektor pSUSr2-2in1 kloniert. Eine Interaktion der beiden Proteine in Hefe ist nur möglich durch Zusatz bestimmter Protein-Cofaktoren, die aus der cDNA Bank, die auf dem Vektor pYOX2-Dest kloniert ist, rekrutiert werden müssen. Die unbekannten Cofaktoren können extra- oder intrazellulärer Natur (Doppelpfeil mit Fragezeichen) sein. Sobald die Interaktion zwischen BAK1 und BRI1 überbrückt wird, re-assoziiert ein funktionales Ubiquitin Molekül, welches von Proteasen erkannt wird, die dann wiederum den Transkriptionsfaktor PLV abspalten, welcher im Kern die Reportergene aktiviert und die Hefe prototroph für Adenin und Histidin macht und so ihre Selektion auf dem entsprechenden Mangelmedium ermöglicht. 3 : Schematic representation of an exemplary embodiment of the method according to the invention. It becomes an interaction partner of the membrane-localized receptor kinases BRI1 and BAK1 searched. To do this BRI1 and BAK1 each C-terminally tagged with NubA or Cub-PLV and in vector pSUSr2-2in1 cloned. An interaction of the two proteins in yeast is only possible by adding certain protein cofactors, which are derived from the cDNA library located on the vector pYOX2 Dest is cloned, must be recruited. The unknown cofactors may be extra- or intracellular in nature (double-headed question mark). Once the interaction between BAK1 and BRI1 bridged, re-associates a functional ubiquitin molecule, which is recognized by proteases, which in turn cleave the transcription factor PLV, which activates the reporter genes in the nucleus and makes the yeast prototrophic for adenine and histidine and thus allows their selection on the appropriate deficiency medium.

AusführüngsbeispieleAusführüngsbeispiele

Herstellung des ersten Vektors, enthaltend die DNA des ersten und des zweiten bekannten ProteinsPreparation of the first vector containing the DNA of the first and the second known protein

Für die erfolgreiche Herstellung eines solchen ,2in1' Vektors musste lange Zeit mit unterschiedlichen Promotoren für die beiden Expressionskassetten bzw. dem Replikationsursprung (,Ori‘) in Hefe experimentiert werden. Die Verwendung eines 2µ high copy Ori sorgte für eine zu hohe Kopienzahl des Plasmids und daraus resultierend, eine zu starke Expression der Cub-Fusion, was den Verlust der Regulierbarkeit des met25 (Methionin-repremierbaren) Promotors zur Folge hatte. Der so überexprimierte Cub-PLV Transkriptionsfaktor bzw. dessen partielle Degradierung löste Hintergrundwachstum selbst in Abwesenheit der Nub-Fusion aus. Es konnte also nur ein low-copy ars/cen Ori zum Einsatz kommen in einem möglichen ,2in1' Vektor. Auch hier traten Probleme auf, da nun, trotz Verwendung des klassischen Alkoholdehydrogenase (adh) Promotors, der konstitutiv angeschaltet ist, zu wenig Nub-Fusion exprimiert wurde und selbst bei Positivkontrollen keine Interaktion gezeigt werden konnte. Zahlreiche weitere Promotoren konnten das Problem nicht lösen. Erst der tdh3 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3) Promotor, der etwa zehn- bis hundertmal stärker konstitutiv exprimiert als der adh Promotor, löste das Problem, so dass jetzt zuverlässig zwei interagierende Proteine auf demselben Plasmid exprimiert und getestet werden können.For the successful production of such a 2in1 vector it was necessary to experiment for a long time with different promoters for the two expression cassettes or the origin of replication ('Ori') in yeast. The use of a 2μ high copy Ori caused too high a copy number of the plasmid and, as a result, too much expression of the Cub fusion, which resulted in the loss of the regulatability of the met25 (methionine repremeable) promoter. The overexpressed Cub-PLV transcription factor or its partial degradation triggered background growth even in the absence of Nub fusion. So it could only be a low-copy ars / cen Ori used in a possible, 2in1 'vector. Here, too, problems arose since, despite the use of the classical alcohol dehydrogenase (adh) promoter, which is constitutively switched on, too little Nub fusion was expressed and even in positive controls no interaction could be shown. Many other promoters could not solve the problem. First the TDH3 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3) promoter which expresses about ten to one hundred times more constitutively expressed as the adh promoter, solved the problem, so that now reliably two interacting proteins can be expressed and tested on the same plasmid.

Herstellung des zweiten Vektors, enthaltend die DNA des dritten, unbekannten ProteinsPreparation of the second vector containing the DNA of the third, unknown protein

Auch der weitere Vektor pYOX2-Dest (2) wurde in der vorliegenden Erfindung neu und speziell für das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt. Dieser ist für die Klonierung der cDNA Bank oder eines möglichen weiteren Gens konzipiert.Also the other vector pYOX2 Dest ( 2 ) was prepared in the present invention new and specifically for the inventive method. This is designed for the cloning of the cDNA library or another possible gene.

Ein high-copy Ori ermöglicht eine starke Expression, zusammen mit dem verwendeten pma1 (Plasmamembran ATPase-) Promotor, der konstitutiv in Hefe angeschaltet ist, ermöglichen eine starke Expression. Ein anderes Resistenzgen, welches Resistenz gegenüber Spectinomycin anstelle von Ampicillin im ,2in1' Vektor überträgt, ermöglicht die einfache Trennung von ,2in1' Plasmid und cDNA Bank, falls DNA aus Hefekolonien nach einem Screen in E. coli amplifiziert werden sollen. Unterschiedliche Resistenzen ermöglichen einfache Trennung der Plasmide, da Bakterien normalerweise nur Plasmide amplifizieren, deren Behalten einen Selektionsvorteil mit sich bringt - in diesem Fall also das Wachstum in Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum-Zusatz. Die Verwendung des Phosphoribosylanthranilat isomerase Gens (TRP1) als Auxotrophie-Marker (Tryptophan-Selektion) ermöglicht die Verwendung des THY.AP5 (1) Hefestammes, also den auf mating basierenden Ansatz.A high-copy Ori allows strong expression, along with the used pma1 (Plasma membrane ATPase) promoter, which is constitutively turned on in yeast, allow strong expression. Another resistance gene which confers resistance to spectinomycin instead of ampicillin in the '2in1' vector allows for easy separation of '2in1' plasmid and cDNA library if DNA from yeast colonies is to be screened in E. coli. Different resistances allow easy separation of the plasmids, since bacteria normally amplify only plasmids, the retention of which brings a selection advantage with it - in this case the growth in medium with the appropriate antibiotic additive. The use of the phosphoribosylanthranilate isomerase gene ( TRP1 ) as an auxotrophy marker (tryptophan selection) allows use of THY.AP5 ( 1 ) Yeast strain, so the mating based approach.

Untersuchung von Interaktion zwischen Rezeptorkinasen BRI1 und BAK1 in A. thaliana mittels des erfindunasaemäßen VerfahrensInvestigation of the interaction between receptor kinases BRI1 and BAK1 in A. thaliana by means of the method according to the invention

In Arabidopsis thaliana gibt es eine Klasse von membranständigen Rezeptorkinasen, welche eine Vielzahl von extrazellulären Stimuli in intrazelluläre Signale umwandeln. Zu dieser Klasse von Leucin-reichen Rezeptorkinasen zählen auch die Hormonrezeptoren Brassinosteroid-insensitive 1 (BRI1) und deren Interaktionspartner BRI1 associated kinase 1 (BAK1). Brassinosteroide (BRs) sind als eigene Klasse von Phytohormonen an grundlegenden Entwicklungsprozessen wie der Blatt- und Wurzelentwicklung, der Xylem-Ausdifferenzierung und der Blühinduktion beteiligt (7, 12). Ihre Perzeption findet im Apoplasten durch die ,Leucine-Rich-Repeat Receptor-like kinase‘ (LRR-RLK) BRI1 und deren Interaktionspartner BAK1 statt.In Arabidopsis thaliana, there is a class of membranous receptor kinases that convert a variety of extracellular stimuli into intracellular signals. This class of leucine-rich receptor kinases also includes the hormone receptors brassinosteroid-insensitive 1 ( BRI1 ) and their interaction partners BRI1 associated kinase 1 ( BAK1 ). Brassinosteroids (BRs) are involved as a distinct class of phytohormones in fundamental developmental processes such as leaf and root development, xylem differentiation and flower induction ( 7 . twelve ). Their perception takes place in the apoplast by the 'Leucine-Rich-Repeat Receptor-like kinase' (LRR-RLK) BRI1 and their interaction partners BAK1 instead of.

Während Signaltransduktion und Transkriptregulierung im Zellinnern recht gut verstanden sind, gibt es widersprüchliche Ergebnisse zu den Vorgängen im Apoplasten. Nach einer ursprünglichen Hypothese liegt BRI1 im inaktiven Zustand als Homodimer vor (10). Hierbei wird die intrazelluläre Domäne von BRI1 durch den negativen Regulator BKI1 gebunden, der die Kinaseaktivität von BRI1 inhibiert (11). BR Perzeption führt dann zu einer Konformationsänderung, die eine Transphosphorylierung des Inhibitors sowie dessen Dissoziation zur Folge hat (9). Daran schließt sich die Rekrutierung von BAK1 an, was wiederum die Signaltransduktionskaskade auslöst.While signal transduction and transcript regulation are well understood inside the cell, there are conflicting results on the processes in the apoplast. According to an original hypothesis BRI1 in inactive state as homodimer before ( 10 ). Here, the intracellular domain of BRI1 through the negative regulator BKI1 bound to the kinase activity of BRI1 inhibits ( 11 ). BR perception then leads to a conformational change, which results in transphosphorylation of the inhibitor and its dissociation ( 9 ). This is followed by the recruitment of BAK1 which triggers the signal transduction cascade.

Eine kürzlich veröffentlichte Arbeit zeigte allerdings mittels FLIM-Studien in Wurzelepidermiszellen von Arabidopsis, dass trotz Zugabe von BR-Biosyntheseinhibitoren präformierte BRI1/-BAK1 Heterodimere in der Plasmamembran vorkommen (8). In den Versuchen konnte auch gezeigt werden, dass trotz BR-Gabe nur ein geringer Anteil der BRI1 Population (ca. 10%) mit BAK1 heterodimerisiert, dies aber ausreicht, um alle BR-regulierten Prozesse auszuführen.However, a recently published study using FLIM studies in Arabidopsis root epidermal cells demonstrated that preformed despite the addition of BR biosynthesis inhibitors BRI1 / - BAK1 Heterodimers occur in the plasma membrane ( 8th ). In the experiments could also be shown that despite BR gift only a small proportion of BRI1 Population (about 10%) with BAK1 heterodimerized, but sufficient to perform all BR-regulated processes.

Da in den Arbeiten unterschiedliche Methoden und Expressionssysteme zum Einsatz kamen, stellt sich die Frage, ob die Diskrepanz der Ergebnisse zur Rezeptor-Heterodimerisierung dadurch erklärt werden kann, dass dabei weitere, bislang unentdeckte Proteine eine entscheidende Rolle spielen.Since different methods and expression systems were used in the work, the question arises as to whether the discrepancy between the results and the receptor heterodimerization can be explained by the fact that further, hitherto undiscovered proteins play a decisive role.

Wir haben festgestellt, dass im klassischen Split-Ubiquitin System die Interaktion der beiden Rezeptoren nur sehr schwach ist, bei Expressionsreduzierung durch Methioningabe vollständig verschwindet. Daher vermuten wir, dass es noch andere Interaktionspartner in Pflanzenzellen geben muss, die in der Hefe fehlen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es nun erstmals überhaupt, solche bislang unbekannten Interaktionspartner zu identifizieren, welche die BRI1/BAK1 Interaktion in Hefe stabilisieren (3).We have found that in the classical split-ubiquitin system, the interaction of the two receptors is very weak, disappears completely in the expression reduction by methionine. Therefore, we suspect that there must be other interaction partners in plant cells that are missing from the yeast. The method according to the invention makes it possible for the first time ever to identify those hitherto unknown interaction partners which stabilize the BRI1 / BAK1 interaction in yeast ( 3 ).

Dazu werden zunächst die neuen Vektoren mit den entsprechenden Konstrukten rekombiniert (5). Das ist einmal der ,2in1' Vektor ,pSUSr2-2in1' (2) mit BAK1 und BRI1. Weiterhin ist es der Hefe-Expressionsvektor ,pYOX2-Dest‘ (2) mit einer aus Arabidopsis Wurzeln gewonnenen cDNA Bank (die Rekombinierung der cDNA Bank erfolgt wie beschrieben im „CloneMiner Kit“ der Firma Life Technologies). BAK1/BRI1 im ,2in1' Vektor wird dann in den Hefestamm THY.AP4 und die cDNA Bank im Expressionsvektor in den Hefestamm THY.AP5 transformiert (3, 1). Die Transformation der Hefe wird im Fall des ,2in1' BAK1/BRI1-Konstruktes im Kleinmaßstab, die der cDNA Bank im Großmaßstab, beides wie in (6) beschrieben, durchgeführt.For this, the new vectors are first recombined with the corresponding constructs ( 5 ). That's the 2in1 vector, pSUSr2-2in1 '( 2 ) With BAK1 and BRI1 , Furthermore, it is the yeast expression vector, pYOX2 Dest '( 2 ) with a cDNA library obtained from Arabidopsis roots (the recombination of the cDNA library is carried out as described in the "CloneMiner Kit" from Life Technologies). BAK1 / BRI1 in the, 2in1 'vector is then added to the yeast strain THY.AP4 and the cDNA library in the expression vector in the yeast strain THY.AP5 transformed ( 3 . 1 ). The transformation of the yeast is in the case of the, 2in1 'BAK1 / BRI1 construct on a small scale, the large scale cDNA library, both as in ( 6 ).

Nach drei Tagen werden die auf Selektionsmedium angezogenen Hefen wie folgt behandelt. 5-10 Kolonien des BAK1/BRl1-Konstruktes werden in 50ml Selektionsmedium (Leucin-Selektion) überführt und über Nacht bei 30°C zu einer optischen Dichte von 10^8 angezogen (ca. 14h). Die Hefen werden dann in einem finalen Volumen von 1ml Vollmedium (YPD) gesammelt. Bei der auf mehreren Selektionsplatten angezogenen cDNA Bank werden alle Kolonien mit Selektionsmedium (Tryptophan-Selektion) heruntergewaschen und in 10ml Finalvolumen gesammelt. Die OD sollte die gleiche Dichte haben, wie die OD des ,2in1' Konstruktes. Je 1ml des ,2in1' bait Konstruktes und 1ml der cDNA Bank werden in YPD bei pH 4,5 für 2 Stunden und bei 30° unter leichter Rotation (35rpm) inkubiert. Im Anschluss wird das gesamte Volumen auf mehreren YPD Platten pH 5,5 ausgestrichen und für 5 Stunden bei 30°C inkubiert. Danach wird mittels eines Gesamtvolumens von 15ml sterilem Wasser die gesamte Hefe von den YPD Platten heruntergespült und durch Zentrifugation und Resuspendierung in 5ml Volumen aufgenommen. Je 100µl Hefe-Suspension werden auf Selektionsmedium (kein Tryptophan, Leucin, Uracil, Adenin und Histidin) ausplattiert und 3 Tage bei 30°C inkubiert. Einzelkolonien werden nach 3 Tagen auf neue Selektionsplatten überführt und im Falle ihres Wachstums per Colony PCR und Sequenzierung des PCR Produktes analysiert.After three days, the yeasts grown on selection medium are treated as follows. 5-10 colonies of the BAK1 / BRl1 construct are transferred to 50 ml of selection medium (leucine selection) and grown overnight at 30 ° C. to an optical density of 10 8 (ca. 14 h). The yeasts are then collected in a final volume of 1 ml of complete medium (YPD). In the case of the cDNA library grown on several selection plates, all colonies are washed off with selection medium (tryptophan selection) and collected in 10 ml final volume. The OD should have the same density as the OD of the 2in1 construct. 1 ml each of the 2'1'bait construct and 1 ml of the cDNA library are incubated in YPD at pH 4.5 for 2 hours and at 30 ° with slight rotation (35 rpm). The entire volume is then spread on several YPD plates pH 5.5 and incubated for 5 hours at 30 ° C. Then, using a total volume of 15 ml of sterile water, all yeast is rinsed off the YPD plates and taken up by centrifugation and resuspension in 5 ml volumes. 100 μl of yeast suspension are plated on selection medium (no tryptophan, leucine, uracil, adenine and histidine) and incubated at 30 ° C. for 3 days. Single colonies are transferred to new selection plates after 3 days and, in the case of their growth, analyzed by colony PCR and sequencing of the PCR product.

Auf diese Weise wurden in der vorliegenden Erfindung erstmals mehrere potentiell interessante Dreifach-Interaktionspartner gefunden. So wurde ein bislang unbekanntes, als putatives MAP Kinase Substrat annotiertes Protein, identifiziert. Da BRI1 und BAK1 als Rezeptorkinasen in der Brassinosteroid Signaltransduktion involviert sind und diese wie oben beschrieben in einer MAP Kinase Kaskade im Cytosol weitergeleitet wird, könnte dieses bislang unbekannte Substrat interessante Hinweise auf mögliche Kreuzreaktionen zwischen funktionaler Dimerisierung der Rezeptoren einerseits und intrazellulärer Phosphorylierungskaskade anderseits Aufschluss geben. Normalerweise würde ein MAP Kinase Substrat als Teil einer Phosphorylierungskette in der Signalweiterleitung fungieren. So ist bekannt, dass zu den bisherigen Substraten der BR Signaltransduktion in erster Linie Transkriptionsfaktoren zählen. Diese lösen BR-spezifische Antworten aus. Unser Fund ist spektakulär, da es sich hier nicht um ein kernlokalisiertes MAP Kinase Substrat, sondern um wahrscheinlich ein Plasmamembran-assoziiertes Protein handelt. Eine Dimerisierung der Rezeptoren, die zunächst Voraussetzung für deren Aktivierung ist, würde durch eine Signalkaskade nicht nur zu direkter Transkriptregulierung einerseits sondern über das neu entdeckte Protein zu einer verstärkten Interaktion der Rezeptoren führen, was auf eine mögliche feedback-Regulierung des BR Signals hindeutet. Eine solche Signal-Amplifizierung in der BR Signaltransduktion wurde bislang noch nicht beschrieben.In this way, several potentially interesting triple interaction partners were found in the present invention for the first time. Thus, a hitherto unknown protein annotated as a putative MAP kinase substrate has been identified. There BRI1 and BAK1 As receptor kinases are involved in brassinosteroid signal transduction and are transduced into the cytosol in a MAP kinase cascade as described above, this hitherto unknown substrate could provide interesting indications of possible cross reactions between functional dimerization of the receptors on the one hand and intracellular phosphorylation cascades on the other hand. Normally, a MAP kinase substrate would function as part of a phosphorylation chain in signal transduction. Thus, it is known that the previous substrates of BR signal transduction include transcription factors in the first place. These trigger BR-specific answers. Our finding is spectacular, as it is not a nuclear localized MAP kinase substrate but is probably a plasma membrane-associated protein. A dimerization of the receptors, which is the first prerequisite for their activation, would lead to a stronger interaction of the receptors by a signal cascade not only to direct transcript regulation on the one hand but via the newly discovered protein, indicating a possible feedback regulation of the BR signal. Such signal amplification in BR signal transduction has not yet been described.

Literaturstellenreferences

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Claims (6)

Klonierungssystem, verwendbar zur Untersuchung von Interaktionen zwischen drei Proteinpartnern, bestehend aus folgenden Komponenten: - erster Vektor, enthaltend: einen ersten, Methionin-reprimierbaren met25 Promotor; die DNA eines ersten bekannten Proteins, gekoppelt an eine Chimäre aus C-terminaler Sequenz (Cub) des Ubiquitins und an die DNA eines Transkriptionsfaktors für mindestens zwei Reportergene; einen zweiten, konstitutiv exprimierenden TDH3- (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3) oder PMA1-Promotor (Plasma Membrane ATPase); die DNA eines zweiten bekannten Proteins, gekoppelt an die N-terminale Sequenz (Nub) des Ubiquitins; ein erstes Auxotrophie-Marker-Gen; einen ersten Replikationsursprung aus E. coli; einen ersten Replikationsursprung aus S. cerevisiae; ein erstes Antibiotikaresistanz-Gen; - zweiter Vektor, enthaltend: einen dritten, konstitutiv exprimierenden PMA1-, TDH3- oder ADH-Prpmotor; die DNA des dritten, unbekannten Proteins; ein zweites Auxotrophie-Marker-Gen; einen zweiten Replikationsursprung aus E. coli; einen zweiten Replikationsursprung aus S. cerevisiae; ein zweites Antibiotikaresistanz-Gen; wobei die einzelnen Komponenten, außer der DNA des dritten, unbekannten Proteins, so ausgewählt sind, dass nach einer Übertragung des ersten Vektors in Hefezellen des ersten Paarungstyps, einer Übertragung des zweiten Vektors in Hefezellen des zweiten Paarungstyps, und einer anschließenden Verschmelzung der Hefezellen beider Paarungstypen nur solche Zellen auf einem Mangel-Medium für den ersten und den zweiten Auxotrophie-Marker überleben und selektioniert werden können, welche die DNA des ersten und des zweiten Proteins von dem ersten Vektor, sowie die DNA des dritten Proteins von dem zweiten Vektor exprimieren und das erste, das zweite und das dritte Protein synthetisieren können, nur wenn diese drei Proteine untereinander interagieren. A cloning system useful for assaying interactions between three protein partners consisting of the following components: - first vector containing: a first, methionine-repressible met25 promoter; the DNA of a first known protein coupled to a chimera of the ubiquitin C-terminal sequence (Cub) and to the DNA of a transcription factor for at least two reporter genes; a second constitutively expressing TDH3 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3) or PMA1 (plasma membrane ATPase) promoter; the DNA of a second known protein coupled to the N-terminal sequence (Nub) of ubiquitin; a first auxotrophic marker gene; a first origin of replication from E. coli; a first origin of replication from S. cerevisiae; a first antibiotic resistance gene; second vector containing: a third constitutively expressing PMA1, TDH3 or ADH promoter; the DNA of the third, unknown protein; a second auxotrophic marker gene; a second origin of replication from E. coli; a second origin of replication from S. cerevisiae; a second antibiotic resistance gene; wherein the individual components except DNA of the third, unknown protein are selected such that after transfer of the first vector into yeast cells of the first mating type, transfer of the second vector into yeast cells of the second mating type, and subsequent fusion of the yeast cells of both mating types only those cells can survive and be selected on a deficient medium for the first and second auxotrophic markers which express the DNA of the first and the second protein from the first vector as well as the DNA of the third protein from the second vector and the First, the second and the third protein can synthesize only when these three proteins interact with each other. Klonierungssystem nach Anspruch 1, wobei der erste Replikationsursprung ein low-copy Hefe- Replikationsursprung ist, wie beispielsweise CEN4/ARS1.Cloning after Claim 1 wherein the first origin of replication is a low-copy yeast replication origin, such as CEN4 / ARS1. Klonierungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei der zweite Replikationsursprung ein high-copy Hefe-Replikationsursprung ist, wie beispielsweise 2µ-Ori.Cloning system according to one of Claims 1 to 2 wherein the second origin of replication is a high-copy yeast replication origin, such as 2μ Ori. Klonierungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das erste und das zweite Antibiotikaresistanz-Gen jeweils unterschiedliche Antibiotika-Resistenzen vermitteln.Cloning system according to one of Claims 1 to 3 wherein the first and second antibiotic resistance gene each confer different antibiotic resistances. Klonierungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die DNA des dritten, unbekannten Proteins als ein gezielt ausgewähltes Gen vorliegt oder aus einer cDNA Bank stammt.Cloning system according to one of Claims 1 to 4 in which the DNA of the third, unknown protein is present as a specifically selected gene or originates from a cDNA bank. Verfahren zur Untersuchung von Interaktionen zwischen drei Proteinpartnern mittels des Klonierungssystems nach Anspruch 1, beinhaltend folgende Schritte: - Übertragung des ersten Vektor in Hefezellen des ersten Paarungstyps; - Übertragung des zweiten Vektors in Hefezellen des zweiten Paarungstyps; - Paarung der Hefezellen des ersten und des zweiten Paarungstyps; - Übertragung der Hefezellen auf ein Mangelmedium, welches auf das Vorhandensein beider Vektoren sowie auf die stattgefundene Interaktion zwischen drei Proteinen zurückzuführende Reportergen-Expression selektiert.Method for investigating interactions between three protein partners by means of the cloning system Claim 1 comprising the steps of: - transferring the first vector into yeast cells of the first mating type; Transfer of the second vector into yeast cells of the second mating type; - pairing of yeast cells of the first and second mating type; - Transferring the yeast cells to a deficient medium, which selects for the presence of both vectors as well as on the occurred interaction between three proteins attributable to reporter gene expression.
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