DE10048383A1

DE10048383A1 - Protonen-translozierendes Retinalprotein

Info

Publication number: DE10048383A1
Application number: DE10048383A
Authority: DE
Inventors: Norbert Hampp; Matthias Pfeiffer; Dieter Oesterhelt
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2000-07-27
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2002-02-07
Also published as: ES2340983T3; ATE459641T1; DE50115374D1

Abstract

Die Erfindung betrifft Protonen-translozierende Retinalproteine, die einen gegenüber dem Wildtyp verlangsamten Photozyklus aufweisen und deren all-trans-Retinal-Gehalt im Hell- und im Dunkel-adaptierten Zustand um nicht mehr als 10% voneinander abweicht. Die Erfindung betrifft weiterhin eine photochrome Zusammensetzung und die Verwendung der Protonen-translozierenden Retinalproteine sowie der photochromen Zusammensetzung.

Description

Die Erfindung betrifft ein Protonen-translozierendes Retinalprotein, eine das Protonen-translozierende Retinalprotein enthaltende photochrome Zusammensetzung und die Verwendung des Protonen-translozierendes Retinalproteins und der Zusammensetzung.

Halobakterien sind Archaea, die neben den Bacteria und Eukarya eine dritte Domäne des Lebens bilden. Archaea verdanken ihren Namen den ungewöhnlichen Biotopen, in denen sie vorkommen. Sie leben häufig unter "archaischen" Bedingungen, d. h. bei extremen Temperaturen, Salzkonzentrationen oder pH-Werten, wie sie auf der frühen Erdoberfläche geherrscht haben könnten.

Die halophilen Archaea umfassen 9 Genera (z. B. Halobacterium, Haloferax, Natronomo nas, etc.) und sind durchwegs extremophil, d. h. sie leben in Salzlösungen, deren Konzen tration von 2 molar bis zur Sättigung reicht und die manchmal noch zusätzlich alkalische pH-Werte bis zu pH 11 aufweisen. In der Natur sind die Halobakterien Teil eines komplexen Ökosystems. Die bei permanenter Sonneneinstrahlung wachsende Salinität in Salzgewin nungsanlagen oder die Bedingungen im Toten Meer und anderen natürlichen hypersalinen Gewässern erlauben nach den jährlichen Regengüssen zunächst das photolitotrophe Wachstum der halotoleranten Grünalge Duniella parva bis zu einem Salzgehalt von etwa 12%. Nach Überschreiten der für sie optimalen Bedingungen stirbt Duniella ab und ermög licht das massive Wachstum von halophilen Archaea, die auf Grund ihres Carotinoidgehalts oft zu einer Rotfärbung dieser Gewässer führen.

Die halophilen Archaea besitzen neben Fermentation, aerober und anaerober Atmung eine zusätzliche Möglichkeit der Energieumwandlung, die unter den Archaea einmalig ist: sie können mittels Retinal-abhängiger Photosynthese Energie aufnehmen und umwandeln. Im Gegensatz zu der grünen, Chlorophyll-abhängigen Photosynthese ist hier nur ein einziges Protein an der Energieaufnahme und -umwandlung beteiligt, nämlich ein lichtgetriebenes Protonen-translozierendes Retinalprotein.

Das bekannteste Beispiel eines solchen Protonen-translozierenden Retinalproteins ist die archaebakterielle Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (BR), die die Lichtenergie direkt zur Erzeugung eines elektrochemischen Protonengradienten, der in chemische Energie ge wandelt wird, ausnutzt. Bakteriorhodopsin ist ein intrinsisches Membranprotein mit einem Molekulargewicht von ca. 26 kDa. Die Polypeptidkette durchquert die Membran siebenmal und bildet so eine Sekundärstruktur von sieben helikalen Transmembranbereichen. An die Seitenkette eines Lysins der siebenten Helix im Inneren des Proteins ist kovalent ein Reti nal (Vitamin A Aldehyd) gebunden. Die entstandene CH=N-Gruppe wird Schiff'sche Base (SB) genannt und ist im Ausgangszustand am Stickstoff protoniert (SBH). Einen Überblick über das Bakteriorhodopsin gibt die Arbeit von Haupts et al. (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 367-99, 1999).

Der Chromophor des BR absorbiert gelbgrünes Licht maximal bei 570 nm, so dass BR dem menschlichen Auge violett erscheint. Nach Absorption eines Photons erfährt das Protein chemische und strukturelle Änderungen, die zu unterscheidbaren, spektroskopisch mess baren Intermediaten führen. Sie werden mit den Buchstaben K, L, M, N und O bezeichnet und jeweils mit der Wellenlänge der maximalen Absorption indiziert. Der Zyklus kann ver einfacht folgendermaßen beschrieben werden:

BR₅₇₀ → K₅₉₀ → L₅₅₀ → M₄₁₀ → N₅₆₀ → O₆₄₀ → BR₅₇₀.

Bakteriorhodopsin ist das bisher einzige Retinalprotein, das in der Natur in Form eines zweidimensionalen Kristalles vorkommt. Im Bakterium sind die Kristalle in der sogenannten Purpurmembran lokalisiert. Die Organisation in der Purpurmembran stabilisiert das Protein in einem solchen Maße, dass es für eine Reihe technischer Anwendungen vorgeschlagen worden ist (zusammengefaßt in Oesterhelt et al., Quarterly Rev. Biophysics 24, 425-478, 1991). Dabei können die bei Belichtung auftretenden Änderungen des pH-Wertes der Lö sung, der elektrischen Spannung und der Farbe genutzt werden.

So ist der Farbwechsel vom Violett des Bakteriorhodopsins im Ausgangszustand BR₅₇₀ zum Gelb im Intermediat M₄₁₀ die Basis für Anwendungen in der optischen Informationstechno logie. Der Zerfall des Intermediates M₄₁₀, das eine Lebensdauer von wenigen Millisekunden hat, ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in diesem Zyklus. Die Lichtintensität und die thermische Zerfallskonstante des M-Intermediats bestimmen im Photozyklus das Ver hältnis der Farben Violett und Gelb.

Der Retinylidenteil des Bakteriorhodopsins liegt im Dunkeln als eine Mischung von all-trans, 15-anti und 13-cis, 15-syn Konfiguration im Verhältnis von etwa 60 : 40 vor. Es ist aus schließlich die all-trans Form des Chromophors, die den physiologischen Prozeß der Proto nentranslokation vermittelt und das gelbe Intermediat M₄₁₀ durchläuft ("trans-Zyklus"). Zwar führt auch die Absorption von Photonen in der 13-cis Konfiguration zu einem Zyklus von Farbänderungen, dem "cis-Zyklus", dieser unterscheidet sich jedoch vom "trans-Zyklus" darin, dass kein gelbes M-ähnliches Intermediat gebildet wird. Aus dem "cis-Zyklus" springt das Molekül bei Belichtung mit einer sehr kleinen Wahrscheinlichkeit in den "trans-Zyklus" hinüber. Dieser Wechsel vom "cis-" in den "trans-Zyklus" wird als Helladaptation der Dun keladaptierten Form bezeichnet. In der Praxis bedeutet das, dass nach Dunkelaufbewah rung einer Probe (Dunkeladaptation) eine anfängliche Belichtung nur zu etwa 60% des theoretisch möglichen M-Intermediats führt. Durch weitere Belichtung adaptiert die Probe nach und nach (Helladaptation), so dass schließlich alle Moleküle in den "trans-Zyklus" überführt sind und das M-Intermediat durchlaufen.

Der Wechsel der Moleküle vom "cis-" in den "trans-Zyklus" führt zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums um mehrere nm und bedeutet einen erheblichen Nachteil für die Verwendung von Bakteriorhodopsinen bei der Herstellung photochromer Erzeugnisse, z. B. optischer Filme oder Druckfarben.

Es wäre deshalb wünschenswert, Protonen-translozierende Retinalproteine herzustellen, deren Absorptionsmaximum im Dunkel-adaptierten Zustand dem im Hell-adaptierten Zu stand möglichst genau entspricht. Darüberhinaus wäre es von Vorteil, wenn die Stabilität des M-Intermediates erhöht werden könnte, um den Farbwechsel der im "trans-Zyklus" vor liegenden Moleküle von Violett nach Gelb möglichst genau beobachten zu können.

Erfindungsgemäß wird nunmehr ein Protonen-translozierendes Retinalprotein bereitgestellt, das aus der Gruppe von:

a) Muteinen eines natürlichen Protonen-translozierenden Retinalproteins aus halophilen Archaebakterien, die einen verlangsamten Photozyklus aufweisen (Typ 1-Mutation) und deren all-trans Retinal-Gehalt im Hell- und Dunkel-adaptierten Zustand um nicht mehr als 10% voneinander abweicht (Typ 2-Mutation) und/oder
b) Homologen der Muteine (i) mit verlangsamten Photozyklus, deren Retina lisomeren-Zusammensetzung im Hell- und Dunkel-adaptierten Zustand um nicht mehr als 10% voneinander abweicht

ausgewählt ist.

Unter einem Mutein werden durch eine Substitution, Deletion oder Insertion modifizierte Protonen-translozierende Retinalproteine verstanden. Muteine können ein oder mehrere Mutationen aufweisen. Typ 1-Mutationen sind dabei Mutationen, die zu einer Verlangsa mung des Photozyklus im Vergleich zum natürlichen Retinalprotein aus Halobacterium sali narum (SEQ ID No. 1) führen. Die Messung des Photozyklus erfolgt dabei wie z. B. von Mil ler & Oesterhelt, Biochem. Biophys. Acta 1020, 57-64, 1990, beschrieben. Typ 2-Mutationen führen zu einer im Vergleich zum natürlichen Retinalprotein aus Halobacterium salinarum (SEQ ID No. 1) erhöhten Konstanz des all-trans-Retinal-Gehalts im Hell- und im Dunkel-adaptierten Protein. Der all-trans-Retinal-Gehalt wird dabei bestimmt, wie von Tittor et al., Biophys. J. 67, 1682-1690, 1994, beschrieben. Die Prozentangabe bezieht sich auf den Gesamtgehalt der mittels des erwähnten Verfahrens bestimmbaren Retinalisomere.

Normalerweise werden Typ 1-Mutationen und Typ 2-Mutationen verschiedene Aminosäu ren betreffen. Es ist jedoch auch möglich, dass eine einzelne Mutation beide gewünschten Wirkungen aufweist und daher gleichzeitig als Typ 1- und als Typ 2-Mutation zu klassifizie ren ist. Soweit natürlich auftretende, archaebakterielle Protonen-translozierende Retinal proteine im Vergleich zu dem bekanntesten Protonen-translozierenden Retinalprotein, d. h., Bakteriorhodopsin aus Halobacterium salinarum (SEQ ID No. 1), einen verlangsamten Photozyklus aufweisen und ihr all-trans-Retinal-Gehalt im Hell- und im Dunkel-adaptierten Zustand um nicht mehr als 10% voneinander abweicht, gelten sie im Rahmen der vorlie genden Erfindung ebenfalls als Muteine.

Der dem Fachmann bekannte Ausdruck "Homolog" bezeichnet eine Verwandtschaft zwi schen zwei oder mehr Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen, der durch die Übereinstim mung zwischen den Sequenzen mittels bekannter Verfahren, z. B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Basic local alignment search tool, S. F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410), bestimmt werden kann. Der Prozentsatz der Identität ergibt sich aus dem Prozentsatz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten. In der Regel werden spezielle Computer programme mit Algorithmen eingesetzt, die den besonderen Anforderungen Rechnung tra gen.

Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Homologie erzeugen zunächst die größte Über einstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Bestim mung der Identität zwischen zwei Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf das GCG Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Re search 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN, und FASTA (Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1999)). Das BLASTX Programm kann vom National Centre for Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST Handbuch, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al., Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus kann zur Bestimmung des Prozentsatzes der Iden tität verwendet werden.

Bevorzugte Parameter für den Aminosäuresequenz-Vergleich umfassen die nachstehen den:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol 48: 443-453 (1970)
Vergleichsmatrix: BLOSUM 62 aus Henikoff und Henikoff, PNAS USA 89 (1992), 10915-10919
Lücken-Wert (Gap Penalty): 12
Lückenlängen-Wert:
(Gap Length Penalty): 4
Homologie-Schwellenwert:
(Threshold of Similarity): 0.

Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter sind die Fehler-Parameter (default parameters) für Aminosäu resequenz-Vergleiche, wobei Lücken an den Enden den Wert nicht verändern. Die Erfin dung umfasst daher auch Fusionsproteine, d. h. Protonen-translozierende Retinalproteine mit einem Fusionsproteinanteil. Bei sehr kurzen Sequenzen im Vergleich zur Referenz- Sequenz kann es weiterhin notwendig sein, den Erwartungswert auf bis zu 100.000 (ex pectation value) zu erhöhen und gegebenenfalls die Wortlänge (word size) auf bis zu 2 zu verkleinern.

Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich abhängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder Best Fit be vorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird.

Eine mit dem oben genannten Algorithmus ermittelte Übereinstimmung von 40% wird im Rahmen dieser Anmeldung als 40% Identität bezeichnet. Entsprechendes gilt für höhere Prozentsätze.

Überraschenderweise hat sich nunmehr gezeigt, dass die Kombination einer Typ 1- Mutation und einer Typ 2-Mutation im erfindungsgemäßen Protonen-translozierenden Retinalprotein zu einer weitgehenden Konstanz des all-trans-Retinal-Gehaltes sowie zu einer Verlangsamung des Photozyklus führen kann. Der all-trans-Retinal-Gehalt der Dunkel-adaptierten Form des erfindungsgemäßen Protonen-translozierenden Retinalproteins un terscheidet sich von dem der Hell-adaptierten Form in der Regel um nicht mehr als 10%. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Unterschiede sogar geringer und liegen bei ma ximal 8 oder sogar maximal 5%. Überraschenderweise hat sich weiterhin gezeigt, dass ge rade Muteine, deren all-trans-Retinal-Gehalt sich im Hell- und im Dunkel-adaptierten Zu stand nicht wesentlich, d. h., um nicht mehr als 10% unterscheidet, einen all-trans-Retinal-Gehalt von mindestens 60% in Hell- wie im Dunkel-adaptierten Zustand aufweisen. Dieser unerwartete Nebeneffekt ist äußerst vorteilhaft, da jede Erhöhung des Anteils der Moleküle, die am "trans-Zyklus" teilnehmen, bei Belichtung zu einem deutlicheren Farbwechsel und damit zu einer Verbesserung der optischen Eigenschaften führt.

Erfindungsgemäß werden Muteine bereitgestellt, die einen konstanten all-trans-Retinal-Gehalt im Bereich von mindestens 60 bis 100%, bevorzugt 62% oder 65% bis 100% auf weisen. Während die meisten Retinalproteine einen all-trans-Retinal-Gehalt im Bereich von 60 oder 65% bis 85% aufweisen, sehen besonders bevorzugte Ausführungsformen einen all-trans-Retinal-Gehalt von mindestens 70% oder 75%, am besten sogar 80% bis 100% vor.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das natürliche Protonen-translozierende Retinal protein, dessen Mutein(e) die oben erwähnten Eigenschaften aufweisen, ein archaebakteri elles Bakteriorhodopsin, z. B. ein halobakterielles Rhodopsin, bevorzugt Bakteriorhodopsin (SEQ ID No. 1) aus Halobacterium salinarum.

Das erfindungsgemäße Protonen-translozierende Retinalprotein umfasst Muteine mit einer Typ 1- und einer Typ 2-Mutation, deren Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz SEQ ID No. 1 eine Identität von mindestens 40% aufweist. In weiteren Ausführungsformen beträgt die Identität mindestens 50, 60 oder 70%. In besonders bevorzugten Ausführungs formen beträgt die Identität mindestens 80, 90 oder 95%.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Protonen-translozierenden Retinalprotein um ein Homolog mit einer Aminosäuresequenz, das im Be reich der C-Helix und/oder der F-Helix eine Identität von mindestens 60% mit den entspre chenden Aminosäuresequenzen des reifen Bakteriorhodopsins aus SEQ ID No. 1 aufweist. In weiter bevorzugten Ausführungsformen liegt der Prozentsatz der Identität für die C-Helix und/oder die F-Helix bei mindestens 70, 80 oder 90%, bevorzugt bei mindestens 95%. Der Identitätsgrad für die C- und die F-Helix kann dabei gleich oder verschieden sein.

Der Photozyklus des erfindungsgemäßen Protonen-translozierenden Retinalproteins wird durch die Typ 1-Mutation verlangsamt. Die thermische Zykluszeit beträgt in jedem Fall mehr als 10 ms, bevorzugt mehr als 1 s oder gar mehr als 10 s. In besonders bevorzugten Aus führungsformen liegt die thermische Zykluszeit im Minutenbereich, d. h. sie beträgt mehr als 1 min. in weiteren bevorzugten Ausführungsformen sogar mehr als 5 oder 10 min. Die thermische Zykluszeit kann im Extremfall bis zu 2 Stunden betragen, in der Regel jedoch nicht mehr als 90 oder 60 min.

Die Typ 1-Mutation des Protonen-translozierenden Retinalproteins kann in einem Ami nosäureaustausch an einer oder mehreren der Aminosäurepositionen bestehen, die im na türlichen Protein am katalytischen Zyklus beteiligt sind. Die vorliegende Erfindung umfaßt daher Retinalproteine, bei denen z. B. eine oder mehrere der Positionen der an der Proto nen-Translokation beteiligten Aminosäuren aus der Gruppe der Aminosäurereste D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 und/oder E204 gemäß SEQ ID No. 1 bzw. der ihnen entspre chenden Aminosäurereste in homologen Proteinen verändert ist. Ein bevorzugter Ami nosäureaustausch ist D96 N, d. h. die Aminosäure D an Position 96 von SEQ ID No. 1 bzw. die entsprechenden Aminosäure in einem homologen Protein wird durch N ersetzt. Weiter bevorzugte Aminosäureaustausche sind D38R und D102R und/oder D104R.

Die Typ 2-Mutation der Retinalproteine der erfindungsgemäßen Retinalproteine führt zu ei nem Aminosäureaustausch an einer oder mehrerer der Aminosäurepositionen, die die Reti nalbindungstasche bilden, und/oder unmittelbar benachbarter Positionen. Unter der Reti nalbindungstasche wird die Summe der Aminosäuren verstanden, die der Schiff'schen Base des Retinals ihre charakteristischen chemischen und physikalischen Eigenschaften ver leihen. Die die Retinalbindungstasche bildenden Aminosäuren bzw. unmittelbar benach barte Aminosäuren sind ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäurereste Va149, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 und Met145 gemäß SEQ ID No. 1 bzw. der ihnen entsprechen den Aminosäurereste in homologen Proteinen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Typ 2-Mutation V49A, V49 G, V49F, L93A, G122K, G122C, G122M, S141A, S141M, M1451, M145F, M145W, M145C oder M145K. Diese Typ 2-Mutationen bewirken überraschender weise eine Konstanz des all-trans Anteils im Retinylidenteil des Bakteriorhodopsins im Hell- und im Dunkel-adaptierten Zustand.

Absorptionsmaxima und Retinalisomerenverhältnisse des Halobacterium salinarum Wild typs (WT), der reinen Typ 1-Mutante D96N, der reinen Typ 2-Mutanten M145F und L93A sowie der erfindungsgemäßen Retinalproteine D96N-M145F und D96N-L93A sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt:

Besonders bevorzugte Kombinationen von Typ 1- und Typ 2-Mutationen sind beispielswei se V49A-D96N, L93A-D96N und M145F-D96N (s. Fig. 1).

In einer weiteren Ausführungsform liegen die erfindungsgemäßen Retinalproteine in mem brangebundener Form vor, wobei die Membran eine Dichte zwischen 1,10 und 1,20 g/cm³ aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Dichte zwischen 1,175 und 1,185 g/cm³. Besonders bevorzugt ist die Form einer Purpurmembran mit einer Dichte von 1,18 g/cm³.

Erfindungsgemäß werden weiterhin Nukleinsäuren bereitgestellt, die für die oben beschrie benen Retinalproteine kodieren. Diese Nukleinsäuren können einmal durch Mutationen be reits bekannter Gene für Protonen-translozierende Retinalproteine, z. B. des für das Bakte riorhodopsin aus Halobacterium salinarum kodierenden Genes erzeugt werden (Dunn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6744-6748, 1981), zum anderen nach bekannten Verfahren vollsynthetisch hergestellt werden. Da der genetische Code der Archaea sich von dem der Prokarya und Eukarya nicht unterscheidet, können auch zur Transformation in Halobakteri en vorgesehene Nukleinsäuren nach den bekannten Regeln hergestellt werden. Der Fach mann wird sich allerdings bemühen, eine auf den jeweils vorgesehenen Wirtsorganismus abgestimmte Codon-Usage zu berücksichtigen. Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kann es sich um Ribonukleinsäuren und/oder Desoxyribonukleinsäuren handeln.

Erfindungsgemäß werden weiterhin Vektoren zur Verfügung gestellt, die die für die Proto nen-translozierenden Retinalproteine kodierenden Nukleinsäuren umfassen. Je nach dem für diesen Vektor vorgesehenen Wirtsorganismus wird der Fachmann zwischen archae bakteriellen Vektoren, Vektoren für die Expression in Prokarya (E. coli, Bacillus, Pseudo monas, Klebstella etc.) oder Eukarya (Hefe, Tierzellkulturen (CHO, HeLa, COS etc.), Pflan zen oder Pflanzenzellen, Insektenzellen) auswählen.

Erfindungsgemäß wird weiterhin eine Wirtszelle bereitgestellt, die eine für ein erfindungs gemäßes Protonen-translozierendes Retinalprotein kodierende Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Bei den Wirtszellen handelt es sich z. B. um Archaea, bevorzugt Halobakterien, besonders bevorzugt Halobacterium salinarum, dessen Trans formation beschrieben ist (Cline et al., Can. J. Microbiol. 35, 148-152, 1989). Alternativ können erfindungsgemäße Vektoren auch in E. coli oder anderen prokaryontischen Wirten, bei Bedarf auch in den oben erwähnten eukaryontischen Zellen exprimiert werden.

Erfindungsgemäß wird weiterhin eine photochrome Zusammensetzung bereitgestellt, die zusätzlich zu einem erfindungsgemäßen Protonen-translozierenden Retinalprotein Stabili satoren, die Schaumbildung vermindernde und/oder UV-Licht absorbierende Zusatzstoffe und/oder Puffersubstanzen enthalten kann.

Die erfindungsgemäße photochrome Zusammensetzung kann z. B. Glycerin, organische Polymere und/oder organische Lösungsmittel enthalten.

Die erfindungsgemäßen Protonen-translozierenden Retinalproteine oder die sie enthalte nen photochromen Zusammensetzungen können zum Herstellen von optischen Filmen verwendet werden. Die Herstellung optischer Filme aus Bakteriorhodopsinen ist bereits be kannt und z. B. in Hampp et al., SPIE 3623, 243, 1999 ausführlich beschrieben. Ein unter Verwendung der erfindungsgemäßen Protonen-translozierenden Retinalproteine herge stellter optischer Film ist für optische Aufzeichnungen geeignet. Eine weitere Verwendungs möglichkeit solcher optischen Filme ist mit der Interferometrie oder bei der holographischen Mustererkennung gegeben. Auch die Verwendung optischer Filme als optischer Lichtmo dulator ist möglich. Darüberhinaus ist die Herstellung volumenhafter Speicher zur optischen Datenspeicherung denkbar (Birge, Scientific American, 1995, 66).

Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren die Verwendung eines Protonen- translozierenden Retinalproteins und/oder einer photochrome Zusammensetzung als Si cherheitsfarbstoff bereit. In einer ersten Ausführungsform wird das Retinalprotein und/oder die photochrome Zusammensetzung auf ein sicherungsbedürftiges Dokument oder einen sicherungsbedürftigen Gegenstand aufgetragen. In einer weiteren Ausführungsform kann die auf das sicherungsbedürftige Dokument oder den sicherungsbedürftigen Gegenstand aufgetragene erfindungsgemäße photochrome Zusammensetzung (bzw. das Retinalpro tein) auf dem Dokument oder Gegenstand fixiert werden.

Dabei kann die Fixierung gemäß der vorliegenden Erfindung durch physikalischen Ein schluß oder kovalente Kopplung an das Dokument bewirkt werden. Erfindungsgemäß ist das sicherungsbedürftige Dokument beispielsweise ein Sicherheitspapier, ein Ausweis oder eine Banknote. Als Dokument kann jedoch erfindungsgemäß auch jedes weitere Dokument gelten, für das ein Sicherungsbedarf besteht.

Schließlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von Dokumenten mit Sicherheitsmerkmal bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass vor, während oder nach der Herstellung eines Dokumentes in üblicher Weise ein erfindungsgemäßes Proto nen-translozierendes Retinalprotein oder eine erfindungsgemäße photochrome Zusam mensetzung aufgetragen und gegebenenfalls fixiert wird.

Die folgenden Figuren und Beispiele erläutern die Erfindung.

Fig. 1 zeigt die Absorptionsspektren verschiedener erfindungsgemäßer Protonen-translozierender Retinalproteine im Vergleich zu dem Spektrum des Wildtyps bzw. von Muteinen mit nur einer Mutation. Die durchgezogenen Linien zeigen jeweils das Absorpti onsspektrum im Hell-adaptierten Zustand, die gepunkteten Linien im Dunkel-adaptierten Zustand. Im Einzelnen zeigen:

Fig. 1A Wildtyp Halobacterium salinarum mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 1. Das Absorptionsmaximum im Hell-adaptierten Zustand liegt bei 568 nm, im Dunkel-adaptierten Zustand bei 560 nm.

Fig. 1B Absorptionsspektrum der Typ 1-Mutante D96N. Das Absorptionsmaximum verschiebt sich von 569 nm im Hell-adaptierten Zustand nach 560 nm im Dunkel-adaptierten Zustand.

Fig. 1C Typ 2-Mutante V49A. Das Absorptionsmaximum liegt im Hell-adaptierten wie im Dunkel-adaptierten Zustand bei 549 nm.

Fig. 1D Erfindungsgemäßes Retinalprotein mit der Doppelmutation V49A-D96N. Das Absorptionsmaximum von 559 nm im Hell-adaptierten Zustand wird um 2 nm nach 557 nm im Dunkel-adaptierten Zustand verschoben.

Fig. 1E Typ 1-Mutation L93A. Das Absorptionsmaximum liegt im Hell-adaptierten wie im Dunkel-adaptierten Zustand bei 541 nm.

Fig. 1F Erfindungsgemäßes Retinalprotein mit der Doppelmutation L93A-D96N. Das Absorptionsmaximum liegt im Hell-adaptierten wie im Dunkel-adaptierten Zu stand bei 544 nm. Diese Doppelmutante erreicht im Dunkel-adaptierten Zu stand einen all-trans Anteil von mehr als 80%.

Fig. 1G Typ 2-Mutation M145F. Das Absorptionsmaximum liegt im Hell-adaptierten Zustand bei 559 nm, im Dunkel-adaptierten Zustand bei 558 nm.

Fig. 1H Erfindungsgemäßes Retinalprotein mit der Doppelmutation D96N-M145F. Diese Doppelmutante erreicht im Dunkel-adaptierten Zustand einen all-trans Anteil von 66%; das Absorptionsmaximum liegt für das Hell-adaptierte wie für das Dunkel-adaptierte Retinalprotein bei 560 nm.

Beispiel 1 Herstellung einer photochromen Zusammensetzung

Für die Herstellung einer photochromen Zusammensetzung werden zunächst die einzelnen Protonen-translozierenden Retinalproteine entweder aus natürlichen Halobakterienpopula tionen oder rekombinant durch Transformation von Halobacterium salinarum (Cline & Doolittle, J. Bact. 169, 1341-1344, 1987) nach stellenspezifischer Mutagenese des Bakteriorho dopsingenes (Dunn et al., Proc. Natl. Acad. Sc., USA 78, 6744-6748) gewonnen. Die Pur purmembran der transformierten Halobakterien wird mittels bekannter Verfahren isoliert und gereinigt (Oesterhelt & Stoeckenius, Meth. Enzym. 31, 667-678, 1974). Für die Gewinnung von Bakteriorhodopsin in großem Maßstab kann das in der deutschen Patentanmeldung 199 45 798.0 beschriebene Verfahren eingesetzt werden.

Beispiel 2 Fixierung der photochromen Zusammensetzung auf einer Oberfläche

Die erfindungsgemäße photochrome Zusammensetzung kann beispielsweise physikalisch in ein Matrixmaterial eingeschlossen werden. Konkret werden z. B. 10 mg Purpurmembran, enthaltend Bakteriorhodopsin-D96N/M145F in 4 ml einer UV-härtenden Farbe (IFS 3000, Firma Schmitt) gleichmäßig suspendiert und auf das sicherungsbedürftige Dokument auf getragen. Nach UV-Belichtung (nach Angaben des Herstellers) des solcherart markierten Dokumentes befinden sich die Purpurmembranpartikel im ausgehärteten Kunststoff.

Beispiel 3 Applikation der photochromen Zusammensetzung mittels verschiedener Verfahren Siebdruck

Das Prinzip des Siebdrucks ist Durchdruck, ähnlich einer Schabloniertechnik. Die Druck form besteht aus einem Siebgewebe, welches mit einer farbundurchlässigen Sperrschicht versehen wird. Das Druckmotiv bleibt offen. Der Druck erfolgt durch das Abziehen des mit Farbe gefüllten Siebes mit einer Rakel. Die Farbe wird dabei auf das darunterliegende Sub strat übertragen. Zur Herstellung einer Siebdruckfarbe wird in eine 7,2% PVA-Lösung (Mowiol Typ 56-98) 100 mg/ml Purpurmembran über Nacht eingerührt. Bei Übereinstimmung der rheologischen Eigenschaften mit einer Standardprobe kann die erhaltene Mischung mit einer herkömmlichen Siebdruckmaschine verdruckt werden.

Offsetdruck

In 5 ml einer Farbe ohne Pigment (Fa. Schmitt, UFO1) werden bei 50°C 1 g Purpurmem bran eingerührt. Die so erhaltene Mischung kann mittels gängiger Offset-Technik verdruckt werden.

Beispiel 4 Herstellen eines abriebsbeständigen Sicherheitsmerkmals

Eine Abriebbeständigkeit der photochromen Zusammensetzung kann erzielt werden, in dem z. B. die mit Protonen-translozierendem Retinalprotein beschichteten Dokumente mit tels eines Heißlaminiergerätes (GPM, Mylam 9) in einer Folientasche vom Typ GHQ-120TR bei einer Temperatur von 90 bis 140°C einlaminiert werden.

Beispiel 5 Erhöhung der UV-Beständigkeit des Sicherheitsmerkmals

Um die UV-Beständigkeit des erfindungsgemäßen Sicherheitsmerkmals zu erhöhen, wird die photochrome Zusammensetzung mit einem UV-Absorber oder einem Derivat davon in einer Konzentration von 1 bis 30%, bevorzugt 3 bis 10% w/w versetzt. Bevorzugte UV-Absorber sind Benzophenon, Hydroxynaphthochinon, Phenylbenzoxazol, Zimtsäureester, Sulfonamid und Aminobenzoesäureester.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Protonen-translozierendes Retinalprotein, ausgewählt aus der Gruppe von:

a) Muteinen eines natürlichen Protonen-translozierenden Retinalproteins aus halophilen Archaebakterien, die einen verlangsamten Photozyklus aufweisen (Typ 1-Mutation) und deren all-trans-Retinal-Gehalt im Hell- und im Dunkel-adaptierten Zustand um nicht mehr als 10% voneinander abweicht (Typ 2-Mutation) und/oder
b) Homologen der Muteine (i) mit verlangsamten Photozyklus, deren all-trans-Retinal-Gehalt im Hell- und im Dunkel-adaptierten Zustand um nicht mehr als 10% voneinander abweicht.

2. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass seine Retinalisomeren-Zusammensetzung im Hell- und im Dunkel-adaptierten Zu stand mindestens 60% all-trans-Retinal aufweist.

3. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, dass das natürliche Protonen-translozierende Retinalprotein ein archaebakte rielles Rhodopsin ist.

4. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das archaebakterielle Rhodopsin ein Rhodopsin aus Halobakteri en ist.

5. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das archaebakterielle Rhodopsin Bakteriorhodopsin (SEQ ID No. 1) aus Halobacterium salinarum ist.

6. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Homolog eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit der Aminosäuresequenz SEQ ID No. 1 mindestens 40% Identität aufweist.

7. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Homolog eine Aminosäuresequenz aufweist, die im Bereich der C- und/oder F-Helix mindestens 60% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID No. 1 aufweist.

8. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Photozyklus der Muteine mit einer Typ 1-Mutation eine thermische Zykluszeit von mehr als 10 ms aufweist.

9. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Typ 1-Mutation ein Aminosäureaustausch an einer oder mehreren der Aminosäurepositionen ist, die im natürlichen Protein am katalyti schen Zyklus beteiligt sind.

10. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die am katalytischen Zyklus beteiligten Aminosäuren aus der die Aminosäurereste D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 und/oder E204 umfassenden Gruppe ausge wählt sind.

11. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Typ 2-Mutation ein Aminosäureaustausch an ei ner oder mehrerer der Aminosäurepositionen ist, die die Retinalbindungstasche bilden.

12. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die die Retinalbindungstaschen bildenden Aminosäuren aus der die Aminosäure reste Va149, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 und Met145 umfassenden Gruppe aus gewählt sind.

13. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Mutein des Bakteriorhodopsins aus Halobacterium sali narum (SEQ ID No. 1) mit aus der folgenden Gruppe ausgewählten Mutationen:
V49A-D96N; L93A-D96N; M145F-D96N
oder ein Homolog eines solchen Muteins ist.

14. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Retinalprotein in Form einer Purpurmembran vorliegt.

15. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte der Purpurmembran zwischen 1,10 und 1,20 g/cm³ beträgt.

16. Protonen-translozierendes Retinalprotein nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte der Purpurmembran 1,175 bis 1,185 g/cm³ beträgt.

17. Nukleinsäure, kodierend für ein Protonen-translozierendes Retinalprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 13.

18. Vektor, umfassend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 17.

19. Wirtszelle, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 17 und/oder einen Vektor gemäß Anspruch 18.

20. Photochrome Zusammensetzung, enthaltend mindestens ein Protonen-translozierendes Retinalprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 16, weiter enthaltend ein oder mehrere Zusatzstoffe, ausgewählt aus Stabilisatoren, die Schaumbildung verringernden Zusatz stoffen, UV-Licht absorbierenden Zusatzstoffen und Puffersubstanzen.

21. Photochrome Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass Glycerin, organische Polymere und/oder organische Lösungsmittel enthalten sind.

22. Verwendung eines Protonen-translozierenden Retinalproteins nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16 und/oder einer photochromen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 oder 21 zum Herstellen von optischen Filmen.

23. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Film für die optische Aufzeichnung geeignet ist.

24. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Film für die Interferometrie geeignet ist.

25. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Film für die holographische Mustererkennung geeignet ist.

26. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Film als optischer Lichtmodulator geeignet ist.

27. Verwendung eines Protonen-translozierenden Retinalproteins gemäß einem der An sprüche 1 bis 16 zum Herstellen volumenhafter Speicher zur optischen Datenspeiche rung.

28. Verwendung eines Protonen-translozierenden Retinalproteins nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16 oder einer photochromen Zusammensetzung nach mindestens einem der Ansprüche 20 oder 21 als Sicherheitsfarbstoff.

29. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Protonen-translozierende Retinalprotein und/oder die photochrome Zusammensetzung auf ein si cherungsbedürftiges Dokument oder einen sicherungsbedürftigen Gegenstand aufge tragen wird.

30. Verwendung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das auf das siche rungsbedürftige Dokument oder den Gegenstand aufgetragene Protonen- translozierende Retinalprotein und/oder die photochrome Zusammensetzung auf dem Dokument oder den Gegenstand fixiert wird.

31. Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Fixierung durch physikalischen Einschluß oder kovalente Kopplung an das Dokument oder den Gegen stand bewirkt ist.

32. Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das sicherungsbedürftige Dokument ein Sicherheitspapier ist.

33. Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das sicherungsbedürftige Dokument ein Ausweis ist.

34. Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das sicherungsbedürftige Dokument eine Banknote ist.

35. Verfahren zum Herstellen von Dokumenten mit Sicherheitsmerkmal, dadurch gekenn zeichnet, dass vor, während oder nach der Herstellung eines Dokumentes in üblicher Weise ein Protonen-translozierendes Retinalprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 oder eine photochrome Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18 aufgetragen und gegebenenfalls fixiert wird.