DE10044805A1

DE10044805A1 - Regulation of the function of uncoupling proteins, e.g. in treatment of obesity, diabetes and neurodegenerative diseases, comprises use of coenzyme Q or analogues as a cofactor

Info

Publication number: DE10044805A1
Application number: DE10044805A
Authority: DE
Inventors: Martin Klingenberg; Edith Winkler; Karim Salim Echtay
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-09-11
Filing date: 2000-09-11
Publication date: 2002-04-04

Abstract

A coenzyme Q, or its analogues, is used as a cofactor for regulating the function of uncoupling proteins (UCP). Independent claims are also included for: (1) a medicament containing the cofactor and a fatty acid; (2) a test method (test I) for determining the effect of compounds on the uncoupling activity of a UCP other than UCP1 comprising: (a) screening yeast transfected with UCP1 with the compounds and determining positive candidates; and (b) testing the positive candidates with respect to their activity on a UCP other than UCP1; (3) a test method (test II) for determining the effect of test compounds on UCP activity comprising: (a) synthesizing a UCP in E. coli; and (b) incorporating the resulting synthesized UCP in an artificial vesicle; and (c) determining the UCP activity in the presence of the compound; (4) A method for the production of an active UCP comprising: (a) obtaining the UCP as inclusion bodies from E. Coli; and (b) solubilizing and re-naturing the UCP from the inclusion bodies; and (c) adding coenzyme Q or one of its analogues during the reconstitution of the UCP.

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Coenzym Q oder einem Coenzym Q-Analogon zur Regulierung der Funktion der Entkopplerproteine (UCP; Uncoupling Proteins) sowie ein Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, die die Entkoppleraktivität von Entkopplerproteinen beeinflussen, insbesondere erhöhen.This invention relates to the use of coenzyme Q or one Coenzyme Q analogue for regulating the function of the decoupler proteins (UCP; uncoupling proteins) and a method for finding Compounds that demonstrate the decoupling activity of decoupling proteins influence, especially increase.

Entkopplerproteine wurden zuerst in den inneren Membranen der Mitochondrien des braunen Fettgewebes gefunden. Es handelt sich um Purin-Nukleotide-bindende Proteine, welche die energetische Kopplung der Biosynthese von ATP (Adenosin-5'-triphosphat) an die Atmungskette aufheben. Die Entkopplerproteinaktivität bewirkt somit, dass die exergonischen Reaktionen der Atmungskette weiterhin ablaufen, ohne dass ATP gebildet wird. Die freiwerdende Energie wird vielmehr in Wärme umgewandelt. Der einer Kurzschlussreaktion nicht unähnliche Mechanismus beruht im Prinzip auf einer Erhöhung der Membrandurchlässigkeit für Protonen, welche die Bemühungen der Atmungsketten-Enzyme, ein Protonengefälle über die Membran aufzubauen, vereitelt (M. Klingenberg, Trends Biochem. Sci., 15(3) (1990), 108-112; D. G Nicholls et al., Physiol. Rev. 64(1) (1984), 1-64; B. Cannon et al., Essays Biochem. 20 (1985), 110-164; M. Klingenberg, J. Bioenerg. Biomembr. 31 (5) (1999), 419-430).Decoupler proteins were first found in the inner membranes of the Mitochondria of the brown adipose tissue found. It is a matter of Purine nucleotide binding proteins, which are the energetic coupling of the Biosynthesis of ATP (adenosine 5'-triphosphate) on the respiratory chain cancel. The decoupler protein activity thus causes the exergonic reactions of the respiratory chain continue without ATP is formed. The released energy is rather in heat converted. The mechanism, which is not unlike a short-circuit reaction is based in principle on an increase in membrane permeability for Protons, which are the efforts of the respiratory chain enzymes Building proton gradient across the membrane thwarted (M. Klingenberg, Trends biochem. Sci., 15 (3) (1990), 108-112; D.G. Nicholls et al., Physiol. Rev. 64 (1) (1984) 1-64; B. Cannon et al., Essays Biochem. 20 (1985), 110-164; M. Klingenberg, J. Bioenerg. Biomembr. 31 (5) (1999), 419-430).

Während diese Funktion für UCP1 von braunem Fettgewebe gut etabliert ist, war die Funktion der Entkopplerproteine UCP2, UCP3 und UCP4 im Stand der Technik bisher noch nicht eindeutig aufgeklärt (D. Ricquier et al., Biochem. J. 345 Pt2 (2000), 161-179; O. Boss et al., Lancet 351(9120) (1998), 1933). Da mit dem Energiestoffwechsel neben einer Thermogenese andere Funktionen verbunden sind, die beispielsweise bei Fettsucht, Diabetes und anderen Erkrankungen, eine Rolle spielen können, ist die Regulierung der UCP-Aktivierung von großem Interesse. So wurde die Regulierung der UCP-Expression durch verschiedene Faktoren bereits beschrieben (D. Riquier et al., supra; O. Boss et al., Eur. J. Endocrinol. 139(1) (1998), 1-9; D. Ricquier et al., J. Intern. Med. 245(6) (1999), 637- 642).While this function is well established for UCP1 from brown adipose tissue is the function of the decoupler proteins UCP2, UCP3 and UCP4 in The state of the art has not yet been clearly clarified (D. Ricquier et al., Biochem. J. 345 Pt2 (2000), 161-179; O. Boss et al., Lancet 351 (9120) (1998), 1933). As with the energy metabolism in addition to thermogenesis other functions are connected, such as obesity, Diabetes and other diseases that can play a role is that Regulation of UCP activation of great interest. So it became Regulation of UCP expression by various factors already (D. Riquier et al., supra; O. Boss et al., Eur. J. Endocrinol. 139 (1) (1998) 1-9; D. Ricquier et al., J. Intern. Med. 245 (6) (1999), 637- 642).

Die Funktionen der neuen UCPs (UCP2 bis 4) waren bisher jedoch nur unvollständig aufgeklärt. Ein Grund hierfür ist ihre geringe Konzentration im Gewebe, was ihrer Isolierung als native Proteine entgegensteht.The functions of the new UCPs (UCP2 to 4) have so far only been incompletely clarified. One reason for this is their low concentration in the Tissue, which prevents their isolation as native proteins.

Aufgrund des bisherigen Verständnisses der Regulation von UCP1, das auch auf die übrigen Entkopplerproteine extrapoliert wurde, gab es zwei Möglichkeiten, die Aktivität von Entkopplerproteinen zu beeinflussen:
Based on the previous understanding of the regulation of UCP1, which was also extrapolated to the other decoupler proteins, there were two ways to influence the activity of decoupler proteins:

a) the activation of the decoupler protein by adding a fatty acid and
b) the inhibition of the decoupler proteins by nucleotides.

Nachteilig bei diesen Verfahren ist, dass Fettsäuren nicht spezifisch von Entkopplerproteinen erkannt werden und somit zum einen nur bei großem Überschuss aktivierend wirken und zum anderen unkontrollierte und unerwünschte Nebenwirkungen durch Beeinflussung anderer Enzyme und Funktionen in der Zelle hervorrufen können. Eine Beeinflussung der Entkopplerproteinaktivität durch Nukleotide sollte oftmals daran scheitern, dass hydrophile Nukleotide oder Nukleotidanaloga die Zellmembranen nicht passieren können.A disadvantage of these processes is that fatty acids are not specific Decoupling proteins are recognized and therefore only for large ones Activate excess and on the other hand uncontrolled and undesirable side effects from influencing other enzymes and Can cause functions in the cell. Influencing the Decoupler protein activity by nucleotides should often fail because that hydrophilic nucleotides or nucleotide analogs do not cross cell membranes can happen.

Weiterhin wurde gefunden, dass rekombinant hergestellte Entkopplerproteine trotz Zugabe von Fettsäure oftmals keine Aktivität aufweisen, sodass sie nicht zur gewünschten Regulierung eingesetzt werden können. Furthermore, it was found that recombinantly produced Decoupling proteins often have no activity despite the addition of fatty acid have so that they are not used for the desired regulation can be.

Eine Aufgabe der Erfindung bestand deshalb darin, eine Vorgehensweise, mit der die Funktion von Entkopplerproteinen (UCP) reguliert und insbesondere aktiviert werden kann, sowie ein Verfahren zur Herstellung aktiver Entkopplerproteine bereitzustellen.It was therefore an object of the invention to provide a procedure which regulates the function of decoupler proteins (UCP) and in particular can be activated, and a method for manufacturing to provide active decoupler proteins.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von Coenzym Q oder einem Coenzym Q-Analogon zur Regulierung der Funktion der Entkopplerproteine. Es wurde festgestellt, dass Entkopplerproteine neben ihrer nativen Konfiguration einen Cofaktor benötigen, um eine Aktivität aufzuweisen. So konnte durch eine Rekonstitution von UCP1 aus E.coli Inclusion Bodies in Vesikel die Cl^--Transportaktivität reaktiviert werden, resultierte jedoch nicht in der gewünschten H⁺-Transportaktivität (K. S. Echtay et al., FEBS Lett. 450 (1999), 8-12).This object is achieved according to the invention by using coenzyme Q or a coenzyme Q analogue to regulate the function of the decoupler proteins. It has been found that decoupler proteins, in addition to their native configuration, require a cofactor to show activity. For example, the reconstitution of UCP1 from E. coli inclusion bodies in vesicles reactivated the Cl ^- transport activity, but did not result in the desired H ⁺ transport activity (KS Echtay et al., FEBS Lett. 450 (1999), 8- 12).

Es wurde nun festgestellt, dass Coenzym Q ein nicht-kovalent gebundener Cofaktor für die Entkopplerproteine, insbesondere für UCP1, UCP2 und UCP3, ist und dass die Aktivität der Entkopplerproteine durch Coenzym Q oder ein Coenzym Q-Analogon beeinflusst werden kann. Besonders bevorzugt wird die Funktion mindestens eines der Entkopplerproteine UCP1, UCP2 und UCP3 reguliert (D. W. Gong et al., J. Biol. Chem. 272(39) (1997), 24129-32; C. Fleury et al., Nat. Genet. 15(3) (1997), 269-272; O. Boss et al., FEBS Lett. 408(1) (1997), 39-42).It has now been found that Coenzyme Q is a non-covalently bound Cofactor for the decoupler proteins, especially for UCP1, UCP2 and UCP3, and that the activity of the decoupling proteins by coenzyme Q or a coenzyme Q analogue can be influenced. Especially the function of at least one of the decoupler proteins UCP1 is preferred, UCP2 and UCP3 regulated (D. W. Gong et al., J. Biol. Chem. 272 (39) (1997), 24129-32; C. Fleury et al., Nat. Genet. 15 (3) (1997), 269-272; O. Boss et al., FEBS Lett. 408 (1) (1997), 39-42).

Durch die Zugabe des Cofaktors kann insbesondere die Aktivität der Entkopplerproteine induziert bzw. erhöht werden. Erst in Gegenwart des Cofaktors können die Entkopplerproteine ihre Funktion als H⁺-Transporter erfüllen.By adding the cofactor, in particular the activity of the decoupler proteins can be induced or increased. Only in the presence of the cofactor can the decoupler proteins fulfill their function as an H ⁺ transporter.

Während erfindungsgemäß der natürliche Cofaktor der Entkopplerproteine, also das Coenzym Q und insbesondere eines der Coenzyme Q₀-Q₂₀ mit der Formel:
While according to the invention the natural cofactor of the decoupler proteins, that is to say the coenzyme Q and in particular one of the coenzymes Q ₀ -Q ₂₀ with the formula:

worin n eine ganze Zahl ist, die die Kettenlänge der Isopren-Seitenkette angibt und bevorzugt von 0 bis 10 (maximaler Wert) und am meisten bevorzugt von 6 bis 10 beträgt, eingesetzt werden kann, ist es auch möglich, ein Coenzym Q-Analogon einzusetzen und mit diesem die Aktivität der Entkopplerproteine, z. B. im Sinne eines erhöhten Energieverbrauchs, zu beeinflussen. Solche Coenzym Q-Analoga können das Coenzym Q am Entkopplerprotein ersetzen, wodurch die Aktivierung reguliert werden kann. Die Aktivierung der Entkopplerproteine kann beispielsweise zur Erzielung eines therapeutischen Effekts verstärkt werden, wenn Coenzym Q-analoge Verbindungen an der Bindungsstelle des Entkopplerproteins für das Coenzym Q angreifen, die durch eine festere Bindung eine größere Entkoppleraktivität hervorrufen. Da das Coenzym Q nur relativ locker an die Entkopplerproteine gebunden ist, kann es durch Strukturanaloga relativ leicht verdrängt werden. Daneben ist es erfindungsgemäß auch möglich, die Aktivität von Entkopplerproteinen durch Zugabe von Coenzym Q oder einem Coenzym Q-Analogon zu einer Zusammensetzung, die zuvor frei von diesem Cofaktor war, erst zu induzieren.where n is an integer representing the chain length of the isoprene side chain indicates and preferably from 0 to 10 (maximum value) and most is preferably from 6 to 10, can also be used possible to use a coenzyme Q analogue and with it the activity the decoupler proteins, e.g. B. in the sense of increased energy consumption influence. Such coenzyme Q analogues can coenzyme Q am Replace decoupler protein, which can regulate activation. The activation of the decoupler proteins can be used, for example, to achieve this of a therapeutic effect can be enhanced when coenzyme Q-analog Compounds at the decoupler protein binding site for the Attack coenzyme Q, which through a stronger bond a larger one Cause decoupling activity. Since the coenzyme Q is only relatively loosely attached to the Decoupler proteins are bound, it can be relative through structural analogs be easily ousted. In addition, it is also possible according to the invention that Activity of decoupler proteins by adding coenzyme Q or a Coenzyme Q analogue to a composition that was previously free of this Cofactor was to induce first.

Das Coenzym Q ist ein Ubichinon, welches eine Chinon-Kopfgruppe und eine hydrophile Isopren-Seitenkette umfasst. Entsprechend weisen bevorzugte Coenzym Q-Analoga eine Chinon-Gruppierung und mindestens eine hydrophobe Seitenkette auf. Es wird angenommen, dass die hydrophobe Seitenkette den Cofaktor in der Membran verankert, während die Chinongruppierung den H⁺-Transport beeinflusst. Coenzyme Q is an ubiquinone which comprises a quinone head group and a hydrophilic isoprene side chain. Accordingly, preferred coenzyme Q analogs have a quinone group and at least one hydrophobic side chain. The hydrophobic side chain is believed to anchor the cofactor in the membrane, while the quinone grouping affects H ⁺ transport.

Bevorzugt weist das Coenzym Q-Analogon die allgemeine Formel:
The coenzyme Q analogue preferably has the general formula:

auf, worin
R¹ einen hydrophoben Rest mit ≧ 10 C-Atomen darstellt, und
R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander H, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy oder R⁴ darstellen oder die Reste R³ und R⁴ einen Ring bilden, der wiederum mit C₁-C₄-Alkyl oder C₁-C₄-Alkoxy substituiert sein kann.on what
R ^{1 represents} a hydrophobic radical with ≧ 10 C atoms, and
R ² , R ³ and R ⁴ independently of one another are H, C ₁ -C ₄ alkyl, C ₁ -C ₄ alkoxy or R ⁴ or the radicals R ³ and R ^{4 form} a ring which in turn is linked to C ₁ -C ₄ alkyl or C ₁ -C ₄ alkoxy may be substituted.

Die Natur des hydrophoben Restes R¹ ist nicht kritisch. So kann R¹ beispielsweise ein linearer oder verzweigter, bevorzugt ein linearer Alkylrest sein. Bei R¹ kann es sich aber auch um einen Rest handeln, der eine oder mehrere Doppelbindungen enthält, beispielsweise ein Polyisopren-Rest. Daneben kann R¹ auch cyclische oder/und aromatische Gruppen umfassen. Weiterhin ist es möglich, dass R¹ Substituenten aufweist, solange diese nicht den hydrophoben Charakter des Restes beeinträchtigen. Es wurde festgestellt, dass R¹ für Coenzym Q-Analoga, die für eine Regulierung von UCP3 vorgesehen sind, bevorzugt mindestens 10 C-Atome aufweist, während R¹ für ein Coenzym Q-Analogon, welches zur Regulierung von UCP1 oder UCP2 vorgesehen ist, bevorzugt mindestens 13 C-Atome aufweist. R¹ weist insbesondere ≧ 20 C-Atome, bevorzugt ≧ 30 C-Atome und mehr bevorzugt ≧ 40 C-Atome auf. Es ist auch möglich, Coenzym Q- Analoga zu verwenden, in denen R¹≧ 50 C-Atome oder ≧ 60 C-Atome enthält. Während die Zahl der C-Atome für den Rest R¹ nach oben nicht begrenzt ist, enthält R¹ bevorzugt ≦ 200 und mehr bevorzugt ≦ 100 C- Atome. The nature of the hydrophobic radical R ¹ is not critical. For example, R ¹ can be a linear or branched, preferably a linear, alkyl radical. However, R ¹ can also be a radical which contains one or more double bonds, for example a polyisoprene radical. In addition, R ^{1 can} also comprise cyclic and / or aromatic groups. It is also possible for R ^{1 to have} substituents as long as these do not impair the hydrophobic character of the rest. It was found that R ¹ for coenzyme Q analogues which are intended for regulating UCP3 preferably has at least 10 C atoms, while R ¹ for a coenzyme Q analogue which is intended for regulating UCP1 or UCP2, preferably has at least 13 carbon atoms. R ¹ has in particular ≧ 20 C atoms, preferably ≧ 30 C atoms and more preferably ≧ 40 C atoms. It is also possible to use coenzyme Q analogs in which R ¹ contains ≧ 50 C atoms or ≧ 60 C atoms. While there is no upper limit to the number of carbon atoms for the radical R ¹ , R ¹ preferably contains ≦ 200 and more preferably ≦ 100 C atoms.

Die Substituenten R², R³ und R⁴ können frei gewählt werden, solange die Kopfgruppe ihren Chinon-Charakter beibehält und zur nicht-kovalenten Bindung an die Bindungsstelle der Entkopplerproteine für Coenzym Q fähig ist. Geeignete Reste umfassen insbesondere Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl-, C₁- C₄-Alkoxy. Es ist auch möglich, dass ein oder mehrere der Reste R², R³ und R⁴ einen weiteren hydrophoben Rest entsprechend R¹ darstellen. Zur Verwendung als Cofaktoren gemäß der Erfindung sind auch Verbindungen geeignet, in denen die Reste R³ und R⁴ einen Ring bilden, der wiederum mit C₁-C₄-Alkyl oder C₁-C₄-Alkoxy substituiert sein kann. Bevorzugt bilden die Reste R³ und R⁴ einen kondensierten aromatischen Ring. Beispiele für solche Verbindungen sind die Minachinone, wie etwa Vitamin K₁₍₂₀₎ und Vitamin K₂₍₃₅₎.The substituents R ² , R ³ and R ⁴ can be chosen as long as the head group retains its quinone character and is capable of non-covalent binding to the binding site of the decoupler proteins for coenzyme Q. Suitable radicals include in particular hydrogen, C ₁ -C ₄ alkyl, C ₁ - C ₄ alkoxy. It is also possible for one or more of the radicals R ² , R ³ and R ^{4 to represent} a further hydrophobic radical corresponding to R ¹ . Compounds in which the radicals R ³ and R ^{4 form} a ring which can in turn be substituted by C ₁ -C ₄ alkyl or C ₁ -C ₄ alkoxy are also suitable for use as cofactors according to the invention. The radicals R ³ and R ⁴ preferably form a condensed aromatic ring. Examples of such compounds are the minaquinones, such as vitamin K _{1 (20)} and vitamin K _{2 (35)} .

Beispiele für weitere Coenzym Q-Analoga, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind Plastochinon, Idebenon und deren Derivate, wie z. B. 2-Desmethylidebenon (2,5-Cyclohexandien-1,4-dion).Examples of other coenzyme Q analogues used according to the invention can be are plastoquinone, idebenone and their derivatives, such as. B. 2-desmethylidebenone (2,5-cyclohexanediene-1,4-dione).

Da offensichtlich Unterschiede im Redoxpotenzial von Chinonen ihre Funktion als Cofaktor für Entkopplerproteine nicht beeinflussen, können auch Strukturanaloge von Coenzym Q verwendet werden, die keine Redoxfunktion aufweisen, aber geometrisch in die Bindestelle für Coenzym Q der Entkopplerproteine passen. Zu solchen Verbindungen gehören Pyridinol-Derivate wie Piericidine, Ubicidine, Chinolon-Derivate wie HQNO, Chinazolin-Derivate wie Femazaquin, SAN 548 A. Auch solche Verbindungen, die keine offensichtlichen Chinon-Analoge, aber Chinon- Antagonisten sind, können als Inhibitoren oder Aktivatoren der Entkopplerproteine eingesetzt werden. Dazu gehören Rotenoide (Isoflavonoide) wie Rotenon, Furanon-Derivate wie Rolliniastatine, Thiazol- Derivate wie Myxothiazol, Benzopyron-Derivate wie Stigmatellin, oder Vallinoide wie Capsaicin. Diese Verbindungen wirken teilweise als Chinon- Antagonisten am Complex I oder III (M. Degli Eposti, Biochimica et Biophysica Acta 1364 (1998), 222-235; Miyoshi, Biochimica et Biophysica Acta 1364 (1998). 236-244). Die dreidimensionale Struktur solcher Verbindungen kann experimentell, beispielsweise durch Röntgenkristallografie, oder auch durch rechnergestützte Methoden, beispielsweise durch Kraftfeldrechnungen, ermittelt werden. Beispielhaft sind die folgenden Verbindungen formelmäßig aufgeführt.There are obvious differences in the redox potential of quinones Function as a cofactor for decoupler proteins structural analogs of coenzyme Q are also used which do not Show redox function, but geometrically in the binding site for coenzyme Q of the decoupler proteins fit. Such connections include Pyridinol derivatives such as piericidines, ubicidines, quinolone derivatives such as HQNO, Quinazoline derivatives such as Femazaquin, SAN 548 A. Also such Compounds that are not obvious quinone analogues, but quinone Antagonists can act as inhibitors or activators of the Decoupler proteins are used. This includes Rotenoids (Isoflavonoids) such as Rotenone, furanone derivatives such as Rolliniastatine, thiazole Derivatives such as myxothiazole, benzopyrone derivatives such as stigmatellin, or Vallinoids like capsaicin. Some of these compounds act as quinones. Antagonists at Complex I or III (Degli Eposti, Biochimica et Biophysica Acta 1364 (1998) 222-235; Miyoshi, Biochimica and Biophysica Acta 1364 (1998). 236-244). The three-dimensional structure of such Connections can be done experimentally, for example X-ray crystallography, or also by computer-aided methods, for example by force field calculations. exemplary the following compounds are listed by formula.

Es wurde festgestellt, dass insbesondere die oxidierten Formen von Coenzym Q bzw. eines Chinon-Analogons von Coenzym Q als Cofaktor nicht-kovalent an Entkopplerproteine gebunden werden und damit deren Aktivität beeinflussen können. Eine Regulierung der Funktion der Entkopplerproteine kann dadurch neben einer Zugabe des Cofaktors auch durch Einstellen des Verhältnisses von reduzierten Formen zu oxidierten Formen des Cofaktors (Cofaktor-H2/Cofaktor) eingestellt werden.It has been found that in particular the oxidized forms of Coenzyme Q or a quinone analogue of coenzyme Q as a cofactor are non-covalently bound to decoupler proteins and thus theirs Can influence activity. A regulation of the function of the In addition to adding the cofactor, decoupling proteins can also by adjusting the ratio of reduced forms to oxidized ones Forms of the cofactor (cofactor-H2 / cofactor) can be set.

Der erfindungsgemäß eingesetzte Cofaktor wird bevorzugt in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 bis 100 : 1, mehr bevorzugt von 10 : 1 bis 80 : 1 bezogen auf das Entkopplerprotein eingesetzt.The cofactor used according to the invention is preferably in a molar Ratio from 1: 1 to 100: 1, more preferably from 10: 1 to 80: 1 based on the decoupler protein used.

Es wurde festgestellt, dass die durch Coenzym Q beeinflusste Funktion der Entkopplerproteine weiterhin abhängig sein kann von der Gegenwart von Fettsäuren oder/und Nukleotiden. Bevorzugt wird deshalb zur Aktivierung der Entkopplerproteine zusätzlich eine Fettsäure eingesetzt, insbesondere eine C₁₀-C₃₀-Fettsäure, welche unverzweigt oder verzweigt und gesättigt oder einfach oder mehrfach ungesättigt sein kann. Beispiele für geeignete Fettsäuren sind Undecansäure, Laurinsäure, Tridecansäure, Myrestinsäure, Pentadecansäure, Palmitinsäure, Margarinsäure, Stearinsäure, Nonadecansäure, Arachinsäure, Behensäure, Lignocerinsäure, Cerotinsäure, Melissinsäure, Isovaleriansäure, Tuberculostearinsäure, Palmitoleinsäure, Ölsäure, Erucasäure, Linolsäure, Linolensäure, Elaeostearinsäure und Arachidonsäure.It was found that the function of the decoupler proteins influenced by coenzyme Q can continue to be dependent on the presence of fatty acids and / or nucleotides. A fatty acid is therefore preferably used to activate the decoupler proteins, in particular a C ₁₀ -C ₃₀ fatty acid, which can be unbranched or branched and saturated or mono- or polyunsaturated. Examples of suitable fatty acids are undecanoic acid, lauric acid, tridecanoic Myrestinsäure, pentadecanoic, margaric acid, stearic acid, nonadecanoic, arachidic, behenic, cerotic, melissinic, isovaleric, tuberculostearic, palmitoleic acid, oleic acid, erucic acid, linoleic acid, linolenic acid, eleostearic acid and arachidonic acid ,

Falls eine Hemmung der Entkopplerproteinaktivität gewünscht wird, kann zusätzlich ein Nukleotid, insbesondere ein Purinnukleotid, wie etwa ATP oder ADP zugesetzt werden.If inhibition of decoupler protein activity is desired, may additionally a nucleotide, in particular a purine nucleotide, such as ATP or ADP can be added.

Da die Entkopplerproteine im Energiestoffwechsel involviert sind, können durch die erfindungsgemäße Verwendung zur Regulierung ihrer Aktivität Erkrankungen, die mit dem Energiestoffwechsel zusammenhängen, behandelt oder vermieden werden. Insbesondere kann Coenzym Q oder ein Coenzym Q-Analogon, welches zur Regulierung der Funktion der Entkopplerproteine geeignet ist, zur Behandlung oder/und Prophylaxe von Fettsucht, Diabetes, neurodegenerativer Erkrankungen, Erkrankungen des Fettsäuremetabolismus oder/und durch Sauerstoff-Radikale hervorgerufenen Alterserkrankungen eingesetzt werden. Durch die Verwendung von Coenzym Q-Analoga kann eine erhöhte oder verminderte Aktivität der Entkopplerproteine erzielt werden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass Coenzym Q-Analoge aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften Zellmembranen leicht passieren können. Weiterhin wurde festgestellt, dass Coenzym Q und die hierin genannten Coenzym Q-Analoga spezifisch von den Entkopplerproteinen erkannt werden, während die Aktivität anderer mitochondraler Trägersysteme, etwa Trägersysteme für Ketoglutarat (G. Fiermonte et al., Biochem. J. 294 (1993), 293-299), Citrat (R. S. Kaplan, J. Bioenerg. Biomembr. 28 (1996), 41-47) und Phosphat (A. Schroers et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 14269-76) nicht beeinflusst werden. Diese Spezifität der Cofaktoren für die Entkopplerproteine ermöglicht ihren Einsatz als Arzneimittel bei gleichzeitiger Minimierung von unerwünschten Nebenwirkungen.Since the decoupler proteins are involved in energy metabolism, by the use according to the invention for regulating their activity Diseases related to energy metabolism treated or avoided. In particular, coenzyme Q or a Coenzyme Q analogue, which is used to regulate the function of the Decoupling proteins is suitable for the treatment and / or prophylaxis of Obesity, diabetes, neurodegenerative diseases, diseases of the Fatty acid metabolism or / and caused by oxygen radicals Aging diseases are used. By the use of Coenzyme Q analogues can increase or decrease the activity of the Decoupler proteins can be achieved. Another advantage is that Coenzyme Q analogues due to their hydrophobic properties Can easily pass through cell membranes. It was also found that Coenzyme Q and the coenzyme Q analogues mentioned herein specifically from the decoupler proteins are recognized while the activity of others mitochondral carrier systems, such as carrier systems for ketoglutarate (G. Fiermonte et al., Biochem. J. 294 (1993), 293-299), citrate (R. S. Kaplan, J. Bioenerg. Biomembr. 28 (1996), 41-47) and phosphate (A. Schroers et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 14269-76) cannot be influenced. This The specificity of the cofactors for the decoupler proteins enables their use as a medicine while minimizing undesirable Side effects.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb die Verwendung von Coenzym Q oder einem Coenzym Q-Analogon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Regulierung der Funktion der Entkopplerproteine.Another object of the invention is therefore the use of Coenzyme Q or a Coenzyme Q analogue to produce a Medicinal product to regulate the function of the decoupler proteins.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Arzneimittel, enthaltend als Wirkstoff
The invention further relates to a medicament containing as an active ingredient

a) a coenzyme Q or / and a coenzyme Q analogue, as above defined, and if necessary
b) a fatty acid.

Die Wirkstoffe können als ein Präparat formuliert sein oder separat, beispielsweise zeitlich versetzt oder/und auf verschiedenen Applikationswegen verabreicht werden. The active ingredients can be formulated as a preparation or separately, for example, staggered in time and / or on different ones Application routes can be administered.

Im erfindungsgemäßen Arzneimittel müssen Fettsäuren nicht unbedingt vorhanden sein, da diese auch in ausreichendem Maße endogen vorliegen können. In bevorzugter Ausführungsform sind allerdings Fettsäuren vorhanden.In the medicament according to the invention, fatty acids are not absolutely necessary be present, since these are also endogenous to a sufficient extent can. In a preferred embodiment, however, are fatty acids available.

Ein Problem, das bei der Suche nach möglichen Cofaktoren, Aktivatoren oder Inhibitoren der von UCP1 verschiedenen Entkopplerproteine, beispielsweise der Entkopplerproteine UCP2, UCP3, UCP4 und UCP5 auftritt, besteht darin, dass diese im Gewebe nur in sehr geringen Mengen vorkommen, sodass ihre direkte Gewinnung aus Gewebe nur schwer realisierbar ist. Für das Screening von aktivierenden Verbindungen wurden diese Entkopplerproteine deshalb nach Transfektion in Hefe exprimiert, wie dies bereits zuvor erfolgreich für UCP1 durchgeführt worden ist (K. S. Echtay et al., Biochemistry 39(12) (2000), 3311-3317; B. Bathgate et al., Mol. Microbiol. 6(3) (1992), 363-370; M. Modriansky et al., J. Biol. Chem. 272(40) (1997), 24759-62; M. Bienengraeber, Biochemistry 37(1) (1998), 3-8). Allerdings liegen von UCP1 verschiedene Entkopplerproteine, insbesondere UCP2 und UCP3, in Hefe nicht in einem funktionell nativen Zustand vor, sodass ein erfolgreiches Screening nicht durchführbar ist. Da erfindungsgemäß festgestellt wurde, dass Coenzym Q nicht nur für UCP1, sondern auch für die übrigen Entkopplerproteine, insbesondere für UCP2 und UCP3, ein essenzieller Cofaktor ist, kann für ein Screening nach geeigneten aktivierenden oder inhibierenden Substanzen in einem ersten Schritt mit UCP1 transfizierte Hefe benutzt werden, um eine erste Auswahl zu treffen. Dabei können Verbindungen festgelegt werden, die eine Wirkung auf die Aktivität von UCP1 zeigen. In einer weiteren Stufe werden dann diese positiven Substanzen, und nur diese, hinsichtlich ihrer Wirkung auf von UCP1 verschiedene Entkopplerproteine getestet. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die in Schritt (b) zu untersuchende Menge an Verbindungen gegenüber der Anzahl an ursprünglich ausgewählten Verbindungen deutlich reduziert, sodass in dem aufwendigeren Schritt (b) nur noch eine geringe Anzahl von bereits vorselektierten Substanzen untersucht werden muss. Bevorzugt werden in Schritt (b) die positiven Kandidatenverbindungen in mit UCP2 oder/und UCP3 transfizierten Kulturen von tierischen Zellen getestet. Bei den ausgewählten Verbindungen handelt es sich bevorzugt um Coenzym Q oder ein Coenzym Q-Analogon. Grundsätzlich können jedoch beliebige Verbindungen getestet werden, um gegebenenfalls weitere Gruppen von aktiven Cofaktoren ausfindig zu machen.A problem when looking for possible cofactors, activators or inhibitors of the decoupler proteins other than UCP1, for example the decoupler proteins UCP2, UCP3, UCP4 and UCP5 occurs, is that this is only in very small amounts in the tissue occur, making their direct extraction from tissue difficult is feasible. For the screening of activating compounds these decoupler proteins are therefore expressed in yeast after transfection, such as this has already been successfully carried out for UCP1 (K. S. Echtay et al., Biochemistry 39 (12) (2000), 3311-3317; B. Bathgate et al., Mol. Microbiol. 6 (3) (1992), 363-370; M. Modriansky et al., J. Biol. Chem. 272: 40 (1997) 24759-62; M. Bienengraeber, Biochemistry 37 (1) (1998), 3-8). However, there are different decoupler proteins from UCP1, especially UCP2 and UCP3, in yeast not in a functionally native Condition before, so that a successful screening cannot be carried out. There According to the invention it was found that coenzyme Q is not only for UCP1, but also for the other decoupler proteins, especially for UCP2 and UCP3, which is an essential cofactor, can be screened for suitable activating or inhibiting substances in a first Step with UCP1 transfected yeast can be used to make an initial selection hold true. Connections can be defined that have an effect point to the activity of UCP1. Then in a further stage these positive substances, and only these, in terms of their effect on Different decoupler proteins tested by UCP1. In which The method according to the invention becomes the one to be examined in step (b) Amount of connections versus the number of originally selected connections significantly reduced, so that more complex step (b) only a small number of already preselected substances must be examined. Are preferred in Step (b) the positive candidate compounds in with UCP2 or / and UCP3 transfected cultures of animal cells were tested. Both selected compounds are preferably coenzyme Q or a coenzyme Q analogue. Basically, however, any Compounds to be tested for additional groups of identify active cofactors.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von ausgewählten Verbindungen auf die Entkopplerproteinaktivität kann insbesondere zur Entwicklung von Wirkstoffen für Arzneimittel eingesetzt werden.The inventive method for determining the effect of selected compounds on the decoupler protein activity used in particular for the development of active ingredients for pharmaceuticals become.

Ein weiteres Verfahren, das zum Testen einer möglichen Cofaktorfunktion für Entkopplerproteine entwickelt worden ist, umfasst die Schritte:
Another method that has been developed to test a possible cofactor function for decoupler proteins comprises the steps:

a) synthesizing a decoupler protein in E. coli,
b) Incorporation of the decoupler protein synthesized in E. coli into artificial ones Vesicles and
c) determining the decoupler protein activity in the presence of a selected connection.

Durch die Synthese in E.coli, Solubilisierung, Renaturierung und Rekonstituierung in künstliche Vesikel, beispielsweise in Proteoliposomen, können Entkopplerproteine in ihrer nativen Konfiguration gewonnen werden. Bei einer solchen Vorgehensweise unter Exprimierung des Entkopplerproteins in E.coli fehlt aber der essenzielle Cofaktor, sodass die Entkopplerproteine trotz korrekter Faltung nicht aktiv sind. Die korrekte Faltung der Entkopplerproteine konnte beispielsweise anhand ihrer Nukleotidbindefähigkeit gezeigt werden. Durch Zugabe verschiedener Testverbindungen kann nun ein Screening hinsichtlich geeigneter Cofaktorverbindungen, welche beispielsweise als Arzneimittelkandidaten eingesetzt werden können, durchgeführt werden. Besonders vorteilhaft ist es, die Entkopplungsaktivität mit einem fluoreszierenden pH-Indikator, wie etwa Pyranin, nachzuweisen.Through synthesis in E.coli, solubilization, renaturation and Reconstitution in artificial vesicles, for example in proteoliposomes, decoupler proteins can be obtained in their native configuration. With such a procedure while expressing the Decoupler protein in E.coli lacks the essential cofactor, so that Decoupler proteins are not active despite correct folding. The correct one The decoupler proteins could be folded, for example, on the basis of their Nucleotide binding ability are shown. By adding various Test compounds can now be screened for suitable ones Cofactor compounds, for example as drug candidates can be used. It is particularly advantageous it, the decoupling activity with a fluorescent pH indicator, such as such as pyranine.

Weiterhin wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass Lösungsmittel in vitro für die Aktivierung der Entkopplerproteine durch CoQ wichtig sein können. Lösungsmittel, die eine Aktivierung mit CoQ oder Analoga oder Antagonisten erlauben, sind insbesondere Chloroform, Halothan, Dichlormethan und -ethan sowie Isoamylalkohol. Bevorzugt werden daher derartige Lösungsmittel im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt. Besonders bevorzugt wird Dichlormethan eingesetzt.Furthermore, it was found in the context of the present invention that In vitro solvent for the activation of the decoupler proteins by CoQ can be important. Solvents that are activated with CoQ or Allow analogs or antagonists, in particular chloroform, Halothane, dichloromethane and ethane and isoamyl alcohol. Prefers become such solvents in the process of the invention used. Dichloromethane is particularly preferably used.

Die erfindungsgemäße Erkenntnis, dass das Coenzym Q ein essenzieller Cofaktor der Entkopplerproteine ist, ermöglicht auch die Herstellung von aktivem Entkopplerprotein. Dabei können nach bisher bekannten Verfahren in nativer Konfiguration hergestellte Entkopplerproteine, die keine Aktivität zeigten, durch Zugabe von Coenzym Q oder einem Coenzym Q-Analogon aktiviert werden. Bevorzugt gewinnt man ein Entkopplerprotein in Form von Inclusion Bodies aus E.coli, solubilisiert und renaturiert anschließend das Entkopplerprotein und versetzt es dann mit einem geeigneten Cofaktor, insbesondere Coenzym Q oder einem Coenzym Q-Analogon, wie oben beschrieben.The realization according to the invention that the coenzyme Q is an essential one Cofactor of the decoupler proteins also enables the production of active decoupler protein. It can be done according to previously known methods Decoupler proteins produced in native configuration that have no activity demonstrated by adding coenzyme Q or a coenzyme Q analog to be activated. A decoupler protein is preferably obtained in the form of Inclusion bodies from E. coli, then solubilized and renatured the Decoupler protein and then mix it with a suitable cofactor, especially coenzyme Q or a coenzyme Q analogue, as above described.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Figuren und die Beispiele weiter erläutert:The invention is further elucidated by the attached figures and the examples explains:

Fig. 1 zeigt einen Assay zur Feststellung der funktionalen Integrität von renaturiertem rekombinantem UCP aus Inclusion Bodies (IB; Einschlusskörper) von E.coli. Dargestellt ist die Fluoreszenz einer Bindung von [2'-O-(Dimethylamino)-naphthalin-1- sulfonyl]-dansyl-GTB (hergestellt wie bei S. G. Huang et al., Biochemistry 34(1) (1995), 349-360 beschrieben) an mit Digitonin behandelte IB-UCP1, IB-UCP2 und IB-UCP3 bei einer Anregungswellenlänge λ_ex = 350 nm und einer Emissionswel lenlänge von λ_em = 525 nm. Dansyl-GTP (5 µM) wurde einer Lösung von 45 µg Protein/ml in 10 mM Mes/Hepes-Puffer enthaltend 0,3% Digitonin, pH 6,5 bei 10°C zugegeben. Um die UCP-assoziierte Bindung zu ermitteln, wurden 0,5 mM ATP zugegeben, um den fluoreszierenden Liganden zu verdrängen. Für eine weitere Diskriminierung wurde die Bindestelle mit dem Wooward-Reagenz K (WRK) inaktiviert. WRK wurde mit dem Protein bei einer Konzentration von 10 µM für 30 Minuten vor der Zugabe des Dansyl-GTP inkubiert. Das Insert bei UCP1 zeigt einen Versuch unter Verwendung eines UCP1-Proteins, welches nicht von Sarcosyl gereinigt wurde. Fig. 1 shows an assay for determining the functional integrity of renatured recombinant UCP from inclusion bodies (IB; inclusion bodies) of E. coli. The fluorescence of a bond of [2'-O- (dimethylamino) naphthalene-1-sulfonyl] dansyl-GTB (produced as described by SG Huang et al., Biochemistry 34 (1) (1995), 349-360) is shown ) on IB-UCP1, IB-UCP2 and IB-UCP3 treated with digitonin at an excitation wavelength λ _ex = 350 nm and an emission wavelength of λ _em = 525 nm. Dansyl-GTP (5 µM) was added to a solution of 45 µg protein / ml in 10 mM Mes / Hepes buffer containing 0.3% digitonin, pH 6.5 added at 10 ° C. To determine the UCP-associated binding, 0.5 mM ATP was added to displace the fluorescent ligand. For further discrimination, the binding site was inactivated with the Wooward reagent K (WRK). WRK was incubated with the protein at a concentration of 10 µM for 30 minutes before the addition of the Dansyl-GTP. The insert at UCP1 shows an experiment using a UCP1 protein that was not purified from sarcosyl.

Fig. 2 zeigt die Aktivierung des H⁺-Transports in UCP1, UCP2 und UCP3 durch das Coenzym Q₁₀ anhand des H⁺-Influx in Vesikel, die mit Digitonin behandelten IB-UCP rekonstituiert wurden. Gezeigt ist die Aufnahme von H⁺ in rekonstituierte UCP- Liposome in Gegenwart von Coenzym Q₁₀ (CoQ₁₀; 2 nmol) und Abwesenheit einer Fettsäure (CoQ), in Gegenwart einer Fettsäure und ohne CoQ₁₀ (LA), in Gegenwart von CoQ₁₀ und einer Fettsäure (CoQ + LA) sowie die Inhibierung mit 20 µM ATP (+ ATP). Der H⁺-Influx wurde als Veränderung des externen pH-Wertes anhand der Pyraninfluoreszenz bei λ_{ex =} 467 nm und λ_em = 510 nm gemessen. 50 µl Vesikel enthaltend 1,3 µg Protein und 530 µg Phospholipid wurden 0,5 mM HEPES-Puffer, pH 7,3, enthaltend 1 µM Pyranin, 0,5 mM EDTA und 280 mM Saccharose auf ein Volumen von 330 µl bei einem pH-Wert von 6,8 und 10°C zugegeben. Valinomycin (Val) mit einer Endkonzentration von 2,5 µM wurde zugegeben, um ein Membranpotenzial in Gegenwart von 125 µM Laurinsäure zu erzeugen. Der pH-Wert wurde schrittweise durch Zugabe von H₂SO₄ mit jeweils 10 nmol H⁺ auf 6,8 eingestellt. Das Entkoppeln durch CCCP (1 µM) wurde verwendet, um die H⁺-Aufnahmekapazität der Vesikel zu bestimmen. Fig. 2 shows the activation of the H ⁺ transport in UCP1, UCP2, and UCP3 were reconstituted by the coenzyme Q ₁₀ based on the H ⁺ influx into vesicles treated with digitonin IB-UCP. Shown is the uptake of H ⁺ in reconstituted UCP liposomes in the presence of coenzyme Q ₁₀ (CoQ ₁₀ ; 2 nmol) and the absence of a fatty acid (CoQ), in the presence of a fatty acid and without CoQ ₁₀ (LA), in the presence of CoQ ₁₀ and a fatty acid (CoQ + LA) and inhibition with 20 µM ATP (+ ATP). The H ⁺ influx was measured as a change in the external pH using the pyranine fluorescence at λ _{ex =} 467 nm and λ _em = 510 nm. 50 µl vesicles containing 1.3 µg protein and 530 µg phospholipid were 0.5 mM HEPES buffer, pH 7.3, containing 1 µM pyranine, 0.5 mM EDTA and 280 mM sucrose to a volume of 330 µl at pH -Value of 6.8 and 10 ° C added. Valinomycin (Val) at a final concentration of 2.5 µM was added to create a membrane potential in the presence of 125 µM lauric acid. The pH was gradually adjusted to 6.8 by adding H ₂ SO ₄ with 10 nmol H ⁺ each. Decoupling by CCCP (1 µM) was used to determine the H ⁺ uptake capacity of the vesicles.

Fig. 3 zeigt die Ergebnisse gemäß Fig. 2, dargestellt als anfängliche H⁺-Transportrate (V: µmol/min mg Protein) geteilt durch die Kapazität der Vesikel (C: µmol/mL). FIG. 3 shows the results according to FIG. 2, represented as the initial H ⁺ transport rate (V: μmol / min mg protein) divided by the capacity of the vesicles (C: μmol / ml).

Fig. 4 zeigt die Identifizierung von Coenzym Q als Cofaktor für die H⁺-Transportaktivität von UCP1. Fig. 4a zeigt eine Analyse von Lipidextrakten verschiedener Mitochondrien durch Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung von Cyclohexan: Ethylacetat (30 : 20) als Laufmittel. Mitochondrien (etwa 200 mg) aus braunem Fettgewebe (BAT), Hefe und Rinderherz (BH) wurden mit Wasser auf eine Konzentration von 15 mg/ml verdünnt. Nach Lyophilisierung wurden 50 ml Chloroform zugegeben und über Nacht bei 4°C gerührt. Nach Filtration wurde der Extrakt unter Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug etwa 20% (nach Masse) an Mitochondrienprotein. In Fig. 4b ist die Dünnschichtchromatographieanalyse der Mitochondrienextraktfraktionen gezeigt. Der Mitochondrienextrakt von BH in 1,5 ml Chloroform wurde auf eine Silikasäule bei Raumtemperatur unter Verwendung von Chloroform zur Äquilibrierung und Elution aufgetragen. Es wurden die Fraktionen 1 (Triglyceride), 2 (aktivierende Verbindungen), 3 (Fettsäuren) und 4 (Lipide) gesammelt. Fig. 4d zeigt ein Dünnschichtchromatogramm von Coenzym Q₆ und Coenzym Q₁₀ (1 µg) unter den gleichen Bedingungen. In Fig. 4b schließlich sind die H⁺-Transportraten berechnet aus der H⁺-Aufnahme, wie in Fig. 2 beschrieben, dargestellt. Die Ergebnisse sind als die anfängliche H⁺-Transportrate (V: µmol/min mg Protein) geteilt durch die Kapazität der Vesikel (C: µmol/ml) dargestellt. Fig. 4 shows the identification of coenzyme Q as a cofactor for the H ⁺ transport activity of UCP1. FIG. 4a shows an analysis of lipid extracts from various mitochondria by thin layer chromatography (TLC) using cyclohexane: ethyl acetate (30: 20) as eluent. Mitochondria (approximately 200 mg) from brown adipose tissue (BAT), yeast and bovine heart (BH) were diluted with water to a concentration of 15 mg / ml. After lyophilization, 50 ml of chloroform were added and the mixture was stirred at 4 ° C. overnight. After filtration, the extract was dried under vacuum. The yield was about 20% (by mass) of mitochondrial protein. In FIG. 4b, the thin layer chromatography analysis of mitochondrial extract fractions is shown. The mitochondrial extract of BH in 1.5 ml chloroform was applied to a silica column at room temperature using chloroform for equilibration and elution. Fractions 1 (triglycerides), 2 (activating compounds), 3 (fatty acids) and 4 (lipids) were collected. FIG. 4d shows a thin layer chromatogram of coenzyme Q ₆ and coenzyme Q ₁₀ (1 μg) under the same conditions. Finally, FIG. 4b shows the H ⁺ transport rates calculated from the H ⁺ uptake, as described in FIG. 2. The results are presented as the initial H ⁺ transport rate (V: µmol / min mg protein) divided by the capacity of the vesicles (C: µmol / ml).

Fig. 5 zeigt die Abhängigkeit des H⁺-Transports von der Konzentration an Coenzym Q bzw. an Fettsäure. Die Transportaktivität wurde mit Inclusion Bodies (IB) von UCP1, UCP2 und UCP3 gemessen. Fig. 5A zeigt eine Titration mit Coenzym Q₁₀. Der H⁺-Transport von IB-UCP in rekonstituierten Vesikeln wurde bei einer ansteigenden Menge an Coenzym Q bei einer Sättigungskonzentration von Laurinsäure (125 µM) gemessen. In Fig. 5B ist eine Titration mit Laurinsäure bei einer konstanten Konzentration von Coenzym Q von 2 nMol gezeigt. Die angegebene Nettotransportaktivität wurde durch Abziehen der Aktivität in Gegenwart von 20 µM ATP erhalten. Fig. 5 shows the dependence of H ⁺ transport from the concentration of coenzyme Q or of fatty acid. Transport activity was measured using inclusion bodies (IB) from UCP1, UCP2 and UCP3. Fig. 5A shows a titration with coenzyme _Q10. The H ⁺ transport of IB-UCP in reconstituted vesicles was measured with an increasing amount of coenzyme Q at a saturation concentration of lauric acid (125 µM). FIG. 5B shows a titration with lauric acid at a constant concentration of coenzyme Q of 2 nmol. The stated net transport activity was obtained by subtracting the activity in the presence of 20 µM ATP.

Fig. 6 zeigt die Konzentrationsabhängigkeit der Inhibierung durch ATP bzw. ADP des Coenzym Q und Fettsäure stimulierten H⁺- Transports durch UCP1, UCP2 und UCP3. Es erfolgte eine Titration mit ATP und ADP hinsichtlich des H⁺-Influx in Proteoliposomen, die mit Digitonin behandelten IB-UCP1 UCP2 und UPC3 rekonstituiert wurden. Die H⁺- Transportmessungen wurden bei festen Mengen an Laurinsäure (125 µM) und an Coenzym Q (2 nmol) durchgeführt. Die K_I-Werte für die ATP- und ADP-Inhibition sind unten in Tabelle 1 gezeigt. Fig. 6 shows the concentration dependence of the inhibition by ATP and ADP of the coenzyme Q and fatty acid stimulated H ⁺ - transport by UCP1, UCP2 and UCP3. The ATP and ADP were titrated for the H ⁺ influx in proteoliposomes, which were reconstituted with digitonin-treated IB-UCP1 UCP2 and UPC3. The H ⁺ transport measurements were carried out with fixed amounts of lauric acid (125 μM) and coenzyme Q (2 nmol). The K _I values for ATP and ADP inhibition are shown in Table 1 below.

Examples example 1 Expression in bacteria, isolation and renaturation of UCP-containing Inclusion Bodies

UCP1 von braunem Fettgewebe (BAT) von Hamster (K. S. Echtay et al., Biochemistry 36(27) (1997), 8253-60) und humane UCP2-und UCP3-Gene (J. P. Giacobino und P. Muzzin, Genf) wurden in E.coli-Zellen BL21 (DE3)plysS exprimiert, die mit dem das UCP-Gen enthaltenden Plasmid pET24a (Novagen) transfiziert worden sind. Eine E.coli-Zellkolonie, die mit dem ein UCP-Gen enthaltenden Plasmid transfiziert worden ist, wurde in ein LB-Medium (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl in 1 l), welches Kanamycin (30 µg/ml) enthielt, inokuliert und die Kultur wurde bei 37°C gezüchtet. Die Expression wurde mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid induziert. Die Inclusion Bodies wurden wie bei K. S. Echtay et al., FEBS Lett. 450(1-2) (1999), 8-12 beschrieben, isoliert.UCP1 of brown adipose tissue (BAT) from hamsters (K.S. Echtay et al., Biochemistry 36 (27) (1997), 8253-60) and human UCP2 and UCP3 genes (J. P. Giacobino and P. Muzzin, Geneva) were made in E. coli cells BL21 (DE3) plysS expressed with the plasmid containing the UCP gene pET24a (Novagen) have been transfected. An E. coli cell colony with the plasmid containing a UCP gene has been transfected into a LB medium (10 g tryptone, 5 g yeast extract and 10 g NaCl in 1 l), which Contained kanamycin (30 µg / ml), inoculated and the culture was at 37 ° C bred. Expression was with 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside induced. The inclusion bodies were as described by K.S. Echtay et al., FEBS Lett. 450 (1-2) (1999), 8-12.

Zur Renaturierung des IB-UCP wurden etwa 5 mg IB in 400 µl 2% (Gew/Vol) Sarcosyl in Puffer A (50 mM NH₄HCO₃, 2 mM Dithioerythritol (DTE) und 2 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), pH 8,0) gelöst und danach bei 12.500 U/min für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde dann mit dem Puffer A auf eine Sarcosylendkonzentration von 0,5% und eine Endkonzentration an Protein von 3 mg/ml verdünnt. Zur Renaturierung des solubilisierten UCP wurde Sarcosyl durch Digitonin ersetzt. Das Protein wurde hierzu auf eine Endkonzentration von 0,6 mg/ml mit dem Puffer B (1 mM DTE, 50 µM β-Mercaptoethanol, 100 mM Kaliumphosphat, 0,2% Digitonin (wasserlöslich) und 0,1% Sarcosyl, pH 8,0) verdünnt, dreifach durch Druckdialyse bei 4°C aufkonzentriert und wiederum auf das ursprüngliche Volumen mit dem Puffer B ohne Sarcosyl verdünnt. Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt, gefolgt von zwei Zyklen mit Puffer C (1 mM DTE, 1 mM EDTA und 100 mM Kaliumphosphat, pH 8,0). Das gesamte Verfahren dauerte etwa 10 Stunden. Um Sarcosyl vollständig zu entfernen, wurde 1 ml Digitonin-solubilisiertes IB-Protein (etwa 1,5 mg Protein/ml) mit einem Anionenaustauschharz (21 K Dowex mesh 20-50; 800 mg CL^--Form plus 20 mg normale OH^--Form) durch Schütteln bei 4°C über Nacht behandelt. Die Ausbeute an renaturiertem Protein betrug 80 bis 90%.To renaturate the IB-UCP, about 5 mg IB in 400 µl 2% (w / v) sarcosyl in buffer A (50 mM NH ₄ HCO ₃ , 2 mM dithioerythritol (DTE) and 2 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), pH 8, 0) dissolved and then centrifuged at 12,500 rpm for 30 minutes. The supernatant was then diluted with buffer A to a final sarcosyl concentration of 0.5% and a final protein concentration of 3 mg / ml. Sarcosyl was replaced by digitonin to renaturate the solubilized UCP. For this purpose the protein was brought to a final concentration of 0.6 mg / ml with the buffer B (1 mM DTE, 50 μM β-mercaptoethanol, 100 mM potassium phosphate, 0.2% digitonin (water-soluble) and 0.1% sarcosyl, pH 8 , 0) diluted three times by pressure dialysis at 4 ° C and again diluted to the original volume with buffer B without sarcosyl. This step was repeated three times, followed by two cycles with buffer C (1 mM DTE, 1 mM EDTA and 100 mM potassium phosphate, pH 8.0). The entire process took about 10 hours. To completely remove Sarcosyl, 1 ml of digitonin-solubilized IB protein (about 1.5 mg protein / ml) was mixed with an anion exchange resin (21 K Dowex mesh 20-50; 800 mg CL ^- form plus 20 mg normal OH ^- - Form) treated by shaking at 4 ° C overnight. The yield of renatured protein was 80 to 90%.

Example 2 Reconstitution of UCP from inclusion bodies in phospholipid vesicles and measurement of H ⁺ transport

Das solubilisierte und Digitonin-behandelte Protein wurde in Liposomen rekonstituiert. Dazu wurde Eigelb-Phospholipid (E. Winkler et al., Eur. J. Biochem. 207(1) (1992), 132-145) emulgiert und mit einem Beladungspuffer bestehend aus 100 mM Kaliumphosphat, 0,2 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7,6 und dem Detergenz n-Decylpentaoxyethylen (C₁₀E₅; Fluka) bei 0°C auf ein Verhältnis von Detergenz: Phospholipid von 1,4 (nach Masse) verdünnt. Die Zugabe von Digitonin behandelten IB bei einem Verhältnis von Phospholipid: Protein von 350 : 1 (nach Masse) resultierte in einer Konzentration von Phospholipid von 17 mg/ml und Protein von 0,05 mg/ml. Das Detergenz wurde schrittweise durch 360 mg Amberlite XAD2 (Sigma) in 20 Minuten-Intervallen mit vorsichtigem Schütteln über Nacht bei 4°C entfernt. Zur Entfernung von externen löslichen Stoffen aus den Proteoliposomenpräparationen wurden die Vesikel über Sephadex G-75 äquilibriert mit 0,5 mM HEPES, 0,2 mM EDTA, pH 7,3 und 0,28 M Saccharose geleitet. Der H⁺-Transport wurde unter Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs Pyranin (8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure, Trinatriumsalz; Molecular Probes) als pH-sensitiver Fluoreszenzsonde bei λ_ex = 467 nm und λ_em = 510 nm in einem Standardmedium (280 mM Saccharose, 0,5 mM HEPES, 0,2 mM EDTA, 1 µM Pyranin, pH 6,8 und Laurat) bestimmt. Valinomycin (2,5 µM) wurde zugegeben, um die durch den K⁺-Ausfluss getriebene H⁺-Aufnahme zu initiieren. Der Entkoppler CCCP (1 µM) wurde zugegeben, um die Vesikelkapazität für eine H⁺- Aufnahme zu bestimmen.The solubilized and digitonin-treated protein was reconstituted in liposomes. For this purpose, egg yolk phospholipid (E. Winkler et al., Eur. J. Biochem. 207 (1) (1992), 132-145) was emulsified and mixed with a loading buffer consisting of 100 mM potassium phosphate, 0.2 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7.6 and the detergent n-decylpentaoxyethylene (C ₁₀ E ₅ ; Fluka) diluted at 0 ° C to a detergent: phospholipid ratio of 1.4 (by mass). The addition of digitonin treated IB at a phospholipid: protein ratio of 350: 1 (by mass) resulted in a phospholipid concentration of 17 mg / ml and protein of 0.05 mg / ml. The detergent was gradually removed by 360 mg of Amberlite XAD2 (Sigma) at 20 minute intervals with gentle shaking at 4 ° C overnight. To remove external soluble substances from the proteoliposome preparations, the vesicles were passed over Sephadex G-75 equilibrated with 0.5 mM HEPES, 0.2 mM EDTA, pH 7.3 and 0.28 M sucrose. The H ⁺ transport was carried out using the fluorescent dye pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid, trisodium salt; molecular probes) as pH-sensitive fluorescent probe at λ _ex = 467 nm and λ _em = 510 nm in a standard medium ( 280 mM sucrose, 0.5 mM HEPES, 0.2 mM EDTA, 1 uM pyranine, pH 6.8 and laurate). Valinomycin (2.5 µM) was added to initiate H ⁺ uptake driven by K ⁺ outflow. The decoupler CCCP (1 µM) was added to determine the vesicle capacity for H ⁺ uptake.

Während auf diese Weise rekonstituiertes UCP1, UCP2 und UCP3 eine normale Cl^--Transportaktivität zeigten, wiesen sie keine äquivalente Fettsäure-abhängige H⁺-Transportaktivität auf. Allerdings konnte durch die beschriebene Rekonstituierungsvorgehensweise die in nativem UCP vorhandene Nukleotidabhängigkeit, insbesondere gegenüber Purinnukleotiden, bei dem IB-UCP wieder hergestellt werden. Dies gelang durch schrittweises Ersetzen des solubilisierenden Sarcosyls im solubilisierten Protein IB-UCP mit Digitonin, gefolgt von einer Anionenaustauschbehandlung, um restliches Sarcosyl zu entfernen. Nach dieser Behandlung hatten die erhaltenen IB-UCP1, IB-UCP2 und IB-UCP3 die native Nukleotidbindekapazität erlangt, wie mit dem fluoreszierenden Derivat Dansyl-GTP nachgewiesen werden konnte (siehe Fig. 1).While UCP1, UCP2 and UCP3 reconstituted in this way showed normal Cl ^- transport activity, they had no equivalent fatty acid-dependent H ⁺ transport activity. However, the described reconstitution procedure made it possible to restore the nucleotide dependency present in native UCP, in particular with respect to purine nucleotides, in the IB-UCP. This was accomplished by gradually replacing the solubilizing sarcosyl in the solubilized protein IB-UCP with digitonin, followed by anion exchange treatment to remove residual sarcosyl. After this treatment, the IB-UCP1, IB-UCP2 and IB-UCP3 obtained had the native nucleotide binding capacity, as could be demonstrated with the fluorescent derivative dansyl-GTP (see FIG. 1).

Bei Zugabe von UCP nimmt die Fluoreszenz von Dansyl-GTP stark zu. Die Fluoreszenzabnahme bei einer nachfolgenden Zugabe von ATP kann der UCP-Bindung zugeordnet werden. Als weitere Kontrolle für die native Konformation des rekonstituierten UCP wurde das Carboxylreagenz "Woodward-Reagenz K" (WRK) verwendet, welches in UCP1 spezifisch die Carboxylgruppe E190 am Eingang der Nukleotidbindestelle blockiert. Eine Vorinkubation mit kleinen Mengen an WRK verringert auch deutlich die ATP sensitive Fluoreszenz in UCP1, UCP2 und UCP3 (siehe Fig. 1). Diese Ergebnisse zeigen, dass UCP2 und UCP3 Nukleotide in ähnlicher Weise wie UCP1 binden können. Weiterhin zeigt die Sensitivität gegenüber WRK an, dass die Nukleotidbindung eine ähnliche pH-Abhängigkeit unter der Kontrolle von E192 (UCP2) bzw. E195 (UCP3) aufweist. When UCP is added, the fluorescence of Dansyl-GTP increases significantly. The decrease in fluorescence with a subsequent addition of ATP can be assigned to the UCP binding. As a further control for the native conformation of the reconstituted UCP, the carboxyl reagent "Woodward-Reagent K" (WRK) was used, which specifically blocks the carboxyl group E190 at the entrance of the nucleotide binding site in UCP1. Pre-incubation with small amounts of WRK also significantly reduces the ATP-sensitive fluorescence in UCP1, UCP2 and UCP3 (see FIG. 1). These results show that UCP2 and UCP3 can bind nucleotides in a similar way to UCP1. Furthermore, the sensitivity to WRK indicates that the nucleotide binding has a similar pH dependence under the control of E192 (UCP2) or E195 (UCP3).

Example 3 Establish an H ⁺ transport activity

Obwohl die IB-UCP-Präparationen nach Inkorporation in Phospholipidvesikel ein CL^--Transport- und Nukleotidbindeverhalten wie native UCP zeigten, wiesen sie trotz der offensichtlich korrekten Faltung nicht den gesuchten H⁺-Transport auf. Daraus wurde gefolgert, dass ein Cofaktor für den H⁺- Transport notwendig ist. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass das Coenzym Q, insbesondere das Coenzym Q₁₀ den zur Herstellung des H⁺-Transports durch IB-UCP erforderlichen Cofaktor bildet. Die Zugabe von Coenzym Q₁₀ zu rekonstituierten IB-UCP, insbesondere IB-UCP1, IB- UCP2 und IB-UCP3, resultierte in einer starken Stimulation des H⁺- Transports (Fig. 2).Although the IB-UCP preparations showed a CL ^- transport and nucleotide binding behavior like native UCP after incorporation into phospholipid vesicles, despite the apparently correct folding, they did not show the H ⁺ transport sought. From this it was concluded that a cofactor is necessary for H ⁺ transport. It has now surprisingly been found that the coenzyme Q, in particular the coenzyme Q _10, forms the cofactor required for producing the H ⁺ transport by IB-UCP. The addition of coenzyme Q ₁₀ to reconstituted IB-UCP, in particular IB-UCP1, IB-UCP2 and IB-UCP3, resulted in a strong stimulation of the H ⁺ transport ( FIG. 2).

Der Cofaktor konnte aus Mitochondrien unter Verwendung von Lipidlösungsmitteln extrahiert werden. Dabei wurde festgestellt, dass die Extraktion von lyophilisierten Mitochondrien mit Chloroform Extrakte ergab, die die höchste Potenz im Hinblick auf eine Aktivierung des H⁺-Transports von wie oben beschriebenen rekonstituierten IB-UCPs aufwiesen.The cofactor could be extracted from mitochondria using lipid solvents. It was found that the extraction of lyophilized mitochondria with chloroform gave extracts which had the highest potency with regard to activation of the H ⁺ transport of reconstituted IB-UCPs as described above.

Daraus ergibt sich, dass die Aktivierung vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungsmittels, wie Chloroform, Halothan, Dichlormethan, Dichlorethan oder Isoamylalkohol durchgeführt wird.It follows that the activation is preferably in the presence of a Solvents such as chloroform, halothane, dichloromethane, dichloroethane or isoamyl alcohol is carried out.

Der durch den Cofaktor Coenyzm Q₁₀ aktivierte H⁺-Transport von UCPs ist abhängig von Fettsäuren und wird durch Nukleotide, wie etwa ATP, inhibiert. Dies zeigt, dass es sich um einen spezifischen Cofaktor handelt. The H ⁺ transport of UCPs activated by the cofactor Coenyzm Q ₁₀ is dependent on fatty acids and is inhibited by nucleotides such as ATP. This shows that it is a specific cofactor.

Example 4 Concentration dependence of the H ⁺ transport of coenzyme Q and of fatty acids

Die Konzentrationsabhängigkeit des H⁺-Transports für die beiden regulatorischen Faktoren für UCP, nämlich für den Cofaktor Coenzym Q und für Fettsäuren, wurde bestimmt. Die H⁺-Transportaktivität wurde mit steigenden Mengen am Coenzym Q bei einer Konzentration von Laurinsäure nahe der Sättigung (125 µM) titriert (Fig. 4A). Die Aufnahmegeschwindigkeit entspricht dem nukleotidsensitiven Teil, d. h. der Differenz zu der mit 20 µM ATP gemessenen Geschwindigkeit. Eine Sättigung wird mit geringen Mengen an Coenzym Q (zwischen 1 und 2 nmol) erreicht. Die Werte für die Halbsättigung liegen bei 0,9 nMol Coenzym Q für UCP1 und 3,5 nMol Coenzym Q für UCP2 und UCP3. Wichtig ist das molare Verhältnis von CoQ zu Phospholipid (600 nMol) und zu UCP2 und UCP3 (0,13 nMol), da das meiste des zugegebenen CoQ vom Lösungsmittel in das Phospholipid transferriert wird. Eine vollständige Aktivierung wird erzielt, wenn das molare Verhältnis von Coenzym Q zu Phospholipid 1 : 300 erreicht und das molare Verhältnis von Coenzym Q zu UCP-Dimer 17 : 1. In Fig. 4B ist die Abhängigkeit des H⁺-Transports von der Fettsäurekonzentration bei einer gegebenen sättigenden Menge an Coenzym Q (2 nMol) angegeben. Dargestellt ist wiederum die Differenz zur ATP inhibierten H⁺-Transportgeschwindigkeit. Bei UCP1 und UCP2 ist der H⁺- Transport bei 150 µM Laurinsäure gesättigt, während bei UCP3 keine Sättigung bis zu 200 µM Laurinsäure beobachtet wurde. Die Halbsättigung liegt bei 80 µM Laurinsäure für UCP1 und UCP2 und bei < 130 µM für UCP3. The concentration dependence of the H ⁺ transport for the two regulatory factors for UCP, namely for the cofactor coenzyme Q and for fatty acids, was determined. The H ⁺ transport activity was titrated with increasing amounts of coenzyme Q at a concentration of lauric acid close to saturation (125 μM) ( FIG. 4A). The uptake rate corresponds to the nucleotide sensitive part, ie the difference to the rate measured with 20 µM ATP. Saturation is achieved with small amounts of coenzyme Q (between 1 and 2 nmol). The half-saturation values are 0.9 nmol coenzyme Q for UCP1 and 3.5 nmol coenzyme Q for UCP2 and UCP3. The molar ratio of CoQ to phospholipid (600 nmol) and to UCP2 and UCP3 (0.13 nmol) is important, since most of the CoQ added is transferred from the solvent to the phospholipid. Complete activation is achieved when the molar ratio of coenzyme Q to phospholipid reaches 1: 300 and the molar ratio of coenzyme Q to UCP dimer 17: 1. The dependence of the H ⁺ transport on the fatty acid concentration is shown in FIG. 4B given a saturating amount of coenzyme Q (2 nmoles). The difference to the ATP-inhibited H ⁺ transport rate is again shown. In UCP1 and UCP2 the H ⁺ transport is saturated at 150 µM lauric acid, while in UCP3 no saturation up to 200 µM lauric acid was observed. The half-saturation is 80 µM lauric acid for UCP1 and UCP2 and <130 µM for UCP3.

Example 5 Concentration dependence of the inhibition by nucleotides

Die Aktivierung des H⁺-Transports durch Coenzym Q ermöglicht nun auch, die Inhibition durch Nukleotide, insbesondere Purinnukleotide, zu bestimmen. Diese Eigenschaft ist ein charakteristisches Merkmal von UCPs und kann insbesondere dazu herangezogen werden, um zu prüfen, ob ein H⁺-Transport aufgrund einer Entkopplerproteinaktivität vorliegt oder lediglich aufgrund von Lösungsmittel-induzierten H⁺-Sickerwegen.The activation of the H ⁺ transport by coenzyme Q now also enables the inhibition by nucleotides, in particular purine nucleotides, to be determined. This property is a characteristic feature of UCPs and can be used in particular to check whether H ⁺ transport is due to decoupler protein activity or only due to solvent-induced H ⁺ leaching.

Die K_i-Werte für die ATP- und ADP-Hemmung und die K_m-Werte für eine Coenzym-Q₁₀-Aktivierung des H⁺-Transports in mit E.coli exprimiertem haUCPI, hUCP2 und hUCP3 Proteoliposomen bei einem pH-Wert von 6,8 und 10°C sind in Tabelle 1 gezeigt. In den Versuchen wurde die Inhibition in Abhängigkeit von der ADP- bzw. ATP-Konzentration in Gegenwart von 2 nMol CoQ₁₀ und 125 µM Laurinsäure bestimmt.The K _i values for the ATP and ADP inhibition and the K _m values for a coenzyme Q ₁₀ activation of the H ⁺ transport in haUCPI, hUCP2 and hUCP3 proteoliposomes expressed with E. coli at a pH of 6.8 and 10 ° C are shown in Table 1. In the experiments, the inhibition was determined as a function of the ADP or ATP concentration in the presence of 2 nmol CoQ ₁₀ and 125 μM lauric acid.

Tabelle 1 Table 1

Aus diesen Ergebnissen kann man schließen, dass UCP nicht nur durch die Konzentration an freiem, d. h. nicht Mg²⁺-gebundenem ATP und ADP und durch den pH-Wert reguliert werden, sondern aufgrund verschiedener Affinitäten für ATP bzw. ADP auch durch das Phosphorylierungspotenzial, welches im Wesentlichen durch das Verhältnis ATP/ADP bestimmt wird. From these results it can be concluded that UCP are not only regulated by the concentration of free, ie not Mg ²⁺ -bound ATP and ADP and by the pH value, but also by the phosphorylation potential due to different affinities for ATP or ADP, which is essentially determined by the ratio ATP / ADP.

Example 6 Structural requirements for the cofactor

Die Strukturanforderungen an den Cofaktor Coenzym Q und dessen Analoga zur Aktivierung des H⁺-Transports wurden durch Verändern der hydrophoben Seitenkette und Variieren der Chinongruppe untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst:The structural requirements for the cofactor coenzyme Q and its analogues for activating H ⁺ transport were examined by changing the hydrophobic side chain and varying the quinone group. The results are summarized in Table 2:

Tabelle 2: Table 2:

Abhängigkeit der H⁺-Transportaktivierung von E.coli-exprimiertem haUCP1, hUCP2 und hUCP3 von Coenzym Q-Analoga Dependence of H ⁺ transport activation of E. coli-expressed haUCP1, hUCP2 and hUCP3 on coenzyme Q analogues

Die Transportaktivitäten von IB-UCPs in rekonstituierten Phospholipidvesikeln wurden in Gegenwart des jeweiligen Q-Analogon (6 µM) gemessen. Der H⁺-Influx (V: µmol H⁺/min mg Protein; C, Kapazität: µmol/ml) ist als Nettotransportaktivitäten angegeben, die durch Abziehen der Aktivität in Gegenwart von 20 µM ATP erhalten werden und als Prozentanteil der Aktivität in Gegenwart von Q₁₀ dargestellt.The transport activities of IB-UCPs in reconstituted phospholipid vesicles were measured in the presence of the respective Q analogue (6 µM). The H ⁺ influx (V: µmol H ⁺ / min mg protein; C, capacity: µmol / ml) is given as the net transport activities obtained by subtracting the activity in the presence of 20 µM ATP and as a percentage of the activity in the presence of Q ₁₀ shown.

Es wurde eine Abnahme der H⁺-Transportstimulierung bei kürzeren Isoprenoidketten beobachtet. Wenn nur noch eine (Q₁) oder keine (Q₀) Isoprenoideinheit am Chinon vorlag, wurde nur noch eine geringfügige Aktivierung beobachtet. Die Verwendung von Plastochinon bzw. Menachinon anstelle der in Coenzym Q vorliegenden Chinongruppe ergab ebenfalls geeignete Cofaktoren, was zeigt, dass alle drei untersuchten Chinonkopfgruppen aktiv sind.A decrease in H ⁺ transport stimulation was observed with shorter isoprenoid chains. If there was only one (Q ₁ ) or no (Q ₀ ) isoprenoid unit on the quinone, only a slight activation was observed. The use of plastoquinone or menaquinone instead of the quinone group present in coenzyme Q also gave suitable cofactors, which shows that all three quinone head groups investigated are active.

Claims

1. Use of Coenzyme Q or a Coenzyme Q analogue for Regulation of the function of the decoupler proteins (UCP).

2. Use according to claim 1, characterized, that the function of at least one of the decoupling proteins UCP1, UCP2 and UCP3 is regulated.

3. Use according to claim 1 or 2, characterized, that the activity of the decoupler proteins is increased.

4. Use according to one of the preceding claims, characterized in that the function of the decoupler protein as an H ⁺ transporter is regulated.

5. Use according to one of the preceding claims, characterized, that the coenzyme Q analogue has a quinone moiety and a includes hydrophobic side chain.

6. Use according to claim 5, characterized in that the coenzyme Q analogue has the general formula:
has, wherein
R ^{1 represents} a hydrophobic radical with ≧ 10 C atoms, and
R ² , R ³ and R ⁴ independently of one another are H, C ₁ -C ₄ alkyl, C ₁ -C ₄ alkoxy or R ⁴ or the radicals R ³ and R ^{4 form} a ring which in turn is linked to C ₁ -C ₄ alkyl or C ₁ -C ₄ alkoxy may be substituted.

7. Use according to claim 6, characterized in that R ^{1 is} a hydrophobic radical with ≧ 13 C atoms.

8. Use according to one of the preceding claims, characterized in that coenzyme Q _{10 is} used.

9. Use according to one of the preceding claims, characterized, that coenzyme Q in oxidized form or an analogue of coenzyme Q is used in oxidized form.

10. Use according to one of the preceding claims, characterized, that regulation by the ratio of coenzyme Q or coenzyme Q analogue in reduced form to coenzyme Q or coenzyme Q- Analog is set in oxidized form.

11. Use according to one of the preceding claims, characterized, that coenzyme Q or a coenzyme Q analogue to Decoupler protein in a molar ratio of 1: 1 to 100: 1 is used.

12. Use according to one of the preceding claims, characterized, that an additional fatty acid to activate the decoupler proteins is used.

13. Use according to one of the preceding claims, characterized, that an additional nucleotide to inhibit the decoupler proteins is used.

14. Use according to one of the preceding claims Treatment or / and prophylaxis of obesity, diabetes, neurodegenerative diseases, diseases of the Fatty acid metabolism and / or by oxygen radicals caused diseases of old age.

15. Use of coenzyme Q or a coenzyme Q analogue for Manufacture of a drug to regulate the function of the Uncoupling.

16. Medicament containing as active ingredient coenzyme Q and / or Coenzyme Q analogue and a fatty acid, the active ingredients combined or available separately.

17. A method for determining the effect of selected compounds on the decoupler protein activity of a decoupler protein other than UCP1, comprising the steps:

a) screening of yeast transfected with UCP1 with the selected compounds and determination of positive candidate compounds and
b) Testing the positive candidate compounds for their effect on decoupler proteins other than UCP1.

18. The method according to claim 17, characterized, that the effect on the decoupler protein activity of UCP2 or / and UCP3 is determined.

19. The method according to claim 17 or 18, characterized, that the selected compound is a coenzyme Q or a coenzyme Q analogue.

20. The method according to any one of claims 17 to 19, characterized, that in step (b) the positive candidate connections in with UCP2 or / and UCP3 transfected cultures of animal cells tested become.

21. A method for determining the effect of a selected compound on decoupler protein activity, comprising the steps of:

a) synthesizing a decoupler protein in E. coli,
b) incorporation of the decoupler protein synthesized in E. coli into artificial vesicles and
c) determining the decoupler protein activity in the presence of the selected compound.

22. The method according to claim 21, characterized, that the decoupler protein activity with a fluorescent pH Indicator, especially with pyranine, is detected.

23. The method according to any one of claims 17 to 22, characterized, that in the presence of a solvent such as chloroform, Halothane, dichloromethane, dichloroethane or isoamyl alcohol, especially dichloromethane.

24. A process for the production of active decoupler protein, characterized in that one

a) the decoupler protein is obtained in the form of inclusion bodies from E. coli,
b) the decoupler protein from the inclusion bodies is solubilized and renatured and
c) adds coenzyme Q or a coenzyme Q analogue when reconstituting the decoupler protein.