DE10043011A1

DE10043011A1 - New stabilized liposomes with stable internal skeleton derived from interfacial polymers, useful for enclosing and transporting pharmaceuticals or as micro-reactors for carrying out enzymatic reactions

Info

Publication number: DE10043011A1
Application number: DE2000143011
Authority: DE
Inventors: Steffen Dr Panzner
Original assignee: NOVOSOM GmbH
Current assignee: Novosom AG
Priority date: 2000-08-30
Filing date: 2000-08-30
Publication date: 2002-03-28

Abstract

Liposomes (I) having a stable internal skelton are new. Also new are interfacial polymers (II), which are stable, crosslinked, predominantly hydrophilic and doped with a predetermined amount of amphipathic groups, have a non-uniform cross-section and have a size of 0.05-500 micro m. An Independent claim is included for the preparation of (II).

Description

State of the art

Die Erfindung betrifft Strukturen, bei denen ein in sich stabiles Innenskelett mit einer liposomalen Membran umgeben ist, Verfahren zur Herstellung solcher Strukturen und Anwendungen solcher Strukturen.The invention relates to structures in which a stable in itself Inner skeleton is surrounded by a liposomal membrane, procedure for the production of such structures and applications of such Structures.

Liposomen sind kleine, in sich geschlossene Strukturen, bei denen eine Membran einen Binnenraum vom äußeren Medium trennt. Sowohl Binnenraum wie auch äußeres Medium sind wäßrige Systeme, die weitere Stoffe, etwa zur Erreichung einer gewissen Ionenstärke oder eines bestimmten pH-Wertes enthalten können. Die Membran besteht aus einem oder mehreren Phospholipiden und kann weitere, amphiphile Stoffe enthalten. Methoden zur Herstellung von Liposomen sind dem Fachmann bekannt.Liposomes are small, self-contained structures in which a membrane separates an internal space from the external medium. Either Internal space as well as external medium are aqueous systems, the others Substances, for example to achieve a certain ionic strength or one certain pH value can contain. The membrane consists of a or more phospholipids and may contain other amphiphilic substances contain. Methods for producing liposomes are known to the person skilled in the art known.

Der Einschluß von wasserlöslichen Fremdstoffen in Liposomen findet in der Pharmazie und Kosmetik vielfältige Anwendung. Liposomen können aus körpereigenen und daher sehr verträglichen, ungiftigen und nicht immunogenen Substanzen gefertigt werden.The inclusion of water-soluble foreign substances in liposomes takes place diverse application in pharmacy and cosmetics. liposomes can be from the body's own and therefore very tolerable, non-toxic and non-immunogenic substances are manufactured.

Die liposomale Membran ist impermeabel für eine große Menge von polaren, insbesondere ionisch geladenen Substanzen, Liposomen sind daher zum Einschluß von Wirkstoffen gut geeignet. Der Einschluß von Wirkstoffen kann diese vor einem vorzeitigen Abbau schützen, eine Freisetzung über einen längeren Zeitraum ermöglichen, toxische Effekte mildern oder diese Wirkstoffe an einen Zielort dirigieren.The liposomal membrane is impermeable to a large amount of polar, in particular ionically charged substances, liposomes therefore well suited for the inclusion of active substances. The inclusion of Active ingredients can protect them from premature degradation, one Release over a longer period of time allow toxic Mitigate effects or direct these agents to a destination.

Nachteilig bei der Verwendung von Liposomen zur Verpackung und Administration von Wirkstoffen ist deren geringe Stabilität in Körperflüssigkeiten und die geringe Effizienz des Einschlussprozesses. Wünschenswert sind stabile Strukturen, die Fremdstoffe mit einer hohen Effizienz einschliessen können. Ein beinahe vollständiger Einschluß von wasserlöslichen Fremdstoffen gelingt bei der Herstellung von Liposomen aus einer Wasser in Öl- Emulsion (w/o-Emulsion). Dabei wird die wäßrige Lösung, die den einzuschließenden Stoff enthält, in einem organischen Lösungsmittel dispergiert. Amphipatische Moleküle wie etwa Phospholipide oder Detergenzien können die entstehende Grenzfläche stabilisieren. Nach Zusatz von weiterem Lipid und Entfernung des organischen Lösungsmittels entstehen Liposomen, deren Größe duch die anfängliche Dispersion bestimmt wird und deren Binnenraum den in der Wasserphase gelösten Fremdstoff enthält. (R. R. C. New: Liposomes - A practical Approach, Academic Press) Ein gravierender Nachteil der so hergestellten Strukturen ist ihre geringe mechanische Stabilität, besonders großen, unilamellaren Liposomen.Disadvantageous when using liposomes for packaging and Administration of active substances is their low stability in Body fluids and the low efficiency of the Inclusion process. Stable structures are desirable that Being able to trap foreign substances with high efficiency. An almost complete inclusion of water-soluble foreign substances succeeds in the production of liposomes from a water in oil Emulsion (w / o emulsion). The aqueous solution that the contains the substance to be enclosed in an organic solvent dispersed. Amphipatic molecules such as phospholipids or Detergents can stabilize the resulting interface. To Addition of further lipid and removal of the organic Solvent liposomes are formed, the size of which is due to the initial Dispersion is determined and its interior space in the water phase contains dissolved foreign matter. (R.R.C. New: Liposomes - A practical Approach, Academic Press) A serious disadvantage of this structures produced is their low mechanical stability, particularly large, unilamellar liposomes.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, stabile Liposomen zu beschreiben und Verfahren zu ihrer Herstellung zu geben.The object of the invention is therefore to describe stable liposomes and give methods for their manufacture.

Description of the invention

Die erfindungsgemäße Aufgabe wurde durch die Herstellung von Liposomen mit einem Innenskelett gelöst. Ein für diese Zwecke geeignetes Skelett entsteht durch Polymerisation und/ oder Vernetzung von ethylenisch ungesättigten Verbindungen an der Grenzfläche einer w/o-Emulsion. Ein in sich stabiles Skelett wird bei der Polymerisation bzw. Vernetzung in Gegenwart mehrfach ungesättigter Verbindungen erhalten. Die Anheftung des umgebenden Lipidfilms wird durch den Einbau von amphipatischen Monomeren in das Skelett erleichtert. Die Ausbildung der Lipidmembran geschieht durch Zusatz von Lipiden zur organischen Phase und anschließende Entfernung des Lösungsmittels.The object of the invention was achieved by the production of Liposomes solved with an inner skeleton. One for these purposes suitable skeleton is created by polymerization and / or Crosslinking of ethylenically unsaturated compounds on the Interface of a w / o emulsion. A skeleton is stable in itself during the polymerization or crosslinking several times in the presence Obtained unsaturated compounds. Attaching the surrounding Lipid film is made by incorporating amphipathic monomers into the Skeleton relieved. The lipid membrane is formed by Addition of lipids to the organic phase and subsequent Removal of the solvent.

Innenskelette im Sinne dieser Erfindung sind selbst kapselartig hohle, amphipatische Strukturen, wobei sich die hydrophilen und strukturbildenden Teile in der inneren, wäßrigen Phase befinden und die hydrophoben Anteile nach aussen gerichtet sind. Durch die Ausführung der Vernetzung an einer Phasengrenze wird die Strukturbildung auf einen Bereich in der Nähe dieser Phasengrenze beschränkt.Inner skeletons in the sense of this invention are themselves capsule-like hollow, amphipathic structures, the hydrophilic and structure-forming parts are in the inner, aqueous phase and the hydrophobic parts are directed outwards. Through the Execution of the crosslinking at a phase boundary is the Structure formation on an area near this phase boundary limited.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß diese Innenskelette auch ohne die anschließende Lipidierung zur Stabilisierung von Wasser/Öl- Grenzflächen geeignet sind. Sie sind daher ein geeignetes Mittel zur Durchführung von Reaktionen an solchen Grenzflächen, etwa zur Enzymkatalyse in organischen Lösungsmitteln. Surprisingly, it was found that these inner skeletons too without subsequent lipidation to stabilize water / oil Interfaces are suitable. They are therefore a suitable means of Carrying out reactions at such interfaces, for example to Enzyme catalysis in organic solvents.

Die Herstellung des Innenskeletts geschieht durch Polymerisation von ethylenisch ungesättigten Verbindungen an der Grenzfläche in einer w/o-Emulsion. Die Herstellung solcher Emulsionen ist dem Fachmann an sich bekannt, hierbei wird eine wäßrige Phase zu einem Überschuß organischer Phase gegeben, wobei beide Phasen nicht miteinander mischbar sind.The inner skeleton is produced by polymerizing ethylenically unsaturated compounds at the interface in one w / o emulsion. The preparation of such emulsions is known to the person skilled in the art known, an aqueous phase becomes an excess given organic phase, both phases not with each other are miscible.

Besonders geeignete organische Phasen sind solche mit niedrigem Siedepunkt und guten Lösungseigenschaften für die zur Membranbildung eingesetzten Lipide, also etwa Chloroform oder Dichlormethan oder aber höhere Ether und andere Lösungsmittel, insofern sie nicht mit der Wasserphase mischbar sind.Particularly suitable organic phases are those with a low one Boiling point and good solution properties for membrane formation lipids used, such as chloroform or dichloromethane or but higher ethers and other solvents insofar as they are not included are miscible in the water phase.

Weniger polare organische Phasen wie etwa Hexan können für die Herstellung der Innenskelette verwendet werden, müssen jedoch im allgemeinen zur Lipidierung der entstandenen Strukturen ausgetauscht werden.Less polar organic phases such as hexane can be used for the Production of the inner skeletons must be used, however, in the generally exchanged for lipidation of the resulting structures become.

Zur Polymerisation lassen sich ein Vielzahl ethylenisch ungesättigter Verbindungen einsetzen, unter denen die Acrylsäure und deren Derivate besonders hervorzuheben sind. Je nach ihrer Struktur werden sich die eingesetzten Monomere zwischen beiden Phasen verteilen. Geeignete Stoffe sind daher solche, die sich beinahe ausschließlich in der wäßrigen Phase oder an der Phasengrenzfläche befinden. Solche Stoffe, deren Großteil in der Ölphase gelöst vorliegt, gehören nicht zu den geeigneten Stoffen. Besonders geeignet für eine Polymerisation in der wäßrigen Phase des Binnenraums sind ionisierte Verbindungen, also die Acrylate oder Methacrylate oder Maleate oder Styrensulfonate oder ethylenisch ungesättigte Verbindungen mit einer quartären Ammoniumfunktion, etwa das 2-Acryloxyethyl-trimethylammoniumbromid oder das Diallyldimethylammoniumchlorid.A large number can be ethylenically used for the polymerization Use unsaturated compounds, including acrylic acid and whose derivatives are particularly noteworthy. Depending on their structure the monomers used between the two phases to distribute. Suitable substances are therefore those that are almost exclusively in the aqueous phase or at the phase interface are located. Such substances, the majority of which is dissolved in the oil phase are not suitable substances. Especially suitable for polymerization in the aqueous phase of the Inside are ionized compounds, i.e. the acrylates or Methacrylates or maleates or styrene sulfonates or ethylenic unsaturated compounds with a quaternary ammonium function, for example the 2-acryloxyethyl-trimethylammonium bromide or that Diallyl dimethyl ammonium chloride.

Eine wichtige Variante der Herstellung von Innenskeletten nutzt die Bildung von Polyelektrolytkomplexen zur Fixierung der Strukturen an der Grenzfläche. Dabei werden der Emulsion solche Stoffe zugesetzt, die die Grenzfläche elektrostatisch komplementär zum entstehenden Polymer aufladen. Zur Herstellung eines Innenskeletts aus Acrylsäure sind demnach kationische Amphiphile wie etwa Cetyltrimethyl ammoniumbromid der Stearylamin als Hilfsstoffe gut geeignet. An important variant of the production of inner skeletons uses the Formation of polyelectrolyte complexes to fix the structures the interface. Such substances are added to the emulsion which are electrostatically complementary to the resulting interface Charge polymer. For the production of an inner skeleton from acrylic acid are therefore cationic amphiphiles such as cetyltrimethyl ammonium bromide the stearylamine well suited as excipients.

Kationische Monomere wie die oben erwähnten können durch Interaktion mit amphipatischen Anionen an der Grenzfläche konzentriert werden, also etwa durch Zusatz von Stearinsäure oder Cholsäure. Eine vorteilhafte Variante der Ausführung besteht darin, dass die zur Lipidierung benutzten Lipide eine geeignete Ladung tragen. Geeignete Lipide sind Phospholipide wie das Phosphatidylglycerol oder die Phosphatidsäure oder auch Cholesterolderivate wie das Cholesterolhemisuccinat oder das Cholesterolsulfat oder das Cholesteryltrimethylammoniumcarbamat.Cationic monomers like those mentioned above can be interacted with be concentrated at the interface with amphipatic anions, for example by adding stearic acid or cholic acid. A advantageous variant of the embodiment is that the for Lipidation used lipids carry an appropriate charge. suitable Lipids are phospholipids like phosphatidylglycerol or Phosphatidic acid or cholesterol derivatives like that Cholesterol hemisuccinate or the cholesterol sulfate or that Cholesteryltrimethylammoniumcarbamat.

Bei einer anderen vorteilhaften Variante zur Herstellung von Innenskeletten wird ein Anteil amphipatischer Monomere eingesetzt, die sich an der Phasengrenze eindeutig orientieren. Geeignete Verbindungen dieser Klasse sind unter den Alkylestern oder -amiden der Acrylsäure oder ihrer Derivate zu finden, etwa der Acrylsäurelaurylester oder ähnliche Verbindungen.In another advantageous variant for the production of Internal skeletons use a proportion of amphipatic monomers which are clearly based on the phase boundary. suitable Compounds of this class are among the alkyl esters or amides of acrylic acid or its derivatives, such as the Acrylic acid lauryl esters or similar compounds.

Eine weitere wichtige Gruppe von Verbindungen sind solche wasserlöslichen Substanzen, die eine Vielzahl von ethylenisch ungesättigten Seitengruppen besitzen. Diese Stoffe können zu Netzwerken weiter polymerisiert werden und erlauben den Einbau von weiteren, modifizierenden Monomeren. Wichtige Vertreter dieser Gruppe sind allyl- oder acrylmodifizierte Dextrane, Alginate oder Chitosane.Another important group of compounds are those water-soluble substances that have a variety of ethylenic have unsaturated side groups. These substances can too Networks are further polymerized and allow the installation of other modifying monomers. Important representatives of this Group are allyl or acrylic modified dextrans, alginates or Chitosans.

Ein wichtiger Gedanke der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sogenannte Ankermoleküle zum polymerisierten Innenskelett gehören. Solche Ankermoleküle sind amphipatische Substanzen und ermöglichen daher die effektive Kopplung der Membran an das Innenskelett. Sie enthalten weiterhin Molekülbestandteile, die einen Einbau in das Innenskelett ermöglichen. Diese Molekülbestandteile finden sich vorzugsweise im hydrophilen Teil der Strukturen.An important idea of the present invention is that so-called anchor molecules belong to the polymerized inner skeleton. Such anchor molecules are amphipathic substances and enable hence the effective coupling of the membrane to the inner skeleton. she also contain molecular components that are incorporated into the Allow inner skeleton. These molecular components can be found preferably in the hydrophilic part of the structures.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform sind solche Ankermoleküle, die zwei oder mehr der ethylenisch ungesättigten Gruppen enthalten. Sie werden in ein Polymerisationsmetzwerk als Quervernetzer eingebaut und beschränken durch ihre Lage an der Grenzfläche den Aufbau eines in sich stabilen Netzwerkes auf Regionen nahe dieser Grenzfläche. Zu diesen Stoffen gehören etwa die N, N' Alkylmethylenbisacrylamide oder mehrfach ethylenisch ungesättigte Phospholipide, wie von Eibl in der DE 30 10 185 beschrieben und andere Stoffe mit verwandtem Molekülaufbau.A particularly preferred embodiment is such anchor molecules containing two or more of the ethylenically unsaturated groups. They are used in a polymerization network as a cross-linker installed and limit by their location at the interface Establishment of a stable network in regions close to these Interface. These substances include the N, N 'alkylmethylenebisacrylamides or polyethylenically unsaturated phospholipids, as described by Eibl in DE 30 10 185 and other substances related molecular structure.

In einer anderen Ausführung der Erfindung sind die Ankermoleküle Bestandteile des polymeren Innenskeletts, aber nicht dessen Quervernetzer. In diesem Fall bestehen die Ankermoleküle aus einer einfach ethylenisch ungesättigten Funktion und hydrophoben Molekülteilen wie oben beschrieben.In another embodiment of the invention, the anchor molecules are Components of the polymeric inner skeleton, but not its Crosslinkers. In this case, the anchor molecules consist of one simply ethylenically unsaturated and hydrophobic Molecular parts as described above.

Geeignete Moleküle sind die Alkylester oder -amide der Acrylsäure, ethylenisch ungesättigte Sterolderivate oder an den Kopfgruppen ethylenisch ungesättigte Phospholipide, wie bei Eibl in der DE 30 10 185 beschrieben.Suitable molecules are the alkyl esters or amides of acrylic acid, ethylenically unsaturated sterol derivatives or on the head groups ethylenically unsaturated phospholipids, as with Eibl in DE 30 10 185 described.

Im letzteren Fall ist die Anwesenheit eines Quervernetzers notwendig, um das Innenskelett in sich zu stabilisieren. Geeignete Quervernetzer sind bekannt und umfassen Moleküle mit mindestens zwei ethylenisch ungesättigten Gruppen, etwa N,N'-Methylenbisacrylamid.In the latter case, the presence of a cross-linker necessary to stabilize the inner skeleton. suitable Crosslinkers are known and comprise molecules with at least two ethylenically unsaturated groups, such as N, N'-methylenebisacrylamide.

Die Initiation der Polymerisation kann nach den bekannten Methoden erfolgen. Geeignete Initiatoren sind chemische oder photochemische Radikalbildner, etwa Benzoylperoxid, Riboflavin oder Ammoniumpersulfat.The polymerization can be initiated by the known methods respectively. Suitable initiators are chemical or photochemical Free radical formers, such as benzoyl peroxide, riboflavin or Ammonium persulfate.

Während der Polymerisationsreaktion wird ein Netzpolymer gebildet, dass durch die oben beschriebenen Maßnahmen auf die Phasengrenzfläche konzentriert wird. Erfahrungsgemäß verläuft die Polymerisationreaktion nicht vollständig, vielmehr verbleibt ein Teil Monomer oder nicht in das Natzwerk integrierte Oligo- oder Polymere im Ansatz. Diese Stoffe können durch Extraktion mit geeigneten Lösungsmitteln ausgewaschen werden, wenn sie für die spätere Anwendung schädlich sind. Durch Manipulation des pH-Wertes kann die Acrylsäure aus ihren Salzen gebildet werden, die mit den verwendeten organischen Lösungsmitteln extrahierbar ist. Eine andere Variante besteht in der vollständigen Entfernung des organischen Lösungsmittels am Rotationsverdampfer und dem Waschen der Skelette mit Wasser. A network polymer is formed during the polymerization reaction, that by the measures described above on the Phase interface is concentrated. Experience has shown that the Polymerization reaction is not complete, rather remains Part of the monomer or oligo- or not integrated into the network Polymers in the approach. These substances can be extracted with suitable solvents are washed out if they are for the later use are harmful. By manipulating the pH the acrylic acid can be formed from its salts, which with the organic solvents used is extractable. Another Variant consists in the complete removal of the organic Solvent on the rotary evaporator and washing the skeletons with water.

Nach Abschluß der Polymerisationsreaktion und gegebenenfalls Entfernung der Monomeren werden die entstandenen Innenskelette lipidiert.After completion of the polymerization reaction and if necessary Removal of the monomers will result in the resulting inner skeletons lipidated.

Ist noch organisches Lösungsmittel vorhanden, so wird diesem eine berechnete Menge Lipid zugesetzt und anschließend das Lösungsmittel abgedampft. Anschließend wird ein wäßriges Medium zugegeben, dabei bilden sich spontan Lipidbilayer aus.If there is still organic solvent, this becomes one calculated amount of lipid added and then the solvent evaporated. An aqueous medium is then added, thereby lipid bilayers form spontaneously.

Innenskelette in einem wäßrigen System gibt man zur Lipidierung zu einem trockenen Film der benutzten Lipide. Die sich spontan bildenden Lipidbilayer umhüllen die Innenskelette vollständig und können etwa durch Ultraschallbehandlung weiter vergleichmäßigt werden.Inner skeletons in an aqueous system are added for lipidation a dry film of the lipids used. The spontaneously forming lipid bilayer completely and completely envelop the inner skeletons can be further equalized by ultrasound treatment become.

Lipidierte Innenskelette werden von freien Liposomen durch Zentrifugation oder Gelfiltration oder Tangentialdialyse abgetrennt. Zur Lipidierung der Innenskelette sind Lipide geeignet, wie sie auch zur Herstellung von konventionellen Liposomen benutzt werden, also insbesondere Phospholipide, Sphingosine, Cholesterole und andere mehr.Lipidated inner skeletons are characterized by free liposomes Centrifugation or gel filtration or tangential dialysis separated. Lipids, as they are, are suitable for lipidizing the inner skeletons used to make conventional liposomes especially phospholipids, sphingosines, cholesterols and others more.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird Acrylsäure in Wasser gelöst, mit Natronlauge in das Acrylatanion überführt und in einer Chloroformphase dispergiert. Riboflavin wird der wäßrigen Phase als photosensibler Initiator zugesetzt. Die Chloroformphase enthält N, N' Dodecylmethylen-Bisacrylamid und Phospholipid. Nach dem Erhalt einer stabilen Suspension wird die Polymerisation durch Bestrahlung mit Licht eingeleitet. Es bilden sich Grenzflächenpolymerisate mit anhaftenden Alkylgruppen. Anschließend wird das Chloroform unter Vakuum entfernt und mit Wasser ersetzt. Durch Einsatz einer geeigneten Menge an Phospholipiden entstehen unilamellare Liposomen mit einem Innenskelett.In a preferred embodiment of the invention, acrylic acid is in Dissolved water, converted into the acrylate anion with sodium hydroxide solution and in dispersed in a chloroform phase. Riboflavin becomes the aqueous Phase added as a photosensitive initiator. The chloroform phase contains N, N 'dodecylmethylene bisacrylamide and phospholipid. To the polymerization is obtained by obtaining a stable suspension Irradiation with light initiated. It is formed Interfacial polymers with adhering alkyl groups. Subsequently the chloroform is removed under vacuum and replaced with water. By using an appropriate amount of phospholipids unilamellar liposomes with an inner skeleton.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Phospholipid mit einer polymerisierbaren, vernetzenden Kopfgruppe, verwendet. Im Gegensatz zur oben skizzierten Variante resultiert ein einheitlicher Membranaufbau aus Phospholipiden. Diese größere strukturelle Homogenität erlaubt bessere Dichtheit der Membran auch gegenüber niedermolekularem Cargo. In another embodiment of the invention, a phospholipid with a polymerizable, crosslinking head group. in the In contrast to the variant outlined above, the result is a uniform one Membrane structure made of phospholipids. This bigger structural Homogeneity also allows the membrane to seal better low molecular weight cargo.

Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird allylmodifiziertes Dextran in der wäßrigen Phase gelöst und in organischem Medium dispergiert. Die Vernetzung erfolgt durch einen amphipatisches, bifunktionelles Monomer. Die entstandenen Innenskelette sind poröser als in den oben beschriebenen Ausführungen, aber sehr hydrophil. Sie können ebenfalls mit Phospholipiden wie oben lipidiert werden.In a further embodiment of the invention allyl-modified dextran dissolved in the aqueous phase and in dispersed organic medium. The networking is done by a amphipathic, bifunctional monomer. The resulting Inner skeletons are more porous than those described above Versions, but very hydrophilic. You can also use Phospholipids can be lipidated as above.

Die Tröpfchengröße der Emulsion und damit die spätere Partikelgröße wird wesentlich bestimmt durch:
The droplet size of the emulsion and thus the later particle size is essentially determined by:

- The organic solvent used
- the amount of amphipathic substances used, d. H. Lipids and anchor molecules
- The energy input, for example by stirring or ultrasound or Temperature.

Das eingesetzte Lösungsmittel ist insofern nur begrenzt variierbar, als es die Lösung der beteiligten amiphipatischen Moleküle wie auch der Phospholipide erlauben muss. Die beiden anderen Parameter können aber weitgehend frei gewählt werden, so dass Liposomen verschiedener Größe reproduzierbar erzeugt werden können. Die erreichbare Größe liegt zwischen 50 nm und 500 µm.The solvent used can only be varied to a limited extent than it is the solution of the amiphipatic molecules involved as well which must allow phospholipids. The other two parameters can but largely chosen freely, so that liposomes are different Size can be generated reproducibly. The attainable size is between 50 nm and 500 µm.

Die produzierten Innenskelette und die Liposomen mit Innenskelett werden vor allem zum Einschluß von hydrophilen Wirkstoffen verwendet. Dazu gehören wasserlösliche Pharmaka, Vitamine, Nahrungsergänzungsstoffe, insbesondere aber auch höhermolekulare Verbindungen wie Enzyme oder Nukleinsäuren. Diese Wirkstoffe können bereits zu Beginn der Herstellung in der wäßrigen Phase enthalten sein oder nach Fertigstellung der Innenskelette in diese verbracht werden. Ein Einschluß zu Beginn der Herstellung ist besonders effizient und verringert die Zahl der erforderlichen Verfahrensschritte.The inner skeletons produced and the liposomes with inner skeletons are used primarily for the inclusion of hydrophilic active substances used. These include water-soluble pharmaceuticals, vitamins, Dietary supplements, but especially high-molecular ones Compounds such as enzymes or nucleic acids. These agents can already contained in the aqueous phase at the start of production or after the inner skeletons have been completed become. Inclusion at the start of manufacture is special efficient and reduces the number of required Process steps.

Empfindliche Substanzen, welche nicht während der Polymerisation anwesend sein sollen, können nach Abschluß der Reaktion in die Innenskelette verbracht werden. In diesen Fällen wird restliches Monomer durch die oben beschriebenen Waschschritte entfernt.Sensitive substances that are not during the polymerization should be present after the reaction in the Inner skeletons are spent. In these cases, the rest Monomer removed by the washing steps described above.

Man verfährt in diesen Fällen wie bei der Verpackung von hydrophilen Substanzen in Liposomen, d. h. die einzuschließenden Stoffe werden zu dem wäßrigen System gegeben und anschließend mit einem trockenem Lipidfilm in Kontakt gebracht. Der Einschluß ist schonender, aber auch weniger effektiv als wenn die Phasengrenze über den gesamten Prozess aufrecht erhalten wird.In these cases, the procedure is the same as for hydrophilic packaging Substances in liposomes, i.e. H. the substances to be included become given the aqueous system and then with a dry Contacted lipid film. The inclusion is gentler, however also less effective than if the phase boundary was over the whole Process is maintained.

Die Erfindung findet ihre Anwendung in der Biotechnologie oder in der Pharmazie.The invention finds application in biotechnology or in of pharmacy.

Liposomen mit Innenskelett können eingeschlossene Enzyme als Wirkstoff enthalten. Die Strukturen können dann bei enzymatischen Reaktionen eingesetzt werden.Liposomes with an inner skeleton can be included as enzymes Contain active ingredient. The structures can then be enzymatic Reactions are used.

Von besonderem Vorteil bei dieser Einsatzform ist die mit dem Innenskelett stabilisierte Phasengrenzfläche. Damit kann ein stabiles Zweiphasensystem zur Enzymkatalyse verwendet werden, welches auch den Einsatz von wäßrigen Enzymen bei der Stoffumwandlung in organischem Lösungsmitteln erlaubt. In dieser wichtigen Variante der erfindungsgemäßen Lehre kann auf eine Lipidierung des Trägers verzichtet werden, wenn die Innenskelette hinreichend dicht und hydrophil ausgeführt werden. Dabei kann die Permeabilität des Innenskeletts so groß sein, daß eingeschlossene Wirkstoffe wie etwa Enzyme das Netzwerk passieren könnten. Ein Verlust von Wirkstoff oder Enzym ist durch die aussen befindliche organische Phase verhindert. Ein hydrophiles Skelett verhindert aber den Durchtritt von organischer Phase in den Binnenraum der Struktur, da die dazu notwendige Benetzung des Innenskeletts energetisch ungünstig ist.A particular advantage of this type of application is that with the Inner skeleton stabilized phase interface. With that a stable two-phase system can be used for enzyme catalysis, which also includes the use of aqueous enzymes in the Substance conversion allowed in organic solvents. In this important variant of the teaching according to the invention can Lipidation of the carrier can be dispensed with if the inner skeletons be made sufficiently dense and hydrophilic. The Permeability of the inner skeleton should be so great that trapped Active substances such as enzymes could pass through the network. On Loss of active ingredient or enzyme is due to the outside prevents organic phase. However, a hydrophilic skeleton prevents the passage of organic phase into the interior of the structure, because the necessary wetting of the inner skeleton is energetic is unfavorable.

Liposomen mit Innenskelett können auch als Wirkstoffträger bei pharmazeutischen Anwendungen benutzt werden. Liposomes with an inner skeleton can also be used as drug carriers pharmaceutical applications.

example 1 Production of liposomes with inner skeleton

Wäßrige Lösung:
1 M Natriumacrylat, 2 mM Riboflavin, 50 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan pH 8.0
Ölphase:
1 mM N,N'-Dodecylmethylen-Bisacrylamid in ChloroformAqueous solution:
1 M sodium acrylate, 2 mM riboflavin, 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane pH 8.0
Oil phase:
1mM N, N'-dodecylmethylene bisacrylamide in chloroform

10 ml der wäßrigen Lösung werden portionsweise in 90 ml der Ölphase in einem Rundkolben dispergiert. Der Kolben wird dabei in einem Ultraschallbad bewegt. Es bildet sich eine stabile Emulsion mit einer Tröpfchengrößen von etwa 2 µm.10 ml of the aqueous solution are added in portions in 90 ml of the oil phase dispersed in a round bottom flask. The piston is in one Ultrasonic bath moves. A stable emulsion is formed a droplet size of about 2 µm.

Die Polymerisation wir durch Bestrahlung der Lösung mit sichtbarem Licht gestartet (150 W Halogenlampe in wenigen cm Abstand) und für etwa 30 Minuten durchgeführt.The polymerization is carried out by irradiating the solution with visible Light started (150 W halogen lamp a few cm away) and for performed for about 30 minutes.

Zur Ölphase wird dann ein Lösung von 250 mg Phosphatidylcholin in 10 ml Chloroform zugesetzt. Anschließend wird die Mischung im Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wird in 100 ml Puffer (50 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan pH 8.0 unter Rühren im Ultraschallbad bei 45°C resuspendiert. Freie Liposomen, die durch überschüssiges Lipid gebildet werden, haben eine weit geringere Größe als die durch das Innenskelett stabilisierten großen Liposomen. Die Mischung kann durch Zentrifugation (10 min bei 20000 g) getrennt werden. Das Sediment enthält die großen Liposomen.A solution of 250 mg of phosphatidylcholine is then added to the oil phase 10 ml of chloroform added. Then the mixture in the Rotary evaporator evaporated. The residue is in 100 ml of buffer (50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane pH 8.0 with stirring in Ultrasound bath resuspended at 45 ° C. Free liposomes by Excess lipid formed are far less Size than the large ones stabilized by the inner skeleton Liposomes. The mixture can be centrifuged (10 min at 20,000 g) be separated. The sediment contains the large liposomes.

Example 2 Production of liposomes with an inner skeleton

Wäßrige Lösung: 0,25 M Natriumacrylat, 1 mM Riboflavin, 50 mM Tris- (Hydroxymethyl)-aminomethan pH 8.0
Ölphase: 0,5 mM N,N'-Dodecylmethylen-Bisacrylamid, 1 mM Cetyltrimethylammoniumbromid in ChloroformAqueous solution: 0.25 M sodium acrylate, 1 mM riboflavin, 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane pH 8.0
Oil phase: 0.5 mM N, N'-dodecylmethylene-bisacrylamide, 1 mM cetyltrimethylammonium bromide in chloroform

Beide Phasen werden wie oben gemischt und polymerisiert. Es bilden sich Partikel mit einer mittleren Größe von 2 µm. Durch Bestrahlung wird die Polymerisation eingeleitet, wobei sich das wachsende Netz durch ionische Wechselwirkungen enger an die Wandung des Tröpfchens anlegt. Es entstehen damit engere Netzwerke, die einen geringeren Volumenanteil des Binnenraums belegen. Both phases are mixed and polymerized as above. Make it up particles with an average size of 2 µm. By radiation the polymerization is initiated, the growing network through ionic interactions closer to the wall of the droplet invests. This creates closer networks, the smaller ones Prove volume share of the interior.

Die Lipidierung der Innenskelette erfolgt wie oben.The inner skeletons are lipidated as above.

Example 3 Production of liposomes with an inner skeleton

Wäßrige Lösung: 0,25 M Natriumacrylat, 0,025 M N,N'-Methylen- Bisacrylamid, 1 mM Riboflavin, 50 mM Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan pH 8.0
Ölphase: 1 mM Acrylsäurelaurylester, 1 mM Cetyltrimethylammoniumbromid in ChloroformAqueous solution: 0.25 M sodium acrylate, 0.025 MN, N'-methylene bisacrylamide, 1 mM riboflavin, 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane pH 8.0
Oil phase: 1 mM acrylic acid lauryl ester, 1 mM cetyltrimethylammonium bromide in chloroform

Beide Phasen werden wie oben gemischt und polymerisiert. Es bilden sich Partikel mit einer mittleren Größe von 2 µm. Durch Bestrahlung wird die Polymerisation eingeleitet, wobei sich das wachsende Netz durch ionische Wechselwirkungen enger an die Wandung des Tröpfchens anlegt. Es entstehen damit engere Netzwerke, die einen geringeren Volumenanteil des Binnenraums belegen. Bei einem Ansatz nach Beispiel 3 kann der Grad der Hydrophobizität des Skeletts unabhängig vom Grad der Quervernetzung eingestellt werden.Both phases are mixed and polymerized as above. Make it up particles with an average size of 2 µm. By radiation the polymerization is initiated, the growing network through ionic interactions closer to the wall of the droplet invests. This creates closer networks, the smaller ones Prove volume share of the interior. With an approach after Example 3 allows the degree of skeletal hydrophobicity to be independent be set by the degree of cross-linking.

Example 4 Production of liposomes with an inner skeleton from prefabricated polymers

Wäßrige Lösung:
0.2 g Allyldextran in 10 ml einer Lösung aus 50 mM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und 1 mM Riboflavin, pH 8
Ölphase: 7,5 mM N,N'-Dodecylmethylen-Bisacrylamid in DichlormethanAqueous solution:
0.2 g allyl dextran in 10 ml of a solution of 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane and 1 mM riboflavin, pH 8
Oil phase: 7.5 mM N, N'-dodecylmethylene-bisacrylamide in dichloromethane

Beide Phasen werden wie in Beispiel 1 gemischt und polymerisiert. Es bilden sich Partikel mit einer mittleren Größe von 5 µm. Nicht genutzte Allylgruppen können durch Zugabe von 2-Aminoethanol in die organische Phase geblockt werden. Die Ausführung nach diesem Beispiel ist daher in besonderem Maße zum Einschluß von sensitiven biologischen Stoffen geeignet.Both phases are mixed and polymerized as in Example 1. It particles with an average size of 5 µm are formed. Not used allyl groups can be added to the by adding 2-aminoethanol organic phase can be blocked. The execution after this Example is therefore particularly important for the inclusion of sensitive suitable for biological substances.

Claims

1. Liposomes, characterized in that they have a stable internal skeleton.

2. Liposomes according to claim 1, characterized in that a firm connection between components of the inner skeleton and the Lipid layer exists.

3. Liposomes according to claim 1 or 2, characterized in that Foreign substances are introduced into the aqueous interior.

4. interfacial polymers, characterized in that these polymers
are stable and networked in themselves
mainly have a hydrophilic character
are doped with a certain amount of amphipathic groups
have a non-uniform cross-section
have a size between 50 nm and 500 µm.

5. interfacial polymers according to claim 4, characterized in that they contain foreign substances in the aqueous inner phase.

6. Interface polymers according to claim 4 or 5, characterized characterized in that for the preparation of these polymers both water-soluble and amphipathic monomers are used.

7. interfacial polymers according to claim 4 or 5, characterized characterized that the used for their manufacture Monomers are ethylenically unsaturated compounds.

8. A process for the preparation of interfacial polymers, characterized in that
an ethylenically unsaturated monomer is dissolved in an aqueous phase,
an amphipatic monomer is dissolved in the aqueous or an organic, water-immiscible phase
a water-in-oil emulsion is formed
the polymerization reaction is initiated and
any unincorporated monomer or uncrosslinked polymers are removed from the product.

9. Use of liposomes with an inner skeleton after one or several of claims 1 to 3 for packaging and transport of active pharmaceutical ingredients.

10. Use of liposomes with an inner skeleton after one or several of claims 1 to 3 as a microreaction space, especially for carrying out enzyme-catalyzed reactions.

11. Use of interfacial polymers after one or more of claims 4 to 7 for the packaging and transport of active pharmaceutical ingredients.

12. Use of interfacial polymers according to one or more of claims 4 to 7 as a micro reaction space, in particular for Carrying out enzyme-catalyzed reactions.