CH648205A5

CH648205A5 - METHOD FOR CLEANING LIPOSOME SUSPENSIONS.

Info

Publication number: CH648205A5
Application number: CH370/80A
Authority: CH
Inventors: Luigi Moro; Guido Neri; Alessandro Rigamonti
Original assignee: Erba Farmitalia
Priority date: 1979-01-19
Filing date: 1980-01-17
Publication date: 1985-03-15
Also published as: CA1148470A; JPH0133446B2; IE800091L; DK157060C; IL59120A; FR2446635B1; AU5458180A; DK22380A; YU8180A; DK157060B; BE881225A; SE8000443L; GB2041871A; FR2446635A1; IE49141B1; ATA19380A; HU184714B; SU1367839A3; FI70672C; ZA80269B

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zum Reinigen von Liposomensuspensionen, die nach bekannten Verfahren erhalten wurden, und auf pharmazeutische Zusammensetzungen erhalten wurden, und auf pharmazeutische Zusammensetzungen (lyophile Liposome). The present invention relates to a new method for cleaning liposome suspensions obtained by known methods and obtained on pharmaceutical compositions, and to pharmaceutical compositions (lyophilic liposomes).

Liposome sind pharmazeutische Zusammensetzungen, in welchen das Heilmittel entweder dispergiert oder in anderer Form als Kügelchen vorhanden ist, die aus wässerigen konzentrischen Schichten bestehen, welche an lipidischen (hydrophoben) Schichten haften; das Heilmittel kann sowohl in der wässerigen Schicht als auch in der Lipidschicht (innen oder aussen) oder irgendwie im dishomogenen, allgemein als Liposomensuspension bekannten System vorhanden sein. Liposomes are pharmaceutical compositions in which the remedy is either dispersed or in a form other than beads, which consist of aqueous concentric layers which adhere to lipidic (hydrophobic) layers; the remedy can be present both in the aqueous layer and in the lipid layer (inside or outside) or somehow in the dishomogenic system, generally known as a liposome suspension.

Die hydrophobe Schicht weist im allgemeinen, aber nicht ausschliesslich, Phospholipide, wie Lecithin und Sphyngo-myelin, Steroide, wie Cholesterin, mehr oder weniger iono-gene oberflächenaktive Substanzen, wie Dicetylphosphat, Stearylamin oder Phosphatidinsäure und/oder ein anderes Material hydrophober Natur auf; die Durchmesser der Liposome betragen im allgemeinen 15 nm bis 5 tun. The hydrophobic layer generally, but not exclusively, has phospholipids, such as lecithin and sphyngo-myelin, steroids, such as cholesterol, more or less ionogenic surface-active substances, such as dicetyl phosphate, stearylamine or phosphatidic acid and / or another material of a hydrophobic nature; the diameter of the liposomes are generally 15 nm to 5 do.

Das Herstellungsverfahren wird im allgemeinen gemäss dem bekannten Stand der Technik durchgeführt und um-fasst zwei Hauptschritte: The manufacturing process is generally carried out in accordance with the known state of the art and comprises two main steps:

1) Herstellung der Liposomen, wobei die lipidischen oder lipophilen Komponenten in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst werden, das dann, im allgemeinen unter Vakuum, zur Trockene abgedampft wird. 1) Preparation of the liposomes, the lipidic or lipophilic components being dissolved in a suitable solvent which is then evaporated to dryness, generally under vacuum.

Die wässerige, das Heilmittel enthaltende Schicht wird dem Kolben, der den Rückstand als dünne Schicht enthält, zugesetzt und das Ganze dann während eines Zeitraumes von 10 s bis einigen h einer mechanischen oder Ultraschallschüttelbehandlung unterworfen. Die dabei erhaltene dishomogene Schicht, im allgemeinen Liposomensuspension genannt, muss von physikalisch nicht-gebundenem Heilmittel gereinigt werden. The aqueous layer containing the medicinal product is added to the flask containing the residue as a thin layer and the whole is then subjected to mechanical or ultrasonic shaking treatment for a period of from 10 s to a few hours. The dishomogenic layer obtained, generally called a liposome suspension, must be cleaned of a physically unbound remedy.

2) Abtrennung der Liposomen vom physikalisch nichtgebundenen Heilmittel: Dieses Verfahren wird gewöhnlich durch Eluieren auf einer chromatographischen Säule unter Verwendung von Harzen, die ausschliesslich Molekularsiebfunktion besitzen, wie Sepharose®, 2B, 4B oder 6B od.dgl. durchgeführt. 2) Separation of the Liposomes from the Physically Unbound Remedy: This procedure is usually carried out by elution on a chromatographic column using resins that have exclusively molecular sieve function, such as Sepharose®, 2B, 4B or 6B or the like. carried out.

Die Liposome werden zuerst gewonnen, während das freie Heilmittel durch das Harz zurückgehalten wird. The liposomes are extracted first, while the free remedy is retained by the resin.

Danach folgt eine Ultrazentrifugierbehandlung bei 100 000 g und anschliessend wird gewaschen, stets durch Ultrazentrifugieren mit gepufferter Lösung. Eine andere verwendete Methode ist die Dialyse. This is followed by an ultracentrifugation treatment at 100,000 g and then washing, always by ultracentrifugation with a buffered solution. Another method used is dialysis.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das im Anspruch 1 beschriebene Verfahren. Zum Reinigen der dishomogenen, als Liposomensuspension bekannten Schicht, können sowohl flüssige als auch feste synthetische oder organische reaktionsfähige Polymere, die als Ionenaustauscher wirksam sind, wie z.B. Styrol, Divinylbenzol, Acryl- oder Methacrylsäure, eingesetzt werden. The present invention relates to the method described in claim 1. To clean the dishomogeneous layer known as a liposome suspension, both liquid and solid synthetic or organic reactive polymers which act as ion exchangers, such as e.g. Styrene, divinylbenzene, acrylic or methacrylic acid can be used.

Die genaue Menge eines oder mehrerer der oben angeführten Harze kann direkt in den Kolben, der die zu reinigende Liposomensuspension enthält, eingebracht werden, worauf 10 bis 60 min. geschüttelt wird. Nach Filtrieren durch ein Sinterglasfilter, das das Ionenaustauscherharz mit absorbiertem physikalisch nicht-gebundenen Heilmittel enthält, kann die reine Liposomensuspension erhalten werden, die gefriergetrocknet werden kann. Dieses Verfahren zum Reinigen der Liposomensuspension mit Ionenaustauscherharzen weist den grossen Vorteil auf, dass hoch konzentrierte Liposomensuspensionen (bis zu 5 mg/ml Doxorubi-cin.HCl) aufrechterhalten werden können, die durch Chromatographie an einer Molekularsiebsäule nicht aufrechterhalten werden könnten (maximal 0,3 mg/ml). Die so erhalte- The exact amount of one or more of the above resins can be placed directly into the flask containing the liposome suspension to be cleaned, followed by 10 to 60 minutes. is shaken. After filtering through a sintered glass filter which contains the ion exchange resin with absorbed physically unbound healing agent, the pure liposome suspension can be obtained, which can be freeze-dried. This method for cleaning the liposome suspension with ion exchange resins has the great advantage that highly concentrated liposome suspensions (up to 5 mg / ml Doxorubi-cin.HCl) can be maintained, which could not be maintained by chromatography on a molecular sieve column (maximum 0.3 mg / ml). The so received

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ne Liposomensuspension ist sehr stabil und tendiert nicht zum Sedimentieren, wie es bei solchen der Fall ist, die durch Ultrazentrifugieren erhalten wurden. A liposome suspension is very stable and does not tend to sediment, as is the case with those obtained by ultracentrifugation.

Alternativ kann man anstelle von Ionenaustauscherharzen Polymere und Copolymere mit keiner spezifischen chemischen Funktion verwenden. Sie reagieren üblicherweise, aber nicht ausschliesslich, auf Grund von Van der Waals-Kräften. Sie sind im allgemeinen als adsorbierende Harze bekannt. Diese Harze können zufolge des Polaritätsunterschiedes zwischen den hydrophoben Substanzen, die die Li-posomenhülle bilden, und den Heilmitteln mit mehr oder weniger hydrophiler Natur bei der Reinigung von Liposomensuspensionen verwendet werden. Alternatively, polymers and copolymers with no specific chemical function can be used instead of ion exchange resins. They usually, but not exclusively, react due to Van der Waals forces. They are generally known as adsorbent resins. These resins can be used in the cleaning of liposome suspensions due to the difference in polarity between the hydrophobic substances that form the liposome shell and the remedies with a more or less hydrophilic nature.

Die chemische Endstabilisierung wird in der Regel durch Gefriertrocknung der Liposomensuspension erzielt. The final chemical stabilization is usually achieved by freeze-drying the liposome suspension.

Beispiel 1: Example 1:

In einem Verseifungskolben wurden die folgenden Anteile von Lipiden in Chloroform gelöst und im Vakuum zur Trockene eingedampft: 1,5 g Eilecithin, 0,4 g Cholesterin und 0,2 g Dicetylphosphat. Eine Lösung von Doxorubicin-hydrochlorid (in einer Konzentration von 10 mg/ml) in Phosphatpuffer 0,007N wurde in den Kolben gegossen und die Mischung 1 min lang mit Ultraschall behandelt. Die Suspension wurde 30 min lang unter Stickstoff bei Raumtemperatur stehen gelassen. 2 g eines Methylmethacrylat-Divinyl-benzolpolymers, das vorher in Natriumform aktiviert worden war, mit freien Carboxylgruppen und makroretikulärer Struktur, die dessen Verwendung auch in hydrophoben Lösungen gestattet, welches im Handel unter der Bezeichnung IRC-50 der Fa. Rohm & Haas erhältlich ist, wurden dann zugesetzt (Masse bezieht sich auf Trockenmasse und entspricht 5 ml gequollenem Harz). The following portions of lipids were dissolved in chloroform in a saponification flask and evaporated to dryness in vacuo: 1.5 g of egg lecithin, 0.4 g of cholesterol and 0.2 g of dicetyl phosphate. A solution of doxorubicin hydrochloride (at a concentration of 10 mg / ml) in phosphate buffer 0.007N was poured into the flask and the mixture was sonicated for 1 minute. The suspension was left under nitrogen at room temperature for 30 minutes. 2 g of a methyl methacrylate-divinyl-benzene polymer which had previously been activated in sodium form, with free carboxyl groups and a macroreticular structure which also permits its use in hydrophobic solutions, which is commercially available under the name IRC-50 from Rohm & Haas were then added (mass refers to dry mass and corresponds to 5 ml of swollen resin).

Der Kolben wurde etwa 30 min lang geschüttelt und dann die Suspension durch eine Glasfritte filtriert. The flask was shaken for about 30 minutes and then the suspension was filtered through a glass frit.

Derart erhaltene Liposome mit verschiedener Grösse von 0,5 bis 2 (im und mit einem Gehalt von etwa 60% der Ausgangsmenge von Doxorubicin wurden durch Gefriertrocknung stabilisiert. Liposomes obtained in this way with different sizes from 0.5 to 2 (in and with a content of about 60% of the starting amount of doxorubicin were stabilized by freeze-drying.

Beispiel 2: Example 2:

Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, wobei die gleichen Anteile an Lipiden und Doxorubicin verwendet wurden. Die Ultraschallschüttelzeit betrug jedoch bis zu 10 min, um Liposome mit einer Grösse von weniger als 1 jxm zu erhalten. The procedure was as described in Example 1, using the same proportions of lipids and doxorubicin. However, the ultrasonic shaking time was up to 10 minutes in order to obtain liposomes with a size of less than 1 μm.

Da die Liposome keine völlig homogene Grösse aufwiesen, wurde ein nicht-granuliertes Harz verwendet, das auch Siebfunktion besitzt. Since the liposomes were not completely homogeneous in size, a non-granulated resin was used, which also has a sieving function.

10 ml eines unter der Bezeichnung Dowex 50-X 4 (100-200 mesh) im Handel befindlichen Harzes, das vorher in Natriumform aktiviert war, wurden zu diesem Zweck zugesetzt. Nach Filtrieren wurde eine Suspension erhalten, die 10 ml of a resin commercially available under the name Dowex 50-X 4 (100-200 mesh), which was previously activated in sodium form, was added for this purpose. After filtering, a suspension was obtained which

Liposome mit einer Grösse von 0,2 bis 0,8 |im enthielt und 75% des Ausgangsdoxorubicins aufwies. Die Liposome wurden durch Gefriertrocknen stabilisiert. Contained liposomes with a size of 0.2 to 0.8 μm and contained 75% of the starting doxorubicin. The liposomes were stabilized by freeze-drying.

Beispiel 3: Example 3:

Eine Lösung von 5-Fluoruracil in einer Konzentration von 10 mg/ml in Phosphatpuffer 0,007N bei pH 8 wurde in einen Verseifungskolben gegossen, der die, wie oben beschrieben hergestellte, Lipidphase enthielt. Die Suspension wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, wobei als Filterharz 10 ml des unter der Bezeichnung Am-berlite IRA-400 (Cl) auf dem Markt befindlichen Harzes, das vorher als Hydrochlorid aktiviert war, verwendet wurden. A solution of 5-fluorouracil at a concentration of 10 mg / ml in phosphate buffer 0.007N at pH 8 was poured into a saponification flask containing the lipid phase prepared as described above. The suspension was treated in the manner described in Example 1, using 10 ml of the resin marketed under the name Am-berlite IRA-400 (Cl), which had previously been activated as hydrochloride, as the filter resin.

Die so erhaltenen Liposome wurden durch Gefriertrocknen stabilisiert. The liposomes thus obtained were stabilized by freeze-drying.

Beispiel 4: Example 4:

Die Liposome von 5-Fluoruracil wurden, wie oben beschrieben, mit den folgenden Anteilen an Lipiden hergestellt: 1,5 g Eilecithin, 0,6 g Cholesterin, 0,2 g Stearylamin. The 5-fluorouracil liposomes were prepared as described above with the following levels of lipids: 1.5 g egg lecithin, 0.6 g cholesterol, 0.2 g stearylamine.

Als Reinigungssystem wurden 10 ml des unter der Bezeichnung Dowex 1 (50-100 mesh) auf dem Markt befindlichen Harzes, das vorher aktiviert worden war, verwendet. Die so erhaltenen Liposome wurden durch Gefriertrocknen stabilisiert. 10 ml of the resin marketed under the name Dowex 1 (50-100 mesh), which had been activated beforehand, was used as the cleaning system. The liposomes thus obtained were stabilized by freeze-drying.

Beispiel 5: Example 5:

Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei jedoch das Dowex-Harz durch 15 g des adsorbierenden Harzes XAD 7 der Fa. Rohm & Haas ersetzt wurde und die Schüttelzeit auf 40 min ausgedehnt wurde. Example 2 was repeated, except that the Dowex resin was replaced by 15 g of the adsorbent resin XAD 7 from Rohm & Haas and the shaking time was extended to 40 min.

Nach Filtrieren durch eine Glasfritte G 1 wurde eine Liposomensuspension mit einem Gehalt von etwa 50% der Ausgangsmenge an Doxorubicin erhalten. Die Liposome wurden durch Gefriertrocknen stabilisiert. After filtering through a glass frit G 1, a liposome suspension containing about 50% of the starting amount of doxorubicin was obtained. The liposomes were stabilized by freeze-drying.

Beispiel 6: Example 6:

1,5 g Sojalecithin, 0,4 g Cholesterin und 0,3 g Dicetylphosphat wurden in CH2C12 gelöst und zu dieser Lösung wurde eine Lösung von Aminosidinsulfat in 0,02M Phosphatpuffer bei pH 6,5 in einer Konzentration von 3 mg/ml zugesetzt. 1.5 g soy lecithin, 0.4 g cholesterol and 0.3 g dicetyl phosphate were dissolved in CH2C12 and to this solution a solution of aminosidine sulfate in 0.02M phosphate buffer at pH 6.5 was added in a concentration of 3 mg / ml.

Die beiden Phasen wurden emulgiert und die Emulsion geschüttelt, worauf Stickstoff bei Raumtemperatur durchgeblasen wurde, bis das Methylenchlorid völlig abgedampft war. The two phases were emulsified and the emulsion shaken, whereupon nitrogen was bubbled through at room temperature until the methylene chloride had evaporated completely.

Die Suspension wurde 4 h bei Raumtemperatur stabilisiert, worauf in den Kolben ein Anteil an Harz entsprechend 5 g Trockenharz gegossen wurde, das im Handel unter der Bezeichnung IRC-50 der Fa. Rohm & Haas erhältlich ist. The suspension was stabilized for 4 hours at room temperature, whereupon a portion of resin corresponding to 5 g of dry resin was poured into the flask, which is commercially available under the name IRC-50 from Rohm & Haas.

Nach 1 h Schütteln wurde die Liposomensuspension durch eine Glasfritte filtriert, um das Harz zu entfernen, das das physikalisch nicht gebundene Heilmittel zurückhielt. Die Liposomensuspension wurde dann durch Gefriertrocknen stabilisiert. After shaking for 1 h, the liposome suspension was filtered through a glass frit to remove the resin that retained the physically unbound remedy. The liposome suspension was then stabilized by freeze drying.

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S S

Claims

648205

1. Process for cleaning dishomogeneous liposome suspensions from physically unbound medicines, characterized in that the liposome suspensions

(a) with liquid or solid, optionally crosslinked, synthetic or organic polymers which are effective as ion exchangers or

(b) treated with polymers and / or copolymers without a specific chemical function, which act as adsorbents.

2. The method according to claim 1, characterized in that the liquid or solid, optionally crosslinked, synthetic or organic polymers which are effective as ion exchangers are used.

2nd

PATENT CLAIMS

3. The method according to claim 2, characterized in that strong, medium or weak cation exchange resins, such as. Phenol formaldehyde resins bearing carbon, phosphone and sulfone groups, styrene-divinylbenzene resins, acrylates, methacrylates, various hydrocarbons and various condensation resins in liquid and solid form can be used.

4. The method according to claim 2, characterized in that strong anion exchange resins with trimethylammonium or dimethylethylammonium groups or medium or weak anion exchange resins, such as. various primary, secondary, tertiary amine or phosphine groups in salt form or resins bearing other groups, for example phenol formaldehyde resins, styrene-divinylbenzene resins, acrylates, methacrylates, various hydrocarbons and various condensation resins in liquid and solid form, can be used.

5. The method according to claim 2, characterized in that the resins are used in salt form or in activated form.

6. The method according to claim 1, characterized in that the polymers and / or copolymers are used without a specific chemical function which are effective as adsorbents.

7. The method according to claim 6, characterized in that the adsorbents in addition to aliphatic and aromatic nature can also be of inorganic origin.

8. The method according to claim 1, characterized in that the liposome suspensions used are obtained by blowing inert gas, such as nitrogen, into a two-phase emulsion or in the presence of two immiscible solvents.

9. The method according to claim 1, characterized in that the liposome suspensions obtained are stabilized by freeze-drying.

10. Pharmaceutical composition, characterized in that it consists of liposome suspensions obtained according to claim 1.

11. Pharmaceutical composition according to claim 10, characterized in that it consists of lyophilic liposomes of doxorubicin hydrochloride.

12. Pharmaceutical composition according to claim 10, characterized in that it consists of lyophilic liposomes of aminosidine sulfate.

13. Pharmaceutical composition according to claim 10, characterized in that it consists of lyophilic liposomes of 5-fluorouracil.