DE10040742B4

DE10040742B4 - Mittel zur Herz-Kreislauf-Protektion

Info

Publication number: DE10040742B4
Application number: DE10040742A
Authority: DE
Inventors: Karl Stangl; Silke Meiners; Michael Laule; Christoph Günther; Peter-Michael Kloetzel
Original assignee: Universitatsklinikum Charite Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2000-08-17
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2020-08-18
Also published as: DE10040742A1

Abstract

Verwendung eines Proteasom-Inhibitors zur Vorbeugung oder Behandlung von myokardialer Hypertrophie.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Proteasom-Inhibitors zur Vorbeugung und Behandlung von myokardialer Hypatrophie.

Hintergrund der Erfindung ist das sogenannte Ubiquitin-Proteasom-System. Das Ubiquitin-Proteasom-System ist eine der zentralen Protein-Abbau-Maschinerien der Zelle und ist wesentlich z.B. beim Abbau falsch gefalteter Proteine, bei der Degradation wichtiger regulatorischer Proteine des Zellzyklus, z. B. von Cyclinen, sowie bei der Kontrolle von Transkriptionsfaktoren, wie etwa bei der Aktivierung von NF kappa B (NFκB), beteiligt (Coux et al., 1996, zur Übersicht). Weiterhin kommt dem Proteasom eine wichtige Rolle in der MHC I-vermittelten Antigen-Präsentation zu (Groettrup et al., 1996; zur Übersicht). Der selektive Abbau proteasomaler Substrate wird über die kovalente Bindung von Ketten multipler Ubiquitinmoleküle vermittelt, die als Erkennungssignal für das Proteasom dienen (Varshavsky, 1997). Bislang wurde zwar das Ubiquitin-Proteasom-Systems ausgiebigst untersucht, jedoch nicht in Zusammenhang mit kardiologisch relevanten Indikationen.

Da etwa 90% der zellulären Proteine Substrat des Ubiquitin-Proteasom-Systems sind, macht die zentrale Rolle in unterschiedlichsten Stimulations- und Regulationsvorgängen diesen Komplex zu einen interessanten Angriffspunkt bei der Kontrolle z. B. von

• der zellulären Proliferation (Restenose nach Katheterinterventionen, Bindegewebsvermehrung im Herzmuskel und Gefäßen)
• inflammatorischen Prozesse (z. B. Atherogenese, entzündliche Herzmuskelerkrankungen)
• der Up-, und Downregulation zellulärer Proteine (z. B. Calcium-regulierende Proteine des Herzmuskels)
• der Halbwertszeit struktureller Proteine (myokardiale Hypertrophie und Regression)
• Herzkreislauf-protektiver Faktoren (z. B. Hitzeschockproteine)

Ausgehend davon ist es daher Aufgabe der Erfindung ein neues pharmazeutisch wirksames Mittel zu schaffen und zur Verfügung zu stellen, welches bei kardiologi schen Indikationen, nämlich bei myokardialer Hypertrophie, verwendet wird.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die im Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale. Durch diese erfindungsgemäßen Maßnahmen wird ein pharmazeutisch wirksames Mittel zur Verwendung bei der Vorbeugung und Behandlung von myokardialer Hypertrophie geschaffen, wobei das Mittel eine wirksame Menge Proteasom-Inhibitoren enthält. Mit dem Mittel kann

A) die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems zur Verhinderung der Restenose nach Katheterinterventionen an Gefäßen,
B) die Regulation des Ubiquitin-Proteasom-Systems zur Verhinderung der Aus bildung von Hypertrophie und Förderung der Rückbildung einer bereits ent
wickelten Hypertrophie des Herzmuskels, sowie
C) die Regulation des Ubiquitin-Proteasom-Systems zur Kardioprotektion durch Induktion von Hitzeschockproteinen

erreicht werden. Der Hintergrund der Erfindung kann hierzu wie folgt dargestellt werden:

ad A) Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems zur Verhinderung der Restenose nach Katheterinterventionen an Gefäßen

Erfolgreiche Therapieansätze bei kardiovaskulären Erkrankungen sind katheterinterventionelle Revaskularisierungsmaßnahmen bei verschlossenen oder fluidynamisch kritisch verengten Gefäßen mittels percutaner transluminaler (koronarer) Angioplastie, Laserangioplastie, direkter Atherektomie, Rotablation ohne oder in Kombination mit der Implantation von Stents Bei 30-50% der katheterinterventionell behandelten Patienten kommt es jedoch zu einer erneuten, fluidynamisch relevanten Gefäßlumeneinengung innerhalb von 12 Monaten nach Intervention. Diese sogenannte Restenose wird ausgelöst durch die Verletzung der Gefäßschichten durch den Interventionsvorgang während der Angioplastie und ist charakterisiert durch den Umbau des Gefäßes (vascular remodeling) mit Ausbildung einer Neointima aus glatten Gefäßmuskelzellen (VSMCs).

Die Ausbildung der Neointima wird ausgelöst durch eine initiale Entzündungsreaktion nach Intervention und durch die nachfolgende Hyperproliferation glatter Muskelzellen (Landzberg et al., 1997).

Es ist bekannt, dass regulatorische Proteine des Zellzyklus in ihrer Stabilität und damit Aktivität durch das Proteasom reguliert werden (Rolfe et al., 1997, zur Übersicht). Die Inhibition des Proteasoms durch spezifische Proteasom-Inhibitoren führt zur Akkumulation dieser Proteine in unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus und induziert die Arretierung des Zellzyklus und möglicherweise Apoptose (Glotzer et al., 1991; Pagano et al., 1995; Grimm et al., 1996; Maki et al., 1996; Drexler, 1997). Als effektive Inhibitoren von VSMCs sind Proteasom-Inhibitoren geeignet, das hyperplastische Wachstum glatter Gefäßmuskelzellen zu blockieren. In der Tumorforschung wurden Proteasom-Inhibitoren bereits erfolgreich im Tiermodell getestet: So führte die einmalige subcutane Injektion eines Peptid-Proteasom-Inhibitors zu einem verminderten Tumorwachstum in Nacktmäusen, verbunden mit einer erhöhten Apoptoserate in diesen Tumoren (Orlowski et al., 1998). Der anti-proliferative Effekt von Proteasom-Inhibitoren ist möglicherweise direkt gekoppelt mit der Induktion von Apoptose (Lopes et al., 1997).

Daneben ist das Proteasom essentiell für die Degradation kurzlebiger Signaltransduktoren und die Regulation von Transkriptionsfaktoren wie beispielsweise NF kappa B (Treffer et al., 1994). Die Aktivierung von NFκB wird durch unterschiedlichste inflammatorische Cytokine ausgelöst und führt zur Expression einer Reihe von Genen, die an spezifischen Immunantworten und entzündlichen Reaktionen beteiligt sind. (Baldwin, 1996; Scheidereit, 1998, zur Übersicht). Solche NFκB-vermittelten inflammatorischen Reaktionen lassen sich durch Proteasom-Inhibitoren vollständig blockieren (Read et al., 1995). Dies lässt den Einsatz spezifischer Proteasom-Inhibitoren auch bei Restenose attraktiv erscheinen. Eine Aktivierung von NFκB wird in Leukozyten, VSMCs und möglicherweise auch Thrombozyten durch Stimulation der Zellen mit inflammatorischen Cytokinen (e.g. TNFα), Wachstumsfaktoren (e.g. PDGF), Thrombin oder α_vβ₃ Integrinbindung ausgelöst (Orlashaw et al., 1992; Baldwin 1996; Maruyama et al., 1997; Scatena et al., 1998). Durch einen gezielten Einsatz von Proteasom-Inhibitoren kann diese Aktivierung blockiert und folglich die lokale Entzündungskaskade unterbrochen und die anti-apoptotischen, protektiven Effekte von NFκB aufgehoben werden. Die spezifische Inhibition von NFκB mittels antisense-Oligonukleotiden führte tatsächlich zu einer verminderten Neointima-Ausbildung im Restenosemodell der Ratte (Autieri et al., 1995).

Bei den Proteasom-Inhibitoren handelt es sich meist um synthetische Peptid-Aldehyde (z. B. MG132), die unterschiedliche Peptidase-Aktivitäten des Proteasoms reversibel inhibieren, aber auch Iysosomale und Calcium-aktivierte Proteasen blockieren können (Goldberg et al., 1997). Der natürlich vorkommende Inhibitor Lactacystin modifiziert und inhibiert irreversibel bestimmte katalytische Zentren des Proteasoms (Fenteany & Schreiber, 1998).

ad B): Regulation des Ubiquitin-Proteasom-Systems zur Verhinderung der Ausbildung von Hypertrophie und Förderung der Rückbildung einer bereits entwickelten Hypertrophie des Herzmuskels

Hypertrophie bezeichnet die Volumenzunahme der Herzmuskelzelle, ohne dass eine Zellteilung stattfindet. Hypertrophie ist die uniforme Antwort der Herzmuskelzelle auf Überlast- und Stressbedingungen unterschiedlicher Genese wie Myokardinfarkt, arterielle Hypertonie, angeborene und erworbene Herzklappenfehler, exogene Noxen wie Alkohol, Virusinfektionen und andere Stressoren. Neben den morphologischen Veränderungen kommt es zu einem Shift im Genexpressionsprogramm hin zu fötalen Formen (Übersicht in Schaub, 1997). Während initial die Hypertrophie zu einer Zunahme der Pumpleistung führt, überwiegen im weiteren Verlauf die negativen Aspekte im Sinne einer ungünstigeren Energiebilanz des Herzmuskels mit konsekutiver Entwicklung hin zur Pumpinsuffizienz und erhöhten Neigung zu tödlichen Herzrhythmusstörungen (Übersicht in McKinsey 1999). In epidemiologischen Studien wurde die Myokardhypertrophie entsprechend als Risikofaktor des plötzlichen Herztodes mit einem 3 bis 8 fachem Exzessrisiko identifiziert (Aronow 1987, messerli 1999); In der Framinghamstudie stellt die Hypertrophie zusätzlich einen eigenständigen Risikofaktor für koronare Ereignisse wie Infarkte dar (Kannel 2000).

Die kardiale Hypertrophie ist zum Teil autokrin/parakrin vermittelt, sie wird über mehrere unabhängige Signaltransduktionswege mediiert (Übersichten in Schaub 1997; McKinsey 1999):

• G-Protein gekoppelte Signaltransduktion Darunter firmieren seven-pass Membranrezeptoren, zu denen α1-β1-adrenerge Rezeptoren, der Endothelin-1 Rezeptor und der Angiotensin II Rezeptor gehören. Der β1-adrenerge Rezeptor vermittelt über stimulatorische G-Proteine, über die Adenlyatzyklase und über die Proteinkinase A Hypertrophie-induzierende Signale, bei den anderen Rezeptoren läuft die Signaltransduktion über Phospholipase C, Phosphokinase C, MAP Kinasen zu GTP bindenden Proteinen.
• Signaltransduktion über MAP Kinasen Darunter werden drei Wege subsumiert, die nach der jeweils terminalen Kinase bezeichet sind: – extracellular signal-regulated protein kinase (ERK), – c-Jun amino-terminal kinase (JNK), und – p38 Kinase (p38) mediierte Signaltransduktion. In diese Wege münden hypertrophe Stimuli über unterschiedliche Rezeptoren ein: Zytokine wie Interleukin 1 b über den Zytokinrezeptor, Wachstumsfaktoren wie insulin-like growth factor über die Rezeptor Thyrosin Kinase, transforming growth factor über die Rezeptor Serin/Threonin Kinase.
• Signaltransduktion über nukleäre Rezeptoren Diesen Weg bedient Trijodthyronin, das über den nukleären T3 Rezeptor seine Hypertrophie-induzierende Wirkung entwickelt. Der T3-Rezeptor bindet ohne weitere zwischengeschaltete Signalmediatoren direkt an die Target-DNA.

ad C): Regulation des Ubiquitin-Proteasom-Systems zur Kardioprotektion durch Induktion von Hitzeschockproteinen

Die Synthese von Hitzeschockproteinen (HSP) ist eine generalisierte Reaktionsform der Zelle zur ihrer eigenen Protektion gegen unterschiedlichste exogene und endogene Noxen und Stressoren wie thermische, mechanische, chemische Belastung, Sauerstoffmangel, Sauerstoffradikale und andere (Übersicht in Benjamin 1998, Freeman 1999, Sarto 2000). Mit HSP110, 90, 70, 60 und 27 sind wenigstens fünf größere HSP-Familien bekannt. Je nach Familie sind eine Reihe von Funktionen wie Translationsregulation, Chaperonfunktionen, Proteintransport, Proteolyse, Proteinfaltung, Verhinderung der Aggregation, Reaktivierung denaturierter Proteine und andere beschrieben (Übersicht in Benjamin 1998, Freeman 1999). Aus den vielfältigen HSP-Funktionen resultiert eine erhöhte Toleranz der Zelle gegen Stressituationen, wie sie bei Sauerstoffmangel oder bei Einwirkung von Sauerstoffradikalen entstehen.

In der kardiovaskulären Medizin gibt es eine Reihe von Situationen, in denen ein erhöhter zellulärer Schutz vor einem myokardialen Stressereignis von großer Bedeutung ist, insbesondere vor herzchirurgischen Eingriffen gegen das Operationstrauma und die Kardioplegie, beim akutem Myokardinfarkt gegen die Sauerstoffmangelversorgung und den Ischämie/Repertusionsschaden nach Wiedereröffnung des infarktbezogenen Gefäßes oder bei Herzinsuffizienz, bei der verschiedene Stressoren wie mechanische Überlast oder die vermehrte Bildung von Sauerstoffradikalen das Herz schädigen. Zur Kardioprotektion wurde ein Präkonditionieren des Myokards durch ischämische Stimuli oder durch pharmakologische Interventionen wie Adenosin, Aprikalin, Trijodthyronin und andere vorgeschlagen Infarktgefäßes (Übersichten in Spinale 1999, Rubino 2000).

In Saccharomyces cerevisiae konnte gezeigt werden, dass, dass HSPs pharmakologisch durch die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems induziert werden können (Lee 1998).

Die Erfindung sieht demnach die Verwendung eines pharmazeutisch wirksamen Mittels zur Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems zur Verwendung oder Behandlung von myokardialer Hypertrophie vor. Dieses Mittel ist in jedweder Applikationsform einsetzbar, d.h. lokale orale systemische (intravenöse, intraarterielle) Applikationen sind bevorzugt. Es handelt sich um pharmakologisch wirksame Hemmstoffe, wobei bevorzugt eine Hemmung durch Gen-Knockout von Systemkomponenten des Ubiquitin-Proteasom-Systems stattfindet und/oder eine Überexpression von Inhibitoren des Ubiquitin-Proteasom-Systems. Das Mittel eignet sich

• zur Prophylaxe, Abschwächung oder Verhinderung der Restenose; bevorzugt ist dabei ein Gabe des erfindungsgemäßen Mittels vor, während und/oder nach katheterinterventionellen Eingriffen.
• zur Verringerung oder Verhinderung von Akut- und Spätkomplikationen während und nach Katheterinterventionen; bevorzugt ist dabei ein Gabe des erfindungsgemäßen Mittels vor, während und/oder nach katheterinterventionellen Eingriffen.
• zur Prophylaxe und Therapie von Gefäßwandveränderungen mit entzündlicher Komponente, insbesondere von akuten koronaren Syndromen.
• erfindungsgemäß zur Verhinderung der Ausbildung der Hypertrophie durch gleichzeitige Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems. Die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systenis zur Prophylaxe und bei Beginn von Erkrankungen, die mit hypertrophen Stimuli für Herz und Gefäße einhergehen, insbesondere ar terielle Hypertonie, Beginn einer Herzinsuffizienz durch entzündliche Herzmuskelerkrankungen, durch Infarkt oder Klappenfehler ist daher bevorzugt.
• erfindungsgemäß dazu, eine bereits ausgebildete Hypertrophie bei fortdauerndem Einwirken des hypertrophen Stimulus durch die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems zur Regression zu bringen. Die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems liegt daher bei Erkrankungen nahe, bei denen eine chronisch erhöhte Aktivität von Hypertrophie-induzierenden Mediatoren vorliegt, die therapeutisch nicht normalisiert werden kann. Dies ist insbesondere der Fall bei langbestehender arterieller Hypertonie und chronischer Herzmuskelschwäche jedweder Genese.
• erfindungsgemäß dazu, eine bereits ausgebildete Hypertrophie auch bei Wegfall des hypertrophen Stimulus durch die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems zur Regression zu bringen. Dies legt daher die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems bei Erkrankungen wie passagerer Herzmuskelschwäche (insbesondere akuter Infarkt, akute Myokarditis, akute Intoxikation), sowie bei gut therapierbarer arterieller Hypertonie nahe.
• zur Induzierung von Hitzeschockproteinen durch Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems. Bevorzugt ist die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems zur Protektion des Herzkreislaufsystems in Situationen, in denen Stressoren jedweder Art auf das Herz einwirken. Einsatzgebiete der Erfindung liegen demzufolge insbesondere – vor, während und nach Herzoperationen, – sowie während und nach Herzinfarkten, – sowie vor, während und nach katheterinterventionellen Eingriffen, – aber auch während und nach Zuständen von akuter und chronischer Herzmuskelschwäche.

Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen enthalten. Die Erfindung ist in den anliegenden Abbildungen dargestellt und wird in Form von Beispielen, die auch auf die Abbildungen bezug nehmen, nachfolgend näher beschrieben. Es zeigt:
1 konzentrationsabhängige Stimulation der Zellen mit MG132;
2 bis 2d TNFα-induzierte Degradation der Inhibitorproteine IκBα und β im Cytoplasma in Abhängigkeit der Proteasom-Inhibitor Konzentration;
3a bis 3d konzentrationsabhängige NFκB-vermittelte DNA-Bindungsaktivität im Bandshift-Assay;
4 Induzierung von Apoptose in VSMCs;
5 Induzierung von Apoptose in VSNCs;
6 histologische Schnitte zur Veranschaulichung der effektiven Verhinderung der Restenoseausbildung;
7 dosisabhängige Zugabe unterschiedlicher Agonisten wie Isoproterenol (Iso), Endothelin-1 (Endo), transforming growth factor (TGF beta) und Trijodthyronin (T3) und Beobachtung der Zunahme des zellulären Proteingehalts;
8 Zeitkinetik für den Agonisten Isoproterenol gem. der 7;
9 dosisabhängige Zugabe unterschiedlicher Agonisten wie Isoproterenol (Iso), Endothelin-1 (Endo), transforming growth factor (TGF beta) und Trijodthyronin (T3) und Beobachtung der Abnahme des zellulären Proteingehalts bei Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems;
10 zeitabhängige Hypertrophieregession bei Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems bei bereits ausgebildeter Hypertrophie gem. der 9;
11 Agonistenvergleich gem. der 10;
12 Induktion von hsp70 nach Behandlung von NRCs mit MG132;
13 Kardioprotektion der HSPs durch Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems;
14 Wirkung der Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems auf die kontraktile Funktion von myokardialen Zellverbänden.
Vergleichsbeispiel zu A)
Es konnte die anti-proliferative, anti-inflammatorische und proapoptotische Wirkung von Proteasom-Inhibitoren gezeigt werden, nämlich zunächst durch Untersuchung in vitro an primären VSMCs der Ratten-Carotis. Die in vivo-Effekte des spezifischen Proteasom-Inhibitors MG132 auf die Ausbildung einer Neointima wurden dann im Modell der Ballondilatation der Ratten-Carotis untersucht.
In vitro konnte gezeigt werden, dass die nur fünfminütige Stimulation der Zellen mit MG132 konzentrationsabhängig (1μM MG132, 10μM MG132, 100μM MG132) zu einem deutlich verminderten Zellwachstum in einem Proliferationsassay nach Trypan-Blau-Ausschluß führte (1). Die Gabe von 10μM MG132 inhibierte das Wachstum der VSMCs um ca. 50% im Vergleich zur Kontrolle.
In einem weiteren Schritt wurde untersucht, welche Effekte die Inhibition des Proteasoms auf die TNFα-stimulierte Aktivierung von NFκB in primären VSMC der Ratten-Carotis sowie in einer humanen Gefäßmuskelzellinie (Daten nicht gezeigt) hat. Im inaktiven Zustand liegt NFκB in einem cytoplasmatischen Komplex mit dem Inhibitor IκB vor. Nach Cytokin-Stimulation (e.g. TNFα) wird IκB phosphoryliert und durch das Proteasom selektiv abgebaut. Der freigesetzte Transkriptionsfaktor NFκB gelangt in den Kern und steuert die Expression inflammatorischer Gene. Der cytoplasmatische Abbau der Inhibitorproteine IκBα und β wurde im Western Blot untersucht, die DNA-Bindungsaktivität des aktivierten und im Kern befindlichen NFκB-Komplexes wurde in Bandshift-Assays analysiert.
Es konnte gezeigt werden, dass MG132 überraschend die TNFα-induzierte Degradation der Inhibitorproteine IκBα und β im Cytoplasma in Abhängigkeit der Proteasom-Inhibitor Konzentration reduziert (2A und 2B). Zur genauen Quantifizierung wurde die Expression der Inhibitorproteine abgeglichen auf die Expression des housekeeping Gens smooth muscle-α-actin (2C und 2D). Parallel dazu kommt es konzentrationsabhängig zu einer verminderten Translokation des aktiven NFκB-Komplexes in den Kern, was sich in einer deutlichen Reduktion der DNA-Bindungsaktivität im Bandshift-Assay ausdrückt (3C). Dieser Effekt läßt sich auch mit dem spezifischen Proteasom-Inhibitor Lactacystin beobachten ( 3D). Die Spezifität des NFκB-vermittelten Bandshifts wurde in einer Kompetitionsanalyse mit unmarkierter DNA bestätigt (3A). Durch supershift-Analyse ließ sich c-rel als Hauptkomponente des nukleären NFκB-Komplexes in Ratten VSMCs identifizieren (3B).
Es konnte mithin erstmals gezeigt werden, dass durch Proteasom-Inhibitoren Apoptose in VSMCs induziert wird. Der apoptotische Zelltod wurde zum einen qualitativ durch eine DAPI/TUNEL-Färbung bestimmt (4a, DAPI-Färbung der unbehandelten Kontrollen; b, korrespondierende TUNEL-Färbung; c, DAPI-Färbung der mit 10μM MG132 behandelten VSMCs; d, korrespondierende TUNEL-Färbung), sowie mittels eines Histon/DNA ELISAs (5)und einer TUNEL-FACS-Analyse quantifiziert. Die Behandlung primärer VSMCs (24h) mit 1, 10 und 50μM MG132 induzierte Apoptose, ebenso wie die nur 5-minütige Stimulation mit 1mM MG132 (5). Durch Verwendung eines weiteren Proteasom-Inhibitors, Lactacystin, konnte gezeigt werden, dass die Induktion des apoptotischen Zelltods in VSMCs spezifisch auf die Inhibition des Proteasoms zurückzuführen ist.
Nachdem in den die Restenose im wesentlichen bedingenden Zellen, nämlich den VSMCs, gezeigt werden konnte, dass die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems anti-inflammatorisch, pro-apoptotisch und anti-proliferativ wirkt, wurde in weiteren in vivo Experimenten die Wirkung der Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems auf die Restenoseentwicklung im Ganztiermodell der Ratte geprüft. Dazu wurden in einem etablierten Restenosemodell, dem sogenannten „balloon injury model" (Clowes et al., 1983), bei dem das Endothel der Rattencarotis mittels eines Ballonkatheters traumatisch entfernt wird und ein Gefäßwandtrauma durch Aufdehnung des Gefäßes gesetzt wird, ein Inhibitor des Ubiquitin-Proteasom-Systems, MG 132, in die gedehnte Gefäßwand eingebracht (5 Minuten, 1mM MG132). In Serien von jeweils 7 Tieren (behandelt und unbehandelt) führte die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems dazu, dass die Restenoseausbildung effektiv verhindert wurde wie in 6 in repräsentativen histologischen Schnitten gezeigt (6: a, dilatiertes Kontrolltier mit M=Media, NI=Neointima, A=Adventitia; b, MG132-behandeltes Tier). Die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems erscheint daher ein wirksames Prinzip zur Verhinderung der Restenose sowie von Entzündungsaktivierung und Komplikationen vor, während und/oder nach katheterinterventionellen Eingriffen.
Ausführungsbeispiel zu B)
Hypertrophie von Herzmuskelzellen geht bekanntermaßen einher mit einer erhöhten Proteinsynthese; weitgehend unbekannt ist der Einfluß des Proteinabbaus auf die Akkumulation zellulärer Proteine im Herzmuskel.
Es konnte im Labor ein Hypertrophiemodell an neonatalen Rattenkardiomyozyten etabliert werden, in dem kardiale Hypertrophie induziert wird durch unterschiedliche hypertrophe Stimuli, die verschiedene Signaltransduktionswege bedienen. Die Hypertrophie wurde als Zunahme des zellulären Proteingehalts (gemessen als pg Protein/Zelle mittels Proteinbestimmung nach Bradford) definiert.
Wie in 7 gezeigt, führt die Zugabe unterschiedlicher Agonisten wie Isoproterenol (Iso), Endothelin-1 (Endo), transforming growth factor (TGF beta) und Trijodthyronin (T3) dosisabhängig nach 48 Stunden zu einer Zunahme des zellulären Proteingehalts zwischen 80%–100%. Der optimale Zeitpunkt der Hypertrophieausbildung wird bei allen Agonisten nach 48 Stunden erreicht, hier beispielhaft in der Zeitkinetik für Isoproterenol gezeigt (8).
Mit Hilfe dieses Hypertrophiemodells wurden die folgenden Fragestellungen geklärt und verifiziert:

1. Ist die Ausbildung der Hypertrophie durch gleichzeitige Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems abschwächbar oder verhinderbar?
2. Kann bei bereits ausgebildeter Hypertrophie bei weiterem Einwirken des hypertrophen Stimulus die Hypertrophieprogression durch jetzt einsetzende Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems (nach 48 h) abgeschwächt oder verhindert werden?
3. Kann bei bereits ausgebildeter Hypertrophie bei Wegfall des hypertrophen Stimulus die Hypertrophie durch die jetzt einsetzende Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems (nach 48 h) schneller zur Regression gebracht werden?

Ad 1.: 9 zeigt, dass durch die gleichzeitige Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems die Hypertrophieentwicklung durch die verschiedenen Agonisten bei einer Dosis von 0.1 μM MG132 bereits abgeschwächt wird. Wie exemplarisch für Iso gezeigt, verhindert die Erhöhung der Dosis auf 1 μM MG132 eine signifikante Zunahme der Proteinmenge und somit die Ausbildung einer Hypertrophie (Werte in Triplika, Mittelwerte und SD).
Ad 2.: In 10 ist dargelegt, dass bei bereits ausgebildeter Hypertrophie unterschiedlicher Genese (induziert durch Iso, Endo, IGF) die jetzt einsetzende Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems durch MG 132 (Beginn nach 48 h, Dosis: 0.1 μM) das Fortschreiten der Hypertrophieentwicklung effektiv zu verhindern vermag. Wie in 10 gezeigt, wird eine Zunahme des Proteingehalts (vergleiche: Iso 1 μM, 48h vs. Iso 1 μM, 48h, dann MG 132) vollständig verhindert. Bei IGF kommt es bei dieser MG 132 Dosierung nach 96 h sogar zu einer Hypertrophieregession durch Absinken des Zellproteingehalts unter das Niveau des 48 h Wertes.
Ad 3.: 11 zeigt, dass bei bereits ausgebildeter Hypertrophie unterschiedlicher Genese und Wegfall des hypertrophen Stimulus durch Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems durch MG 132 (Beginn nach 48 h, Dosis: 0.1 μM) die Hypertrophie schneller zur Regression bringt als bei den unbehandelten Kontrollen.
Dies Untersuchungen führen zu dem überraschenden und unerwarteten Ergebnis, dass die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems einen neuen und generellen Ansatz darstellt, unabhängig vom Signaltransduktionsweg die Ausbildung kardialer Hypertrophie zu verhindern und die Regression zu beschleunigen.
Vergleichsbeispiel zu C)
Es wurde im Labor ein Modell an neonatalen Rattenkardiomyozyten etabliert, in dem HSPs durch Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems induziert werden können. In 12 ist gezeigt, dass – exemplarisch für HSPs – HSP 70 bereits zwei Stunden nach Gabe der Proteasominhibitors MG 132 dosisabhängig auf Proteinebene im Vergleich zur Kontrolle aber auch im Vergleich zum dem natürlichem Induktor „Wärmeschock" verstärkt exprimiert wird (linke Seite der 12). Diese HSP-Induktion erreicht nach 4 Stunden ein Maximum (rechte Seite der 12). Dabei wurden NRCs mit 1 oder 10 μM MG132 für 1 Stunde vorinkubiert und entweder direkt (0h) oder nach 2 (2h) bzw. 4 (4h) Stunden lysiert. 100 μg Zellysat wurden auf einem SDS-Gel aufgetrennt, geblotted und mit einem Antikörper gegen hsp70 markiert (siehe Pfeil, rechte Seite der 12). Als Positivkontrolle wurden hitzegeschockte Zellen (HS) eingesetzt (30 min Hintzeschock bei 42°C, Lyse nach 30 min Erholungsphase, siehe Pfeilspitze). Als Negativkontrolle dienten unbehandelte Zellen. Rekombinates Protein diente als Marker.
Die Induktion der HSPs durch Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems führt tatsächlich zu einer Kardioprotektion: 13 zeigt in arbiträren Einheiten eines Zellvitalitätstests (XTT-Test) in neonatalen Kardiomyozyten, die einem Hitzestress von 2 Stunden ausgesetzt wurden, ein nach 2 und 4 Stunden deutlich besseres Überleben durch Vorinkubation der Zellen mit 1 μM MG132.
In einem weiteren Schritt wurde die Wirkung der Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems auf die kontraktile Funktion von myokardialen Zellverbänden (Rattenpapillarmuskel) geprüft. Dazu wurden Papillarmuskel präpariert, eine Stunde mit 1 μM MG132 inkubiert, in eine Kraftmeßmaschine eingespannt und nach zwei Stunden einer Ischämie von 40 min ausgesetzt (14). Die Ordinate zeigt die entwickelte Kraft, die Abszisse markiert verschiedene Zeitpunkte (Z) (Z1 Basalwert, Z2 Beginn der Hypoxie, Z3 bis Z8 Erholung der Kontraktionskraft nach Wiederzuführen von Sauerstoff.) Aus 14 geht eindeutig hervor, dass die mit MG132 behandelten Tiere (nach Induktion von HSPs) sich schneller und besser erholen. Während die Kontraktionskraft der MG132 behandelten Tiere auf das Ausgangsniveau wieder zurückkehrt, wird dieses Niveau bei den Kontrollen nicht mehr erreicht.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems einen Ansatz darstellt, kardioprotektive Faktoren wie Hitzeschockproteine im Herzen zu induzieren und dadurch eine effektive Protektion gegen Stressfaktoren, insbesondere gegen Sauerstoffmangel, zu erreichen.
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Claims

Verwendung eines Proteasom-Inhibitors zur Vorbeugung oder Behandlung von myokardialer Hypertrophie.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die myokardiale Hypertrophie Folge eines Myokardinfarkts, arterieller Hypertonie, eines angeborenen oder erworbenen Herzklappenfehlers oder exogener Noxen ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteasom-Inhibitor ein synthetisches Peptid-Aldehyd ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteasom-Inhibitor MG 132 oder Lactacystin ist.