DE10022687A1 - Gene-transfer vector containing an enhancer-promoter, useful for prevention or treatment of tumors, is able to enter normal tissue to prevent metastasis - Google Patents

Gene-transfer vector containing an enhancer-promoter, useful for prevention or treatment of tumors, is able to enter normal tissue to prevent metastasis

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DE10022687A1
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Abstract

An agent (A) for prophylaxis and treatment of tumors comprising a vector (I), an enhancer-promoter (II) and a transgene (III), with >= 1 of these components being able to enter normal cells, is new. An independent claim is also included for a similar agent (A') containing an antitumor transgene (IIIa), or its sequences, provided with a membrane anchor sequence. - ACTIVITY : Cytostatic. - MECHANISM OF ACTION : Inhibition of enzymes that break down extracellular matrix, increasing collagen content of tissue, or improving cell-cell and cell-matrix adhesion, all of which lead to reduced metastatic invasion. Liver metastases were induced in mice by injecting 2 million LS174 cells into the spleen, 3 days after administration of 3X1010> plaque-forming units of an adenoviral vector expressing the TIMP-2 metalloproteinase inhibitor. After 4 weeks, the mean weight of liver tumors was 200 mg, compared with 3200 mg in untreated controls.

Description

Die bei weitem häufigste Todesursache maligner Tumorerkrankungen ist die Organmetastasierung. Während der Primärtumor zumindest in frühen und mittleren Stadien chirurgisch reseziert werden kann, ist dies im Fall der Metastasierung selten möglich. Von wenigen Ausnahmen abgesehen, können die konventionellen Methoden der Chemotherapie und Bestrahlung, wenn überhaupt, dann nur vorübergehende Besserungen des klinischen Bildes metastasierter Tumoren erreichen.By far the most common cause of death from malignant tumor diseases is Organ metastasis. During the primary tumor at least in early and middle Stages can be surgically resected, this is rare in the case of metastasis possible. With a few exceptions, the conventional ones Methods of chemotherapy and radiation, if any, then only temporary improvements in the clinical picture of metastatic tumors to reach.

Zu den häufigsten Tumoren gehören kolorektale Karzinome. Lebermetastasen kolorektalen Ursprungs sind die häufigste Todesursache für Patienten mit kolorektalen Karzinomen. Da sie nach chirurgischer Entfernung des Primärtumors häufig über einen längeren Zeitraum die einzige Manifestation der Erkrankung darstellen, sind sie ein mögliches Ziel für kurative Therapieansätze (Dreben, JA and Niederhuber, JE. (1993) Cancer of the lower gastrointestinal tract - Colon cancer. In: Niederhuber, JE ed. Current Therapy in Oncology. St. Louis, MO: Decker, 426-431). Die potentiell kurative chirurgische Entfernung von Lebermetastasen ist aber nur für einen kleinen Prozentsatz der Patienten möglich und für die Chemotherapie sind zwar vorübergehende Remissionen aber keine Lebensverlängerung gezeigt. Daher besteht dringender Bedarf nach alternativen Therapieformen.The most common tumors include colorectal cancer. Liver metastases of colorectal origin are the leading cause of death for patients with colorectal cancer. Since they are often the only manifestation of the disease over a long period of time after surgical removal of the primary tumor, they are a possible target for curative therapeutic approaches (Dreben, JA and Niederhuber, JE. ( 1993 ) Cancer of the lower gastrointestinal tract - colon cancer. In : Niederhuber, JE ed. Current Therapy in Oncology. St. Louis, MO: Decker, 426-431). The potentially curative surgical removal of liver metastases is only possible for a small percentage of the patients and temporary remissions are shown for chemotherapy but no life extension. There is therefore an urgent need for alternative forms of therapy.

Die seit etwa 10 Jahren in der Entwicklung befindlichen gentherapeutischen Ansätze besitzen aufgrund ihrer Komplexität ein gegenüber konventionellen Therapieformen dramatisch erhöhtes Maß an Regulierbarkeit. Diese kann im Bereich der Krebsgentherapie unter anderem zum tumorspezifischen Targeting der Vektoren oder der Beschränkung der Genexpression auf Tumorgewebe und zur spezifischen Adaptation der transferierten Transgene an Angriffspunkte des jeweiligen Tumortyps genutzt werden.The gene therapy approaches that have been in development for about 10 years have due to their complexity compared to conventional forms of therapy dramatically increased level of adjustability. This can be in the range of Cancer gene therapy, among other things, for tumor-specific targeting of the vectors or the restriction of gene expression to tumor tissue and specific Adaptation of the transferred transgenes to points of attack of the respective tumor type be used.

Abgesehen von immunologischen Herangehensweisen, haben die bisher verfolgten gentherapeutischen Ansätze, wie schon die konventionellen Methoden, fast ausschließlich das infiltrierende Tumorgewebe zum primären Angriffspunkt. Dies birgt die Problematik unzureichenden Erreichens des Tumors, welcher sich mit erhöhtem intratumoralem Druck und eingeschränkter Blutversorgung präsentiert und selbst bei der üblicherweise durchgeführten direkten intratumoralen Injektion gentherapeutischer Transfervehikel nur ungenügend getroffen wird. Im Falle multipler Metastasierung hat sich gezeigt, daß sich bei der dann erforderlichen systemischen oder regionalen Gabe der Vektoren das umgebende Normalgewebe sogar wesentlich besser infizieren läßt als die Tumorzellen.Aside from immunological approaches, those who have been persecuted so far gene therapy approaches, like the conventional methods, almost only the infiltrating tumor tissue to the primary target. This harbors the problem of inadequate reaching of the tumor, which is associated with increased intratumoral pressure and restricted blood supply and even with the direct intratumoral injection usually performed gene therapy transfer vehicle is insufficiently hit. In the event of Multiple metastasis has been shown to be necessary in the then required systemic or regional administration of the vectors to the surrounding normal tissue can even infect much better than the tumor cells.

Die Erfindung hat das Ziel, die Prophylaxe und die Therapie von Tumormetastasen und Primärtumoren zu verbessern.The aim of the invention is the prophylaxis and therapy of tumor metastases and improve primary tumors.

Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Die gemäß der Erfindung entwickelte Strategie umgeht die Problematik der schwierigen Erreichbarkeit des Tumorgewebes, indem das gut zu erreichende Normalgewebe zum primären gentherapeutischen Ziel erklärt wird. Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß das normale Organgewebe direkt am Ort einer potentiellen oder stattgehabten Metastasierung mit Abwehrfunktionen ausgestattet wird, die eine Etablierung bzw. ein weiteres Wachstum der Metastasen verhindern. Ebenso kann die weitere Ausbreitung eines inoperablen Primärtumors verhindert werden. Diese Strategie der Imprägnierung des gesunden Gewebes unterscheidet sich grundlegend von allen bisher durchgeführten gentherapeutischen und nicht-gentherapeutischen Ansätzen. Gegenüber der systemischen oder intraperitonealen Applikation z. B. synthetischer Proteaseinhibitoren (Nelson, N. J. (1998) Inhibitors of Angiogenesis enter phase III testing, J Natl. Cancer Inst., 90, 960-963) besteht der Vorteil des gentherapeutischen Ansatzes darin, lokal im Zielorgan sehr hohe Konzentrationen an Wirkstoff zu erreichen mit dem Vorteil der Verringerung von Nebenwirkungen und der Möglichkeit der gleichzeitigen Applikation mehrerer Inhibitoren (s. u.). Außerdem ist eine dauerhafte Genexpression nach einmaliger Vektorapplikation kostengünstiger und nebenwirkungsärmer als die wiederholte Gabe synthetischer Substanzen über einen längeren Zeitraum.The invention is implemented according to the claims. The strategy developed according to the invention circumvents the problem of the difficult accessibility of the tumor tissue by declaring the easily accessible normal tissue to be the primary gene therapy target. The method is characterized in that the normal organ tissue is equipped with defense functions directly at the site of a potential or existing metastasis, which prevent the establishment or further growth of the metastases. The further spread of an inoperable primary tumor can also be prevented. This strategy of impregnating healthy tissue differs fundamentally from all gene therapy and non-gene therapy approaches carried out to date. Compared to systemic or intraperitoneal application, e.g. B. synthetic protease inhibitors (Nelson, NJ ( 1998 ) Inhibitors of Angiogenesis enter phase III testing, J Natl. Cancer Inst., 90, 960-963), the advantage of the gene therapy approach is to achieve very high concentrations of active substance locally in the target organ with the advantage of reducing side effects and the possibility of simultaneous application of several inhibitors (see below). In addition, permanent gene expression after a single vector application is less expensive and has fewer side effects than repeated administration of synthetic substances over a longer period of time.

In folgende klinischen Szenarien läßt sich der oben beschriebene Ansatz einfügen:
The approach described above can be inserted into the following clinical scenarios:

  • 1. Die präoperative oder intraoperative Vektorapplikation in Zielorgane, um die Extravasion etwaiger bei Operation des Primärtumors losgelöster metastatischer Tumorzellen zu unterbinden.1. The preoperative or intraoperative vector application in target organs to the Extravasion of any metastatic lesions released during surgery of the primary tumor To prevent tumor cells.
  • 2. Die adiuvante über Jahre dauernde kontinuierliche Expression von Inhibitoren im Zielgewebe zur Verhinderung des Auswachsens bzw. zum Abtöten okkulter Mikrometastasen vor allem bei Hochrisikogruppen wie dem operierten Mammakarzinom mit Lymphknotenbefall.2. The continuous continuous expression of inhibitors in the Target tissue to prevent outgrowth or to kill occult Micrometastases, especially in high-risk groups such as the operated one Breast cancer with lymph node involvement.
  • 3. Die Begrenzung des Wachstums bereits etablierter Metastasen oder inoperabler Primärtumoren.3. Limiting the growth of already established metastases or inoperable Primary tumors.
Ausführungsbeispiel 1Embodiment 1 Gentherapie kolorektaler Lebermetastasen durch adenoviralen Transfer von Metalloproteinaseinhibitoren (TIMPs) in das LeberparenchymGene therapy by colorectal liver metastases adenoviral transfer of metalloproteinase inhibitors (TIMPs) into the Liver parenchyma

Metastasen kolorektaler Karzinome produzieren verschiedene Proteasen, die sie zur Intravasion und Extravasion sowie zur Invasion im Zielgewebe benötigen. Darunter sind verschiedene Metalloproteinasen (MMPs) und hier insbesondere die MMP-2 und MMP-9, die für die Degradation von Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) verantwortlich sind (Duffy, M. J. and McCarthy, K. (1998) Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and targets for therapy (review), Int. J. Oncol., 12, 1343-48). Von den MMPs-2 und -9 wird vorzugsweise Kollagen IV als Hauptkomponente der Basalmembranen abgebaut. Im Zuge dieser Erkenntnisse wurden synthetische Proteaseinhibitoren entwickelt, die klinisch bereits eingesetzt werden und in einigen Fällen bereits die Phase III der klinischen Testung erreicht haben (Nelson, N. J. (1998) Inhibitors of Angiogenesis enter phase III testing, J Natl. Cancer Inst., 90, 960-963).Colorectal cancer metastases produce various proteases that they need for intravasion and extravasion, as well as for invasion into the target tissue. These include various metalloproteinases (MMPs) and here in particular the MMP-2 and MMP-9, which are responsible for the degradation of components of the extracellular matrix (ECM) (Duffy, MJ and McCarthy, K. ( 1998 ) Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and targets for therapy (review), Int. J. Oncol., 12, 1343-48). MMPs-2 and -9 preferentially break down collagen IV as the main component of the basement membranes. In the course of these findings, synthetic protease inhibitors have been developed which are already in clinical use and in some cases have already reached phase III of clinical testing (Nelson, NJ ( 1998 ) Inhibitors of Angiogenesis enter phase III testing, J Natl. Cancer Inst., 90 , 960-963).

Die gemäß der Erfindung entwickelte therapeutische Grundidee besteht darin, Hemmstoffe von Metalloproteinasen durch das Leberparenchym sezernieren zu lassen, um metastatische Tumorzellen an ihrer Extravasion zu hemmen, die weitere Infiltration bereits etablierter Metastasen zu unterbinden und die Versorgung der Tumors mit Gefäßen durch Hemmung von Gefäßentwicklung zu unterbinden. Zunächst wurde der Gewebsinhibitor der Metalloproteinase 2 (TIMP-2) ausgewählt. Dieser Inhibitor, wie auch mehrere verwandte Stoffe, sorgt physiologischerweise für eine Begrenzung der MMP-Aktivität bei Umbauprozessen. Durch Bindung an MMP-2 kann TIMP-2 deren Aktivität hemmen.The basic therapeutic idea developed according to the invention is to have inhibitors of metalloproteinases secreted by the liver parenchyma in order to inhibit metastatic tumor cells from extravasating, to prevent further infiltration of already established metastases and to prevent the tumor from being supplied to vessels by inhibiting vascular development . First, the tissue inhibitor of metalloproteinase 2 (TIMP-2) was selected. This inhibitor, like several related substances, physiologically limits MMP activity in remodeling processes. By binding to MMP-2, TIMP-2 can inhibit their activity.

Als Vektor zum Gentransfer wurden Erstgenerations-Adenoviren, die zu den etabliertesten Gentransfersystemen gehören (Brand, K. und Strauss, M (1998) Molekulare Grundlagen des Gentransfers und Anwendung für die Gentherapie. In: Ruckpaul, D. und Ganten, D. (Hrsg.) Handbuch der Molekularen Medizin, Bd 2 Tumorerkrankungen, Springer, Berlin, Heidelberg, New York) verwendet. Diese Vektoren, die aufgrund des Fehlens des adenoviralen E1-Gens nicht replizieren können, infizieren mit hoher Effizienz epitheliale Zellen und können in den notwendigen großen Mengen generiert werden.First-generation adenoviruses, which are among the most established gene transfer systems, were used as vectors for gene transfer (Brand, K. and Strauss, M ( 1998 ) Molecular basis of gene transfer and application for gene therapy. In: Ruckpaul, D. and Ganten, D. (ed .) Handbook of Molecular Medicine, Vol. 2 Tumor Diseases, Springer, Berlin, Heidelberg, New York). These vectors, which cannot replicate due to the lack of the adenoviral E1 gene, infect epithelial cells with high efficiency and can be generated in the necessary large amounts.

  • a) Zum Nachweis der Sekretion von TIMP-2 durch Hepatozyten in vitro, wurden A2 Zellen (Hepatozytenzellinie aus p53 k.o Mäusen) mit unterschiedlichen multiplicities of infection (MOIs) Ad-TIMP-2 infiziert. Die Konstruktion von Ad-TIMP-2 ist beschrieben worden (Baker, A. H., Wilkinson, G. W., Hembry, R. M., Murphy, G., and Newby, A. C. (1996) Development of recombinant adenoviruses that drive high level expression of the human metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and -2 genes: characterization of their infection into rabbit smooth muscle cells and human MCF-7 adenocarcinoma cells. Matrix Biol. 15: 383- 395). Das Virus beinhaltet die humane TIMP-2 cDNA unter der Kontrolle des CMV Promotors. 24 h oder 48 h später wurde der Zellkulturüberstand (ZKÜ) gewonnen. 10 µl wurden auf ein 10% Polyacrylamidgel aufgetragen und nach elektrophoretischer Auftrennung auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Für den immunologischen Nachweis wurde ein monoklonaler Antikörper (T2-101, Ab-1 von Dianova, Hamburg, Deutschland) verwendet.
    Der Western Blot zeigte eine starke TIMP-2 Bande im Überstand von Ad-TIMP-2 infizierten Zellen und keine Banden in nicht infizierten und Kontrollvirus-infizierten Überständen.    a) To detect the secretion of TIMP-2 by hepatocytes in vitro, A2 cells (hepatocyte cell line from p53 ko mice) were infected with different multiplicities of infection (MOIs) Ad-TIMP-2. The construction of Ad-TIMP-2 has been described (Baker, AH, Wilkinson, GW, Hembry, RM, Murphy, G., and Newby, AC ( 1996 ) Development of recombinant adenoviruses that drive high level expression of the human metalloproteinase- 9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and -2 genes: characterization of their infection into rabbit smooth muscle cells and human MCF-7 adenocarcinoma cells. Matrix Biol. 15: 383-395). The virus contains the human TIMP-2 cDNA under the control of the CMV promoter. The cell culture supernatant (ZKÜ) was obtained 24 hours or 48 hours later. 10 μl were applied to a 10% polyacrylamide gel and, after electrophoretic separation, transferred to a nitrocellulose membrane. A monoclonal antibody (T2-101, Ab-1 from Dianova, Hamburg, Germany) was used for the immunological detection.
    The Western blot showed a strong TIMP-2 band in the supernatant from Ad-TIMP-2 infected cells and no bands in uninfected and control virus-infected supernatants.
  • b) Die Funktionsfähigkeit von TIMP-2 wurde mittels reverser Zymographie (nach Baker, A. H., Wilkinson, G. W., Hembry, R. M., Murphy, G., and Newby, A. C. (1996) Development of recombinant adenoviruses that drive high level expression of the human metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and -2 genes: characterization of their infection into rabbit smooth muscle cells and human MCF-7 adenocarcinoma cells. Matrix Biol. 15: 383-395) überprüft. Zellen wurden infiziert, wie unter (a) beschrieben. Der ZKÜ wurde mittels eines Amicon Konzentrators (Lexington, MA, USA) konzentriert. NaN3, Brij and CaCl2 wurden zugegeben um eine Endkonzentration von of 0.1%, 0.05% bzw. 5 mM zu erhalten. Die Proben wurden mit nicht reduzierendem Puffer gemischt und auf ein 10% Polyacrylamid/SDS Gel geladen, welches 1 mg/ml Gelatine (porcine skin type I, bloom 300, SIGMA G2500) und 107 ng/ml aktives MMP-2 Protein (Oncogene, Cambridge, MA, USA) enthält. Nach der Elektrophorese, wurde das SDS durch Inkubation für 2 h in 2.5% Triton X 100 aus dem Gel entfernt. Das Gel wurde über Nacht in 50 mM Tris HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Brij-35, und 0.02% NaN3 bei 37°C inkubiert. Das Gel wurde mit 0.5% Coomassie Brilliantblau (SIGMA R250, Deisenhofen, Deutschland) gefärbt, und Banden Gelatinase-inhibitorischer Aktivität, die TIMP-2 representieren erscheinen dann dunkel gegen den verdauten Hintergrund. Die reverse Zymographie zeigte Gelatinase-inhibitorische Aktivität nur in den Überständen Ad-TIMP-2 infizierter Zellen und nicht in Überständen von nicht infizierten oder Kontrollvirus infizierten Zellen.b) The functionality of TIMP-2 was determined using reverse zymography (according to Baker, AH, Wilkinson, GW, Hembry, RM, Murphy, G., and Newby, AC ( 1996 ) Development of recombinant adenoviruses that drive high level expression of the human metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and -2 genes: characterization of their infection into rabbit smooth muscle cells and human MCF-7 adenocarcinoma cells. Matrix Biol. 15: 383-395). Cells were infected as described in (a). The ZKÜ was concentrated using an Amicon concentrator (Lexington, MA, USA). NaN 3 , Brij and CaCl 2 were added to give a final concentration of 0.1%, 0.05% and 5 mM, respectively. The samples were mixed with non-reducing buffer and loaded onto a 10% polyacrylamide / SDS gel containing 1 mg / ml gelatin (porcine skin type I, bloom 300, SIGMA G2500) and 107 ng / ml active MMP-2 protein (Oncogene, Cambridge, MA, USA) contains. After electrophoresis, the SDS was removed from the gel by incubation for 2 h in 2.5% Triton X 100. The gel was incubated overnight in 50 mM Tris HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM CaCl 2 , 0.05% Brij-35, and 0.02% NaN 3 at 37 ° C. The gel was stained with 0.5% Coomassie brilliant blue (SIGMA R250, Deisenhofen, Germany), and bands of gelatinase-inhibitory activity representing TIMP-2 then appear dark against the digested background. Reverse zymography showed gelatinase inhibitory activity only in the supernatants of Ad-TIMP-2 infected cells and not in the supernatants of uninfected or control virus infected cells.
  • c) Die Produktion von MMP-2 durch Tumorzellen wurde durch Gelatin Zymographie nachgewiesen. Der ZKÜ verschiedener Zellinien wurde gesammelt und konditioniert, wie unter (b) beschrieben. Die Zymographie wurde durchgeführt wie unter (b) beschrieben, nur MMP-2 wurde nicht zugeben. Banden der Lyse, die gelatinolytische Aktivität anzeigen, waren gegen den dunklen Hintergrund sichtbar. Unter mehreren Zellinien zeigten LS 174 Kolontumorzellen die stärkste MMP-2 Aktivität.c) The production of MMP-2 by tumor cells was demonstrated by gelatin zymography. The CCT of various cell lines was collected and conditioned as described in (b). The zymography was carried out as described under (b), only MMP-2 was not added. Bands of lysis indicating gelatinolytic activity were visible against the dark background. Among several cell lines, LS 174 colon tumor cells showed the strongest MMP-2 activity.
  • d) Zum Nachweis rekombinanten humanen TIMP-2 im Blut von Nacktmäusen wurden verschieden Dosen Ad-TIMP-2 intravenös in die Schwanzvene von Nacktmäusen injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde Blut abgenommen und Serum gewonnen. Die Proben wurden mittels eines TIMP-2 ELISAs (RPN 2618, Amersham Buchler, Braunschweig, Germany) auf TIMP-2 Gehalt überprüft. Die Ergebnisse zeigen eine Abhängigkeit der TIMP-2 Expression von der applizierten Virusmenge mit einer TIMP-2-Konzentration von 45 µg/ml bei einer Dosis von 3 × 1010 pfus (plaque forming units). Die Serumkonzentration an TIMP-2 war über 2 Wochen stabil. Diese Ergebnisse zeigen, daß TIMP-2 nach intravenöser Injektion in das Blut sezerniert wird.d) To detect recombinant human TIMP-2 in the blood of nude mice, different doses of Ad-TIMP-2 were injected intravenously into the tail vein of nude mice. Blood was drawn at various times and serum was obtained. The samples were checked for TIMP-2 content using a TIMP-2 ELISA (RPN 2618 , Amersham Buchler, Braunschweig, Germany). The results show a dependency of the TIMP-2 expression on the amount of virus applied with a TIMP-2 concentration of 45 μg / ml at a dose of 3 × 10 10 pfus (plaque forming units). The serum concentration of TIMP-2 was stable over 2 weeks. These results show that TIMP-2 is secreted into the blood after intravenous injection.
  • e) Um das Ausmaß des Gentransfers in die Leber zu prüfen, wurden Adenoviren in die Schwanzvene von Nacktmäusen injiziert. Nach drei Tagen wurden die Tiere getötet und die Lebern in Flüssigstickstoff eingefroren. Zur immunohistochemischen Detektion von TIMP-2 wurde ein monoklonaler Mausantikörper gegen humanes TIMP-2 (1 : 10, T2-101, Ab-1, Dianova, Hamburg, Germany) verwendet. Ein FITC konjugierter Schaf anti-Mausantikörper wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Das Ergebnis der Färbung ergab eine Expression von TIMP-2 durch 40% der Hepatozyten bei einer Dosis von 3 × 1010 pfu und von < 80% bei einer Dosis von 6 × 1010 pfu. Eine ähnliche Gentransfereffizienz wurde nach Applikation von Ad-ßgal und nachfolgendes X-gal staining dokumentiert. e) To test the extent of gene transfer to the liver, adenoviruses were injected into the tail vein of nude mice. After three days, the animals were sacrificed and the livers frozen in liquid nitrogen. A monoclonal mouse antibody against human TIMP-2 (1:10, T2-101, Ab-1, Dianova, Hamburg, Germany) was used for the immunohistochemical detection of TIMP-2. A FITC conjugated sheep anti-mouse antibody was used as the secondary antibody. The result of the staining showed expression of TIMP-2 by 40% of the hepatocytes at a dose of 3 × 10 10 pfu and of <80% at a dose of 6 × 10 10 pfu. A similar gene transfer efficiency was documented after the application of Ad-ßgal and subsequent X-gal staining.
  • f) Die Wirksamkeit intravenöser Applikation von Ad-TIMP-2 gegenüber LS 174 abgeleiteten Lebermetastasen wurde mit folgenden Experimenten geprüft. Adenoviren wurden 1 Tag vor oder 10 Tage nach Metastaseninduktion appliziert. Die Metastaseninduktion erfolgte durch Applikation von 2 × 106 LS174 Zellen in die Milz der Tiere. 5 Wochen nach Metastaseninduktion wurden die Tiere getötet und die Tumorgewichte bestimmt. Im präventiven Versuchsansatz wurden an Tag 0 Ad- TIMP-2 oder Ad-ßgal Kontollvirus in einer Dosis von 3 × 1010 pfu, die zu etwa 40% Leberzellinfektion führt, über die Schwanzvene gegeben. Nach 3 Tagen erfolgte die Metastaseninduktion über die oben beschriebene Milzinjektion von Tumorzellen. Nach 4 Wochen wurde das Experiment beendet und die Volumina der Lebertumoren bestimmt. Es zeigte sich, daß sowohl in der unbehandelten Kontrollgruppe, wie auch in der mit Kontrollvirus behandelten Gruppe die Mehrzahl der Tiere eine, die Leber fast vollständig aufbrauchende, Metastasierung aufwiesen, während die mit Ad- TIMP-2 behandelten Tiere in der Mehrzahl makroskopisch tumorfrei waren (Abb. 1: Unbehandeltes, Ad-ßgal behandeltes (Mitte) und Ad-TIMP-2 behandeltes Tier (rechts)).
    Die quantitative Auswertung ergab ein Verhältnis des Mittelwertes der Tumorgewichte in den Versuchsgruppen von 1 : 20 (Ad-TIMP-2: Ad-ßgal oder unbehandelt, Abb. 2, Punkte entsprechen einzelnen Tieren, Balken entsprechen den Mittelwerten). Die histopathologische Untersuchung ergab nur vereinzelte Mikrometastasen in den makroskopisch tumorfreien Tieren der Ad-TIMP- 2 Gruppe. Damit läßt sich feststellen, daß die gentherapeutisch medijerte Sekretion von TIMP-2 durch Hepatozyten sowohl die Zahl als auch die Größe kolorektaler Metastasen im Nacktmausmodell hochsignifikant einschränkt. Dieser Befund war in seiner Eindeutigkeit überraschend und spricht für eine zentrale, nicht ersetzbare Funktion der MMP-2. Da im beschriebenen Ansatz nur etwa 40% der Hepatozyten transduziert waren liegt hier offensichtlich eine hochwirksame Therapie vor, die vermutlich durch lokale hohe Konzentrationen des Wirkstoffs mit antimetastatischer Wirkung auf mehreren Ebenen (Extravasion, Infiltration und Angiogenese) bedingt ist.
    In einem zweiten Versuch erfolgte die Applikation der therapeutischen Vektoren eine Woche nach Metastaseninduktion. In diesem Falle war die Therapieeffizienz geringer als bei präventiver Gabe der Vektoren. Die Unterschiede zwischen Behandlungsgruppe (TIMP-2) und Kontrollgruppen (Ad-ßgal oder unbehandelt) waren aber hochsignifikant.    f) The effectiveness of intravenous administration of Ad-TIMP-2 against LS 174 derived liver metastases was tested with the following experiments. Adenoviruses were administered 1 day before or 10 days after metastasis induction. The metastasis was induced by applying 2 × 10 6 LS174 cells in the spleen of the animals. The animals were sacrificed 5 weeks after metastasis induction and the tumor weights were determined. In the preventive test approach, Ad-TIMP-2 or Ad-ßgal control virus was administered via the tail vein in a dose of 3 × 10 10 pfu on day 0, which leads to approximately 40% liver cell infection. After 3 days, the metastasis was induced by the spleen injection of tumor cells described above. The experiment was terminated after 4 weeks and the volumes of the liver tumors were determined. It was found that both in the untreated control group and in the group treated with control virus, the majority of the animals had metastasis which almost completely consumed the liver, while the majority of the animals treated with AD-TIMP-2 were macroscopically tumor-free ( Fig. 1: Untreated, Ad-ßgal-treated (middle) and Ad-TIMP-2 treated animal (right)).
    The quantitative evaluation showed a ratio of the mean of the tumor weights in the test groups of 1:20 (Ad-TIMP-2: Ad-ßgal or untreated, Fig. 2, points correspond to individual animals, bars correspond to the mean values). The histopathological examination revealed only isolated micrometastases in the macroscopic tumor-free animals of the Ad-TIMP- 2 group. It can thus be established that the gene therapy mediated secretion of TIMP-2 by hepatocytes limits both the number and the size of colorectal metastases in the nude mouse model in a highly significant manner. This finding was surprising in its uniqueness and speaks for a central, irreplaceable function of the MMP-2. Since only about 40% of the hepatocytes were transduced in the described approach, there is obviously a highly effective therapy here, which is presumably due to local high concentrations of the active substance with antimetastatic activity on several levels (extravasion, infiltration and angiogenesis).
    In a second experiment, the therapeutic vectors were applied one week after the induction of metastases. In this case the therapy efficiency was lower than with preventive administration of the vectors. The differences between treatment group (TIMP-2) and control groups (ad-ßgal or untreated) were highly significant.
  • g) Die Lebern der Tiere beider experimenteller Ansätze wurden histologisch aufgearbeitet, um sie auf die Standard-Tumorparamenter Apoptose und Proliferation sowie das Ausmaß an Angiogenese zu untersuchen.
    Zur Bestimmung der Angiogenese, Proliferation und Apoptose wurden Paraffinschitte der Lebern angefertigt und mit den folgenden Antikörpern gefärbt: Zum Nachweis der Angiogenese wurde ein CD31 Antikörper (Daco, Hamburg, Germany) verwendet, zur Bestimmung der Prozentzahl proliferierender Zellen ein MIB-1 (Ki-67) Antikörper (dia 505, Dianova). Der Nachweis erfolgte mittels eines biotinylierten zweiten Antikörpers und eines horse-radish-konjugiertem Avidin (Dako). Zum Nachweis von Apoptose wurde ein ApopTag fluorescein in situ apoptose Kit (Intergen, Oxford, UK, TUNEL-Methode) verwendet. Deparaffinisierte Schnitte wurden mit Proteinase K vorbehandelt. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) wurde zur primären Färbung verwendet und anti-Digoxigenin, konjugiert an Fluorescein, wurde als Reporter Molekül verwendet. Propidiumiodid wurde als Gegenfärbung eingesetzt. Mitosen wurden auf Hematoxylin/Eosin gefärbten Schnitten gezählt. 10 mikroskopische Felder pro Tier wurden bei einer Vergrößerung von x400 (MIB, mitoses, CD31) oder mit einem Ölimmersionsobjektiv (x1000, TUNEL) unter Verwendung eines Zeiss (Axioskop) Fluoreszenzmikroskops (Carl Zeiss, Jena, Germany) gezählt, und die Mittelwerte wurden errechnet. Die Mittelwerte aller Daten tumortragender Tiere in den einzelnen Behandlungsgruppen wurden errechnet, und zur statistischen Analyse wurde Student's T-Test angewendet.
    Es zeigte sich eine signifikant bis hochsignifikant erniedrigte Proliferationsrate und Anzahl an Blutgefäßen und erhöhte Apoptoserate bei Ad-TIMP-2 behandelten Tieren im Vergleich zu unbehandelten oder Kontrollvirus behandelten Tieren.    g) The livers of the animals of both experimental approaches were processed histologically in order to examine them for the standard tumor parameters apoptosis and proliferation as well as the extent of angiogenesis.
    To determine the angiogenesis, proliferation and apoptosis, paraffin sections of the liver were prepared and stained with the following antibodies: A CD31 antibody (Daco, Hamburg, Germany) was used to detect the angiogenesis, and an MIB-1 (Ki- 67) Antibodies (dia 505, Dianova). The detection was carried out using a biotinylated second antibody and a horse-radish-conjugated avidin (Dako). An ApopTag fluorescein in situ apoptosis kit (Intergen, Oxford, UK, TUNEL method) was used to detect apoptosis. Deparaffinized sections were pretreated with Proteinase K. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) was used for primary staining and anti-digoxigenin conjugated to fluorescein was used as the reporter molecule. Propidium iodide was used as a counterstain. Mitoses were counted on hematoxylin / eosin stained sections. 10 microscopic fields per animal were counted at a magnification of x400 (MIB, mitoses, CD31) or with an oil immersion objective (x1000, TUNEL) using a Zeiss (Axioskop) fluorescence microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany) and the mean values were calculated . The mean values of all data from tumor-bearing animals in the individual treatment groups were calculated and Student's t-test was used for statistical analysis.
    There was a significantly to highly significantly reduced proliferation rate and number of blood vessels and an increased apoptosis rate in animals treated with Ad-TIMP-2 compared to untreated or control virus-treated animals.

Weitere Ausführungsformen der Erfindung betreffen Vektoren, Promotoren/Enhancer, Transgene, Transmembrananker und Zielorgane Further embodiments of the invention relate to vectors, Promoters / enhancers, transgenes, transmembrane anchors and target organs  

VektorenVectors

Vor allem beim Vorliegen okkulter Metastasen, deren Reaktivierung erst nach jahrelanger Latenz auftreten kann und bei präoperativer Metastasenprävention ist die Langzeitexpression des transferierten Gens essentiell. Bei Verwendung von Erstgenerations-Adenoviren sind die therapeutischen Effekte zeitlich auf einige Wochen begrenzt. Hierfür werden immunologische Abwehrreaktionen des Empfängers verantwortlich gemacht. Diese scheinen durch die Restexpression adenoviraler Gene bedingt zu sein (Yang, Y. et al. (1994) Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenovirus for gene therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4407-4411.). Ein vielversprechender Ansatz zur Reduktion der Immunogenität ist die Auslagerung aller kodierenden adenoviralen Genomabschnitte aus dem therapeutischen Vektor (Chen, H. H. et al. (1997) Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1645- 1650). Gleichzeitig wird die Transportkapazität solcher Viren erheblich erhöht, so daß mehrere Transgene auf einem Vektor Platz haben, was einen Angriff an verschiedenen Stellen der Metastasierungskaskade möglich macht. Solche TIMP-2 tragenden, sogenannten helper dependent (HD), gutless, oder Minimal-Adenoviren können vermutlich einen langandauernden Schutz vor Organmetastasierung bieten. Weitere Vektoren, die eine längerdauernde Fremdgenexpression zulassen, sind Retroviren und adeno-assoziierte Viren (AAVs). Beide Viren sind nicht immunogen und integrieren notwendigerweise (Retroviren) oder potentiell (AAVs) in das Genom der Wirtszelle. Während bei Retroviren die Notwendigkeit der Replikation der Zielzellen und die Schwierigkeit der Generation hochtitriger Virussuspensionen noch Probleme bereiten, könnten moderne AAV-Vektoren bereits mittelfristig zum Gentransfer von Proteaseinhibitoren verwendet werden. Aussichtsreiche Vektoren sind außerdem Lentiviren Hybridkonstrukte sowie Herpes Simplex Viren, die eine hohe Affinität zu neuronalem Gewebe haben und daher insbesondere zue Behandlung von Hirnmetastasen und Glioblastomen geeignet sind. Unter den nicht viralen Vektorsystemen sind Liposomen hervorzuheben. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Modifikationen in der Oberflächenstruktur von Viren, die ein Retargeting der Vektoren ermöglicht. Dies wird erreicht in dem ein geeigneter Ligand wird auf viralen spikes exprimiert wird, was eine gezielte Transduktion bestimmter Normalgewebe ermöglicht. So kann man z. B. durch Inkorporation einer Heparindomäne Heparan-exprimierende Zellen gezielt adenoviral transduzieren.Especially in the presence of occult metastases, which can only be reactivated after years of latency, and in preoperative metastasis prevention, long-term expression of the transferred gene is essential. When using first generation adenoviruses, the therapeutic effects are limited to a few weeks. Immunological defense reactions of the recipient are held responsible for this. These seem to be caused by the residual expression of adenoviral genes (Yang, Y. et al. ( 1994 ) Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenovirus for gene therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 , 4407-4411 . ). A promising approach to reducing immunogenicity is the outsourcing of all coding adenoviral genome sections from the therapeutic vector (Chen, HH et al. ( 1997 ) Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1645-1650). At the same time, the transport capacity of such viruses is increased considerably, so that several transgenes have space on one vector, which enables an attack at different points in the metastasis cascade. Such TIMP-2-bearing, so-called helper dependent (HD), gutless, or minimal adenoviruses can presumably offer long-term protection against organ metastasis. Retroviruses and adeno-associated viruses (AAVs) are further vectors that allow longer foreign gene expression. Both viruses are not immunogenic and necessarily integrate (retroviruses) or potentially (AAVs) into the genome of the host cell. While the need for replication of the target cells and the difficulty of generating high-titer virus suspensions still pose problems for retroviruses, modern AAV vectors could already be used in the medium term for gene transfer of protease inhibitors. Promising vectors are also lentiviruses, hybrid constructs and herpes simplex viruses, which have a high affinity for neuronal tissue and are therefore particularly suitable for the treatment of brain metastases and glioblastomas. Among the non-viral vector systems, liposomes should be emphasized. A preferred embodiment of the invention is the modifications in the surface structure of viruses, which enables retargeting of the vectors. This is achieved by expressing a suitable ligand on viral spikes, which enables a specific transduction of certain normal tissues. So you can z. B. by incorporating a heparin domain heparan-expressing cells specifically transduce adenoviral.

Enhancer/PromotorenEnhancers / promoters

Es können Enhancer/Promotoren verwendet werden, die im jeweiligen zu schützenden Normalgewebe aktiv sind. Hierunter fällt in den meisten Fällen das Organparenchym. In Einzelfällen kann auch eine Expression von Antitumortransgenen durch unterrepräsentierte Zellen des Organs sinnvoll sein, wie z. B. die unten angesprochene Sekretion von Kollagen z. B. durch Fibroblasten.Enhancers / promoters can be used that are specific to each protective normal tissues are active. In most cases this is the case Organ parenchyma. In individual cases, an expression of Antitumor transgenes through underrepresented cells of the organ may be useful, such as e.g. B. the below-mentioned secretion of collagen z. B. by fibroblasts.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, Promotoren zu verwenden, die erst nach Zugabe einer körperfremden Substanz aktiviert werden. Mit solchen Promotoren, wie z. B. Tetracyclin abhängigen Promotorelementen oder Steroid responsiven Elementen hat man die Möglichkeit, nur sporadisch zu imprägnieren oder die für eine Metastasierung gefährlichsten Zeitpunkte auszuwählen.Another option is to use promoters that are only after Addition of a foreign substance can be activated. With such promoters as e.g. B. tetracycline-dependent promoter elements or steroid responsive Elements can be impregnated only sporadically or for one Metastasis to select the most dangerous times.

TransgeneTransgenes

  • 1. TIMP-2 ist das geeignete Protein zur Behandlung LS174-Zell abgeleiteter Metastasen. MMP-2, welche durch TIMP-2 gehemmt wird, gehört zu den für die Tumorzellinvasion relevantesten Proteasen. Andere Zellinien produzieren jedoch auch andere MMPs, und dies spiegelt sich auch im Proteasemuster humaner Tumoren wieder. Auch die extrazelluläre Matrix der Zielorgane ist unterschiedlich aufgebaut was unterschiedliche Anforderungen an die Tumorzellproteasen stellt. Ein allgemeingültiger Ansatz muß daher auch andere Proteasehemmstoffe als TIMP-2, wie z. B. TIMP-1, PAI-1 oder PAI-2 einbeziehen. Modifikationen in der Struktur der natürlich vorkommenden Inhibitoren führen zu Steigerungen der Wirksamkeit oder zur Verringerung etwaiger Nebenwirkungen. Solche Modifikationen bestehen in Verkürzungen des Moleküls oder in der Veränderung der Sequenz durch Austausch einzelner Basen der DNA. Bespielsweise gelingt es durch Entfernung eines endständigen (C-terminalen) Teils des TIMP-2 Moleküls, dessen unerwünschte Protease-aktivierende Funktion zu entfernen.1. TIMP-2 is the appropriate protein for treating LS174-derived cells Metastases. MMP-2, which is inhibited by TIMP-2, is one of those for Tumor cell invasion most relevant proteases. However, other cell lines produce other MMPs as well, and this is also reflected in the protease pattern more humane Tumors again. The extracellular matrix of the target organs is also different constructed which places different demands on the tumor cell proteases. On general approach must therefore also protease inhibitors other than TIMP-2, such as B. Include TIMP-1, PAI-1 or PAI-2. Modifications in the structure of the naturally occurring inhibitors lead to increases in effectiveness or to reduce any side effects. Such modifications consist in Shortening the molecule or changing the sequence through exchange individual bases of DNA. For example, by removing one  terminal (C-terminal) part of the TIMP-2 molecule, its undesired Remove protease activating function.
  • 2. Eine Alternative zur Hemmung der Degradation der extrazellulären Matrix (ECM) ist die Verstärkung oder Modifikation derselben. Es können hier natürlicherweise vorkommende Komponenten der extrazellulären Matrix überexprimiert werden. Hierunter fallen die Gene für die verschiedenen Kollagene, Fibronektin, Laminin und Gene deren Produkte für die Synthese von nicht proteinischen Komponenten der ECM verantwortlich sind. Weiterhin können Komponenten der ECM, die gewöhnlich nicht in dem betreffenden Organ exprimiert werden, ortsfremd exprimiert werden und damit die Organspezifität von Metastasen verändert werden. Weiterhin können nicht abbaubare oder schwer abbaubare Substanzen, die ein unüberwindliches Hindernis für metastatische Zellen darstellen exprimiert werden.2. An alternative to inhibiting the degradation of the extracellular matrix (ECM) is the amplification or modification of the same. It can be natural here occurring components of the extracellular matrix are overexpressed. This includes the genes for the various collagens, fibronectin, and laminin Genes whose products for the synthesis of non-protein components of the ECM are responsible. Furthermore, components of the ECM, which are common are not expressed in the organ in question, are expressed locally and to change the organ specificity of metastases. Can not continue degradable or poorly degradable substances that are an insurmountable obstacle for metastatic cells to be expressed.
Ausführungsbeispiel 2Embodiment 2

Es ist seit längerem bekannt, daß in zirrhotischen Lebern seltener Metastasen entstehen, als in normalen Lebern. Ursache hierfür ist vermutlich die Hemmung der Ausbreitung metastatischer Zellen in fibrotischem Gewebe. Diesen Zusammenhang kann man therapeutisch nutzen und erweitern indem hepatisches Normalgewebe durch Gentransfer dazu gebracht wird, seine Mikroanatomie so zu ändern, daß eine Art eingeschränkte künstliche Zirrhose/Fibrose zu generiert wird und damit metastatische Zellen an ihrer Expansion gehindert werden. Kollagen IV ist Hauptbestandteil von Basalmembranen. Eine solche existiert zwischen Hepatozyten und Sinusoiden nicht. Nur wenig kollagenes Gewebe liegt im Disseschen Raum. Eine geringgradige Erhöhung des Kollagengehaltes wird die Metastasierungsfähigkeit empfindlich einschränken.It has long been known that in cirrhotic livers metastases are less common arise than in normal livers. The reason for this is probably the inhibition of Spread of metastatic cells in fibrotic tissue. This connection can be used therapeutically and expanded by normal hepatic tissue is caused by gene transfer to change its microanatomy so that a Type restricted artificial cirrhosis / fibrosis is generated and thus metastatic cells are prevented from expanding. Collagen IV is Main component of basement membranes. One exists between hepatocytes and not sinusoids. There is little collagenous tissue in the Disseschen area. A slight increase in the collagen content will Restrict metastatic ability sensitively.

VektorkonstruktionVector construction

Die beiden Polypeptidketten, die die Tripelhelix der Kollagenfibrille generieren, werden in einen Minimal-Adenovirus shuttle Vektor kloniert. Als Promotor wird ein tet-Aktivator-responsiver und Doxycyclin-abhängiger Promotor verwendet, um das Ausmaß der Transgenexpression steuerbar zu halten. Außerdem wird der tet-Aktivator mit auf das shuttle Plasmid gebracht. Unter Verwendung eines beliebigen Verpackungssystems wird ein Minimal-Adenovirus hergestellt (= HDAD-tetColl) The two polypeptide chains that make up the triple helix of the Generating collagen fibrils are transformed into a minimal adenovirus shuttle vector cloned. A tet activator-responsive and doxycycline-dependent is promoted Promoter used to keep the level of transgene expression controllable. The tet activator is also brought onto the shuttle plasmid. Under Using any packaging system becomes a minimal adenovirus manufactured (= HDAD-tetColl)  

VektortestungVector testing

In Nacktmäusen werden durch Injektion von LS174 Zellen Lebermetastasen induziert. Die Verabreichung von HDAd-tetColl erfolgt in Analogie zur Methodik in Ausführungsbeispiel 1. Gleiches gilt für die Auswertung
In nude mice, liver metastases are induced by injection of LS174 cells. HDAd-tetColl is administered in analogy to the methodology in exemplary embodiment 1. The same applies to the evaluation

  • 1. Ein anderer Weg zur Blockade von Tumorzellinvasion und Motilität ist die Verstärkung der Zell-Zell und Zell-Matrix-Adhäsionen. Zu nennen sind die tight junctions mit den Proteinen Claudin und Occludin, die Desmosomen und Adherence junctions mit dem Hauptprotein Cadherin, Integrine, die v. a. mit Komponenten der ECM reagieren, die Immunglobulin Superfamilie, die Selectine und die Muzine.1. Another way to block tumor cell invasion and motility is Enhancement of cell-cell and cell-matrix adhesions. These are tight junctions with the proteins Claudin and Occludin, the Desmosomes and Adherence junctions with the main protein cadherin, integrins, which v. a. with components of the ECM respond, the immunoglobulin superfamily, the Selectine and the Muzine.
Ausführungsbeispiel 3Embodiment 3

Es wurde bereits gezeigt, daß E-Cadherin für die Interaktion von Epithelzellen verantwortlich ist und ein Verlust von E-Cadherin durch Zellen im Primärtumor Metastasierung fördert (Birchmeier, W. (1995) E-cadherin as a tumor (invasion) suppressor gene. Bioessays 17, 97-99). Eine Expression von E-Cadherin durch Normalzellen führt einerseits zu einer Adhesion mit den Tumorzellen und zu einer Hemung von deren Motilität und weiterhin zu einer Verstärkung der Adhesion innerhalb der Normalzellen.It has already been shown that E-cadherin is responsible for the interaction of epithelial cells and that loss of E-cadherin by cells in the primary tumor promotes metastasis (Birchmeier, W. ( 1995 ) E-cadherin as a tumor (invasion) suppressor gene. Bioessays 17 , 97-99 ). Expression of E-cadherin by normal cells leads on the one hand to adhesion with the tumor cells and to an inhibition of their motility and further to an increase in adhesion within the normal cells.

VektorkonstruktionVector construction

Ein Erstgenerations-Adenovirus wird konsruiert, welches das E- Cadherin-Gen unter der Kontrolle des RSV-Promotors trägt: Ad-RSV-E-Cad.A first generation adenovirus is being Cadherin gene under the control of the RSV promoter carries: Ad-RSV-E-Cad.

In vitro TestungIn vitro testing

Zur Funktionstestung werden A2 Zellen mit Ad-RSV-E-Cad transduziert. Eine Zunahme der Adhesion wird durch Bestimmung der Zeitdauer ermittelt, die Trypsin benötigt, um die Zellen zu vereinzeln.A2 cells with Ad-RSV-E-Cad transduced. An increase in adhesion is determined by determining the length of time determined that trypsin needed to separate the cells.

VektortestungVector testing

In Nacktmäusen werden durch Injektion von LS174 Zellen Lebermetastasen induziert. Die Verabreichung von Ad-RSV-E-Cad erfolgt in Analogie zur Methodik in Ausführungsbeispiel 1. Gleiches gilt für die Auswertung.In nude mice are injected with LS174 cells Liver metastases induced. Ad-RSV-E-Cad is administered in Analogy to the methodology in exemplary embodiment 1. The same applies to the evaluation.

Transgene mit MembranankersequenzTransgenes with membrane anchor sequence

Suizidgene werden im Sinne der Erfindung zur Imprägnierung von Normalgewebe verwendet, dazu müssen sie mit einer Membranankersequenz ausgestattet werden, um extrazellulär wirksam zu sein und eine applizierte Prodrug auch extrazellulär toxifizieren zu können. In the sense of the invention, suicide genes are used to impregnate normal tissue used, they must be equipped with a membrane anchor sequence, to be extracellularly effective and an applied prodrug also extracellularly to be able to toxify.  

Ausführungsbeispiel 4Embodiment 4

Das Gen für das Suizidgen Cytosin Desaminase unter der Kontrolle des HNFAlbumin-Promotors wird mit einer Membranankersequenz versehen, so daß es nach Transfektion membranständig exprimiert wird. Diese Expressionskassette wird in einen AAV-shuttle Plasmid kloniert und ein AAV wird unter Verwendung eines beliebigen Helfersystems hergestellt (= AAV-HNFAlb-CD-Tm).The gene for the suicide gene cytosine deaminase under the control of the HNFAlbumin promoter is provided with a membrane anchor sequence so that it is expressed at the membrane after transfection. This expression cassette will cloned into an AAV shuttle plasmid and an AAV is isolated using a any helper system manufactured (= AAV-HNFAlb-CD-Tm).

In vitro TestungIn vitro testing

A2 Zellen werden mit AAV-HNFAlb-CD-Tm transduziert. 24 h nach Transduktion wird die Prodrug 5-FC in den Zellkulturüberstand (ZKÜ) gegeben. 5-FC wird nun durch die membranständige CD in das zytotoxische 5-FU überführt. Der Überstand wird nach 24 h gesammelt und auf die Zellinie LS174 sowie auf ruhende primäre Hepatozyten gegeben. Nach weiteren 72 h werden Zellzählungen vorgenommen, und das Ausmaß der Apoptose wird bestimmt.A2 cells are transduced with AAV-HNFAlb-CD-Tm. 24 hours after Transduction, the Prodrug 5-FC is added to the cell culture supernatant (ZKÜ). 5-FC is now transferred to the cytotoxic 5-FU through the membrane-bound CD. The The supernatant is collected after 24 h and on the cell line LS174 as well as on resting given primary hepatocytes. After a further 72 h, cell counts and the extent of apoptosis is determined.

In vivo TestungIn vivo testing

Vektorappplikation und Ermittlung der Therapieeffizienz verlaufen in Analogie zum Ausführungsbeispiel 1.Vector application and determination of therapy efficiency run in Analogy to embodiment 1.

ZielorganeTarget organs

Auf Grund der hervorragenden Infizierbarkeit der Leber bei systemischer Gabe von Adenoviren und der hohen klinischer Relevanz der Behandlung kolorektaler Metastasen wurde das erfindungsgemäße Verfahren an Hand des oben beschriebenen Krankheitsmodells entwickelt. Das Modell läßt sich auch auf andere Tumorerkrankungen anwenden. Zu den häufigsten Krankheitsbildern gehören Leber-, Lungen, -Knochen- und Hirnmetastasen bei Mammakarzinom mit Latenzzeiten bis zu 10 Jahren nach Entfernung des Primärtumors, ein Zeitraum, der bisher ungenutzt verstreicht, Hirnmetastasen bei Bronchialkarzinom und Knochenmetastsen bei Prostatakarzinom.Due to the excellent infectability of the liver when systemic administration of Adenoviruses and the high clinical relevance of colorectal treatment The method according to the invention was metastasized using the above disease model described developed. The model can also be applied to others Apply tumor diseases. The most common clinical pictures include liver, Lung, bone and brain metastases in breast cancer with latency times up to to 10 years after removal of the primary tumor, a period that was previously unused passes, brain metastases in bronchial carcinoma and bone metastases in Prostate cancer.

Weiterhin gibt es Primärtumoren, die aufgrund des fortgeschrittenen Stadiums primär inoperabel sind, wie häufig Glioblastome und Hepatozelluläre Karzinome. Als lebensverlängernde Maßnahme ist hier der Schutz des umgebenden Normalgewebes nach oben genanntem Prinzip vorstellbar. There are also primary tumors that are primary due to the advanced stage the frequency of glioblastomas and hepatocellular carcinomas is inoperable. As The life-extending measure here is the protection of the surrounding Normal tissue conceivable according to the principle mentioned above.  

Abb. 1 Fig. 1

Verhinderung von Lebermetastasierung durch systemische Applikation von Ad-TIMP-2. An Tag 0 wurden 3 × 1010 pfu Ad-TIMP-2 oder Ad-ßgal in die Schwanzvene von Nacktmäusen appliziert. 3 Tage später erhielten die Tiere eine intrasplenale Injektion von LS174 Kolonkarzinomzellen zur Induktion von Lebermetastasen. Representative in situ Photographien von unbehandelten (links), Ad-ßgal behandelten (Mitte) und Ad-TIMP-2 behandelten (rechts) Tieren nach 5 Wochen.Prevention of liver metastasis through systemic application of Ad-TIMP-2. On day 0, 3 × 10 10 pfu Ad-TIMP-2 or Ad-ßgal were applied to the tail vein of nude mice. 3 days later, the animals received an intrasplenic injection of LS174 colon carcinoma cells to induce liver metastases. Representative in situ photographs of untreated (left), Ad-ßgal-treated (middle) and Ad-TIMP-2 treated (right) animals after 5 weeks.

Abb. 2 Fig. 2

Methodik wie Abb. 1. Nach 5 Wochen wurden die Tiere getötet und die Tumormassen wurden bestimmt. Punkte entsprechen einzelnen Tieren, Balken entsprechen den Mittelwerten.Methodology as in Fig. 1. After 5 weeks, the animals were sacrificed and the tumor masses were determined. Points correspond to individual animals, bars correspond to the mean values.

Claims (51)

1. Mittel zur gentherapeutischen Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen umfassend einen
  • - Vektor im Sinne eines Gentransfervehikels
  • - Enhancer/Promotor
  • - Transgen
wobei mindestens einer der aufgeführten Bestandteile auf die Imprägnierung von Normalgewebe ausgerichtet ist.1. Means for gene therapy prophylaxis and therapy of tumor diseases comprising one
  • - Vector in the sense of a gene transfer vehicle
  • - enhancer / promoter
  • - transgene
where at least one of the listed components is aimed at the impregnation of normal tissue. 2. Anwendung des Mittels nach Anspruch 1 zur gentherapeutischen Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen umfassend einen
  • - Vektor im Sinne eines Gentransfervehikels
  • - Enhancer/Promotor
  • - Transgen
wobei mindestens einer der aufgeführten Bestandteile auf die Imprägnierung von Normalgewebe ausgerichtet ist.2. Use of the agent according to claim 1 for gene therapy prophylaxis and therapy of tumor diseases comprising a
  • - Vector in the sense of a gene transfer vehicle
  • - enhancer / promoter
  • - transgene
where at least one of the listed components is aimed at the impregnation of normal tissue. 3. Anwendung eines Gentransfervektors umfassend ein Transgen in operativer Verknüpfung mit einem Enhancer/Promotor zur Herstellung eines Mittels für die gentherapeutische Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen durch Verabreichung an Normalgewebe.3. Application of a gene transfer vector comprising a transgene in operative Linking with an enhancer / promoter to produce an agent for the gene therapy prophylaxis and therapy of tumor diseases by Administration to normal tissue. 4. Verfahren zur gentherapeutischen Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mittel umfassend einen Vektor im Sinne eines Gentransfervehikels
  • - Enhancer/Promotor
  • - Transgen
wobei mindestens einer der aufgeführten Bestandteile auf die Imprägnierung von Normalgewebe ausgerichtet ist, einem Subjekt, welches einer prophylaktischen oder therapeutischen Tumorbehandlung bedarf, derart verabreicht, daß der Vektor im Wesentlichen von Normalzellen aufgenommen wird. 4. A method for gene therapy prophylaxis and therapy of tumor diseases, characterized in that an agent comprising a vector in the sense of a gene transfer vehicle
  • - enhancer / promoter
  • - transgene
wherein at least one of the listed components is aimed at the impregnation of normal tissue, a subject who needs prophylactic or therapeutic tumor treatment, administered in such a way that the vector is essentially absorbed by normal cells. 5. Mittel nach Anspruch 1, mit einem Promotor und/oder Enhancer, der durch Transkriptionsfaktoren reguliert wird, die in Normalgewebe aktiv sind.5. Composition according to claim 1, with a promoter and / or enhancer, by It regulates transcription factors that are active in normal tissue. 6. Mittel nach Anspruch 5 enthaltend den CMV-Promotor oder den SV 40 Promotor oder den RSV Promotor, oder leberspezifische Promotoren, wie den Albumin Promotor oder lungenspezifische Promotoren oder hirngewebsspezifische Promotoren oder knochenspezifische Promotoren oder Promotoren, die in potentiellen metastatischen Zielorganen oder Organen des Entstehens von Primärtumoren aktiv sind.6. Composition according to claim 5 containing the CMV promoter or the SV 40 promoter or the RSV promoter, or liver-specific promoters, such as the albumin promoter or lung-specific promoters or brain tissue-specific promoters or bone-specific promoters or promoters, which occur in potential metastatic target organs or organs of primary tumors are active. 7. Mittel nach Anspruch 5 enthaltend einen Enhancer/Promotor der durch Zugabe einer applizierbaren Substanz aktiviert wird.7. Containing agents according to claim 5 an enhancer / promoter which is activated by adding an applicable substance becomes. 8. Mittel nach Anspruch 5 und 7 bei dem es sich um einen Tetracyclin abhängigen oder einen Steroidhormon abhängigen Promotor handelt.8. Composition according to claim 5 and 7, which is a tetracycline dependent or a steroid hormone dependent promoter. 9. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend Transgene für Substanzen,
  • - welche das Wachstum des Tumors begrenzen
  • - den Tumor zerstören
  • - das Normalgewebe vor Tumorinvasion schützen.
9. Composition according to claim 1 containing transgenes for substances,
  • - which limit the growth of the tumor
  • - destroy the tumor
  • - protect normal tissue from tumor invasion.
10. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend Gene von Metalloproteaseinhibitoren10. Agent according to claim 1 containing genes of metalloprotease inhibitors 11. Mittel nach Anspruch 1 und 10 enthaltend ein antitumorales Transgen kodierend für:
TIMP-1 oder TIMP-211. Agent according to claim 1 and 10 containing an antitumor transgene coding for:
TIMP-1 or TIMP-2 12. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Protease-inhibitorisches Transgen kodierend für:
TIMP-3 oder TIMP-4 oder PAI-1 oder PAI-2. 12. Composition according to claim 1 containing a protease inhibitory transgene coding for:
TIMP-3 or TIMP-4 or PAI-1 or PAI-2. 13. Mittel nach Anspruch 11 oder 12 enthaltend ein modifiziertes Transgen, dessen antitumorale Wirkung durch diese Modifikation verstärkt wurde.13. Composition according to claim 11 or 12 containing a modified transgene antitumor effect was enhanced by this modification. 14. Mittel nach Anspruch 13, welches als betreffendes Transgen C-terminal trunkierte TIMP-2 enthält.14. Agent according to claim 13, which truncated as the relevant transgene C-terminal TIMP-2 contains. 15. Mittel nach Anspruch 1, 2 oder 3 enthaltend ein Transgen der Extrazellulären Matrix.15. Composition according to claim 1, 2 or 3 containing a transgene of the extracellular Matrix. 16. Mittel nach Anspruch 15 enthaltend mindestens zwei Polypeptidketten des Kollagen oder Fibronektin oder Laminin oder Gene deren Produkte für die Synthese von nicht proteinischen Komponenten der ECM verantwortlich sind.16. Composition according to claim 15 containing at least two polypeptide chains of Collagen or fibronectin or laminin or genes their products for synthesis of non-protein components of the ECM are responsible. 17. Mittel nach Anspruch 15 oder 16 enthaltend ein so modifiziertes Transgen der Extrazellulären Matrix, daß es schwer oder nicht abbaubar ist.17. Composition according to claim 15 or 16 containing a modified transgene of the Extracellular matrix that it is difficult or not degradable. 18. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Transgen kodierend für ein Adhäsionsmolekül.18. Composition according to claim 1 containing a transgene coding for Adhesion molecule. 19. Mittel nach Anspruch 18 in dem das betreffende Adhäsionsmolekül das Claudin oder Occludin oder ein Cadherin oder ein Integrin oder ein Gen aus der Immunglobulin Superfamilie ein Selectin oder ein Muzin ist.19. Composition according to claim 18 in which the adhesion molecule in question is claudin or occludin or a cadherin or an integrin or a gene from the Immunoglobulin superfamily is a selectin or a muzin. 20. Mittel zur Prophylaxe und Behandlung von Tumorerkrankungen enthaltend ein antitumorales Transgen oder Sequenzen desselben, welches mit einer Membranankersequenz versehen ist.20. Containing agents for the prophylaxis and treatment of tumor diseases antitumor transgene or sequences of the same, which with a Membrane anchor sequence is provided. 21. Anwendung eines Gentransfervektors zur Herstellung eines Mittels zur Prophylaxe und Behandlung von Tumorerkrankungen enthaltend ein antitumorales Transgen oder Sequenzen desselben, welches mit einer Membranankersequenz versehen ist. 21. Application of a gene transfer vector for the production of an agent for Prophylaxis and treatment of tumor diseases containing an antitumor Transgene or sequences of the same, which with a membrane anchor sequence is provided.   22. Verfahren zur Prophylaxe und Behandlung von Tumorerkrankungen bei dem ein antitumorales Transgen oder Sequenzen desselben, welches mit einer Membranankersequenz versehen ist transferiert wird.22. Procedure for the prophylaxis and treatment of tumor diseases in the one antitumor transgene or sequences of the same, which with a Membrane anchor sequence is transferred. 23. Mittel nach Anspruch 20, welches als betreffendes Transgen ein Suizidgen oder ein sonstwie chemotherapeutisch wirksames Gen enthält23. A composition according to claim 20, which as a transgene in question is a suicide gene or contains an otherwise chemically active gene 24. Mittel nach Anspruch 23 in dem das betreffende Transgen Cytosin Desaminase oder aktive Teilsequenzen derselben oder Nitroreduktase oder aktive Teilsequenzen derselben sind.24. Means according to claim 23 in which the transgene in question Cytosine deaminase or active partial sequences of the same or nitroreductase or are active part-sequences of the same. 25. Mittel nach Anspruch 1 in dem der Vektor ein Virus ist.25. Composition according to claim 1, in which the vector is a virus. 26. Mittel nach Anspruch 25 in dem das Virus ein Erstgenerations-Adenovirus oder ein Adeno-assoziiertes Virus oder ein Minimal-Adenovirus oder ein HSV oder ein Lentivirus ist.26. A composition according to claim 25 in which the virus is a first generation adenovirus or an adeno-associated virus or a minimal adenovirus or an HSV or a Lentivirus is. 27. Mittel nach Anspruch 26 in dem das Virus ein Lentivirus/Minimal-Adenovirus Hybrid ist.27. A composition according to claim 26, in which the virus is a lentivirus / minimal adenovirus Is hybrid. 28. Mittel nach Anspruch 27 in dem der Vektor ein nicht-humanes Mammalier- Adenovirus ist.28. A composition according to claim 27, in which the vector is a non-human mammalian Adenovirus is. 29. Mittel nach Anspruch 1 in dem der Vektor kein Virus ist.29. Composition according to claim 1, in which the vector is not a virus. 30. Mittel nach Anspruch 29 in dem der Vektor eine liposomale Formulation ist oder Trägerproteine verwendet sind.30. Composition according to claim 29, in which the vector is a liposomal formulation or Carrier proteins are used. 31. Mittel nach Anspruch 25 und 29, in dem die Oberfläche so modifiziert ist, daß ein spezifischer Gentransfer in das Normalgewebe erreicht wird.31. Composition according to claim 25 and 29, in which the surface is modified so that a specific gene transfer into normal tissue is achieved. 32. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Minimal-Adenovirus und TIMP-2. 32. Agent according to claim 1 containing a minimal adenovirus and TIMP-2.   33. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Minimal-Adenovirus und C-terminal trunkiertes TIMP-2.33. Agent according to claim 1 containing a minimal adenovirus and C-terminal truncated TIMP-2. 34. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein AAV und TIMP-2.34. Composition according to claim 1 containing an AAV and TIMP-2. 35. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Erstgenerations-Adenovirus und TIMP-2.35. Agent according to claim 1 containing a first generation adenovirus and TIMP-2. 36. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Lentivirus/Minimaladenovirus Hybrid und TIMP-2.36. Composition according to claim 1 containing a lentivirus / minimal adenovirus hybrid and TIMP-2. 37. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein AAV und C-terminal trunkiertes TIMP-2.37. Agent according to claim 1 containing an AAV and C-terminally truncated TIMP-2. 38. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Minimal-Adenovirus und E-Cadherin.38. Composition according to claim 1 containing a minimal adenovirus and E-cadherin. 39. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein AAV und E-Cadherin.39. Composition according to claim 1 containing an AAV and E-cadherin. 40. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend ein Minimal-Adenovirus und mindestens zwei Polypeptidketten des Kollagen.40. Composition according to claim 1 containing a minimal adenovirus and at least two Collagen polypeptide chains. 41. Mittel nach Anspruch 1 zum Gentransfer ins Lebergewebe.41. Agent according to claim 1 for gene transfer into liver tissue. 42. Mittel nach Anspruch 1 zur Therapie und Prophylaxe von Lebermetastasen.42. Agent according to claim 1 for the therapy and prophylaxis of liver metastases. 43. Mittel nach Anspruch 1 zur Therapie von Hirntumoren.43. Agent according to claim 1 for the therapy of brain tumors. 44. Mittel nach Anspruch 1 zur Therapie von Lungenmetastasen.44. Agent according to claim 1 for the therapy of lung metastases. 45. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend den HNFAlbumin-Enhancer/Promotor, AAV und TIMP-1.45. Agent according to claim 1 containing the HNFAlbumin enhancer / promoter, AAV and TIMP-1. 46. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend einen Enhancer/Promotor, der durch eine körperfremde Substanz aktiviert wird und mindestens zwei Polypeptidketten des Kotlagen. 46. Composition according to claim 1 containing an enhancer / promoter, which by a foreign substance is activated and at least two polypeptide chains of the Feces.   47. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend einen leberspezifischen Promotor, ein AAV und einen Metalloprotease-Inhibitor.47. Agent according to claim 1 containing a liver-specific promoter, an AAV and a metalloprotease inhibitor. 48. Mittel nach Anspruch 1 enthaltend einen leberspezifischen Promotor, ein Minimal-Adenovirus und einen Metalloprotease-Inhibitor.48. Agent according to claim 1 containing a liver-specific promoter Minimal adenovirus and a metalloprotease inhibitor. 49. Mittel nach Anspruch 1 und 9 enthaltend einen leberspezifischen Promotor und ein Minimal-Adenovirus.49. Composition according to claim 1 and 9 containing a liver-specific promoter and a minimal adenovirus. 50. Mittel nach Anspruch 1 und 9 enthaltend einen leberspezifischen Promotor und ein AAV.50. Composition according to claim 1 and 9 containing a liver-specific promoter and an AAV. 51. Mittel nach Anspruch 1 und 9 enthaltend einen leberspezifischen Promotor und ein Lentivirus/Minimal-Adenovirus Hybrid.51. Composition according to claim 1 and 9 containing a liver-specific promoter and a lentivirus / minimal adenovirus hybrid.
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