DE10019289A1

DE10019289A1 - Method for detecting cocoa components in cocoa products, useful e.g. for quality control, comprises amplifying a new husk-specific DNA

Info

Publication number: DE10019289A1
Application number: DE10019289A
Authority: DE
Inventors: Michael Anton Muench; Peter Schieberle; Markus Fischer; Adelbert Bacher
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-04-19
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2001-11-08

Abstract

Method for detecting cocoa components in cocoa products comprising amplification and identification of selected DNA fragments, is new. Independent claims are also included for the following: (1) method for preparing a gene probe by subjecting target DNA to randomly directed polymerase chain reaction (PCR), using the primer 5'-AACGCGCAA, cloning a specific amplicon into a vector, sequencing the insert and preparing oligonucleotides that hybridize with the target DNA; (2) 229 bp DNA fragment (I); (3) all possible DNA sequences (II) that contain parts (oligonucleotides; ON) of (I); (4) use of pairs of ON for use as PCR primers; (5) use of single ON as hybridization probe; (6) peptides (III) encoded by (I); (7) antibodies (Ab) directed against (III); and (8) preparation of a test kit containing ON.

Description

Verfahren für den Nachweis von Kakaoschalen in Kakaoprodukten, wobei ein kakao schalenspezifisches DNA-Fragment (ca. 250 bp) mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert wird. Die amplifizierten DNA-Fragmente werden elektrophoretisch aufgetrennt und anhand von Vergleichsmustern mit definierten Kakaoschalengehal ten semiquantitativ zugeordnet.Method for the detection of cocoa shells in cocoa products, one being cocoa Shell-specific DNA fragment (approx. 250 bp) using the polymerase chain reaction (PCR) is amplified. The amplified DNA fragments become electrophoretic separated and based on comparison samples with defined cocoa shell content assigned semiquantitatively.

Das Primerpaar hat folgende Nucleotidsequenzen:
Primer A:5'-TGC GGT GGT ATT CTG CCA GAA C-3' (Strang-Primer)
Primer B:5'-CGC GCA ACA CAT CCT TCA TGC-3' (Gegenstrang-Primer).The primer pair has the following nucleotide sequences:
Primer A: 5'-TGC GGT GGT ATT CTG CCA GAA C-3 '(strand primer)
Primer B: 5'-CGC GCA ACA CAT CCT TCA TGC-3 '(counter strand primer).

Es wird ferner ein Test-Kit bereitgestellt, der dATP, dTTP, dCTP, dGTP, Primer A und B sowie Puffer in lyophilisierter Form enthält.A test kit is also provided, the dATP, dTTP, dCTP, dGTP, primer A and B as well as buffers in lyophilized form.

Eine hohe Nachweisempfindlichkeit auch thermisch behandelter Proben ist gegeben; ein Schalengehalt ab 0.5% kann semiquantitativ ermittelt werden.A high detection sensitivity is also given to thermally treated samples; a shell content from 0.5% can be determined semi-quantitatively.

description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Kakaoschalen in Kakaopro dukten. Bevor Rohkakao zur Herstellung von Kakaoerzeugnissen wie Kakaomasse, Kakaopulver und auch Kakaobutter eingesetzt werden kann, sind die wertlosen Schalenanteile im Rahmen des technisch Möglichen weitestgehend zu entfernen. Ein erheblicher Teil der Kakaobohnenernte (10-20%) ist von minderer Qualität. Von die sen Bohnen läßt sich die Schale meist nur sehr schwer entfernen.The invention relates to a method for the detection of cocoa shells in cocoa pro products. Before raw cocoa is used to make cocoa products like cocoa mass, Cocoa powder and cocoa butter can be used are the worthless Remove as much of the shell as possible within the scope of what is technically possible. On considerable part of the cocoa bean harvest (10-20%) is of poor quality. From the It is usually very difficult to remove the husk from the beans.

Die Kakaoverordnung begrenzt aus Qualitätsgründen deshalb den Gehalt an Scha lenanteilen einschließlich Keimwürzelchen bei Kakaokernen und Kakaomassen auf 5 % bezogen auf die fettfreie Trockenmasse. Bis zu diesem Wert kann ein Anteil als technologisch nicht vermeidbar angesehen werden.For quality reasons, the cocoa regulation therefore limits the Scha content Oil proportions, including germinates in cocoa seeds and cocoa masses on 5 % based on the fat-free dry matter. Up to this value, a share can be considered technologically unavoidable.

Höhere Schalenanteile sind als qualitätsmindernd anzusehen, sei es weil Kakao da durch gestreckt wird oder die Bohnen, vor allem bei minderen Qualitäten, nicht in ausreichendem Maße von den Schalen und Keimwürzelchen befreit wurden. Wäh rend bei Kakaomasse und letztendlich auch bei Schokoladen der Schalenanteil selbst von Interesse ist, geht es bei der Qualitätsbeurteilung von Kakaobutter, insbe sondere von Kakopressbutter darum, inwiefern diese aus zu schalenreichen Roh stoffen abgepreßt wurde. Auch eine Gewinnung durch zu starke Abpressung gilt es zu unterbinden, da hierbei zu hohe Anteile an Schalenfett und anderen uner wünschten Begleitsubstanzen in die Kakaobutter übergehen. Der Nachweis von Ka kaoschalen als Verfälschung von Kakaoprodukten ist mit zunehmender Verfeinerung der Zerkleinerungstechnik immer schwieriger zu führen.Higher proportions of shells are to be regarded as reducing quality, either because cocoa is present by being stretched or the beans, especially if they are of low quality, not in were sufficiently freed from the shells and germ roots. Wuh with cocoa mass and ultimately also with chocolate is of interest, the quality assessment of cocoa butter, in particular of cocoa press butter, in particular, to what extent these are made from raw shells was squeezed out. It is also important to obtain them by pressing too hard to prevent, since this is too high proportions of shell fat and other un desired accompanying substances in the cocoa butter. Evidence of Ka kaoshells as adulteration of cocoa products is with increasing refinement shredding technology is becoming increasingly difficult to manage.

Previously used methods for the analysis of cocoa shells in cocoa products

Zur Bestimmung des Schalengehaltes in Kakaoerzeugnissen wurden bisher zahlrei che mikroskopische sowie chemische Verfahren herangezogen. To date, there have been numerous tests for determining the shell content in cocoa products microscopic and chemical processes are used.

Microscopic procedures

Zur mikroskopischen Bestimmung des Schalenanteiles zählen Hanausek [1916] und Huss [1916] die in der Kakaoschale regelmässig auftretenden Schleimzellen aus. Sie gehen dabei jedoch von der unbewiesenen Vermutung aus, dass bei allen Kakao sorten die Zahl der Schleimzellen pro Schalengewicht konstant ist. Fischer [1900] schlug die Bestimmung der Zahl der Sklereiden in der Kakaoschale, die bei allen Sorten zu einem einschichtigen Mantel zusammengefügt sind, vor. Aus der Anzahl der Sklereiden, ihrer Länge und Breite kann auf die Oberfläche der Steinzellen schicht und somit, unter bestimmten Voraussetzungen, auf den Schalenanteil rück geschlossen werden. Wenn diese Methoden auch von Ezendam [1924], Griebel und Sonntag [1926] Alpers [1927] Wagenaar [1929] Hermann [1937] Josephy [1953, 1956], Sachsse und Geuting [1956] Schetty [1956] und Sandbäck [1957] verbessert und vereinfacht wurden, so bleiben sie dennoch sehr arbeitsaufwendig. Ferner be rücksichtigen diese Methoden nicht oder nur unzureichend, dass die Zahl der Sklereidzellen bei gegebenem Schalengehalt mit zunehmendem Zerkleinerungsgrad stark abnimmt. Van Breederode und Reeskamp [1957] untersuchten systematisch den Zusammenhang zwischen dem Zerkleinerungsgrad einerseits und der Zahl der Sklereidenzellgruppen sowie der Zahl der Skiereiden je Gruppe andererseits. Eine gewisse weitere Vereinfachung stellt die von Ruge [1970] angewendete Polarisa tionsmikroskopie dar. Dabei wurde nach Entfettung und Säureaufschluss des Ka kaopulvers im Polarisationsmikroskop der Flächenwert der aufleuchtenden Partikel als Mass für den Schalenanteil ermittelt. Meursing [1973] berechnete den Schalen gehalt nach Isolierung und Anreicherung der Steinzellengruppen. Dabei wurden die Zahl der Steinzellengruppen sowie die Anzahl der Steinzellen pro Gruppe ausge zählt. Der Schalenanteil wurde daraus über eine empirisch aufgestellte Eichkurve, bei der die Zahl der Steinzellengruppen zu der durchschnittlichen Anzahl von Stein zellengruppen eines Kakaoprodukts mit 1%-igem Schalengehalt in Relation gesetzt wurde, ermittelt. Zudem wurde versucht, eine Korrektur der Zellen, die während des Zerkleinerungsprozesses verloren gingen, vorzunehmen.Hanausek [1916] and Huss [1916] eliminated the mucous cells that regularly appeared in the cocoa shell. she assume, however, from the unproven presumption that all cocoa the number of mucus cells per shell weight is constant. Fischer [1900] suggested determining the number of sclereids in the cocoa shell, in all Varieties are assembled into a single-layer jacket. From the number the sclereids, their length and width can be on the surface of the stone cells layer and thus, under certain conditions, back to the shell portion getting closed. If these methods also by Ezendam [1924], Griebel and Sunday [1926] Alpers [1927] Wagenaar [1929] Hermann [1937] Josephy [1953, 1956], Sachsse and Geuting [1956] Schetty [1956] and Sandbäck [1957] improved and have been simplified, they still remain very labor intensive. Furthermore be do not or insufficiently take these methods into account that the number of Sclereid cells with a given shell content with increasing degree of comminution decreases sharply. Van Breederode and Reeskamp [1957] examined systematically the relationship between the degree of shredding on the one hand and the number of Sclereid cell groups as well as the number of ski skirts per group on the other hand. A the polarisa used by Ruge [1970] provides some further simplification tion microscopy. After degreasing and acid digestion of the Ka kaopulvers in the polarizing microscope the area value of the illuminating particles determined as a measure of the shell portion. Meursing [1973] calculated the shells content after isolation and enrichment of the stone cell groups. The Number of stone cell groups as well as the number of stone cells per group counts. The shell portion was derived from this using an empirically established calibration curve, where the number of stone cell groups is related to the average number of stone Cell groups of a cocoa product with 1% shell content in relation was determined. Attempts were also made to correct the cells that appeared during the Shredding process was lost.

Physical and chemical processes

Zur Bestimmung des Gehaltes an Kakaoschalen in Kakaokernbruch wurden von Streuli und Schär [1953] und Acker et al. [1955] Trennverfahren vorgeschlagen, die auf der unterschiedlichen Dichte der Kakaokerne und Kakaoschalen beruhen. Dabei gab die Summe der nach einem Siebdurchgang von Hand ausgelesenen und durch Schlämmung mit konzentrierter Phosphorsäure/Methanol (1 : 1) isolierten Schalenbe standteile den Schalengehalt der Einwaage.To determine the content of cocoa shells in cocoa kernel from Streuli and Schär [1953] and Acker et al. [1955] proposed separation processes that are based on the different densities of the cocoa kernels and cocoa shells. there gave the sum of the read by hand after a sieving and passed Slurry with concentrated phosphoric acid / methanol (1: 1) isolated peel constituents the shell content of the sample.

Die meisten chemischen Verfahren eignen sich, von Extremfällen abgesehen, nicht zur Bestimmung des Kakaoschalengehaltes [Lange und Fincke A., 1970]. Dies gilt im Besonderen für die Bestimmung des Rohfasergehaltes, die immer wieder zum Schalennachweis vorgeschlagen wurde. Da sich die Rohfasergehalte der fettfreien Trockenmasse von Kakaokernen und Kakaoschalen nur wenig voneinander unter scheiden, kam Fincke H. [1939] zu der Schlußfolgerung, daß erst Schalengehalte < 15% (berechnet auf Kakaokerne) durch eine Rohfaserbestimmung sicher erkannt werden können. Die Statistische Auswertung von Rohfaseranalysen durch Van Breederode und Reeskamp [1957] zeigte, dass erst bei einem Schalengehalt < 25%, berechnet auf die fettfreie Trockenmasse signifikant hohe Rohfasergehalte zu erwarten sind. Verfahren zur Bestimmung des Rohfasergehaltes über eine Bestim mung des Pektinsäure- bzw. Galakturonsäuregehaltes [Winkler, 1962; Jackson, 1962] sind nicht nur sehr langwierig, sondern liefern auch schlecht reproduzierbare Werte [Lange und Fincke A., 1970].With the exception of extreme cases, most chemical processes are unsuitable to determine the cocoa shell content [Lange and Fincke A., 1970]. This applies in Especially for the determination of the raw fiber content, which is always used Shell verification was proposed. Since the crude fiber content of the fat-free The dry matter of cocoa kernels and cocoa shells is only slightly separated from each other divorce, Fincke H. [1939] came to the conclusion that only shell contents <15% (calculated on cocoa kernels) reliably detected by raw fiber determination can be. The statistical evaluation of crude fiber analyzes by Van Breederode and Reeskamp [1957] showed that only with a shell content <25%, calculated on the fat-free dry matter to expect significantly high crude fiber contents are. Method for determining the raw fiber content using a determ Measurement of the pectic acid or galacturonic acid content [Winkler, 1962; Jackson, 1962] are not only very lengthy, but also provide poorly reproducible Values [Lange and Fincke A., 1970].

Mittels Dünnschichtchromatographie konnte ein zunächst noch nicht identifizierter "Stoff A" in Kakaoschalen nach Anreicherung und Isolierung durch Besprühen der Platten mit unterschiedlichen Reagenzien, Dichlorchinonchlorimid [Wurziger, 1961], Vanillin-HCl [Meyer, 1962], Eisen(III)chlorid, Äthylvanillin, Benzaldehyd, o-Chlorbenz aldehyd, p-Nitrobenzaldehyd, Salicylaldehyd, p-Dimethylaminobenzaldehyd [Fincke A., 1962] aufgrund der daraus resultierenden charakteristischen Färbungen nachge wiesen werden.By means of thin layer chromatography, an initially unidentified one could be identified "Substance A" in cocoa shells after enrichment and isolation by spraying the Plates with different reagents, dichloroquinone chlorimide [Wurziger, 1961], Vanillin-HCl [Meyer, 1962], iron (III) chloride, ethyl vanillin, benzaldehyde, o-chlorobenz aldehyde, p-nitrobenzaldehyde, salicylaldehyde, p-dimethylaminobenzaldehyde [Fincke A., 1962] due to the resulting characteristic colorations be shown.

Meyer [1962], Fincke A. und Sacher [1963] sowie Diemair et al. [1963] wiesen in die sem Zusammenhang bereits auf das Vorkommen dieser Verbindung in Kakaokernen der Kakaobohne hin.Meyer [1962], Fincke A. and Sacher [1963] and Diemair et al. [1963] pointed to the related to the presence of this compound in cocoa seeds the cocoa bean.

Sacher [1965] gelang es schliesslich, diese Verbindung als Behensäuretryptamid zu isolieren und identifizieren. Dieser Schritt ermöglichte dann die Entwicklung eines photometrischen Verfahrens zum Nachweis von Kakaoabfallfetten in Kakaobutter. Dabei wurde die bei Reaktion mit p-Dimethylaminobenzaldehyd entstehende Blau färbung photomerisch gemessen. Aus deren Intensität konnte man den sogenannten "Blauwert" errechnen. Bei einwandfreier Kakaobutter liegt dieser unter 0.05 [Fincke A. und Sacher, 1963].Sacher [1965] finally succeeded in using this compound as behenic acid tryptamide isolate and identify. This step then allowed the development of one photometric method for the detection of cocoa waste fats in cocoa butter. The blue that formed on reaction with p-dimethylaminobenzaldehyde became staining measured photomerically. From their intensity you could get the so-called Calculate "blue value". If the cocoa butter is perfect, it is less than 0.05 [Fincke A. and Sacher, 1963].

Einen Weg, so den Schalengehalt in Kakaoerzeugnissen quantitativ zu bestimmen, zeigten Acker und Hünermann auf [1966]. Sie stellten zudem Testmischungen mit unterschiedlichen Schalenzusätzen her und verglichen die photometrisch bestimm ten Werte mit den mikroskopisch ermittelten nach Schetty [1956] und Van Breedero de und Reeskamp [1957].One way to quantify the shell content in cocoa products showed Acker and Hünermann [1966]. They also provided test mixes different shell additives and compared the photometrically determined values with the microscopically determined according to Schetty [1956] and Van Breedero de and Reeskamp [1957].

Das "Blauwert-Verfahren" findet bis heute in der Qualitätskontrolle von Ka kaoprodukten Anwendung [IOCCC Method 108, 1988].The "blue value process" is still used in Ka quality control Kao products application [IOCCC Method 108, 1988].

Eine weitere Methode zur Schalenquantifizierung in Kakaoprodukten über den Ge halt an Fettsäuretryptamiden, basierend auf HPLC mit fluorimetrischer Detektion wurde beschrieben [Münch und Schieberle, 1999]. Die Autoren konnten zudem zei gen, dass die "Blauwert"-Methode zu unempfindlich ist, um den Schalengehalt inner halb des gesetzlich festgelegten Rahmens zu bestimmen.Another method for shell quantification in cocoa products via the Ge holds fatty acid tryptamides, based on HPLC with fluorimetric detection has been described [Münch and Schieble, 1999]. The authors were also able to that the "blue level" method is too insensitive to the inner shell content half of the legal framework.

Description of the work steps

- Isolation of the total DNA from the cocoa samples
- Use of a pair of primers, the primer complementary to the shell-specific DNA is for the duplication of the DNA by means of polymerase chain reaction
- Electrophoretic separation of the DNA fragments
- Semi-quantitative estimation of the proportion of cocoa shells using Ver same samples with defined shell additives

Schematische Darstellung der Isolierung der Gesamt-DNA aus den Kakaoproben (z. B. Schokolade, Kakaomasse, Kakaopulver) Schematic representation of the isolation of the total DNA from the cocoa samples (e.g. chocolate, cocoa mass, cocoa powder)

Production of the test kit

Die Herstellung der Oligonucleotide erfolgte auf dem Wege einer Auftragssynthese. Die Primer wurden den Angaben entsprechend mit Wasser verdünnt und in Eppen dorf-Caps mit Konzentrationen von 50 pmol pro Primer pipettiert. Nach einer Vaku umtrocknung wurde je Cap ein RAPD Analysis Bead (Amersham Pharmacia, Frei burg) zugegeben. Ein Bead enthält: AmpliTaq DNA-Polymerase und Stoffel Frag ment, BSA (2.5 µg), dNTP's (0.4 mM je dNTP) und Puffer (3 mM MgCl₂, 30 mM KCl, 10 mM Tris (pH 8.3) in einem 25 µL Reaktionsansatz.The oligonucleotides were produced by custom synthesis. The primers were diluted with water according to the instructions and pipetted into Eppendorf caps with concentrations of 50 pmol per primer. After vacuum drying, one RAPD Analysis Bead (Amersham Pharmacia, Freiburg) was added to each cap. One bead contains: AmpliTaq DNA polymerase and Stoffel fragment, BSA (2.5 µg), dNTP's (0.4 mM each dNTP) and buffer (3 mM MgCl ₂ , 30 mM KCl, 10 mM Tris (pH 8.3) in a 25 µL reaction mixture .

Polymerase chain reaction

Für die PCR wird die DNA auf eine Konzentration von 1 ng pro Ansatz verdünnt. Zu Beads, beispielsweise RAPD Analysis Beads (Amersham Pharmacia, Freiburg), die die Primerkombination (50 pmol je Primer) bereits enthalten, werden 24 µL Was ser und 1 µL DNA-Template gegeben. For the PCR, the DNA is diluted to a concentration of 1 ng per batch. For beads, for example RAPD Analysis Beads (Amersham Pharmacia, Freiburg), that already contain the primer combination (50 pmol per primer) will be 24 µL Was water and 1 µL DNA template.

Die PCR wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
The PCR is carried out under the following conditions:

1.5 min / 94 ° C
2. 30 s / 94 ° C
3. 30 s / 60 ° C
4. 30 s / 172 ° C
5. 8 min / 72 ° C
Steps 2-4 are followed 30 times.
6. cool to 4 ° C

Electrophoresis

Die amplifizierten DNA-Fragmente werden anschliessend durch Gelelektrophorese in 3%igem Agarosegel mit 1 µg/mL Ethidiumbromid oder Polyacrylamid-Gelelektro phorese mit Silberfärbung oder sonstige dem Fachmann bekannte Verfahren sichtbar gemacht. Die Konzentration der Amplifikate wird nach Vergleich mit DNA bekannter Konzentration semiquantitativ abgeschätzt. Die Intensität kann auch mit Hilfe eines Densitometers bzw. eines Scanners mit entsprechender Ausstattung er mittelt werden.The amplified DNA fragments are then in gel electrophoresis in 3% agarose gel with 1 µg / mL ethidium bromide or polyacrylamide gel electro phoresis with silver staining or other methods known to the person skilled in the art made visible. The concentration of the amplificates is compared to DNA known concentration semiquantitatively estimated. The intensity can also with With the help of a densitometer or a scanner with the appropriate equipment be averaged.

Results and discussion

Abb. 1 gibt Auskunft über das 229 bp DNA-Fragment in Kakaoschalen und Kakao kernen unterschiedlichen Ursprungs. Starke Banden lassen sich in den Proben 3, 5, 7 und 9 erkennen. Es wird deutlich, dass das 229 bp Fragment in allen untersuchten Kakaoschalen, nicht aber in den Kakaokernen vorkommt. Es wurden Proben aus Ghana, Nigeria, Malaysia und Venezuela untersucht. Fig. 1 provides information about the 229 bp DNA fragment in cocoa shells and cocoa kernels of different origins. Strong bands can be seen in samples 3, 5, 7 and 9. It is clear that the 229 bp fragment occurs in all the cocoa shells examined, but not in the cocoa seeds. Samples from Ghana, Nigeria, Malaysia and Venezuela were examined.

Abb. 2 zeigt das 229 bp Fragment isoliert aus unterschiedlichen Teilen der Ka kaopflanze. Die eindeutig stärkste Bande resultiert aus den Kakaoschalen. Schwä cher, aber dennoch gut detektierbar folgen die Banden von frischen Blättern des Ka kaobaumes sowie Amplikons der Keimlinge. Im Kern lässt sich das 229 bp Fragment wiederum nicht nachweisen. Fig. 2 shows the 229 bp fragment isolated from different parts of the Kaa plant. The clearly strongest band results from the cocoa shells. The bands of fresh leaves of the cocoa tree as well as amplicons of the seedlings follow weaker, but still well detectable. The core of the 229 bp fragment is again not detectable.

Abb. 3 zeigt Kakaokerne mit steigenden Zusätzen an Kakaoschalen. Die zugesetzten Mengen an Schalen betrugen 0.2%, 0.5%, 1%, 2% und 5%. Mit steigenden Schalen zusätzen werden die Banden intensiver. Klar zu erkennen ist bereits ein Schalenzu satz von nur 0.5%. Der laut Gesetz geduldete Schalenanteil von maximal 5% bezo gen auf die fettfreie Trockenmasse kann eindeutig nachgewiesen werden. Fig. 3 shows cocoa kernels with increasing additions to cocoa shells. The added amounts of dishes were 0.2%, 0.5%, 1%, 2% and 5%. With increasing shells, the gangs become more intense. A shell addition of only 0.5% can already be clearly seen. The maximum proportion of shells tolerated by law of 5% based on the fat-free dry matter can be clearly demonstrated.

Abb. 4 zeigt einige untersuchte Zartbitter- und Vollmilchschokoladenproben aus dem Handel. Auch hier lässt sich das 229 bp Fragment eindeutig nachweisen. Die Voll milchschokoladen (Proben 2 und 5) zeigen im Vergleich zu den Zartbitterschokola den (Proben 1 und 4) stärkere Banden. Um nun eine Aussage über den Schalenge halt der Schokoladen zu treffen, werden die Intensitäten der Banden mit jenen der Proben mit definierten Schalenzusätzen verglichen. Der Schalengehalt in den unter suchten Proben liegt nach semiquantitativer Abschätzung in den Zartbitterschokola den (Proben 1 und 4) um 1%, in den Vollmilchschokoladen (Proben 2 und 5) um 2%. Abb. 5 zeigt das DNA-Fragment aus Kakaomasse und Kakaopulvern aus dem Han del. Schwache Banden zeigen die undotierte Kakakomasse (Probe 1) sowie das Ka kaopulver 3 (Probe 6). Deutlich stärkere Banden lassen sich bei Kakaopulver 2 (Pro be 5) und Kakaopulver 1 (Probe 4) erkennen. Die stärksten Banden zeigen die mit jeweils 2% Kakaoschalen dotierten Proben Kakaomasse (Probe 2) und Kakaopulver 3 (Probe 7). Vergleicht man die Bandenintensität der Kakaomassen und Kakaopulver mit den Banden der Proben mit definierten Schalenzusätzen (Abb. 5), so lässt sich der Schalengehalt in der Kakaomasse (Probe 1) und im Kakaopulver 3 (Probe 6) auf 0.5%, im Kakaopulver 2 (Probe 5) auf 1% sowie im Kakaopulver 1 (Probe 4) auf 2% semiquantitativ ermitteln. Fig. 4 shows some of the dark chocolate and whole milk chocolate samples examined in the trade. The 229 bp fragment can also be clearly identified here. The whole milk chocolates (samples 2 and 5) show stronger bands than the dark chocolate (samples 1 and 4). In order to make a statement about the shell content of the chocolates, the intensities of the bands are compared with those of the samples with defined shell additives. According to a semi-quantitative estimate, the shell content in the samples examined is 1% in the dark chocolate (samples 1 and 4) and 2% in the whole milk chocolate (samples 2 and 5). Fig. 5 shows the DNA fragment from cocoa mass and cocoa powders from the trade. Weak bands show the undoped cocoa mass (sample 1) and the cocoa powder 3 (sample 6). Significantly stronger bands can be seen in cocoa powder 2 (sample 5) and cocoa powder 1 (sample 4). The strongest bands show the samples of cocoa mass (sample 2) and cocoa powder 3 (sample 7), each with 2% cocoa shells. If you compare the band intensity of the cocoa mass and cocoa powder with the bands of the samples with defined shell additives ( Fig. 5), the shell content in the cocoa mass (sample 1) and in cocoa powder 3 (sample 6) can be reduced to 0.5%, in cocoa powder 2 ( Determine sample 5) to 1% and in cocoa powder 1 (sample 4) to 2% semiquantitatively.

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Claims

1. Method for the detection of cocoa constituents in cocoa products by Am plification and identification of selected DNA fragments.

2. Method for the detection of cocoa shells in cocoa products by amplification and identification of selected DNA fragments, characterized by the execution of the following analytical process steps:

Isolation of the total DNA from the cocoa samples
- Use of a pair of primers whose primers are complementary to the shell-specific DNA for the amplification of the DNA by means of the polymerase chain reaction
- Electrophoretic separation of the DNA fragments
- Semi-quantitative estimation of the proportion of cocoa shells based on comparative samples with defined shell additives

3. The method according to claim 2, characterized in that the following primers are used for the multiplication of the plant DNA by means of polymerase chain reaction in the sample to be tested:
Primer A: 5'-TGC GGT GGT ATT CTG CCA GAA C-3 '(strand primer)
Primer B: 5'-CGC GCA ACA CAT CCT TCA TGC-3 '(counter strand primer)

4. A method for producing a gene probe, characterized in that the respective target DNA of a random PCR (5 '-AAC GCG CAA-3') under a certain fragment is cloned into a vector, the insert DNA of this vector is sequenced and then oligonucleotides, which with hybridize to the target DNA fragment.

5. DNA fragment, characterized by the following sequence:

6. All possible DNA sequences, characterized in that they each have parts (Oligonucleotides) of the sequence set mentioned in claim 5.

7. Use of pairs (strand sequence with counter strand sequence) of the under An say 6 formed oligonucleotides as primers for PCR.

8. Use of individual oligonucleotides mentioned in claim 6 as probes in DNA hybridization experiments.

9. peptide sequences resulting from all possible 3-base codes, e.g. B. the following sequence:

10. Antibodies against the shown or parts of those mentioned in claim 9 Peptide sequence can be obtained.

11. Use of the antibodies according to claim 10 in immunoassay methods (ELI- SA, surface plasmon resonance method, etc.)

12. A method for producing the test kit, characterized in that the oligonucleotides in question are introduced in dissolved form into the analysis vessels, then dried using methods known to those skilled in the art and analysis beads (Amersham-Pharmacia, Freiburg) are then added. If necessary, the components contained are dissolved in a defined amount of water and mixed with DNA to be analyzed and a polymerase chain reaction is carried out.
Sequence listing: