DE10014516A1

DE10014516A1 - Antagonisten des RANTES Rezeptors CCR1 zur Prävention und Therapie der Atherosklerose und Restenose

Info

Publication number: DE10014516A1
Application number: DE2000114516
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-03-23
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2001-09-27

Description

Anwendungsgebiet

Die Erfindung betrifft eine Anwendung entsprechend dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Stand der Technik

Atherosklerose arterieller Gefäße ist das morphologische Korrelat kardiovas kulärer Zivilisationserkrankungen, wie koronare Herzerkrankung mit Myo kardinfarkt, cerebrovaskuläre Insuffizienz mit Schlaganfall und periphere arterielle Verschlußkrankheit. Nach Aktivierung von Gefäßendothel und Thrombozyten durch diverse Noxen ist die initiale Rekrutierung von Mono zyten von fundamentaler Bedeutung für die Genese der atherosklerotischen Frühläsion. Dies führt zur subintimalen Infiltration mit Makrophagen, zur Lipidakkumulation in Schaumzellen und via Sekretion diverser Faktoren zur Progression, Destabilisierung, Ruptur und Thrombogenität der atherosklero tischen Plaques. Auch nach Intervention mittels Ballondilatation spielen emigrierte Monozyten via Wachstumsfaktoren eine kritische Rolle bei der Proliferation glatter Muskelzellen und sukzessiven Restenose des Gefäßes.

Nachteile des Standes der Technik

Es gibt Hinweise aus Expressions- und "Knockout"-Tierstudien, daß die Monozytenrekrutierung bei der Atherogenese durch sequentielle Beteiligung multipler Adhäsions- und Signalmoleküle, so z. B. durch das CC-Chemokin MCP-1, die Chemokinrezeptoren CCR2 und CXCR2. Die experimentelle Modulation dieser Moleküle haben zur wenngleich inkompletten Hemmung oder Verzögerung von Atherogenese und Restenose geführt. Allerdings ste hen pharmakologisch anwendbare Antagonisten bisher nicht zur Verfügung. Zudem ist die spezifische Rolle anderer Chemokine oder Rezeptoren bei Einzelschritten der atherogenen Rekrutierung bisher ungeklärt, d. h. oben ge nannte Moleküle könnten eher in der Spätphase von Bedeutung sein. Auf grund der Limitationen und potentiell immunsuppressiver Nebenwirkungen bei fraglicher Selektivität haben diese Konzepte zur Prävention der Athero genese und Restenose, in der klinischen Anwendung keinen Eingang gefun den. Daher beschränkt sich die Primär- und Sekundärprävention bisher auf die Lipid-senkende Behandlung (HMG-CoA-Reduktaseinhibitoren) und Hemmung der Thrombozytenaggregation und -aktivierung (Aspirin oder Clopidogrel). Diese zeigen jedoch noch weitaus geringere Spezifität und be achtliche Nebenwirkungen, wie Myopathien und Blutungskomplikationen.

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist die selektive Blockade der Monozytenrekrutierung in atherosklerotische Frühläsionen also die Elimination des kritischen Patho mechanismus der Atherogenese und Restenose. Dies hat bei hoher Wirkspe zifität die klinische Anwendung in der Prävention und Therapie zur Folge.

Lösung der Aufgabe

Von aktivierten Thrombozyten auf arteriellem und mikrovaskulärem Gefäß endothel immobilisiertes CC-Chemokin RANTES ist entscheidend am Arrest und der Rekrutierung von Monozyten in atherosklerotischen Frühläsionen und Neointima nach Verletzung atherosklerotischer Gefäße beteiligt, was via immunhistochemischer Anfärbung von RANTES in diesen Läsionen und die funktionelle Hemmung mit RANTES-Peptidantagonist nachgewiesen wird. Der Arrest wird durch den RANTES-Rezeptor CCR1 auf Monozyten vermit telt, der so ein ideales Ziel zum Einsatz synthetischer Antagonisten darstellt.

Vorteile der Erfindung

RANTES-Rezeptorblockade zeigt Effektivität und Spezifität der Hemmung der initialen Anheftungsphase der Monozytenrekrutierung in atherosklero tischen und entzündlichen, nicht aber gesunden Gefäßen und ist zur Anwen dung bei Transplantatabstoßung in präklinischer Erprobung. Durch selek tive Blockade des Monozytenarrests werden alle Folgemechanismen der Atherogenese verhindert. Bei hoher Selektivität für vaskuläre Syndrome infolge der Deposition von RANTES als Sekretionsprodukt aktivierter Thrombozyten läßt sich für dessen Blockade im Gefäßlumen ein geringes Nebenwirkungsspektrum erwarten. Weiterhin ist eine Synergie in der Kombination mit obengenannten Therapieformen denkbar.

Beschreibung von Ausführungsbeispielen

Um zu zeigen, daß Thrombozyten und ihre sekretorischen Produkte Endothel für den Arrest und die Rekrutierung von Monozyten unter physiologischen Flußbedingungen konditionieren, wurden Zytokin-aktivierte, mikrovaskuläre Endothelzellschichten mit Thrombin-stimulierten oder unstimu lierten Plättchen oder ihren Überständen unter statischen Bedingungen inkubiert oder bei konstanten Scherraten in einer laminaren Flußkammer perfundiert. Anschließend wurden isolierte, humane Monozyten über das vorbehandelte Endothel bei einer Scherrate von 1.5 dyn/cm² perfundiert und die Zahl der scherresistent adhärenten Monozyten wurde nach 5 min der Akkumulation bestimmt. Die Exposition des Endothels mit Thrombin-stimulierten, nicht aber unstimulierten Plättchen oder ihren Überständen in Stase oder nach Perfusion induzierte einen 2-fachen Anstieg des Monozyten arrests (Fig. 1A). Die Präinkubation der Monozyten mit dem Peptidantagonisten metRANTES (Startmethionin retiniert) resultierte in einer kompletten Blockade dieser Effekte (Fig. 1A), wodurch die entscheidende Rolle von thrombozytär sezerniertem RANTES beim Arrest unter Scherflußbe dingungen demonstriert wird. Analoge Befunde wurden für aortales Endothel erhoben (Fig. 1B).

Bei der Fähigkeit zur Immobilisierung an endotheliale Heparanproteoglykane wurde getestet, ob es zu einer juxtakrinen Deposition von RANTES an das Endothel kommt. RANTES wurde von stimulierten Plättchen substantiell in Überstände sezerniert und nicht an der Oberfläche gebunden (Abb. 2A, B). Dagegen wurde mit Oberflächen-ELISA und Immunfluoreszenz gezeigt, daß die Prä inkubation mit stimulierten Plättchen oder Überständen zu einer deutlichen Immobilisierung auf aktiviertem Endothel führte (Abb. 2C, D). Dies ist für die Funktion von RANTES entscheidend, da auf adhärenten Thrombozyten oder umbilikalen Venenendothelzellen ohne gebundenes RANTES der Arrest von Monozyten nicht durch RANTES vermittelt wird (keine Abbildung). Dies zeigt, daß eine jux takrine Deposition von RANTES durch Thrombozyten Arrest von Monozyten auf aktivierte Endo thel fördert. Um die Relevanz der endothelialen RANTES-Deposition nachzuweisen, ergab Immun histochemie von Atherektomiepräparaten humaner Carotiden mit fortgeschrittener Atherosklerose, daß RANTES-Färbung in der Media und Intima, insbesondere auf der luminalen Oberfläche detek tierbar war (Abb. 3A). Ebenso wurde RANTES in Intima und Mediazellen früher, atheroskleroti scher Läsionen in Carotiden von apoF-/-Mäusen nach atherogener Diät oder nach Atherektomie mit akzentuierter Färbung der luminalen Endotheloberfläche gefunden (Abb. 3B, C).

In einem Modell der initialen Makrophagenrekrutierung bei der Atherogenese zeigte sich, daß die Anheftung und Akkumulation humaner Monozyten auf dem Endothel atherosklerotischer Früh läsionen in ex-vivo-perfundierten Carotiden apoF-defizienter Mäuse durch Pertussistoxin inhibier bar, also von G-Protein-ahängigen (Chemokin-)-Rezeptoren abhängig ist (Abb. 3D). Der Arrest wurde auch durch metRANTES, den Antagonisten der RANTES-Rezeptoren CCR1, CCR3 und CCR5 oder auf ähnliche Weise durch den CXCR2-Peptidantagonisten 8-73GRO gehemmt (Abb. 3D), wobei sich bei additiven Effekten der Kombination beider möglicherweise eine beinahe kom plette, mit Pertussistoxin vergleichbare Blockade erzielen läßt. Die Spezies-übergreifende Kreuz reaktivität ist durch die strukturelle und funktionelle Konservation von RANTES plausibel. Somit ist thrombozytäres RANTES nach Immobilisierung auf der luminalen Oberfläche entscheidend an der inflammatorischen und atherogenen Monozyteninfiltration auf Endothel diverser Stromgebieten als universell relevantes Prinzip der Rekrutierung entzündlicher Zellen beteiligt.

Da Monozyten und Th1 Helfer T Lymphozyten mehrere RANTES-Rezeptoren auf mRNA- und Protein-Ebene exprimieren, d. h. CCR1 und CCRS (Abb. 4 A), wurde geklärt, welcher dieser Rezeptoren für die oben beschriebenen Effekte unter Flußbedingungen verantwortlich ist. Die Vorbehandlung mit dem synthetischen, klein-molekularen CCR1-Antagonisten BX471, nicht aber die Blockade oder Desentisierung von CCRS mit Antikörpern, modifiziertem AOP-RANTES oder dem synthetischen Antagonisten TAK-779 reduzierte den Arrest von Monozyten (Abb. 4B) oder Th1-Zellen (Abb. 4C) auf RANTES-vorbehandeltem, aktiviertem mikrovaskulärem Endothel unter Scherfluß. Zudem induzierte MIP-1β als selektiver CCR5-Agonist keinen signifikanten Arrest. Somit wird der RANTES-induzierte Arrest von Monozyten in Scherfluß durch CCR1 vermittelt.

Abb. 1

Durch Sekretionsprodukte stimulierter Thrombozyten vermittelte Rekrutierung von Monozyten auf aktiviertem Endothel wird durch metRANTES blockiert. IL-1β-aktivierte, humane, mikrovaskuläre (a) oder aortale (b) Endothelzellen wurden für 20 min mit Thrombin-stimulierten Plättchen oder ihren Überständen in Stase präinkubiert oder präperfundiert. Monozytäre Zellen (a) oder Monozyten (b) wurden nach Vorbehandlung mit und ohne (Kontrolle) RANTES Antagonist metRANTES (1 µg/ml) bei 1.5 dyn/cm² über das Endothel perfundiert. Die Zahl adhärenter Mono zyten wurde nach 5 min bestimmt. Daten sind Durchschnitt ± SD. * = p < 0.05 vs Kontrolle.

Abb. 2

Durch Thrombin-stimulierte Plättchen sezerniertes RANTES wird auf aktiviertem Endothel immobilisiert. RANTES wurde in thrombozytären Überständen durch ELISA gemessen (a). Die Oberflächenexpression von P-Selektin und RANTES (----) oder Isotypkontrolle () auf aktivierten Plättchen wurde mittels Durchflußzytometrie bestimmt (b). Nach Rotationsinkubation (c) bzw. Präperfusion (d) mit aktivierten Thrombozyten oder Überständen wurden MCP-1 und RANTES auf der Oberfläche aktivierten Endothels per ELISA bestimmt (c), und die Immobili sierung von RANTES auf Endothel wurde durch Immunofluoreszenz detektiert (d).

Abb. 3

RANTES-Nachweis und Funktion ex vivo. Immunohistochemie für RANTES zeigt Färbung für RANTES (bräunlich) in Paraffin-Schnitten muriner Carotiden apoE-defizienter Mäuse mit atherosklerotischen Frühläsionen (a), Atherektomie-ähnlicher Gefäßverletzung (b) oder in Gefrierschnittten von Carotiden mit fortgeschrittenen Plaques aus humanen Atherektomie präparaten (c). Perfusion explantierter, muriner Carotiden (apoE-/-) ex vivo zeigt, daß die Vor behandlung mit Pertussistoxin (50 ng/ml) oder metRANTES die Akkumulation von monozytären Zellen auf Endothel atherosklerotischer Frühläsionen signifikant (p < 0.05) hemmt (d).

Abb. 4

Monozyten und Th1-Zellen exprimieren RANTES-Rezeptoren CCR1 und CCR5 als mRNA und Oberflächenprotein (a). CCR1 und nicht CCR5 vermittelt Arrest von Monozyten (b) und Th1-Zellen (c). Leukozyten wurden mit Antikörpern gegen CCR5 oder Isotypkontrolle (10 µg/ml), CCR1-Antagonist BX471, CCR5-Antagonist TAK-779 (10 µM) oder DMSO präinku biert und auf IL-1β-aktiviertem, mit RANTES oder MIP-1β vorbehandeltem Endothel perfundiert und nach 5 min wurde die Zahl adhärenter Zellen bestimmt. * = p <0.05 vs RANTES-Kontrolle.

Claims

1. Anwendung eines therapeutischen Prinzips zur Prävention der humanen Atherosklerose, post operativen oder postinterventionellen Restenose (d. h. nach Ballondilatation, Atherektomie, Bypassoperation) durch Hemmung der Monozyteninfiltration, dadurch gekennzeichnet, daß die durch RANTES-vermittelte Monozytenrekrutierung in atherosklerotischen Plaques bzw. Neointima durch orale/intravenöse Gabe (akut, chronisch) eines (nicht-)synthetischen Antagonisten gegen RANTES-Rezeptor CCR1 blockiert wird.

2. Anwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die durch RANTES-vermittelte Monozytenrekrutierung in atherosklerotischen Plaques bzw. Neointima durch ex-vivo-Applikation (z. B. vor Implantation eines Gefäßinterponats) oder intravasale Applikation (z. B. Katheterintervention, Stent-Implan tation) (nicht-)synthetischer Antagonisten gegen RANTES-Rezeptor CCR1 blockiert wird.

3. Anwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die durch RANTES-vermittelte Monozytenrekrutierung in atherosklerotischen Plaques bzw. Neointima durch alternative Neutralisation der juxtakrinen RANTES Sekretion und Deposition auf Endothel, z. B. durch Antagonisierung von RANTES in Thrombozytengranula oder der RANTES-Bindungsstellen auf Endothel blockiert wird.

4. Anwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß oben genannte Prozesse durch diverse, technische Optionen zum Gentransfer eines modifizierten Peptidantagonisten gegen RANTES in Endothel ex vivo oder in vivo, oder durch Auskleidung von intravasal applizierbarem Material mit synthetischen oder nicht-synthetischen Antagonisten gegen den RANTES-Rezeptor CCR1 blockiert werden.

5. Anwendung nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß synthetische oder nicht synthetische (Peptid-)Antagonisten gegen RANTES/CCR1 in Endothel in den oben charakterisierten Anwendungen mit Blockade via analoger Antagonisten gegen den Rezeptor CXCR2 für additive Effekte kombiniert werden.